CN106215183A

CN106215183A - 一种abc群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN106215183A
Application number: CN201610579059.XA
Authority: CN
Inventors: 苏桂民; 杜琳; 朱卫华; 冀颖
Original assignee: Beijing Zhifei Lvzhu Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: ANHUI ZHIFEI LONGCOM BIOPHARMACEUTICAL CO., LTD.; Chongqing Zhi Fei biological products Limited by Share Ltd; Beijing Zhifei Lvzhu Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-07-21
Filing date: 2016-07-21
Publication date: 2016-12-14

Abstract

本发明提供一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法，本发明的一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗含有A群和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物，以及B群脑膜炎球菌人H因子结合蛋白(fHBP)A亚族和B亚族两个亚家族的重组蛋白，本发明还提供了重组fHBP‑A和fHBP‑B蛋白的制备方法，本发明的联合疫苗用于2岁以上儿童的免疫，用于预防由A群或B群或C群脑膜炎球菌引起的脑脊髓膜炎、菌血症、肺炎及心包炎等侵袭性疾病，提供对脑膜炎球菌更好、更广泛的保护作用。

Description

一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种疫苗的制备，特别涉及一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法，所述ABC群脑膜炎球菌联合疫苗包括A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、B群脑膜炎球菌人H因子结合蛋白(fHBP)A和B亚族两种重组蛋白混合配制而成的联合疫苗制剂及其制备方法。

背景技术

1流行性脑脊髓膜炎分类及流行情况：

流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)，是由脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitides,NM)感染引起的以脑脊髓膜炎和菌血症为主的呼吸道传染病。目前以婴幼儿发病为主，呈地方性流行、暴发、散发形式，NM引起的侵袭性疾病有脑膜炎、菌血症和肺炎等，病死率约为12％～20％，幸存者中有11％～19％留有后遗症。

脑膜炎奈瑟菌根据荚膜多糖的结构特征分为12个血清群，无法分群的脑膜炎奈瑟菌统称为不可分群菌株(nongroupable,NG)，大多为健康人群携带，较少引起致病。根据外膜蛋白PorB和PorA的特征，脑膜炎球菌进而分为不同的血清型和血清亚型。通过多基因位点序列分型(multi locus sequence typing,MLST)，脑膜炎奈瑟菌可分为不同的序列型(sequence type,ST)，不同的ST菌株聚类为不同的克隆群(clonal complex,cc)。

流脑有95％的病例由A、B、C、Y和W135群引起,而以A、B、C群菌致病更高达90％以上。随着时间的推移和疫苗的应用，流脑流行的优势血清群经常发生变迁，美国经历了由A群至B群，又转至C、Y群的过程，目前Y、B、C群引起的病例约各占1/3；欧洲以C群为主，但目前B群流脑病例已占45～80％；非洲以A群为主，而近年也出现C群、W135群引起的病例。

中国一直以A群Nm引起的流脑为主，B群、C群只引起散发病例。近10年来，中国流脑流行菌群的分布出现了明显变化，自2004～2005年安徽省出现C群流脑的爆发以来，中国流脑病例中C群所占比例逐年增多，C群逐渐成为流脑主要流行菌株。而根据流脑数据监测，近期由B群引起的流脑病例也显著增加，由B群流脑引起婴幼儿死亡的病例时见报道，并且B群菌株呈现ST4821克隆群克隆化趋势。当前我国C群菌株优势菌群为ST-4821cc，因此揭示出，我国ST-4821克隆群C群和B群菌株之间发生了血清群转换。

2流脑疫苗的应用效果：

流脑疫苗的应用对于控制流脑的流行起到关键作用。A群流脑多糖疫苗于1980年研制成功，注射后反应轻微，保护效果>90％；A+C脑膜炎球菌多糖疫苗于2000年研制成功上市，ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗于2006年研制成功上市。

A+C多糖蛋白结合疫苗于2006年研制成功上市，A+C群脑膜炎球菌(结合)b型流感嗜血杆菌(结合)联合疫苗于2014年研发成功上市。

多糖疫苗和多糖蛋白结合疫苗的应用，有效的降低了脑脊髓膜炎的发病率。对A，C，W 135和Y群脑膜炎奈瑟菌起到了预防和治疗作用。

然而，由于B群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖免疫原性弱，加之包含的表位和人体组织的唾液酰基蛋白存在交叉反应，而不能被作为疫苗成份。因此，B群脑膜炎球菌疫苗研发集中在有效的蛋白成份上。

