CN103394082A - 多价免疫原性组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种多价免疫原性组合物，包括灭活的甲肝抗原和灭活的脊髓灰质炎病毒。进一步还可以含有纯化后的百日咳抗原、白喉类毒素、破伤风类毒素、丝状血细胞凝集素、b型流感嗜血杆菌多糖、脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖、乙肝抗原、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型抗原的一种或两种以上，以及生理学可接受的载体。本发明以二联苗或更多联合疫苗的形式免疫受种人群，在不降低各免疫抗原的免疫效果的同时节省受种次数，节约时间和人力资源。

Description

多价免疫原性组合物

技术领域

本发明涉及医学生物技术领域，具体地说，涉及一种多价免疫原性组合物。

背景技术

甲型病毒性肝炎简称甲型肝炎，是由甲型肝炎病毒(甲肝病毒)引起的一种急性传染病，粪-口传播是其主要传播途径。临床上表现为起病急，有畏寒、发热、食欲减退、恶心、疲乏、肝肿大及肝功能异常。部分病例出现黄疸，无症状感染病例较常见，一般不转为慢性和病原携带状态。

甲型肝炎病毒属于微小核糖核酸病毒科，肝病毒属。病毒颗粒呈球形，直径约为27nm，无囊膜，衣壳由32个壳粒组成，呈20面体立体对称，每个壳粒具有四个多肽分别为病毒蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，基因组为单股正链RNA，其长度相当于7500个核苷酸左右。在RNA的3′末端有多聚的腺苷序列，在5′末端以共价形式与病毒基因组蛋白。根据病毒核苷酸序列分析，人甲肝病毒可以分为四个基因型，但其抗原性相似，所以甲型肝炎病毒只有一个血清型。

脊髓灰质炎是由病毒感染人引起的高传染性疾病。脊髓灰质炎病毒可以侵染人体神经系统，并可在数小时内导致病人肢体麻痹，造成终身残疾。脊髓灰质炎可在所有年龄段人群中发生，但好发于小于5岁的婴幼儿，因此该病又称为“小儿麻痹症”。

脊髓灰质炎病毒属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒属。电子显微镜下观察病毒呈小的圆球形，直径为24～30nm，呈圆形颗粒状。脊髓灰质炎病毒含有单股正链RNA，被3个外壳蛋白包裹，分别为VP1-3，另外一个VP4蛋白为内壳蛋白。脊髓灰质炎病毒按照血清型分类可以分为I、II和III型，均可以致病。

到目前为止医学界还没有治疗脊髓灰质炎的特效药，仅能通过缓解症状来治疗病人，比如通过物理疗法和服用止痉挛药来缓解肌肉麻痹和紧张。但是脊髓灰质炎可以通过注射疫苗来达到良好的预防效果。

灭活的脊髓灰质炎疫苗（IPV）最先由Salk博士在上世纪50年代开发成功。1954年在美国进行了大规模临床试验，次年临床试验结果证明疫苗具有良好的安全性和保护性，随后在美国开展了大规模接种活动。另外一种减毒口服的脊髓灰质炎疫苗（OPV）由Sabin博士在上世纪60年代开发成功，并迅速在世界范围内使用，为防治脊髓灰质炎疫情贡献了坚实力量。

1988年世界卫生组织（WHO）启动了全球脊髓灰质炎消灭行动，首先鼓励发展中国家在计划免疫中使用多价或单价的OPV，从而彻底阻断自然界中野生脊髓灰质炎病毒在人群中的传染，随后使用灭活的脊髓灰质炎疫苗逐步代替OPV，从而避免因服用减毒活疫苗带来的疫苗衍生脊髓灰质炎病毒（VDPV）和脊髓灰质炎疫苗相关病例（VADP）。此种灭活的脊髓灰质炎疫苗可分为两类：由野毒株制备的灭活疫苗和由减毒株制备的灭活疫苗（sabin-IPV）。但是前者生产IPV使用野毒株极大的限制了在发展中国家的推广使用，尤其是在消灭脊髓灰质炎病毒后时代，WHO会更严格限制野毒株的使用，因此sabin-IPV疫苗就成为代替OPV疫苗在发展中国家推广使用的一种新产品。

甲肝疫苗和脊髓灰质炎疫苗同做为针对婴幼儿计划免疫的疫苗，有广泛的受种人群，且接种群的年龄较相似。该两种疫苗均为多剂免疫，受种人群需要多次接种，费时费力。因此，需要一种联合疫苗，在不降低二者免疫效果的同时节省受种次数，节约时间和人力资源。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种含有灭活甲肝抗原和灭活脊髓灰质炎病毒的多价免疫原性组合物。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种多价免疫原性组合物，所述多价免疫原性组合物包括灭活的甲肝抗原和灭活的脊髓灰质炎病毒。

所述灭活的脊髓灰质炎病毒来自sabin株，包含sabin Ⅰ型、sabinⅡ型和sabinⅢ型。

所述免疫原性组合物含有灭活的甲肝抗原50-1000U单位/人份，sabin I型抗原1.5-20D单位/人份，sabin II型抗原2-40D单位/人份，sabinIII型抗原5-70D单位/人份。

优选地，所述免疫原性组合物含有灭活的甲肝抗原100-600U单位/人份，sabin I型抗原5-15D单位/人份，sabin II型抗原10-30D单位/人份，sabin III型抗原10-40D单位/人份。

进一步地，所述多价免疫原性组合物还可以含有纯化后的百日咳抗原、白喉类毒素、破伤风类毒素、丝状血细胞凝集素、b型流感嗜血杆菌多糖（hib）、脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖、乙肝抗原、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）抗原的一种或两种以上。

上述抗原在多价免疫组合物中的抗原含量分别为：百日咳类毒素：5-40ug/人份的；白喉类毒素：10-50lf/人份；破伤风类毒素：2.5-30lf/人份；丝状血细胞凝集素：5-40ug/人份；2.5-20ug/人份的菌毛抗原；b型流感嗜血杆菌：2.5-30ug/人份；乙肝抗原：5-40ug/人份；灭活EV71抗原：300-1200U单位/人份；灭活CA16抗原：1000-8000U单位/人份。

优选地，所述多价免疫原性组合物还包含如下一种或多种抗原：百日咳类毒素：20-35ug/人份；白喉类毒素：20-40lf/人份；破伤风类毒素：8-20lf/人份；丝状血细胞凝集素：20-35ug/人份；5-15ug/人份的菌毛抗原；b型流感嗜血杆菌：5-20ug/人份；乙肝抗原：15-30ug/人份；灭活EV71抗原：300-1000U单位/人份；灭活CA16抗原：1000-6000U单位/人份。

