CN108295253A - 一种A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌/乙型脑炎联合疫苗 - Google Patents

一种A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌/乙型脑炎联合疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种A、C群脑膜炎球菌‑b型流感嗜血杆菌/乙型脑炎联合疫苗，采用A群、C群脑膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血杆菌，分别提取荚膜多糖，纯化的荚膜多糖活化后，与白喉CRM197蛋白结合；采用Vero细胞培养乙脑病毒，经灭活纯化后，与A、C群脑膜炎多糖结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗按一定比例混合，用于预防A群、C群脑膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血杆菌、乙型脑炎病毒引起的感染。

Description

一种A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌/乙型脑炎联合疫苗
技术领域
本发明提供一种由A群、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗、乙型脑炎灭活疫苗联合而成的四联疫苗，用以预防由A群、C群脑膜炎球菌引起的脑脊髓膜炎；由b型流感嗜血杆菌引起的脑膜炎、肺炎、会厌炎、关节炎、蜂窝织炎、败血症；由乙型脑炎病毒引起的乙型脑炎等重要疾病，属于疫苗生产制备技术领域。
背景技术
流行性脑膜炎是细菌性脑脊髓膜炎中唯一能造成流行的疾病，可引起相当高的病死率和致残率。流脑从病原体的发现至今已超过100年，呈世界范围分布，全世界每年流脑病例可达30万～35万，是世界范围的一个严重公共健康问题，至今仍未得到有效的控制。
流脑由脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides，Nm)引起。据Nm荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)的化学性质和抗原特性的不同，已确定13个血清群，分别为A、B、C、D、29E、H、I、K、L、W135、X、Y和Z13，A、B、C、W135、Y群Nm引起约95％的感染病例数，其中A群、C群脑膜炎奈瑟氏菌传染性最强，是引起流行性脑脊髓炎最常见的菌株。
脑膜炎球菌多糖疫苗(Meningococcal polysaccharide vaccine，MPV)是由提取的脑膜炎球菌的荚膜多糖制成的疫苗，荚膜多糖决定脑膜炎球菌菌体本身毒力强弱的，不具有荚膜多糖的突变型脑膜炎球菌在血清中很快被补体系统清除，也不具备病原性，由免疫系统诱导产生针对荚膜多糖的血清抗体是对抗脑膜炎球菌的主要作用物质。现有的多糖疫苗均是基于此原理发展而来。荚膜多糖是非T细胞依赖性抗原，为半抗原，其诱导的免疫应答没有T淋巴细胞参与，不能产生免疫记忆，尤其是两岁以下婴幼儿。所以WHO曾建议流脑多糖疫苗一般不用于2岁以下、幼儿的常规免疫接种。
脑膜炎球菌多糖结合疫苗(Meningococcal polysaccharide conjugatevaccine，MCV)是借助化学连接剂将脑膜炎球菌的荚膜多糖与其中一种蛋白载体(白喉CRM197蛋白、白喉类毒素、破伤风类毒素、脑膜炎球菌的外膜蛋白OMP)共价连接成结合的疫苗，该疫苗是抗原T细胞依赖性抗原，其诱导的免疫应答有T淋巴细胞参与，能产生免疫记忆。流脑多糖结合疫苗的接种范围较流脑多糖疫苗扩大，可用于2岁以下婴、幼儿的常规免疫接种。
流感嗜血杆菌是一类革兰氏阴性小杆菌，常呈多形态性，无鞭毛，无芽孢形成，需氧或兼性厌氧，在人工培养时必须供给新鲜血液才能生长，故名嗜血杆菌。根据是否有荚膜抗原，流感嗜血杆菌分为可分型和不可分型两大类，其中可分型流感嗜血杆菌根据荚膜多糖的组成成分和抗原性，分为a、b、c、d、e、f 6个血清型。Hib是其中致病力最强的型别，与大多数严重局部和侵袭性感染有关。
b型流感嗜血杆菌是引起5岁以下婴幼儿肺炎、脑膜炎、会厌炎和蜂窝织炎等侵入性感染发病和致死的重要病原菌，据世界卫生组织(WHO)统计：全世界每年至少造成300万例严重侵袭性疾病，导致38.6万儿童死亡。抗生素治疗不能阻止Hib带来的严重危害，接种b型流感嗜血杆菌结合疫苗是预防该病的最主要措施。
乙型脑炎是一种中枢神经系统急性传染病，是由病毒所引起的一种自然疫源性疾病，一般通过蚊虫进行传播，多在夏季和秋季造成儿童发病。该流行病死亡率较高，临床上的特征包括头痛、发热、嗜睡、呕吐、肌肉紧张和颈项强直等各种病理反应，情况严重的时候还会出现惊厥，昏迷并且导致呼吸衰竭。
二十世纪初，乙脑主要在亚洲的温带地区流行，特别在日本，中国和朝鲜半岛长期流行。第二次世界大战以后疫区扩展到亚洲其他国家，到了二十世纪末进一步扩展到大洋洲的新西兰和澳大利亚等国家，并且还有进一步扩大的趋势。世界卫生组织资料显示，乙脑疫区易感人群(乙脑主要发病人群为农村小于15岁儿童)确切的发病率1.8～2.5/10000人，病死率为25％，后遗症为45％，而这一发病数据还是在中国，日本，南朝鲜等国家长期执行了国家计划免疫措施的情况下产生的。随着脊髓灰质炎在全球范围的基本根除，乙脑成为流行区儿童神经系统病毒感染和残疾的首要原因。
目前乙脑没有特异性的治疗方法。所谓的治疗方法，主要是支持性的对症治疗。皮质类固醇和抗炎症的药物曾经被用于治疗乙脑，但是效果不显著。控制乙脑流行的方法主要是灭蚊和疫苗接种。在蚊虫控制措施难以全面落实的情况下，疫苗接种成为控制乙脑流行最为有效的方法。
发明内容