B群外膜蛋白(out membrane protein,OMP)或被称为外膜囊泡疫苗(outmembrane vesicle,OMV)，为目前研制与应用较为广泛的疫苗，主要有古巴单价VA-MENGOC-BC疫苗、新西兰MeNZB^TM疫苗及挪威MenBvac疫苗，研究发现外膜蛋白疫苗诱导的抗体只能针对相应的菌株，鉴于B群流脑遗传学的多样性，因此单价OMV疫苗是不可能保护和抵抗所有不同B群流脑菌株所导致的疾病。

3 B群流脑疫苗的研发方向

目前B群流脑疫苗研发工作最为深入的方向之一即为重组膜蛋白疫苗。脑膜炎球菌基因组学和蛋白质组学的发展，提供了更多的鉴别筛选新疫苗抗原分子的方法和可能。反向疫苗学已经成为一门新的学科，通过采用计算机对细菌基因组进行分析，鉴定筛选出合适的抗原物质，该技术即为基因组挖掘技术。利用该技术已经鉴定筛选出大量的疫苗候选蛋白：基因组衍生的奈瑟菌抗原GNA1870，NadA，及GNA2132等。

GNA1870是一种几乎表达于所有脑膜炎奈瑟菌表面的脂蛋白，分子量约29KD。有科学家采用免疫学方法将其命名为脂蛋白2086(Lipoprotein 2086,LP2086)，该蛋白能够结合人H因子而下调补体激活途径从而使细菌在人体血液内存活，因此该蛋白名称更改为fHBP，即H因子结合蛋白(factor H-binding prorein,fHBP)，从而反映其逃避宿主防御机制的这个重要功能。

fHBP分为两个亚家族，A亚族和B亚族，基于聚类比对分析，fHBP蛋白系统发生树表明，B亚族约占分离株的70％，A亚族约占30％。fHBP的氨基酸序列较保守，同一亚族内91.6％～100％氨基酸相同，不同亚族最低为62.8％。重组fHBP免疫产生的抗体可引起对同一类亚族的补体介导的杀菌作用，并能诱导对感染乳鼠模型的被动保护，但对不同类亚族的菌株不具有杀菌力。

fHBP重组蛋白具有良好的免疫原性，能诱导机体产生高水平的杀菌抗体，且对顺序变异不敏感，其结构和保护性抗原表位可进行组合，因此完全具备作为候选疫苗免疫原性蛋白质的特征。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脑膜炎球菌联合疫苗，即ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，以减少接种针次，扩大免疫覆盖范围，提供更广泛的预防脑膜炎球菌的保护作用。

本发明的另一目的在于提供ABC群脑膜炎球菌联合疫苗的制备方法。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，所述的联合疫苗包括：A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、以及B群脑膜炎球菌fHBP-A重组蛋白和fHBP-B重组蛋白，其中A群和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的含量，以多糖含量计分别为1-10μg/剂；重组蛋白fHBP-A和fHBP-B含量分别为20-40μg/剂，其中任选还包括生物制品用冻干保护剂或佐剂。

优选的，其中A群和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的含量，以多糖含量计分别为4-6μg/剂；重组蛋白fHBP-A和fHBP-B含量分别为25-35μg/剂，疫苗的pH为6.4-7.4；铝含量为0.4-0.6mg/ml。

本发明的A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖可通过以下方法制备获得：

A群脑膜炎球菌采用CMCC 29201(A4)菌株，C群脑膜炎球菌采用CMCC 29205(C11)菌株，脑膜炎球菌经发酵培养后，采用沙培离心机、碟片式离心机或其他大容量离心机分离培养液，收集离心上清；将离心上清以100KD膜包超滤浓缩，采用25-80％的乙醇进行分级沉淀，收集沉淀并用无水乙醇及丙酮分别洗涤，得到粗制多糖；灭菌注射用水溶解多糖并经脱氧胆酸钠处理后，采用GE填料Capto adhere和Capto DEAE或其他厂家相同功能性质的离子交换填料，以串联层析或分步层析的方法进行粗糖精制，收集流穿峰，采用GE SephadexG25Coarse对流穿峰进行脱盐，或30KD超滤浓缩去除盐类等小分子，乙醇沉淀或冻干回收多糖。