所述多价免疫原性组合物还包含四种血清型的脑膜炎多糖抗原，包括2.5-30ug/人份的A群脑膜炎多糖抗原，2.5-30ug/人份的C群脑膜炎多糖抗原，2.5-30ug/人份的W群脑膜炎多糖抗原，2.5-30ug/人份的Y群脑膜炎多糖抗原。

优选地，所述多价免疫原性组合物还包含四种血清型的脑膜炎多糖抗原，包括5-20ug/人份的A群脑膜炎多糖抗原，5-20ug/人份的C群脑膜炎多糖抗原，5-20ug/人份的W群脑膜炎多糖抗原，5-20ug/人份的Y群脑膜炎多糖抗原。

进一步地，前述免疫原性组合物还可以包含生理可接受的载体，包含可与b型流感嗜血杆菌多糖抗原缀合的生理可接受的载体蛋白，如10-50ug/人份的破伤风类毒素载体，也可选自白喉类毒素、白喉CRM197蛋白和脑膜炎外膜蛋白或任何已知的其它载体。该免疫原性组合物还可能包含可与脑膜炎多糖抗原缀合的生理可接受的载体蛋白，如30-200ug/人份的白喉类毒素载体，也可选自白喉类毒素，白喉CRM197蛋白和脑膜炎外膜蛋白或任何已知的其它载体。

细菌多糖与载体蛋白的偶联方法使用公知技术，包括使用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）活化多糖抗原后与载体蛋白共价连接，也包括使用还原胺化法处理多糖和载体蛋白的偶联，或者使用溴化氰活化多糖后与载体蛋白偶联的方法。

进一步地，所述多价免疫原性组合物，其特征在于，所述多价免疫原性组合物还可以包含佐剂。

优选地，所述佐剂为铝盐。

更为优选地，所述铝盐为磷酸铝或氢氧化铝，最优选为氢氧化铝。

进一步地，所述多价免疫原性组合物的剂型为喷雾剂、注射剂、冻干剂、胶囊剂、片剂或丸剂。

本发明还提供了前述多价免疫原性组合物在制备预防或治疗甲肝或脊髓灰质炎药物中的应用。

前述抗原的制备：

前述免疫原性组合物中甲肝抗原的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，包括甲肝病毒的培养、收获、纯化和灭活，其中甲肝病毒培养的细胞基质可以选择人二倍体细胞如SV-1细胞或者传代细胞如Vero细胞，培养方式可以选择细胞工厂或者生物反应器；甲肝抗原的纯化可包括多级澄清过滤、浓缩和分子筛层析；甲肝抗原的灭活使用甲醛，方法符合中国药典2010版相关要求和WHO对灭活甲肝疫苗的指导原则中对灭活步骤的要求。

前述免疫原性组合物中脊灰抗原的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，包括三种血清型脊灰病毒的培养、收获、纯化和灭活，其中脊灰病毒培养的细胞基质可以选择人二倍体细胞如2BS细胞或者传代细胞如Vero细胞，培养方式可以选择细胞工厂或者生物反应器；脊灰抗原的纯化可包括多级澄清过滤、浓缩、分子筛层析和离子交换层析；脊灰抗原的灭活使用甲醛，方法符合WHO对灭活脊灰疫苗指导原则中对灭活步骤的要求。

前述免疫原性组合物中肠道病毒抗原的制备针对EV71病毒和/或者CA16病毒，通过对EV71或CA16病毒的培养、收获、灭活和纯化实现，其中病毒培养的细胞基质可以选择人二倍体细胞如SV-1细胞或者传代细胞如Vero细胞，培养方式可以选择细胞工厂或者生物反应器；病毒抗原的灭活使用甲醛，方法参照灭活甲肝疫苗的相关要求。病毒抗原的纯化可包括糖密度梯度离心、浓缩、酶切和分子筛层析。

前述免疫原性组合物中乙肝抗原的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，包括重组乙肝抗原的表达和纯化，其中重组乙肝表达载体可以是汉逊酵母或者啤酒酵母，通过细菌发酵罐培养并表达乙肝抗原；乙肝抗原的收获和纯化可包括研磨破菌、PEG沉淀、超滤浓缩、分子筛层析、离子交换层析和离心脱盐。制备方法符合中国药典2010版对乙肝抗原制备的相关要求。

前述免疫原性组合物中百日咳抗原的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，通过对百日咳菌的培养、收获和多组分纯化获得，包括百日咳菌在发酵罐中的培养、针对百日咳类毒素、丝状红细胞凝集素、百日咳外膜蛋白和百日咳菌毛的纯化。制备方法符合中国药典2010版和WHO对百日咳抗原制备的相关要求。

前述免疫原性组合物中白喉抗原的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，通过对白喉菌的培养和纯化获得，包括白喉菌在发酵罐中的培养、菌体经硫酸铵处理、三步层析、类毒素化处理和超滤步骤纯化。制备方法符合中国药典2010版和WHO对白喉抗原制备的相关要求。

前述免疫原性组合物中破伤风抗原的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，通过对破伤风菌的培养和纯化获得，包括破伤风菌在发酵罐中的培养、菌体经硫酸铵处理、三步层析、类毒素化处理和超滤步骤纯化。制备方法符合中国药典2010版和WHO对破伤风抗原制备的相关要求。

前述免疫原性组合物中hib多糖蛋白缀合物的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，通过对hib菌的培养和纯化获得，包括hib菌在发酵罐中的培养，对菌体进行福尔马林处理、离心浓缩和一系列化学方法的处理获得纯化后的荚膜多糖，然后通过一种上述的生理可接受载体蛋白，基于一种上述的多糖和载体蛋白的偶联方法获得hib荚膜多糖结合物。制备方法符合中国药典2010版对hib抗原结合物制备的相关要求。

前述免疫原性组合物中脑膜炎球菌A、C、W135和Y群抗原的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，通过分别对A、C、W135和Y群的培养和纯化获得，包括脑膜炎球菌各血清型在发酵罐中的培养、收获和甲醛灭活，对菌体进行去菌体、沉淀、解离、去核酸、沉淀收集多糖、超滤膜过程去除杂蛋白和内毒素和沉淀收集多糖，然后通过一种上述的生理可接受载体蛋白，基于一种上述的多糖和载体蛋白的偶联方法获得多糖结合物。制备方法符合WHO对脑膜炎球菌抗原结合物制备的相关要求。

