CN106109486A - 一种组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种组合物及其制备方法与应用，属于生物制品制备技术领域。本发明的组合物含有多价肺炎链球菌荚膜多糖缀合物与HIB多糖蛋白缀合物，其中，多价肺炎链球菌是指血清型为1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的肺炎链球菌。本发明的组合物能诱导机体产生体液免疫，对由上述13种常见血清型肺炎链球菌及B型流感嗜血杆菌引起的感染性疾病能产生较好的保护效果，且免疫覆盖率广，利于该组合物制备得到的联合疫苗其效果优于市面上已有的各类肺炎链球菌多糖疫苗和结合疫苗，具有良好的市场价值。

Description

一种组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物制品制备技术领域，具体地说，涉及一种含有多价肺炎链球菌荚膜多糖缀合物和B型嗜血杆菌多糖蛋白缀合物的组合物及其制备方法与应用。

背景技术

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，简称肺炎球菌(pneumococcus)，该菌为革兰染色阳性，成双或成短链状排列的双球菌，有毒株在其菌体外形成荚膜多糖。肺炎球菌是细菌感染性疾病的主要病原菌之一，可引起肺炎、脑膜炎、败血症、中耳炎等疾病，5％～10％健康成年人以及20％～40％儿童的鼻咽等呼吸道中携带此菌，有毒株是引起人类疾病的重要病原菌。据联合国统计，每年有超过一百万两岁以下儿童死于肺炎球菌引起的疾病。在我国，由肺炎球菌引起的菌血症的死亡率约为25％～29％。3类人群特别容易受到侵袭：65岁以上的人群，5岁以下儿童，特别是2岁以下的幼童，高危族，如长期病患者等。当前由于肺炎球菌对抗菌药物的抗药性增加，以及抗药菌株在世界范围的传播，因此除使用疫苗预防外，尚无其他有效的公共干预措施。已经发现的肺炎链球菌有90多个血清型，肺炎球菌多糖抗原是非T细胞依赖性抗原，初次免疫能诱导产生保护水平的抗体，再次免疫不能诱导产生免疫记忆；并且该疫苗对2岁以下的儿童不能引起有效的保护性抗体应答，而该年龄段人群是肺炎球菌感染的高危人群。

1880年美国Steinberg和法国Pasteur最先分离出肺炎球菌，并于1882年的实验中指出通过疫苗预防肺炎球菌感染的可能性。1914年，全菌体疫苗首次得以使用，但因副反应强、效果差，其安全性和有效性受到广泛质疑，之后逐渐被淘汰。1927年，Sehiemann等证明了肺炎球菌荚膜多糖对人的免疫原性，并开始了对肺炎球菌多糖疫苗的研究。23价肺炎球菌多糖疫苗虽然(如)可以对85％的55岁以上的人群提供长达五年的保护，由于上述血清型组合主要针对欧美发达国家流行情况而设计，对亚洲特有的血清型缺乏保护。此外，由于23价多糖疫苗只是多糖的组合物，在免疫系统发育不完善的婴幼儿体内不能起到良好的保护效果，因此，将适合亚洲人群的多糖分别缀合至载体蛋白上，激起婴幼儿良好的免疫应答保护婴幼儿免受肺炎球菌的侵害成为了亟待解决的问题。

HIB(B型流感嗜血杆菌)是儿童鼻咽部常见的共生细菌，可引起儿童肺炎和脑膜炎，在尚未开展大规模HIB疫苗接种的地区，HIB疾病是一个主要的公共卫生问题。每年至少有300万严重病例发生，约38.6万死亡。HIB发病与死亡多见于发展中国家，疾病负担在4-18月龄儿童最为严重，但小于3月龄和大于5岁儿童也偶有发病。在未免疫人群，HIB是1岁以内儿童非流行性细菌性脑膜炎的主要病因。即便及时给予足量的抗生素治疗，3-20％的Hib脑膜炎患者仍会死亡。

对HIB感染最有效的预防措施是肌肉注射HIB偶联菌苗，可大大降低肺炎及脑膜炎的发病几率。HIB荚膜多糖虽然有一定的免疫原性，但由于儿童免疫系统发育不健全，对多糖的免疫应答较弱，因此，需将HIB荚膜多糖与载体蛋白进行缀合后免疫，激发婴幼儿体内的TD免疫途径，以增强婴幼儿对多糖的免疫应答。