荚膜多糖残余核酸和蛋白质含量均要求不高于10mg/g，本研究中不高于5mg/g，最佳为不高于2mg/g。

本发明的多糖蛋白结合物，是由A群脑膜炎球菌多糖、C群脑膜炎球菌多糖和载体蛋白结合得到的，其中所述载体蛋白选自：破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)或白喉无毒变异株(CRM197)中的任意一种。其制备方法以TT为例，选用破伤风梭状芽孢杆菌CMCC64008株，发酵培养物经碟片式离心机、沙培离心机或其他大容量离心机离心收集上清，经硫酸铵沉淀，柱层析，超滤等方法进行蛋白纯化，采用甲醛或戊二醛等脱毒，脱毒完全后制备成TT原液。脱毒过程需要进行脱毒检查，原液需要进行特异性毒性检查及毒性逆转检查。

本发明的A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物可通过以下方法制备获得：

采用本行业常用的方法，即胺还原法或溴化氰活化法制备多糖蛋白结合物。

胺还原法为多糖经高碘酸钠避光氧化，再加己二酰肼(ADH)和硼氰化钠制备多糖衍生物，采用超滤方法将ADH和硼氰化钠等去除，然后加入TT或DT或CRM197等载体蛋白，在碳二亚胺(EDAC)作用下，形成多糖蛋白结合物。

溴化氰活化法为将A/C群脑膜炎球菌多糖经溴化氰(CNBr)活化，在活化的糖链上连接上己二酰肼，采用超滤的方法将溴化氰、游离的己二酰肼去除，然后加入TT或DT或CRM197等载体蛋白，在碳二亚胺的连接作用下，多糖蛋白结合形成多糖蛋白复合物。

多糖蛋白结合物采用GE Sepharose 4FF或Sepharose 6B或其他厂家相似功能的分子筛填料纯化，收集V₀处洗脱峰，经30KD膜包超滤浓缩制备成多糖蛋白结合物原液。

游离多糖含量应不高于20％，本研究中应不高于10％，最佳为不高于5％。

游离蛋白含量应不高于5％，本研究中应不高于3％，最佳为不高于1％。

本发明的B群脑膜炎球菌重组fHBP蛋白fHBP-A重组蛋白和fHBP-B重组蛋白可通过以下方法制备获得：

重组B群fHBP-A的制备方法，方法如下：根据fHBP-A的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列，将目的基因片段fhbp-A和质粒pET43.1a以T4 ligase连接，连接产物转化转化E.coli BL21(DE3)，得到fHBP-A/BL21(DE3)菌株(该菌株已经保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12609，保藏日期2016年06月14日，分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，将菌种培养扩增得到菌体，经过蛋白提取、蛋白纯化得到重组蛋白。

重组B群fHBP-B的制备方法，方法如下：根据fHBP-B的氨基酸序列设计并合成全长DNA序列，将目的基因fhbp-B和pET43.1a以T4 ligase连接，转化E.coli BL21(DE3)，得到fHBP-B/BL21(DE3)表达菌株，(该菌株已经保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12610，保藏日期2016年06月14日，分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，将菌种培养扩增得到菌体，经过蛋白提取、蛋白纯化得到重组蛋白。

优选的制备方法如下：

工程菌的构建：

fHBP蛋白分为A、B两个亚家族，分别筛选fHBP-A、fHBP-B特异亚族氨基酸序列，根据大肠杆菌密码子偏爱性设计并合成基因，质粒选择为pBR322、pSC101、pET32a或pET43.1a等，抗性基因可以采用卡那霉素、四环素或氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)等，采用限制性内切酶Hind III、Bam HI、NdeI、XhoI等处理基因合成产物和质粒，并以T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，测序验证DNA序列完全正确后，提取阳性克隆质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含抗生素的培养基上培养，挑取单克隆培养后，经电泳或质谱或氨基酸序列测定等方法鉴定后，确定为fHBP蛋白表达，并将工程菌株按药典要求制备成种子库。

本发明中质粒最佳选择为pET43.1a，抗性基因最佳选择为氨苄青霉素，限制性内切酶最佳选择为NdeI、XhoI。

工程菌的发酵培养与诱导表达：

取工程菌株工作种子库菌种，划种LB琼脂培养基(含Amp)，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种至LB液体培养基(含Amp)中，并以1-2％的接种比例逐步扩大至发酵罐发酵培养，待OD600达到16-20时，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养4-8小时，停止培养，离心收集上清。