多价免疫原性组合物的混合：将灭活的甲肝抗原原液和脊灰抗原原液进行搅拌混合作为一种抗原混合物，将EV71抗原和/或CA16抗原、乙肝抗原、多组分百日咳抗原、破伤风抗原、白喉抗原、hib抗原和脑膜炎抗原按照不同价次需求与甲肝和脊灰抗原混合物进行搅拌混合，并控制混合液的pH值在6-7之间。如果抗原混合物包含佐剂，则把抗原与佐剂进行吸附后进行混合搅拌，并控制混合液的pH值在6-7之间。

前述抗原的免疫原性：

评价多价抗原组合物的免疫原性通过动物体内实验进行。多价抗原组合物中甲肝抗原的免疫原性通过恒河猴效价实验进行评价，同时与灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每组的规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫后28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体。此类效价实验按照中国药典2010版要求进行。

多价抗原组合物中脊灰抗原的免疫原性通过大鼠效价实验进行评价，同时与灭活脊灰单价疫苗进行对比。选用SD大鼠或者Wistar大鼠按照10只每组的规格进行肌肉注射免疫，抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价。此类中和实验按照中国药典2010版要求进行。

评价多价抗原组合物的免疫原性通过动物体内实验进行。多价抗原组合物中EV71抗原和/或CA16抗原和脊灰抗原的免疫原性通过大鼠效价实验进行评价，同时与灭活EV71疫苗和/或CA16疫苗和灭活脊灰的单价疫苗进行对比。选用SD大鼠或者Wistar大鼠按照10只每组的规格进行肌肉注射免疫，抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价。此类中和实验按照中国药典2010版要求进行。

多价抗原组合物中乙肝抗原的免疫原性通过BALB/c小鼠效价实验进行评价，同时与单价重组乙肝疫苗进行对比。小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫，4-6周后采血，采用ELISA法测定乙肝抗体，计算半数有效剂量ED50。ED50实验按照中国药典2010版要求进行。

多价抗原组合物中百日咳抗原的免疫原性通过BALB/c小鼠或者NIH小鼠效价实验进行评价，同时与百白破联合疫苗进行对比。小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。小鼠免疫后14-16天进行百日咳菌的攻毒实验，攻毒实验按照中国药典2010版要求进行。

多价抗原组合物中破伤风抗原的免疫原性通过BALB/c小鼠或者NIH小鼠效价实验进行评价，同时与百白破联合疫苗进行对比。小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。小鼠免疫后4周进行破伤风毒素的攻毒实验，攻毒实验按照中国药典2010版要求进行。

多价抗原组合物中白喉抗原的免疫原性通过250g～350g的豚鼠效价实验进行评价，同时与百白破联合疫苗进行对比。豚鼠按照10只每组的规格进行肌肉注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。豚鼠免疫4周后进行白喉毒素的攻毒实验，攻毒实验按照中国药典2010版要求进行。

多价抗原组合物中b型流感嗜血杆菌抗原的免疫原性通过BALB/c小鼠或者NIH小鼠效价实验进行评价，同时与b型流感嗜血杆菌结合疫苗进行对比。小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照每次2.5ug多糖的抗原混合物的注射量进行免疫。小鼠首先进行0.85%氯化钠溶液注射，于第1、14天注射两次，与第21～28天经眼眶静脉采血，用ELISA法测定hib的IgG抗体。效价实验按照中国药典2010版要求进行。

多价抗原组合物中脑膜炎抗原的免疫原性通过BALB/c小鼠或者NIH小鼠效价实验进行评价，同时与A、C、W135、Y群四价脑膜炎结合疫苗进行对比。小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。小鼠于第1、14天注射两次，与第21～28天经眼眶静脉采血，用ELISA法测定抗原各血清型的IgG抗体。同时选择SD怀孕大鼠按照相同分组原则进行免疫，对乳鼠进行采血测定针对A群脑膜炎的IgG抗体。效价实验按照WHO相关要求进行。

本发明将甲肝和脊髓灰质炎疫苗或同时还含其它疫苗结合起来，以二联苗或更多联合疫苗的形式免疫受种人群，在不降低二者免疫效果的同时节省受种次数，节约时间和人力资源。且本发明所述脊髓灰质炎疫苗生产所用抗原为灭活的减毒株，和OPV相比能够避免毒株毒力返祖的风险，对受种者和环境均具有很好的安全性。本发明所述联合疫苗包含甲型肝炎和脊髓灰质炎疫苗，能够很好的预防由甲肝病毒和脊髓灰质炎病毒引起的甲型肝炎和小儿麻痹症的发生。且本发明研究表明，上述各抗原在免疫受种者后互相不干扰抗原性和免疫效果，具有很好的免疫原性和安全性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如下我们所采纳的实施例使用了标准的技术，除非另有详细描述，为本领域技术人员众所周知且为常规技术。实施例是例证性的，但并不限制本发明。

实施例1甲肝病毒的培养

甲肝病毒（TZ84株或者YN5株，来自北京科兴生物制品有限公司），在10层细胞工厂2BS细胞中适应生长并连续传代，使用EMEM培养基加10%新生牛血清（v/v），置37.5±1.0℃培养箱中培养5-7天后，按照MOI0.05接种甲肝病毒，37.5±1.0℃下继续培养3-5天后收获病毒液，经澄清过滤后用酶联免疫法检测病毒滴度值。甲肝病毒收获液可在6-8LgCCID₅₀/ml范围内。

实施例2甲肝抗原的纯化和灭活

将实施例1中描述的甲肝病毒收获液进行三级澄清过滤；将澄清过滤后的料液进行超滤浓缩；然后将浓缩后的料液通过分子筛层析柱，用0.1MPBS（pH7.2）缓冲液进行平衡，然后继续用0.1M PBS（pH7.2）洗脱，收集第1峰为病毒峰。将收集的病毒液通过0.22μm过滤后用1:4000甲醛37℃灭活12-13天，最后经除菌过滤后获得疫苗原液。

实施例3Sabin脊髓灰质炎病毒的培养

由美国ATCC提供的脊灰毒株sabin I型、sabin II型、sabin III型，分别在10层细胞工厂Vero细胞中适应生长并连续传代，使用MEM培养基加10%小牛血清（v/v），置37.5±1.0℃培养箱中培养3-5天后换无血清M199培养基，按照MOI=0.01分别接sabin株I型、II型和III型病毒，在32.5℃培养3-4天后收获病毒液，经澄清过滤后用CCID₅₀法检测病毒滴度值。以上三型脊灰病毒收获液可在7-8LgCCID₅₀/ml范围内。病毒收获液同时通过D抗原ELISA双抗夹心检测法检测D抗原值。以上三型脊灰病毒收获液的D抗原含量在20-120DU/ml范围内。