多价肺炎结合疫苗与HIB结合疫苗同作为针对婴幼儿免疫的疫苗，有广泛的受种人群，且接种群的年龄较相似。该两种疫苗均为多剂免疫，受种人群需要多次接种，费时费力。因此，亟待需要一种联合疫苗，在不降低二者免疫效果的同时节省受种次数，节约时间和人力资源。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有多价肺炎链球菌荚膜多糖缀合物和B型嗜血杆菌多糖蛋白缀合物的组合物及其制备方法与应用。

本发明的另一目的是提供一种含有上述组合物的疫苗。

为了实现本发明目的，本发明的多价肺炎球菌荚膜多糖缀合物是由13种不同血清型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)荚膜多糖和载体蛋白缀合形成的缀合物；其中，所述13种不同血清型为1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。

进一步地，所述肺炎链球菌荚膜多糖与载体蛋白质的质量比为1:2-2:1，各血清型肺炎链球菌荚膜多糖的等质量混合。

本发明组合物中各血清型肺炎链球菌荚膜多糖的含量为2-10μg/ml，B型流感嗜血杆菌多糖含量为5-30μg/ml。

优选地，组合物中各血清型肺炎链球菌荚膜多糖的含量为4-8μg/ml，B型流感嗜血杆菌多糖含量为10-20μg/ml。

更优选地，组合物中各血清型肺炎链球菌荚膜多糖的含量为4μg/ml，B型流感嗜血杆菌多糖含量为10μg/ml。

其中，本发明的13价肺炎链球菌荚膜多糖缀合物中各血清型多糖的标准物质可购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)。

前述多价肺炎球菌荚膜多糖缀合物的组合物中，还含有赋形剂，所述赋形剂为氯化钠和磷酸盐缓冲剂等。

本发明还提供一种制备上述组合物的方法，包括步骤：

(1)分别对13种不同血清型肺炎链球菌的荚膜多糖进行分离纯化，然后将各血清型荚膜多糖分别与载体蛋白质进行缀合，形成缀合物，最后将各型单价缀合物混合，得到多价肺炎链球菌荚膜多糖缀合物；

(2)B型流感嗜血杆菌多糖蛋白分离纯化，与载体蛋白缀合，形成B型流感嗜血杆菌多糖蛋白缀合物；

(3)将多价肺炎链球菌荚膜多糖缀合物与B型流感嗜血杆菌多糖蛋白缀合物混合，使各血清型肺炎链球菌荚膜多糖的含量为4-8μg/ml，B型流感嗜血杆菌多糖含量为10-20μg/ml。

本发明还提供一种制备多价肺炎球菌荚膜多糖缀合物组合物的方法：分别对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F的荚膜多糖进行分离纯化，然后将各纯化的血清型荚膜多糖分别与载体蛋白缀合后混合，任选加入赋形剂，即得多价肺炎球菌荚膜多糖缀合物的组合物。

其中，肺炎链球菌荚膜多糖分离纯化的步骤为：

1)建立肺炎球菌菌种库，采用肺炎球菌工作种子进行肺炎球菌发酵；

2)向肺炎球菌发酵液中加入适量的去氧胆酸钠进行杀菌并剥离肺炎球菌荚膜多糖；

3)对杀菌后的发酵液进行离心，去除菌体，收集离心上清，然后进行超滤浓缩；

4)向浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度为25％～45％，搅拌后离心去除核酸；

5)向上清中加入乙醇使其终浓度达到55％～80％，搅拌后，离心，去除上清收集沉淀；

6)加水溶解沉淀，加入1-3倍溶液体积的苯酚进行多次抽提，去除蛋白质；

7)向上清中加入乙醇，使其终浓度达到55％～80％，离心后收集沉淀，即得纯化的肺炎球菌荚膜多糖。

还可采用本领域熟知的其它纯化技术，如柱层析、乙醇沉淀、酶切等方法对肺炎链球菌荚膜多糖及HIB多糖进行纯化。

本发明还提供上述含有多价肺炎球菌荚膜多糖缀合物及HIB多糖缀合物的组合物在制备用于预防或治疗肺炎链球菌及B型流感嗜血杆菌所致疾病的药物中的应用。

含有本发明所述组合物的疫苗也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种多价肺炎球菌荚膜多糖缀合物及HIB多糖缀合物结合疫苗，其含有将上述多价肺炎球菌荚膜多糖组合物与载体蛋白共价连接形成的缀合物，含有将上述HIB多糖组合物与载体蛋白共价连接形成的缀合物，以及任选基于铝的佐剂。基于铝的佐剂其终浓度为0.125-2.0mg/ml。所述载体蛋白应为无毒性，且能与多糖结合并且能够引起多糖免疫原性显著升高的蛋白，同时易于大量获得。本发明的载体蛋白优选为白喉类毒素或破伤风毒素，更优选为白喉类毒素CRM197。上述蛋白载体的获得，需经过菌体发酵、超滤、纯化、脱毒等步骤，均为本领域常规技术。