重组蛋白的提取纯化：

将发酵培养收获的细菌离心，收集菌体，采用超声破碎、高压均质破碎或渗透冲击等方法将细菌菌体破碎，离心收集上清液，经过硫酸铵分级沉淀，酒精分步沉淀提取蛋白，再采用阴离子交换或疏水层析及分子筛等进行精细纯化，去除脂多糖、核酸及其他大肠杆菌杂蛋白，得到纯度大于95％的重组fHBP蛋白原液。

细菌内毒素不高于20EU/ml，本研究应不高于10EU/ml，最佳不高于5EU/ml。

本发明的ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，其制备方法如下：

本联合疫苗不仅仅是将单一的组份物理的合并在一起，而是通过大量的实验使得疫苗联合为疫苗组分混合物，从而使各组份在免疫机理上有协同促进作用，具体的方法为：

将A群、C群多糖蛋白结合物及相应剂量的fHBP(A and B)，采用乳糖、明胶、蔗糖或人血白蛋白等保护剂成份制备成冻干制剂，以西林瓶分装冻干；稀释剂为无菌、无热原的注射用水、生理盐水或PBS等，以预填充注射器或西林瓶分装。

或者

将相应剂量的A群、C群多糖蛋白结合物及fHBP(A and B)，采用氢氧化铝、磷酸铝等佐剂制备成吸附疫苗，以预填充注射器或西林瓶分装。

或者

将A群、C群多糖蛋白结合物以0.5ml的剂量制备成冻干粉剂，以西林瓶分装冻干；将B群fHBP蛋白疫苗制备成铝佐剂吸附的水剂疫苗，以预填充注射器分装。接种使用时，以B群fHBP蛋白疫苗成份作为稀释剂将AC群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗稀释混匀，从而配制成联合疫苗注射至体内。其中，所述A群、C群多糖蛋白结合物以0.5ml的剂量制备成冻干粉剂，方法如下：采用乳糖、明胶、蔗糖或人血白蛋白等保护剂成份制备成冻干制剂，以中硼或高硼硅西林瓶分装冻干，稀释剂为无菌、无热原的注射用水、生理盐水或PBS等；或者采用氢氧化铝、磷酸铝等佐剂制备成吸附疫苗，以预填充注射器分装。按以上配制方式任选一种，配制成最终含有A群多糖为1-10μg/剂，C群多糖为1-10μg/剂的疫苗制剂。其中所述将B群fHBP蛋白疫苗制备成铝佐剂吸附的水剂疫苗，方法如下：将重组fHBP蛋白原液，以磷酸铝或氢氧化铝或其他相应佐剂进行吸附，采用生理盐水或磷酸盐缓冲液或其他稀释剂稀释配制，以预填充注射器或西林瓶分装。或者采用乳糖、明胶、蔗糖或人血白蛋白等保护剂成份制备成冻干制剂，以西林瓶分装冻干；稀释剂为无菌、无热原的注射用水、生理盐水或PBS等，以预填充注射器或西林瓶分装。按以上任一疫苗配制方式，每个亚族分别稀释配制成20-40μg/剂，最佳剂量为30μg/剂。

按以上任一种疫苗配制方式，每剂配制成终浓度含有A群多糖为1-10μg/剂，C群多糖为1-10μg/剂，fHBP-A和fHBP-B各20-40μg/剂的疫苗制剂。

本发明的优点是，针对B群脑膜炎球菌荚膜多糖成份不适合用作疫苗，利用反向遗传学的技术，表达B群脑膜炎球菌人H因子结合蛋白(fHBP)重组抗原，该蛋白抗原含有A亚族和B亚族两个亚族的重组蛋白，完全覆盖了B群脑膜炎球菌所有菌株，对B群脑膜炎球菌感染起到有效的预防作用；同时添加A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物，制备成ABC联合疫苗，使得本疫苗能够预防由ABC三个血清群引起的脑膜炎球菌侵袭性疾病。多联多价疫苗，能够减少接种针次，以减轻儿童的接种痛苦，而且多联疫苗各抗原组分能够起到相互促进的协同增效作用，从而提供更为广泛的疫苗保护效果。