实施例4Sabin脊髓灰质炎病毒的纯化和灭活

将实施例3中描述的脊灰病毒收获液进行三级澄清过滤；将澄清过滤后的料液进行两级超滤浓缩，第一级选用100KD聚醚砜类膜包浓缩30-50倍，第二级选用100KD聚醚砜类膜包再浓缩5-10倍；然后将浓缩后的料液通过分子筛层析柱，用0.08M PBS（pH7.0）缓冲液进行平衡，然后继续用0.08M PBS（pH7.0）洗脱，收集第1峰为病毒峰。将收集的病毒液加到用0.08M PBS（pH7.0）平衡好的装有DEAE Sepharose Fast Flow的层析柱中，用0.08M PBS（pH7.0）洗脱，收集第1洗脱峰为病毒峰。该病毒收集液通过0.22μm过滤后用1:4000甲醛37℃灭活12-13天，最后经除菌过滤后获得抗原原液。

实施例5EV71病毒的培养

将EV71病毒株（保藏号为CGMCC No.3544），在10层细胞工厂Vero细胞中适应生长并连续传代，使用MEM培养基加10%（v/v）小牛血清，置37±1℃培养箱中培养5-7天后换MEM培养基加2%小牛血清（v/v），按照MOI=0.001接种EV71病毒，于33±1℃培养15天，每天观察细胞病变，当细胞病变达50%以上时，收获病毒液，经澄清过滤后用CCID50法检测病毒滴度值。EV71病毒收获液可在6-8LgCCID50/ml范围内。

实施例6EV71病毒的纯化和灭活

将实施例6中描述的EV71病毒收获液中加入甲醛溶液（1:1000-1:10000）（v/v），使游离甲醛终浓度为100～200μg/ml，置36.5℃±1℃灭活13天，制得病毒灭活液。将灭活液在30000rpm的蔗糖密度梯度离心6-12小时，收集病毒所在区带，经膜包超滤脱糖。随后经分子筛层析，用0.01M PBS（pH7.0）缓冲液进行平衡，然后继续用0.01M PBS（pH7.0）洗脱，收集病毒峰，最后经除菌过滤后获得疫苗原液。

实施例7CA16病毒的培养

一株CA16病毒株，（保藏号为CGMCC No.5371），在10层细胞工厂Vero细胞中适应生长并连续传代，使用MEM培养基加10%小牛血清，置37±1℃培养箱中培养5-7天后换MEM培养基加2%小牛血清，按照MOI=0.001接种CA16病毒，并在37±1℃培养箱中继续培养，每天观察细胞病变，当细胞病变达50%以上时，收获病毒液，经澄清过滤后用CCID₅₀法检测病毒滴度值。CA16病毒收获液可在6-8LgCCID₅₀/ml范围内。

实施例8CA16抗原的纯化和灭活

从实施例7中获得的CA16病毒收获液加入1:1000-1:10000（v/v）的甲醛溶液，使游离甲醛终浓度为100～200μg/ml，置36.5℃±1℃灭活13天，制得病毒灭活液。将灭活液进行离心澄清处理后超滤浓缩10-50倍。浓缩后料液加入PEG并使其终浓度达到5-15%，pH值在5-7之间，混合后进行搅拌10-60分钟，然后于2-8℃沉淀8-24小时后再离心7500-10000rpm约20-60分钟。将沉淀物用PBS缓冲液重溶后获得溶液，再经蔗糖密度梯度离心并收集病毒区带后，再超滤脱糖获得病毒液，然后上分子筛层析获得病毒层析液，最后经除菌过滤后获得疫苗原液。

实施例9乙肝抗原的制备

采用培养汉逊酵母，购自ATCC No.26012，制备重组乙肝抗原的方法，在摇瓶和细菌发酵罐中两级培养汉逊酵母后进行收获破菌，可采用玻璃珠研磨法进行两次研磨破碎，然后进行PEG沉淀和超滤浓缩，将浓缩液进行层析纯化，结合分子筛Sepharose CL-4B层析柱和离子交换DEAE层析住进行，然后对纯化液进行氯化铯梯度离心处理和脱盐处理获得纯化后的乙肝抗原，最后经除菌过滤后获得疫苗原液。

实施例10百日咳菌的培养和抗原的制备

按照中国专利申请号为200780036247的公开专利中对百日咳菌培养和抗原制备方法的描述，包括对百日咳菌的培养，对培养液进行浓缩和离心分离，取上清液，再通过在上清液中加入缓冲液并进行两步层析收集百日咳毒素液（PT）。该实施例还包括此专利对纤维状红细胞凝集素的制备方法的描述，包括将百日咳菌体进行溶解，进行离心分离后获取上清液，再通过在上清液中加入乙酸钙溶液并过滤收集含丝状红细胞凝集素的液体（FHA），然后对滤液进行硫酸铵浓缩处理，并进行密度梯度离心，收集含有目标抗原的部分。该实施例还包括此专利对外膜蛋白的制备方法的描述，包括对从含纤维状红细胞凝集素的液体中重新分离的菌体进行溶解、离心、取上清、加入缓冲液过滤、层析纯化分离和过滤步骤处理。获得纯化后的外膜蛋白。该实施例还包括此专利对菌毛制备方法的描述，包括将收集含外膜蛋白的液体加入盐和缓冲液，过滤后得到含菌毛的滤液，再通过硫酸铵浓缩后进行密度梯度离心获得纯化后的菌毛。

实施例11白喉菌的培养和类毒素的制备

按照中国专利申请号为200780036247的公开专利中对白喉菌培养和类毒素制备方法的描述，包括对白喉菌的培养，对培养液进行硫酸铵处理，取上清液进行过滤并进行三步层析纯化，包括苯基疏水层析、DEAE离子交换层析和凝胶过滤层次方法，收集层析液获得纯化毒素液，然后对毒素液进行类毒素化处理，包括加入定量的赖氨酸盐酸盐，福尔马林并加热，最后用超滤法去除多余的福尔马林和赖氨酸盐酸盐，获得类毒素液。

实施例12破伤风菌的培养和类毒素的制备

按照中国专利申请号为200780036247的公开专利中对破伤风培养和类毒素制备方法的描述，包括对破伤风的培养，对培养液进行硫酸铵处理，取上清液进行过滤并进行三步层析纯化，包括苯基疏水层析、DEAE离子交换层析和凝胶过滤层次方法，收集层析液获得纯化毒素液，然后对毒素液进行类毒素化处理，包括加入定量的福尔马林等并加热处理，最后用超滤法去除多余的福尔马林，获得类毒素液。