本发明还提供制备所述多价肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗的方法，分别对不同血清型肺炎链球菌的荚膜多糖进行分离纯化，然后将各血清型肺炎链球菌荚膜多糖分别与载体蛋白进行共价连接(例如，先将纯化的荚膜多糖化学活化，通过还原胺化法将活化荚膜多糖分别单独结合到载体蛋白上)，形成单价缀合物，将各型单价缀合物分别采用铝佐剂吸附后混合，或各型单价缀合物混合后再采用铝佐剂吸附，即得多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗半成品。所述基于铝的佐剂，如氧化铝、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等，其终浓度为0.25-4.0mg/ml。所述基于铝的佐剂可市售获得，也可以采用本领域常规方法进行制备。

本发明还提供制备所述HIB多糖结合疫苗的方法，将HIB多糖进行分离纯化，然后将其与载体蛋白进行共价连接(例如，先将纯化的荚膜多糖化学活化，通过还原胺化法将活化荚膜多糖结合到载体蛋白上)，将缀合物采用铝佐剂吸附，即得HIB多糖结合疫苗半成品。所述基于铝的佐剂，如氧化铝、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等。所述基于铝的佐剂可市售获得，也可以采用本领域常规方法进行制备。后将所述的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗半成品与HIB多糖结合疫苗半成品混合，制备成多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗-HIB多糖结合疫苗联合疫苗。

本发明的联合可用于预防或者治疗由于肺炎球菌及B型流感嗜血杆菌感染引发肺炎及脑膜炎的病人，疫苗可以通过肌肉、皮下、皮内途径注射或经过粘膜给药，适于接种人和动物。

本发明是针对我国特有血清型肺炎球菌及B型流感嗜血杆菌的流行情况，首次选择了肺炎球菌多糖1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F的血清型及HIB多糖组合，从而开发出针对我国特有流行情况而设计的多价肺炎链球菌多糖缀合物与HIB多糖缀合物的联合疫苗，以向易感人群提供最大限度的保护。

采用本发明方法制备的疫苗组合物，其稳定性较好，该组合物具有针对上述13种血清型的肺炎球菌及B型流感嗜血杆菌侵袭的多重免疫原性和保护性能，覆盖范围更广，理化性质稳定，互无干扰，优于已上市的肺炎多糖组合物，且免疫应答高于多糖组合物。接种本发明的疫苗可以减少接种针次，简化免疫程序，同时可有效预防人及动物因上述细菌所致的疾病，覆盖更加广泛，免疫效果更好。

本发明更加方便多效，成本更低。上述荚膜多糖的生产，均采用发酵后纯化的方式进行制备，具有相似的生产工艺，便于工业化大规模生产，且通过灭活后提纯荚膜多糖，使疫苗具有更高的安全性及良好的免疫原性，同时，本发明所述组合物中的各个免疫原吸附完全，理化性质稳定，互无干扰。另外，由本发明组合物制备得到的疫苗免疫原性效果远高于同类多价次的多糖类疫苗，可有效激活2岁以下儿童B细胞，从而产生抗体，并激活记忆B细胞，诱发免疫记忆反应，可以起到更好的保护效果。

动物实验表明，本发明的联合疫苗可有效诱导机体产生针对上述多糖的高滴度、特异性抗体，体外实验表明，由该疫苗所诱导的抗体具有明显的反应性与中和活性；特别是组合物中各肺炎链球菌血清型荚膜多糖的免疫效果不受另一组分的影响与干扰，吸附率大于75％，免疫原性不低于单价缀合物。该疫苗具有与各血清型单价结合原液相同的免疫原性，组合接种可以在不影响疗效的基础上大大减少接种次数。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。如下我们所采纳的实施例使用了标准的技术，除非另有详细描述，为本领域技术人员众所周知且为常规技术。实施例是例证性的，但并不限制本发明。