附图说明

图1为fhbp-A基因与pET43.1a经NdeI和XhoI酶切后的DNA电泳图。

图2为fhbp-A基因与pET43.1a连接后的酶切电泳图。

图3为fHBP-A蛋白表达条带。

图4为fHBP-A蛋白纯度的测定。

图5为fHBP-A和fHBP-B蛋白特异性的测定。

图6为fhbp-B基因的PCR产物。

图7为fhbp-B基因与pET43.1a经NdeI和XhoI酶切后的DNA电泳图。

图8为fhbp-B阳性克隆的PCR鉴定。

图9为含有fhbp-B基因的质粒pET43.1a酶切电泳图。

图10为fHBP-B蛋白表达条带。

图11为fHBP-B蛋白纯度的测定。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。

实施例1A群、C群多糖的制备：

A群、C群脑膜炎球菌发酵后，碟片式离心机离心收集上清液，加入终浓度为0.15％的十六烷基三甲基溴化铵沉淀多糖，离心收集多糖沉淀，以终浓度为0.5mol/L的氯化钙溶解沉淀，并以终浓度为25％的乙醇沉淀去除核酸，离心收集上清液，以终浓度为75％的冷乙醇沉淀多糖。将多糖溶解并以1-3％的脱氧胆酸钠处理后，采用GE Capto adhere和CaptoDEAE两种凝胶介质串联的层析方法，收集流穿峰，将流穿峰以30KD膜包超滤或经GESephadex G25Coarse脱盐柱进行脱盐去除杂质及盐类小分子等成分，再用75％的乙醇将多糖沉淀，经无水乙醇和丙酮洗涤后得到精制多糖。

实施例2载体蛋白TT的制备：

发酵培养物经碟片式离心机离心收集上清液，经0.5％甲醛脱毒后，30KD超滤去除杂质成份，30％硫酸铵沉淀TT，Sephacryl S-300HR凝胶过滤层析，收集TT蛋白单体峰，30KD超滤浓缩制备成TT原液。脱毒过程需要进行脱毒检查，原液需要进行特异性毒性检查及毒性逆转检查。

实施例3多糖蛋白结合物的制备(以溴化氰活化法为例)：

3.1多糖活化：

将多糖溶解至5-15mg/ml，调节pH值至10.8左右，在多糖溶液中加入1/10(g/g) 的溴化氰，室温、维持pH值10.8的碱性环境下活化多糖8min。

3.2多糖衍生：

按1：1(与活化多糖的体积比)的比例加入0.5mol/L的已二酰肼，室温反应50-70min。30KD膜包超滤去除溴化氰及已二酰肼，得到多糖衍生物。

3.3多糖蛋白结合：

将多糖衍生物与载体蛋白TT以1：1(g/g)的比例混合并搅拌，按碳二亚胺：多糖＝1：10的比例加入碳二亚胺，室温、酸性环境(pH5.6)下反应60min。经100KD超滤膜包超滤去除杂质，并浓缩。

实施例4多糖蛋白结合物原液的制备

4.1多糖蛋白结合物纯化：

采用GE Sepharose 4FF进行凝胶层析纯化，收集V₀附近的洗脱液。

4.2多糖蛋白结合物原液

分别将A群、C群多糖蛋白结合物纯化液，经30KD膜包超滤浓缩，0.22μm除菌过滤后得到A群、C群多糖蛋白结合物原液。

实施例5、fHBP-A的制备：

5.1 fHBP-A工程菌株的构建：

根据fHBP-A的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列(fhbp-A，为基因合成质粒)，以限制性内切酶NdeI和XhoI处理基因合成质粒和pET43.1a，得到酶切处理后的目的基因片段和质粒pET43.1a，如图1。

将处理后的目的基因片段fhbp-A和质粒pET43.1a以T4ligase连接，连接产物转化E.coli DH5α，37℃过夜培养。挑取阳性克隆接种LB液体培养基，37℃振荡培养过夜。离心收集菌体并抽提质粒，以限制性内切酶NdeI和XhoI酶切鉴定，鉴定结果如图2显示，经NdeI+XhoI处理后，获得的基因片段为约5300bp的pET43.1a和约800bp左右的fhbp-A。将目的基因测序，结果显示质粒pET43.1a的外源基因片段DNA序列(fhbp-A)完全正确。

将质粒转化E.coli BL21(DE3)，37℃过夜培养(含100μg/ml氨苄青霉素)，得到fHBP-A/BL21(DE3)表达菌株，挑取单个克隆，37℃振荡培养至细菌密度至OD₆₀₀约0.5～1.0时，加入终浓度0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃振荡诱导培养2-6小时，经SDS-PAGE鉴定，结果如图3显示，fHBP-A/BL21(DE3)诱导后有明显的表达条带，分子量为28.5KD。将表达蛋白条带经质谱鉴定为fHBP-A蛋白，表达正确。将工程菌种按《中国药典三部2015版》进行种子库的建立，fHBP-A/BL21(DE3)保藏编号为CGMCC NO.12609。