本发明提供了一种含A群、C群脑膜炎球菌多糖结合、b型流感嗜血杆菌结合及乙型脑炎灭活疫苗的联合疫苗制剂，使其具有安全、有效、可控及一针防多病的特点，并符合2015版《中国药典》三部“A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗”“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”“冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)”规程相关要求，以实现实际应用的目的。
实现本发明的技术方案：本发明提供的联合疫苗由A群流行性脑膜炎奈瑟是球菌荚膜多糖-蛋白结合物，C群流行性脑膜炎奈瑟是球菌荚膜多糖-蛋白结合物，b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-蛋白结合物，乙型脑炎灭活疫苗组分组成：
所述的组分A群、C群脑膜炎球菌多糖结合物，b型流感嗜血杆菌结合物是按以下方法制备的：
1.制备A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液：
(I)A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液：A群脑膜炎球菌工作种子批采用发酵罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜的方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，待沉淀充分解离后，加入冷却的乙醇至终浓度25％(v/v)，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖溶于含脱氧胆酸钠的Tris-HCl缓冲液中，再经过Capto adhere和DEAE SepharoseTM FF串联柱层析，收集层析流穿液，用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钙溶液，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液；
根据2015版《中国药典》三部中“A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液经CDAP活化，加入1、6-己二酰肼(ADH)反应2-4小时后除去CDAP和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；检定合格后，将多糖衍生物与载体蛋白等质量混合，然后加入适量碳二亚胺(EDAC)冰水浴反应2-5小时，用0.2mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经SepharoseTM4FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即为A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液，于2-8℃保存；
(II)C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液：C群脑膜炎球菌工作种子批采用发酵罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜的方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，待沉淀充分解离后，加入冷却的乙醇至终浓度25％(v/v)，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖溶于含脱氧胆酸钠的Tris-HCl缓冲液中，再经过Capto adhere和DEAE SepharoseTMFF串联柱层析，收集层析流穿液，用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钠溶液，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液；
根据2015版《中国药典》三部中“A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液，加入1、6-己二酰肼(ADH)反应2-4小时后除去未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；检定合格后，将多糖衍生物与载体蛋白等质量混合，然后加入适量碳二亚胺(EDAC)冰水浴反应2-5小时，用0.2mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经SepharoseTM4FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即为C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液，于2-8℃保存；
(III)b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液：b型流感嗜血杆菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，澄清过滤后用100KD超滤膜包用10mmol/L PB超滤并浓缩至澄清液体积的1/10，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钠溶液，待沉淀充分解离后，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清；于上清液中加入乙醇至终浓度75％，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖用注射水溶解后，加入等体积的Tris-HCl-NaCl溶液，充分混匀，再加入适量的脱氧胆酸钠，充分搅拌，离心收集上清，上清用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钙溶液，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液；