实施例13流感嗜血杆菌的培养和多糖纯化

按照中国专利申请号为200810125160的公开专利中对b型流感嗜血杆菌培养方法的描述，包括2次在固体培养基上的预培养和1次液体培养基的预培养，然后在发酵罐中培养并收获。按照该专利中对b型流感嗜血杆菌多糖纯化方法的描述，包括将收获液进行福尔马林处理、离心收集抗原上清液并浓缩，随后进行一系列化学方法的处理，获得纯化的b型流感嗜血杆菌多糖。

实施例14流感嗜血杆菌结合物的制备

按照中国专利申请号为200680023334.4的公开专利中对b型流感嗜血杆菌和破伤风类毒素的共价结合方法的描述，包括加入溴化氢对多糖进行活化处理，以及一系列化学方法将多糖和破伤风类毒素进行偶联形成缀合物，再对缀合物进行层析纯化，获得流感嗜血杆菌结合疫苗原液。

实施例15脑膜炎奈瑟菌的培养和多糖纯化

按照中国专利申请号为201110245718的公开专利中对脑膜炎球菌A、C、W和Y135群培养方法的描述，包括细菌在传代培养、发酵罐培养、收获和甲醛灭活。脑膜炎球菌纯化方法包括该专利中公开的去菌体、沉淀、解离、去核酸、沉淀收集多糖、超滤膜过程去除杂蛋白和内毒素、沉淀收集多糖。

实施例16脑膜炎奈瑟菌结合物的制备

按照中国专利申请号为200310119414的公开专利和A群和C群脑膜炎多糖结合疫苗的WHO指导文件中对脑膜炎球菌结合物制备方法的描述，包括将A群、C群、W群和Y群血清型的脑膜炎多糖分别与溴化氰混合进行活化，加入已二酰肼，透析、加入等量白喉类毒素、加入碳二亚胺、超滤浓缩、层析纯化、除菌过滤等步骤，获得各型脑膜炎多糖蛋白缀合物。

实施例17甲肝和脊灰组合物的制备

将实施例2中制得的甲肝抗原原液与实施例4中制得的脊灰抗原原液按一定浓度搅拌混合，获得联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。组合物抗原含量见表1：

实施例18含佐剂的甲肝和脊灰组合物的制备

将实施例2中所述的甲肝抗原原液和实施例4中所述的脊灰抗原原液分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将含有佐剂的甲肝抗原和脊灰抗原等体积混合搅拌，获得含铝佐剂的疫苗，确定pH值在6-7的范围内。组合物抗原含量见表1：

表1甲肝和脊灰组合物抗原含量

实施例19甲肝、脊灰、EV71和/或CA16组合物的制备

将实施例2中制得的甲肝抗原原液、实施例4中制得的脊灰抗原原液和实施例6中制得的EV71抗原原液和/或实施例8中制得的CA16抗原原液按一定浓度搅拌混合，获得联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。含EV71抗原的组合物的抗原含量见表2，含CA16抗原的组合物的抗原含量如表3所示。

实施例20含佐剂的甲肝、脊灰、EV71和/或CA16组合物的制备

将实施例2中所述的甲肝抗原原液、实施例4中的脊灰抗原原液和实施例6中所述的EV71抗原原液和/或实施例8中所述的CA16抗原原液分别与1.2mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将上述含佐剂的抗原等体积混合搅拌，获得含铝佐剂的联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。含EV71抗原的组合物的抗原含量见表2，含CA16抗原的组合物的抗原含量如表3所示。

表2含EV71、脊灰、甲肝的联合疫苗中各抗原含量

表3含CA16、脊灰、甲肝的联合疫苗中各抗原含量

实施例21甲肝、脊灰、乙肝组合物的制备

将实施例2中制得的甲肝抗原原液、实施例4中制得的脊灰抗原原液和实施例9中制得的乙肝抗原原液按一定浓度搅拌混合，获得多价联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。联合疫苗组合物中各抗原含量见表4。

实施例22含佐剂的甲肝、脊灰、乙肝组合物的制备

将实施例2中所述的甲肝抗原原液、实施例4中所述的脊灰抗原原液和实施例9中所述的乙肝抗原原液分别与1mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将上述含佐剂的抗原等体积混合搅拌，获得含铝佐剂的联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。联合疫苗组合物中各抗原含量见表4。

表4甲肝、脊灰、乙肝组合物中抗原含量

实施例23甲肝、脊灰、百白破组合物的制备

将实施例10、11、12中制得的无细胞百日咳、白喉和破伤风抗原混合制成百白破组分I；将实施例2中制得的甲肝抗原原液与实施例4中制得的脊灰抗原原液按一定浓度搅拌混合制成组分II，再将组分I和组分II混合成联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。联合疫苗组合物中各抗原含量见表5。

实施例24含佐剂的甲肝、脊灰、百白破组合物的制备

将实施例23中所述的组分I与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品；将实施例2中所述的甲肝抗原原液和实施例4中所述脊灰抗原原液分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将含佐剂的甲肝抗原和脊灰抗原等体积混合，该混合液与含佐剂的组分I搅拌混合，获得含铝佐剂的联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。联合疫苗组合物中各抗原含量见表5。

表5含甲肝、脊灰、百白破的多价联合疫苗组合物抗原含量

实施例25甲肝、脊灰、hib组合物的制备

将实施例14中制得的b型流感嗜血杆菌结合物抗原作为组分I；将实施例2中制得的甲肝抗原原液与实施例4中制得的脊灰抗原原液按一定浓度搅拌混合制成组分II，再将组分I和组分II混合成联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。联合疫苗组合物中各抗原含量见表6。

实施例26含佐剂的甲肝、脊灰、hib的组合物制备

将实施例25中所述的组分I与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品；将实施例2中所述的甲肝抗原原液和实施例4中所述的脊灰抗原原液分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将含佐剂的甲肝抗原和含佐剂的脊灰抗原等体积混合，该混合液与组分I搅拌混合，获得含铝佐剂的联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。联合疫苗组合物中各抗原含量见表6。

表6含甲肝、脊灰、hib结合物的联合疫苗组合物抗原含量

实施例27甲肝、脊灰、四价脑膜炎抗原组合物的制备

将实施例16中制得的四价脑膜炎抗原（A、C、W135、Y）多糖蛋白缀合物混合作为组分I；将实施例2中制得的甲肝抗原原液与实施例4中制得的脊灰抗原原液按一定浓度搅拌混合制成组分II，再将组分I和组分II混合成联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。联合疫苗组合物中各抗原含量见表7。