5.2 fHBP-A工程菌的发酵

将菌种接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养12小时。以1％比例扩大接种至发酵罐，37℃、200rpm培养3-6小时后，OD600至16～20，IPTG(0.5mM)诱导4小时。大容量离心机离心收集菌体。

5.3 fHBP-A重组蛋白的提取纯化

菌体破碎：取菌体加入破菌缓冲液(20m M PB，2mM EDTA，pH7.5)，高压(800-1000bar)均质破菌二遍后，离心(10000rpm，60min，8℃)取上清。

蛋白提取：采用30-60％硫酸铵分级沉淀，20mM PB PH7.5溶解，30KD超滤并浓缩至原体积的1/5-1/3。

蛋白纯化：采用Sepharose QFF，平衡液：20mM PB PH7.5，洗脱液：20mM PB+1MNaCl PH7.5，洗脱方法：0-100％梯度洗脱，收集10％洗脱峰。

5.4 fHBP-A重组蛋白原液制备：

取10％梯度洗脱液30KD超滤膜包超滤浓缩，经GE Sepharose 4FF层析，收集V₀处蛋白峰，以0.15mol/L氯化钠、10KD超滤5次以上，并浓缩至蛋白含量为1-2mg/ml，0.22μm除菌过滤。经无菌检查、蛋白含量检查、分子量和纯度检查、蛋白特异性检查、细菌内毒素检查合格后，即为fHBP-A蛋白原液。

分子量与纯度检查：采用12％的分离胶进行SDS-PAGE，并以未转化的大肠杆菌BL21(DE3)为对照，以Gel Doc^TM XR+凝胶成像仪进行凝胶扫描，以Image Lab软件计算分子量及纯度分析，结果如图4所示，分子量为28.3KD，纯度为97.9％。

蛋白特异性检查Western Blot：样品和未转化的大肠杆菌BL21(DE3)经SDS-PAGE后，转印至PVDF膜上，以脱脂奶粉封闭后结合兔抗fHBP特异性抗体，室温孵育1小时，以PBST洗涤5次，结合羊抗兔二抗，室温孵育1小时，以PBST洗涤5次，DAB显色。结果如图5显示，fHBP-A在28KD左右显现特异性蛋白带，而未转化大肠杆菌则无特异性蛋白带显现。

实施例6 fHBP-B的制备：

6.1 fHBP-B工程菌的构建：

根据fHBP-B的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列(fhbp-B)，以合成得到的fhbp-B序列为模板，设计fhbp-B-U1和fhbp-B-D1为引物，引物序列如下：

fhbp-B-U1:5’TTAAATTTCATATGTGCAGCTCGGGCGGCGGCGGTAGCGG 3’(NdeI)

fhbp-B-D1:5’GCCCCTCGAGCTATTACTGTTTTGCCGCCAGA 3’(XhoI)

PCR扩增得到fhbp-B基因，如图6所示。回收fhbp-B的PCR产物(约800bp)，以限制性内切酶NdeI和XhoI酶切处理PCR产物和pET43.1a，电泳如图7所示。

将酶切处理后PCR产物(目的基因fhbp-B)和pET43.1a以T4ligase连接，连接产物转化E.coli DH5α，37℃过夜培养。挑取单克隆菌落进行PCR鉴定，结如图8所示。挑取阳性克隆接种LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，抽提质粒。以限制性内切酶NdeI和XhoI鉴定，酶切鉴定如图9所示。通过NdeI+XhoI处理后可获得约5300bp的pET43.1片段和约800bp左右的fhbp-B片段。将目的基因测序，结果显示质粒pET43.1a的外源基因片段DNA序列完全正确。

将质粒转化E.coli BL21(DE3)，37℃过夜培养(含100μg/ml氨苄青霉素)，得到fHBP-B/BL21(DE3)表达菌，挑取单克隆，37℃振荡培养至菌密度达OD₆₀₀约0.5～1.0，加入终浓度0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃振荡诱导培养2-6小时，经SDS-PAGE鉴定，结果如图10显示，fHBP-B/BL21(DE3)诱导后有明显的表达条带，分子量为28.8KD。经质谱鉴定为fHBP-B蛋白。将工程菌种按《中国药典三部2015版》进行种子库的建立，fHBP-B/BL21(DE3)保藏编号为CGMCC NO.12610。