实施例1 肺炎链球菌荚膜多糖原液制备

1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F血清型肺炎球菌(Streptococcuspneumoniae)菌株均来源于中国药品生物制品检定所与丹麦血清研究所(SSI)。将上述菌种进行传代建立原始种子库、主种子库和工作种子库，代次分别为：原始种子批为第1代，主种子批为第4代，工作种子批为第8代。工作种子批启开后至接种发酵罐培养，传代应不超过10代。每代种子采用奶粉做冻干保护剂，冻干保藏。取工作种子在大豆蛋白胨固体培养基划线挑取菌种，接种于5ml的液体综合培养基，35℃培养后，转种到500ml的培养液后经过培养再扩增至10L培养液和50L培养液。于对数生长期的后期或静止期的前期中止培养，取样进行纯菌检查，纯菌检查合格后在收获的培养液中加入合适量的无菌的去氧胆酸钠至终浓度为1％杀菌两小时以裂解细菌细胞并释放荚膜多糖。将已杀菌的培养液离心后收集上清液，上清液用100KD截留分子量的超滤膜包超滤浓缩10倍。

用pH7.0左右的磷酸盐缓冲液对超滤液采进行超滤换液，然后加入无水乙醇，使乙醇终浓度为30％，充分搅拌后离心去除核酸。

向上清中加入乙醇使其终浓度达到70％，搅拌后，离心，去除上清收集沉淀。

加水溶解沉淀，加入2倍溶液体积的苯酚进行多次抽提，去除蛋白。

向上清中加入乙醇，使其终浓度达到55％，离心后收集沉淀，将沉淀采用注射水复溶，经过0.22μm的无菌滤器除菌过滤后，获得1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F纯化血清型的肺炎球菌荚膜多糖原液。

实施例2 多价肺炎链球菌荚膜多糖缀合物的制备

将实施例1中制备的13种肺炎链球菌荚膜多糖原液，采用盐酸进行酸化降解，然后在多糖中加入高碘酸钠氧化，氧化后检测多糖的活化度，然后按照多糖：蛋白质＝1:1的重量比加入纯化后的白喉类毒素CRM197蛋白质进行结合，结合后加入硼氢化钠终止结合反应，制备肺炎球菌荚膜多糖结合物，结合物采用超滤透析，去除未结合的蛋白质和多糖，纯化后采用0.2μm的滤器除菌过滤，即为肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质单价共轭物。

将上述制备的1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F血清型的肺炎球菌荚膜多糖缀合物按照多糖含量8μg/ml混合，即得13价的肺炎球菌荚膜多糖缀合物。

实施例3 多价肺炎球菌荚膜多糖缀合物铝吸附

对多价肺炎球菌荚膜多糖缀合物进行吸附制备疫苗。将纯化后的1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F血清型的肺炎球菌荚膜多糖缀合物先与0.5μg/ml的磷酸铝佐剂吸附，再混合，使多糖含量各血清型均为8μg/ml，铝佐剂终浓度为0.25mg/ml。

检测上述吸附方式制备缀合物的混合物的吸附完全性、各型多糖含量回收率。各型多糖的吸附效果与各型多糖含量采用免疫浊度法进行检测。

多糖吸附完全性与各型多糖回收率计算方法如下：

吸附完全性：

Xn型多糖为1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F血清型。

疫苗的吸附完全性反应疫苗中未被铝佐剂捕获的游离的各型多糖的含量占疫苗中总的理论各型多糖含量的比值，结果越高显示疫苗的吸附效果越好。

疫苗各型多糖回收率：

疫苗解离后分别检测各型多糖的含量，将检测值与该血清型多糖含量的理论值进行对比，要求回收率为理论值的70％～130％之间。检测结果见表1。

表1各型多糖吸附完全性与各型多糖含量结果

从表1可以看出，采用上述方法制得的组合物吸附率效果较好，均超过75％(检测限度)；疫苗解离后的各型多糖含量在70％～130％之间。表明疫苗的含量准确，吸附效率高。

实施例4 B型流感嗜血杆菌的培养和多糖纯化

按照公开专利200810125160中对b型流感嗜血杆菌培养方法的描述，包括2次在固体培养基上的预培养和1次液体培养基的预培养，然后在发酵罐中培养并收获。按照该专利中对b型流感嗜血杆菌多糖纯化方法的描述，包括将收获液进行福尔马林处理、离心收集抗原上清液并浓缩，随后进行一系列化学方法的处理，获得纯化的b型流感嗜血杆菌多糖。

实施例5 B型流感嗜血杆菌缀合物的制备

按照公开专利200680023334.4中对b型流感嗜血杆菌多糖和白喉类毒素变种CRM197蛋白的共价结合方法的描述，包括加入溴化氢对多糖进行活化处理，以及一系列化学方法将多糖和CRM197进行偶联形成缀合物，再对缀合物进行层析纯化，获得B型流感嗜血杆菌多糖缀合物原液。