实施例28含佐剂的甲肝、脊灰、四价脑膜炎抗原组合物的制备

将实施例27中所述的组分I与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品；将实施例2中所述的甲肝抗原原液和实施例4中所述的脊灰抗原原液分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将含佐剂的甲肝抗原和含佐剂的脊灰抗原等体积混合，该混合液与组分I搅拌混合，获得含铝佐剂的甲肝、脊灰、四价脑膜炎抗原组合物，确定pH值在6-7的范围内。联合疫苗组合物中各抗原含量见表7。

表7含甲肝、脊灰、四价脑膜炎的疫苗组合物的抗原含量

实施例29甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib组合物的制备

将实施例10、11、12中制得的无细胞百日咳、白喉和破伤风抗原混合制成百白破组分I；将实施例2中制得的甲肝抗原原液与实施例4中制得的脊灰抗原原液与实施例6中制得的EV71抗原原液或实施例8中制得的CA16抗原原液与实施例9中制得的乙肝抗原原液按一定浓度搅拌混合制成组分II；将实施例14中制得的hib多糖结合疫苗原液作为组分III，再将组分I、组分II和组分III混合成含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib的疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。含EV71抗原的组合物中各抗原含量见表8，含CA16抗原的组合物的抗原含量如表9所示。

实施例30含佐剂的甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib组合物的制备

将实施例29中所述的组分I和组分III分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品；将实施例2、4中所述的甲肝抗原原液和脊灰抗原原液和实施例6中所述的EV71抗原原液和/或实施例8中所述CA16抗原原液和实施例9中所述的乙肝抗原原液分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将含佐剂的甲肝抗原、脊灰抗原、EV71抗原和/或CA16抗原和乙肝抗原等体积混合，该混合液与组分I和组分III搅拌混合，获得含佐剂的甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib组合物，确定pH值在6-7的范围内。含EV71抗原的组合物中各抗原含量见表8，含CA16抗原的组合物的抗原含量如表9所示。

表8含甲肝、脊灰、EV71、乙肝、百白破、hib的疫苗组合物

表9含甲肝、脊灰、CA16、乙肝、百白破、hib的疫苗组合物

实施例31甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎抗原组合物的制备

将实施例10、11、12中制得的无细胞百日咳、白喉、破伤风抗原混合制成百白破组分I；将实施例2中制得的甲肝抗原原液与实施例4中制得的脊灰抗原原液与实施例6中制得的EV71抗原原液或实施例8中制得的CA16抗原原液和实施例9中制得的乙肝抗原原液按一定浓度搅拌混合制成组分II；将实施例14中制得的hib多糖结合物原液作为组分III；将实施例16中制得的四价脑膜炎抗原多糖结合物原液作为组分IV，再将组分I、组分II、组分III和组分IV混合成含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎抗原的联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎抗原的联合疫苗组合物中各抗原含量见表10、11和12。

实施例32含佐剂的甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎抗原组合物的制备

将实施例31中所述的组分I、组分III和组分IV分别与0.5mg/ml的磷酸铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品；将实施例2中所述的甲肝抗原原液、实施例4中所述的脊灰抗原原液、实施例6中所述的EV71抗原原液或实施例8中所述的CA16抗原原液和实施例9中所述的乙肝抗原原液分别与0.5mg/ml的磷酸铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将上述含佐剂的甲肝抗原、脊灰抗原、EV71抗原和/或CA16抗原和乙肝抗原等体积混合，该混合液与组分I、组分III和组分IV搅拌混合，获得含铝佐剂的甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎抗原联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎抗原的联合疫苗组合物中各抗原含量见表10、11和12。

表10含甲肝、脊灰、EV71、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎抗原的组合物中各抗原含量

含CA16抗原的联合疫苗抗原含量见表11：

表11含甲肝、脊灰、CA16、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎抗原的组合物中各抗原含量

表12含脊灰、甲肝、EV71、CA16、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎的联合疫苗中各抗原含量

实施例33甲肝、脊灰组合物的免疫原性

通过对恒河猴免疫含甲肝和脊灰抗原的联合疫苗或者含结合了佐剂的甲肝和脊灰抗原的联合疫苗来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性。选用恒河猴进行效价实验，同时与灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每组的规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫后28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效价，说明该混合物在恒河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。

通过对SD大鼠免疫含甲肝和脊灰抗原的联合疫苗组合物或者含结合了抗原佐剂的甲肝和脊灰抗原组合物来评估该抗原混合物中脊灰抗原的免疫原性。大鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。选择灭活脊灰疫苗作为对照组，大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价，采用ELISA法检测血清阳转率。中和用病毒选用Sabin I、II和III型，各型的滴度为100CCID50。阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36°C进行7天，并观察细胞病变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III型病毒的中和作用和血清阳转，说明该混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中灭活脊灰疫苗的免疫原性相当。

实施例34甲肝、脊灰、EV71和/或CA16组合物的免疫原性

通过对恒河猴免疫含甲肝抗原、脊灰抗原、EV71和/或CA16抗原的联合疫苗组合物或者含结合了佐剂的甲肝、脊灰抗原、EV71和/或CA16抗原的组合物来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性。选用恒河猴进行效价实验，同时与灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每组的规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫后28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效价和血清阳转，说明该混合物在恒河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。

通过对SD大鼠免疫含甲肝、脊灰抗原、EV71和/或CA16抗原的联合疫苗组合物或者含结合了佐剂的甲肝抗原、脊灰抗原、EV71和/或CA16抗原的组合物来评估该抗原混合物中脊灰抗原、EV71抗原和/或者CA16抗原的免疫原性。大鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。选择灭活脊灰疫苗、灭活EV71疫苗或灭活CA16疫苗作为对照组，大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价和血清阳转。中和用病毒选用SabinI、II和III型、EV71和CA16病毒株，各型的滴度为100CCID50。阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36oC进行7天，并观察细胞病变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III型病毒、EV71病毒、CA16病毒的中和作用和血清阳转，说明该混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中的灭活脊灰疫苗、EV71疫苗和/或CA16疫苗的免疫原性相当。

实施例35甲肝、脊灰、乙肝组合物的免疫原性

通过对恒河猴免疫含甲肝、脊灰、乙肝抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰、乙肝抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性。选用恒河猴进行效价实验，同时与灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每组的规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫后28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效价和血清阳转，说明该混合物在恒河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。

通过对SD大鼠免疫含甲肝、脊灰和乙肝抗原的组合物或者含甲肝、脊灰和乙肝抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中脊灰的免疫原性。大鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。选择灭活脊灰疫苗作为对照组，大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价和血清阳转。中和用病毒选用、Sabin I、II和III型，各型的滴度为100CCID50。阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36°C进行7天，并观察细胞病变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III型病毒的中和作用和血清阳转，说明该抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中灭活的脊灰疫苗的免疫原性相当。