根据2015版《中国药典》三部中“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液，经高碘酸钠活化16-24小时，用10KD超滤膜包用注射水超滤，收集超滤液；检定合格后，将活化多糖与载体蛋白等质量混合，然后加入适量氰基硼氢化钠反应60-72小时，用0.15mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经Phenyl sepharose 6FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，用100KD超滤膜包用生理盐水超滤后除菌过滤，即为b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液，于2-8℃保存；
2.合并冻干：将A群、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按照1∶1∶1(w/w/w，以多糖计)混合后，加入蔗糖分装冻干，即得到A、C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗。
3.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于：所述的乙型脑炎灭活疫苗按以下方法制备：
取乙脑工作细胞库中的Vero细胞，经复苏、扩增2-3代、与一定量的微载体Cytodex-1混合制备成细胞接种液；接种到生物反应罐内继续培养5-7天，然后按0.002MOI的比例接种乙脑毒种工作种子批，病毒感染后，连续收获病毒液；用0.65μm滤芯澄清病毒收获液，用300KD孔径膜包进行超滤浓缩，按终浓度1∶4000比例向病毒浓缩液中加入β-丙内酯灭活24小时，灭活结束后，将病毒灭活液置37℃下水解2小时；病毒灭活液经过SepharoseTM6FF进行柱层析或其它适宜的方法进行纯化，即为乙型脑炎灭活疫苗原液，于2-8℃保存；根据2015版《中国药典》三部中“冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)”中检定要求，对乙型脑炎灭活疫苗原液进行检定；检定合格的疫苗原液，经过配比稀释后即为乙型脑炎灭活疫苗。
本发明提供的疫苗在使用时将以下两种组分临用前混合：
(a)A群C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗；
(b)乙型脑炎灭活疫苗；
(a)和(b)分别装在分开的容器中。
本发明联合疫苗的制备工艺，包括以下步骤：
本发明疫苗可以0.5ml的剂量给予接种者。所述的组分(a)混合的A群、C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗组分未经佐剂处理，且不含防腐剂；所述的组分(b)乙型脑炎灭活疫苗组分未经佐剂处理，且不含防腐剂；所述的组分(a)为冻干制剂，赋形剂为蔗糖；所述的组分(b)为液体制剂。
具体实施方式
本发明包括但不限于以下实施例。
实施例1：
一.制备A群、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液：
(1)A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液的制备：A群脑膜炎球菌工作种子批采用发酵罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜的方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，使其终浓度为1mol/L，2-8℃搅拌3小时以上，待沉淀充分解离后，加入冷却的乙醇至终浓度25％(v/v)，2-8℃静置3小时以上，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次以上，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖溶于含脱氧胆酸钠的Tris-HCl缓冲液中，再加入一定量的EDTA，使多糖终浓度达到2～5mg/ml，再经过Captoadhere和DEAE SepharoseTMFF串联柱层析，收集层析流穿液，用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钙溶液，使其终浓度为0.1mol/L，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次以上，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液；
根据2015版《中国药典》三部中“A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液经CDAP活化，加入1、6-己二酰肼(ADH)反应1-4小时后除去CDAP和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；检定合格后，将多糖衍生物与载体蛋白等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰水浴反应2-5小时，用0.2mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经SepharoseTM4FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即为A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液，于2-8℃保存；