6.2 fHBP-B工程菌的发酵

将菌种接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养12小时，以1％接种比例扩大接种至发酵罐培养，37℃、200rpm培养3-6小时后，OD600至16～20，IPTG(0.5mM)诱导4小时。大容量离心机离心收集菌体。

6.3 fHBP-B重组蛋白的提取纯化

菌体破碎：取菌体加入破菌缓冲液(50m M PB，2mM EDTA，pH7.5)，高压(800-1000bar)均质破菌二遍后，离心(10000rpm，60min，8℃)取上清。

蛋白提取：采用30-60％硫酸铵分级沉淀，50mM PB PH7.5溶解，30KD超滤5次，并浓缩至原体积的1/5-1/3。

蛋白纯化：采用Sepharose QFF层析，平衡液：50mM PB PH7.2，洗脱液：50mM PB+1MNaCl PH7.2。洗脱方法：0-100％梯度洗脱，收集10％的洗脱液。

6.4 fHBP-B重组蛋白原液制备：

取10％梯度洗脱液经30KD超滤膜包超滤浓缩，采用Sepharose 4FF凝胶过滤层析，收集V₀处蛋白峰，以0.15mol/L氯化钠、10KD超滤5次以上，并浓缩至蛋白含量为1-2mg/ml，0.22μm除菌过滤。经无菌检查、蛋白含量检查、分子量和纯度检查、蛋白特异性检查、细菌内毒素检查即为fHBP-B蛋白原液。

分子量与纯度检查：检测方法同fHBP-A的方法，结果如图11所示，分子量为28.5KD，纯度为96.7％。

蛋白特异性检查(Western Blot)：检测方法同fHBP-A的方法，结果如图5所示。

实施例7、联合疫苗的配制：

7.1两价fHBP蛋白疫苗的配制

将重组B群fHBP蛋白A和B，分别以磷酸铝佐剂搅拌吸附，4℃过夜。以0.15mol/L氯化钠稀释配制，至fHBP-A、fHBP-B终浓度分别为240μg/ml，铝含量终浓度为0.45-0.6mg/ml。

7.2 A、C群多糖蛋白结合疫苗的配制：

将A群、C群多糖蛋白结合物原液，以多糖含量A：C＝1：1的比例混合后，采用磷酸铝佐剂搅拌吸附，以0.15mol/L氯化钠稀释配制，至A群、C群多糖蛋白结合物以多糖含量计终浓度分别为20μg/ml，铝含量终浓度为0.45-0.6mg/ml。

7.3将磷酸铝佐剂吸附配制后的fHBP-A、fHBP-B、A群、C群多糖蛋白结合物按1：1:2比例混合,搅拌均匀，以预填充注射器分装，0.5ml/支，2-8℃保存。

本实施例中，联合疫苗各抗原组份为，A群、C群多糖含量分别为5μg/剂，fHBP-A、fHBP-B蛋白含量分别为30μg/剂。

实施例8联合疫苗的免疫原性及疫苗相融性研究

8.1免疫：

免疫剂型为：单价疫苗成份和联合疫苗的冻干剂型、铝佐剂吸附剂型及生理盐水液体剂型，各疫苗成份剂量相同。

小鼠免疫：分别皮下免疫6周龄SPF级NIH小鼠10只，免疫剂量为0.2ml/只，免疫程序为0，2，4周，免疫结束后2周采血，离心收集血清；另设10只小鼠对照，相同方法注射生理盐水。

8.2 A、C群血清特异性抗体滴度的检测：

A、C群血清特异性抗体滴度的检测采用间接ELISA法。采用A群多糖(C群多糖)与牛血清白蛋白的多糖蛋白结合物，分别以适宜剂量包被酶标板，37℃孵育过夜，洗板后加入系列稀释的待测小鼠血清，37℃孵育后洗板，加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗显色，酶标仪测定，读取492nm(630nm为参比波长)吸光度值(A值)。阴性对照组血清A均值+3倍的标准偏差为Cutoff值，待测血清A值大于Cutoff值判为阳性，以A值大于Cutoff值的最大稀释度计算各型别小鼠的几何平均滴度，即为小鼠血清IgG抗体效价。

表1不同剂型及组份免疫小鼠的血清抗体几何平均滴度(A多糖包被)

表2不同剂型及组份免疫小鼠的血清抗体几何平均滴度(C多糖包被)