通过对BALB/c小鼠免疫含甲肝、脊灰和乙肝抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰和乙肝抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中乙肝的免疫原性。选择重组乙肝疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫，4-6周后采血，采用ELISA法测定乙肝抗体，计算半数有效剂量ED50。结果显示该抗原混合物符合中国药典上对重组乙肝疫苗效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中重组乙肝疫苗的免疫原性相当。

实施例36甲肝、脊灰、百白破组合物的免疫原性

通过对恒河猴免疫含甲肝、脊灰、百白破抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰、百白破抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性。选用恒河猴进行效价实验，同时与灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每组的规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫后28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效价和血清阳转，说明该混合物在恒河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。

通过对SD大鼠免疫含甲肝、脊灰和百白破抗原的组合物或者含甲肝、脊灰和百白破抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中脊灰的免疫原性。大鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。选择灭活脊灰疫苗作为对照组，大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价和血清阳转。中和用病毒选用Sabin I、II和III型，各型的滴度为100CCID₅₀。阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36°C进行7天，并观察细胞病变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III型病毒的中和作用和血清阳转，说明该抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中灭活脊灰疫苗的免疫原性相当。

通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰和百白破抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰和百白破抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中破伤风和百日咳菌的免疫原性。选择百白破联合疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。小鼠免疫后14-16天进行百日咳菌的攻毒实验，结果显示该抗原混合物符合中国药典上对百日咳菌效价的相关规定。小鼠免疫后4周进行破伤风毒素的攻毒实验，结果显示该抗原混合物符合中国药典上对破伤风疫苗效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中百白破联合疫苗中破伤风和百日咳抗原的免疫原性相当。

通过对250g～350g的豚鼠免疫含甲肝、脊灰和百白破抗原的五价抗原混合物或者含甲肝、脊灰和百白破抗原和氢氧化铝佐剂的五价抗原混合物来评估对抗原混合物中白喉菌的免疫原性。选择百白破联合疫苗作为对照组，豚鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。豚鼠免疫4周后进行白喉毒素的攻毒实验，结果显示该抗原混合物符合中国药典上对白喉疫苗效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中百白破联合疫苗中白喉抗原的免疫原性相当。

实施例37甲肝、脊灰、hib组合物的免疫原性

通过对恒河猴免疫含甲肝、脊灰、hib结合物抗原的组合物或者含甲肝、脊灰、hib结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性。选用恒河猴进行效价实验，同时与灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每组的规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫后28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效价和血清阳转，说明该混合物在恒河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。

通过对SD大鼠免疫含甲肝、脊灰和hib结合物抗原的组合物或者含甲肝、脊灰和hib结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中脊灰的免疫原性。大鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。选择灭活脊灰疫苗作为对照组，大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价和血清阳转。中和用病毒选用Sabin I、II和III型，各型的滴度为100CCID₅₀。阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36°C进行7天，并观察细胞病变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III型病毒的中和作用和血清阳转，说明该抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中灭活脊灰疫苗的免疫原性相当。

通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰和hib结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰和hib结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中b型流感嗜血杆菌的免疫原性。选择hib结合疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫（含10只对照/每组）。抗原混合物按照每次2.5ug多糖的抗原混合物的注射量进行免疫。小鼠首先进行0.85%氯化钠溶液注射，于第1、14天注射两次，与第21～28天经眼眶静脉采血，用ELISA法测定hib的IgG抗体。结果显示该抗原混合物符合中国药典上对hib效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组hib结合疫苗的免疫原性相当。

实施例38甲肝、脊灰、脑膜炎抗原组合物的免疫原性

通过对恒河猴免疫含甲肝、脊灰、脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰、脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性。选用恒河猴进行效价实验，同时与灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每组的规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫后28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效价，说明该混合物在恒河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。

通过对SD大鼠免疫含甲肝、脊灰和脑膜炎结合物抗原的组合物或者含甲肝、脊灰和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中脊灰的免疫原性。选择灭活脊灰疫苗作为对照组，大鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价和血清阳转。中和用病毒选用Sabin I、II和III型，各型的滴度为100CCID₅₀。阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36°C进行7天，并观察细胞病变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III型病毒的中和作用和血清阳转，说明该抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中灭活脊灰疫苗的免疫原性相当。

通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰和脑膜炎结合物抗原的组合物或者含甲肝、脊灰和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中脑膜炎抗原的免疫原性。选择四价脑膜炎结合疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫（含10只对照/每组）。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。小鼠于第1、14天注射两次，与第21～28天经眼眶静脉采血，用ELISA法测定脑膜炎各血清型的IgG抗体。结果显示该抗原混合物符合WHO相关指导文件对各血清型脑膜炎抗原临床前免疫原性的相关规定。此外，选择SD怀孕大鼠按照相同分组原则进行免疫，对乳鼠进行采血测定针对A群脑膜炎的IgG抗体，结果显示该抗原混合物中A群脑膜炎抗原据有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中四价脑膜炎结合疫苗相应血清型的免疫原性相当。

实施例39甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破和hib组合物的免疫原性

通过对恒河猴免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物、脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物、脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性。选用恒河猴进行效价实验，同时与灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每组的规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫后28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效价，说明该混合物在恒河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。

通过对SD大鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中脊灰和EV71抗原和/或者CA16抗原的免疫原性。选择灭活脊灰疫苗和灭活EV71疫苗和/或灭活CA16疫苗作为对照组，大鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价。中和用病毒选用Sabin I、II和III型、EV71病毒株或CA16病毒株，各型的滴度为100CCID₅₀。阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36°C进行7天，并观察细胞病变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III型病毒、EV71病毒、CA16病毒的中和作用，说明该抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中的灭活脊灰疫苗、EV71疫苗、CA16疫苗的免疫原性相当。

通过对BALB/c小鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中乙肝的免疫原性。选择重组乙肝疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫，4-6周后采血，采用ELISA法测定乙肝抗体，计算半数有效剂量ED₅₀。结果显示该抗原混合物符合中国药典上对重组乙肝疫苗效价的相关规定。同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中重组乙肝疫苗的免疫原性相当。

通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中破伤风和百日咳菌的免疫原性。选择百白破联合疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。小鼠免疫后14-16天进行百日咳菌的攻毒实验，结果显示该联合抗原混合物符合中国药典上对百日咳菌效价的相关规定。小鼠免疫后4周进行破伤风毒素的攻毒实验，结果显示该抗原混合物符合中国药典上对破伤风疫苗效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中百白破联合疫苗中破伤风和百日咳抗原的免疫原性相当。