(2)C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液的制备：C群脑膜炎球菌工作种子批采用发酵罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜的方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，使其终浓度为1mol/L，2-8℃搅拌3小时以上，待沉淀充分解离后，加入冷却的乙醇至终浓度25％(v/v)，2-8℃静置3小时以上，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次以上，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖溶于含脱氧胆酸钠的Tris-HCl缓冲液中，再加入一定量的EDTA，使多糖终浓度达到2～5mg/ml，再经过Captoadhere和DEAE SepharoseTMFF串联柱层析，收集层析流穿液，用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钠溶液，使其终浓度为0.2mol/L，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次以上，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液；
根据2015版《中国药典》三部中“A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液，加入1、6-己二酰肼(ADH)反应1-4小时后除去未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；检定合格后，将多糖衍生物与载体蛋白等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰水浴反应2-5小时，用0.2mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经SepharoseTM 4FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即为C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液，于2-8℃保存；
(3)b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液：b型流感嗜血杆菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，澄清过滤后用100KD超滤膜包用10mmol/L PB超滤并浓缩至澄清液体积的1/10，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钠溶液，使其终浓度为1mol/L，2-8℃搅拌3小时以上，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至终浓度25％，2-8℃静置3小时以上，离心收集上清；于上清液中加入乙醇至终浓度75％，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖用注射水溶解后，加入等体积的Tris-NaCl缓冲溶液，充分混匀，再加入脱氧胆酸钠至终浓度2％，使多糖终浓度达到4-6mg/ml，充分搅匀，离心收集上清，上清用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钙溶液，使其终浓度为0.1mol/L，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液；
根据2015版《中国药典》三部中“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液，经高碘酸钠活化16-24小时，用10KD超滤膜包用注射水超滤，收集超滤液；检定合格后，将活化多糖与载体蛋白等质量混合，然后加入适量氰基硼氢化钠反应60-72小时，用0.15mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经Phenyl sepharose 6FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，用100KD超滤膜包用生理盐水超滤后除菌过滤，即为b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液，于2-8℃保存；
(4)合并冻干：将A群、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按照1∶1∶1(w/w/w，以多糖计)混合后，加入蔗糖分装冻干，即得到A、C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗。
二.乙型脑炎灭活疫苗的制备
取乙脑工作细胞库中的Vero细胞，经复苏、扩增2-3代、与一定量的微载体Cytodex-1混合制备成细胞接种液；接种到生物反应罐内继续培养5-7天，然后按0.002MOI的比例接种乙脑毒种工作种子批，病毒感染后，连续收获病毒液；用0.65μm滤芯澄清病毒收获液，用300KD孔径膜包进行超滤浓缩，按终浓度1∶4000比例向病毒浓缩液中加入β-丙内酯灭活24小时，灭活结束后，将病毒灭活液置37℃下水解2小时；病毒灭活液经过SepharoseTM6FF进行柱层析或其它适宜的方法进行纯化，即为乙型脑炎灭活疫苗原液，于2-8℃保存；根据2015版《中国药典》三部中“冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)”中检定要求，对乙型脑炎灭活疫苗原液进行检定；检定合格的疫苗原液，经过配比稀释后即为乙型脑炎灭活疫苗。