实施例6流感嗜血杆菌缀合物铝吸附

将实施例5获得的纯化后的HIB多糖缀合物原液与0.5μg/ml的磷酸铝佐剂吸附，再混合，使多糖含量为20μg/ml，铝佐剂终浓度为0.25mg/ml。

实施例7 肺炎多糖缀合物和HIB缀合物混合物的制备

将实施例3与实施例6中制得的吸附铝佐剂的缀合物原液按一定浓度搅拌混合，获得联合疫苗组合物，确定pH值在6-7的范围内。组合物抗原终浓度见表2。

表2各型别多糖和HIB组合物抗原含量

实施例8 本发明的组合物免疫原性分析

对实施例7制得的吸附铝佐剂的多价肺炎多糖缀合物与HIB多糖缀合物的联合疫苗进行免疫原性分析，分别比较缀合与不缀合蛋白的多糖免疫后的抗体滴度，结果表明，缀合载体蛋白后，抗体滴度明显增加，保护效果更好。

将用两剂组合物免疫家兔，四周后用ELISA的方法测定血清中IgG的含量(GMT)，具体数据见表3。

表3免疫疫苗组合物后的抗体水平(GMT，95％CI)

为了进一步验证，联合疫苗中的各个组份之间互不干扰，互不影响彼此的免疫原性，对联合疫苗中的各个组份与其单价免疫后4周进行了抗体滴度比较，结果见表4。

表4免疫单价及疫苗组合物后的抗体水平(GMT，95％CI)

	单价多糖缀合物	多糖缀合物组合物
			1	35998	37845
3	11425	10998
			4	13698	14265
5	37867	39022
			6A	23669	24875
6B	36985	36965
			7F	35112	36980
9V	58774	58012
			14	25963	29872
18C	74887	76356
			19A	25998	26594
19F	21458	21987
			23F	48752	49563
HIB	36524	37412

结果可见，上述联合疫苗中的各个肺炎链球菌荚膜多糖缀合物免疫后均产生浓度较高的抗体，与其单价次免疫时产生的抗体滴度无差异。由此可见，本发明的疫苗不仅减少免疫次数，降低成本，还对机体产生了良好的保护效果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，含有多价肺炎链球菌荚膜多糖缀合物和B型流感嗜血杆菌多糖蛋白缀合物，所述多价肺炎球菌荚膜多糖缀合物是由13种不同血清型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)荚膜多糖和载体蛋白缀合形成的缀合物；其中，所述13种不同血清型为1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，肺炎链球菌荚膜多糖与载体蛋白质的质量比为1:2-2:1，各血清型肺炎链球菌荚膜多糖的等质量混合。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，组合物中各血清型肺炎链球菌荚膜多糖的含量为2-10μg/ml，B型流感嗜血杆菌多糖含量为5-30μg/ml。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，组合物中各血清型肺炎链球菌荚膜多糖的含量为4-8μg/ml，B型流感嗜血杆菌多糖含量为10-20μg/ml。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述载体蛋白为生理可接受的载体。

6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还含有赋形剂，所述赋形剂为氯化钠和磷酸盐缓冲剂。

7.制备权利要求1-6任一项所述组合物的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)分别对13种不同血清型肺炎链球菌的荚膜多糖进行分离纯化，然后将各血清型荚膜多糖分别与载体蛋白质进行缀合，形成缀合物，最后将各型单价缀合物混合，得到多价肺炎链球菌荚膜多糖缀合物；

(2)B型流感嗜血杆菌多糖蛋白分离纯化，与载体蛋白缀合，形成B型流感嗜血杆菌多糖蛋白缀合物；

(3)将多价肺炎链球菌荚膜多糖缀合物与B型流感嗜血杆菌多糖蛋白缀合物混合，使各血清型肺炎链球菌荚膜多糖的含量为4-8μg/ml，B型流感嗜血杆菌多糖含量为10-20μg/ml。

8.权利要求1-6任一项所述组合物在制备用于预防或治疗肺炎链球菌及B型流感嗜血杆菌所致疾病的药物中的应用。

9.一种疫苗，其含有权利要求1-6任一项所述的组合物，以及任选基于铝的佐剂和/或赋形剂。

10.根据权利要求9所述的疫苗，其特征在于，基于铝的佐剂其终浓度为0.125-2.0mg/ml。