8.3重组B流脑疫苗的免疫效果评价，采用两种方法：一为全菌体包被测定全细胞ELISA，另一为流行株的杀菌力实验。

8.3.1全菌体ELISA

全菌体包被选择B群菌株CMCC29356，或CMCC29361，将该菌株扩大培养增殖后，刮取细菌菌苔，以生理盐水溶解，甲醛杀菌后，稀释为2×10⁸个/ml，以此浓度包被96孔酶标板，100ul/孔，4℃包被过夜，洗板后，进行检测。

表3 CMCC29356全细胞ELISA

表4 CMCC29361全细胞ELISA

8.3.2流行株的杀菌力实验：

采用菌株440902或者341215，两株菌株均为ST4821序列型，同属ST4821序列群。

靶菌的制备：培养流行性脑膜炎球菌440902菌株，在8-12％羊血琼脂平板上，37℃6-10％二氧化碳培养16-18小时，刮取菌苔至生理盐水中，细菌比浊法计数，根据计数，将靶菌稀释至1×10⁶。

将待检血清中加入补体，并设灭活补体、补体对照，倍比稀释至96孔培养板上，并滴加10ul靶菌。混匀于37℃培养2-4小时。

点样：将培养后的混合菌液，以10ul的量滴加至固体琼脂培养基上，37℃培养过夜。

显色：将含有150-300ug/ml的TTC的软琼脂覆盖在固体琼脂上，适宜温度显色。

计数：采用图像扫描技术，分析并计算细菌菌落个数，以杀菌力结果计算软件计算出杀菌滴度。

结果：BC₅₀titer

表5 B群流行株440902株杀菌力实验:BC₅₀titer(1：)

备注：杀菌力实验以大于1：8为具有保护性。

Claims

1.一种ABC群脑膜炎球菌联合疫苗，其特征在于，所述疫苗含有：A群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、以及B群脑膜炎球菌fHBP-A重组蛋白和fHBP-B重组蛋白，其中A群和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的含量，以多糖含量计分别为1-10μg/剂；重组蛋白fHBP-A和fHBP-B含量分别为20-40μg/剂，其中任选还包括生物制品用冻干保护剂或佐剂。

2.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，其中A群和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的含量，以多糖含量计分别为4-6μg/剂；重组蛋白fHBP-A和fHBP-B含量分别为25-35μg/剂，疫苗的pH为6.4-7.4；铝含量为0.4-0.6mg/ml。

3.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述的A群和C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物，为荚膜多糖与破伤风类毒素，白喉类毒素，或白喉无毒变异株结合的多糖蛋白结合物。

4.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，为供皮下或肌肉注射的冻干或液体制剂。

5.根据权利要求4所述的联合疫苗，其特征在于，所述疫苗为冻干剂型，采用乳糖、明胶、蔗糖或人血白蛋白等保护剂成份制备成冻干制剂，以西林瓶分装冻干；稀释剂为无菌、无热原的注射用水、生理盐水或PBS等，以预填充注射器或西林瓶分装。

6.根据权利要求4所述的联合疫苗，其特征在于，所述疫苗为液体剂型，采用氢氧化铝、磷酸铝或其他铝佐剂等制备成铝吸附液体疫苗，以西林瓶或预填充注射器分装。

7.根据权利要求5所述的联合疫苗，其特征在于，所述疫苗为A、C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物制备成冻干剂型，重组B群fHBP-A和fHBP-B由铝佐剂配制成液体剂型，使用前以液体制剂稀释冻干疫苗制剂，混匀后注射至体内。

8.权利要求1所述联合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)A群、C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的制备；

(2)fHBP-A和fHBP-B两个亚族重组蛋白的制备；

(3)将获得的A群、C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物、fHBP-A和fHBP-B重组蛋白，按比例稀释配制后，采用冻干或吸附的方式配制成脑膜炎球菌联合疫苗。

9.重组B群fHBP-A的制备方法，其特征在于，

根据fHBP-A的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列，将目的基因片段fhbp-A和质粒pET43.1a以T4ligase连接，连接产物转化转化E.coli BL21(DE3)，得到fHBP-A/BL21(DE3)菌株，将菌种培养扩增得到菌体，经过蛋白提取、蛋白纯化得到重组蛋白。

10.重组B群fHBP-B的制备方法，其特征在于，

根据fHBP-B的氨基酸序列设计并合成全长DNA序列，将目的基因fhbp-B和pET43.1a以T4ligase连接，转化E.coli BL21(DE3)，得到fHBP-B/BL21(DE3)表达菌，将菌种培养扩增得到菌体，经过蛋白提取、蛋白纯化得到重组蛋白。