通过对250g～350g的豚鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的组合物或者含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的混合物来评估对抗原混合物中白喉菌的免疫原性。选择百白破联合疫苗作为对照组，豚鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。豚鼠免疫4周后进行白喉毒素的攻毒实验，结果显示该抗原混合物符合中国药典上对白喉疫苗效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中百白破联合疫苗中白喉抗原的免疫原性相当。

通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中b型流感嗜血杆菌的免疫原性。选择hib结合疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫（含10只对照/每组）。抗原混合物按照每次2.5ug多糖的抗原混合物的注射量进行免疫。小鼠首先进行0.85%氯化钠溶液注射，于第1、14天注射两次，与第21～28天经眼眶静脉采血，用ELISA法测定hib的IgG抗体。结果显示该抗原混合物符合中国药典上对hib效价的相关规定。同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中hib结合疫苗的免疫原性相当。

实施例40甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib、脑膜炎抗原组合物的免疫原性

通过对恒河猴免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物、脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物、脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性。选用恒河猴进行效价实验，同时与灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照7只每组的规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫后28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体。结果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效价，说明该混合物在恒河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。

通过对SD大鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中脊灰和EV71抗原和/或者CA16抗原的免疫原性。选择灭活脊灰疫苗和灭活EV71疫苗和/或灭活CA16疫苗作为对照组，大鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价。中和用病毒选用Sabin I、II和III型、EV71病毒株或CA16病毒株，各型的滴度为100CCID₅₀。阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36°C进行7天，并观察细胞病变。结果显示各组大鼠血清均有对sabin I、II和III型病毒、EV71病毒、CA16病毒的中和作用，说明该抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中的灭活脊灰疫苗、EV71疫苗、CA16疫苗的免疫原性相当。

通过对BALB/c小鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中乙肝的免疫原性。选择重组乙肝疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫，4-6周后采血，采用ELISA法测定乙肝抗体，计算半数有效剂量ED₅₀。结果显示该抗原混合物符合中国药典上对重组乙肝疫苗效价的相关规定。同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中重组乙肝疫苗的免疫原性相当。

通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中破伤风和百日咳菌的免疫原性。选择百白破联合疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。小鼠免疫后14-16天进行百日咳菌的攻毒实验，结果显示该联合抗原混合物符合中国药典上对百日咳菌效价的相关规定。小鼠免疫后4周进行破伤风毒素的攻毒实验，结果显示该抗原混合物符合中国药典上对破伤风疫苗效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中百白破联合疫苗中破伤风和百日咳抗原的免疫原性相当。

通过对250g～350g的豚鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的组合物或者含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的混合物来评估对抗原混合物中白喉菌的免疫原性。选择百白破联合疫苗作为对照组，豚鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。豚鼠免疫4周后进行白喉毒素的攻毒实验，结果显示该抗原混合物符合中国药典上对白喉疫苗效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中百白破联合疫苗中白喉抗原的免疫原性相当。

通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中b型流感嗜血杆菌的免疫原性。选择hib结合疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫（含10只对照/每组）。抗原混合物按照每次2.5ug多糖的抗原混合物的注射量进行免疫。小鼠首先进行0.85%氯化钠溶液注射，于第1、14天注射两次，与第21～28天经眼眶静脉采血，用ELISA法测定hib的IgG抗体。结果显示该抗原混合物符合中国药典上对hib效价的相关规定。同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中hib结合疫苗的免疫原性相当。

通过对NIH小鼠免疫含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的九联合疫苗组合物或者含甲肝、脊灰、EV71和/或CA16、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中脑膜炎抗原的免疫原性。选择四价脑膜炎结合疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫（含10只对照/每组）。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。小鼠于第1、14天注射两次，与第21～28天经眼眶静脉采血，用ELISA法测定脑膜炎各血清型的IgG抗体。结果显示该抗原混合物符合WHO相关指导文件对各血清型脑膜炎抗原临床前免疫原性的相关规定。此外，选择SD怀孕大鼠按照相同分组原则进行免疫，对乳鼠进行采血测定针对A群脑膜炎的IgG抗体，结果显示该抗原混合物中A群脑膜炎抗原据有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中四价脑膜炎结合疫苗各血清型的免疫原性相当。

表13含甲肝、脊灰抗原的不同组合物的免疫原性实验结果（血清阳转率%）

注：百日咳和脑膜炎抗原的免疫原性中血清阳转率为各组分的平均值。

组合物1：甲肝+脊灰

组合物2：甲肝+脊灰+乙肝+佐剂

组合物3：甲肝+脊灰+百白破

组合物4：甲肝+脊灰+hib

组合物5：甲肝+脊灰+脑膜炎

组合物6：甲肝+脊灰+EV71+乙肝+百白破+hib+佐剂

组合物7：甲肝+脊灰+EV71+乙肝+百白破+hib+脑膜炎

组合物8：甲肝+脊灰+EV71+CA16+乙肝+百白破+hib+脑膜炎

本发明包含但不限于上述组合物，其它组合物免疫原性实验结果类似，不在此赘述。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种多价免疫原性组合物，其特征在于，所述多价免疫原性组合物包括灭活的甲肝抗原和灭活的脊髓灰质炎病毒。

2.根据权利要求1所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述灭活的脊髓灰质炎病毒来自sabin株，包含sabin I型、sabin II型和sabin III型。

3.根据权利要求1所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物含有灭活的甲肝抗原50-1000U单位/人份，sabin I型抗原1.5-20D单位/人份，sabin II型抗原2-40D单位/人份，sabin III型抗原5-70D单位/人份。

4.根据权利要求3所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物含有灭活的甲肝抗原100-600U单位/人份，sabin I型抗原5-15D单位/人份，sabin II型抗原10-30D单位/人份，sabin III型抗原10-40D单位/人份。

5.根据权利要求1所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述多价免疫原性组合物还含有纯化后的百日咳抗原、白喉类毒素、破伤风类毒素、丝状血细胞凝集素、b型流感嗜血杆菌多糖、脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖、乙肝抗原、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型抗原的一种或两种以上。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，还包含生理学可接受的载体。

7.根据权利要求6所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述多价免疫原性组合物还包含佐剂，所述佐剂为铝盐。

8.根据权利要求7所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述佐剂为氢氧化铝或磷酸铝，优选为氢氧化铝。

9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述多价免疫原性组合物的剂型为喷雾剂、注射剂、冻干剂、胶囊剂、片剂或丸剂。

10.权利要求1-9任意一项所述多价免疫原性组合物在制备预防或治疗甲肝或脊髓灰质炎药物中的应用。