三.分装：将上述制备的A群C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗与乙型脑炎灭活疫苗分别分装在两个独立的中硼西林瓶中，其中A群C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗为冻干制剂，乙型脑炎灭活疫苗为液体制剂。
四.成品检定：除水分含量测定外，吸取乙型脑炎灭活疫苗0.5ml加至冻干的A群C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗中复溶后进行其余各项检定。
成品检定如下：
1.物理检查
1.1外观：冻干制剂应为白色疏松体，按标示量加入乙型脑炎灭活疫苗后应迅速溶解为无色透明液体，无摇之不散的异物。
1.2装量差异：依法检查(2015版《中国药典》通则0102)，装量差异限度应≤±15％。
1.3鉴别试验：采用免疫双扩散法测定(2015版《中国药典》通则3403)，本品应分别与A群、C群脑膜炎奈瑟氏菌诊断血清、b型流感嗜血杆菌诊断血清及白喉抗毒素形成明显的沉淀线。采用酶联免疫法检查，应证明含有乙脑病毒抗原。
2.化学检查
2.1水分：应不高于3.0％(2015版《中国药典》通则0832)。
2.2 pH值：依法测定(2015版《中国药典》通则0631)，应为6.0-8.0。
2.3渗透压摩尔浓度：依法测定(2015版《中国药典》通则0632)，应为280-550mOsmol/kg。
2.4多糖含量：依法测定磷含量(2015版《中国药典》通则3103)，计算A群多糖含量；依法测定唾液酸含量(2015版《中国药典》通则3102)，以N-乙酰神经氨酸作为对照品，计算C群多糖含量；依法测定核糖含量(2015版《中国药典》通则3421)，计算b型流感嗜血杆菌多糖含量。每一次人用剂量含A群多糖10～15μg；C群多糖10～15μg；Hib多糖10～15μg。
2.5游离多糖含量：
A群：采用冷苯酚将结合物原液中与蛋白结合的多糖沉淀，分别测定沉淀前原液和沉淀后上清液中的磷含量(2015版《中国药典》通则3103)，计算A群游离多糖含量，应不高于20％。
C群：采用冷苯酚将结合物原液中与蛋白结合的多糖沉淀，分别测定沉淀前原液和沉淀后上清液中的唾液酸含量(2015版《中国药典》通则3102)，计算C群游离多糖含量，应不高于15％。
同法检测A群、C群多糖原液沉淀前后的磷含量和唾液酸含量，分别计算多糖回收率，应为80％～100％。
Hib：采用去氧胆酸钠(DOC)在酸性条件下能专一性地沉淀蛋白物质，多糖蛋白结合物在DOC-HCl的作用下沉淀下来，而游离多糖不被沉淀留存上清中。通过测定上清的核糖含量，以结合物总糖含量计算游离糖的比率，应不高于15％。
同法检测Hib活化多糖沉淀前后的多糖含量，分别计算多糖回收率，应为85％～115％。
3.效力试验：每批疫苗皮下注射12-14g NIH(或BaLb/c)小鼠，每组10只，另取同批小鼠10只作对照，注射生理氯化钠溶液，分别在第0天、第14天皮下注射1次，每次注射剂量分别含A群、C群、Hib多糖各2.5μg，于第一针后第21～28天采血，以Elisa法测定血清中抗A群、抗C群和抗Hib多糖IgG抗体滴度，以生理氯化钠溶液对照组小鼠血清的吸光度值求出Cutoff值。疫苗组抗体阳转率应不低于80％。
4.效价测定：采用免疫小鼠中和抗体测定法，以蚀斑减少中和试验测定中和抗体。参考疫苗(RA和RB)以及中和试验阳性血清由中国食品药品检定研究院提供。将被检疫苗(T)稀释成1∶32参考疫苗(R)按要求的稀释度稀释，分别腹腔免疫体重为12-14g小鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，间隔7天。第二次免疫后第7天采血，分离血清，同组小鼠血清等量混合，于56℃灭能30分钟。稀释阳性血清、被检疫苗血清和参考疫苗血清，分别与稀释病毒(约200PFU/0.4ml)等量混合，作为病毒对照，置37℃水浴90分钟，接种6孔细胞培养板BHK21细胞，每孔0.4ml，置37℃培养90分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，与37℃ 5％二氧化碳孵箱中培养5天，染色，蚀斑计数，计算被检疫苗和参考疫苗组对病毒对照组的蚀斑减少率。病毒对照组的蚀斑平均数应在50～150之间。
5.热稳定性试验：疫苗出厂前进行稳定性试验，于37℃放置7天，按上述效价测定方法进行效价测定，仍应合格。
6.牛血清白蛋白残留量：应不高于50ng/剂(2015版《中国药典》通则3411)。
7.抗生素残留量：采用酶联免疫法，应不高于50ng/剂。
8.Vero细胞DNA残留量：应不高于100pg/剂(2015版《中国药典》通则3407第一法)。
9.Vero细胞蛋白质残留量：采用酶联免疫法，应不高于2μg/ml。
10.无菌检查：应符合规定(2015版《中国药典》通则1101)。
11异常毒性检查：应符合规定(2015版《中国药典》通则1141)。
12.细菌内毒素检查：乙型脑炎灭活疫苗应不高于50EU/ml；A群C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗每1次人用剂量应不高于500EU(2015版《中国药典》通则1143)。
13.热源检查：依法检查(2015版《中国药典》通则1142)。注射剂量按家兔体重每1kg注射1ml，含多糖1μg(含A群多糖1.0μg、C群多糖1.0μg、Hib多糖1.0μg)。
检查结果
实施例2：
一.制备A群、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液：
(1)A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液的制备：A群脑膜炎球菌工作种子批采用发酵罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜的方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，使其终浓度为1mol/L，2-8℃搅拌3小时以上，待沉淀充分解离后，加入冷却的乙醇至终浓度25％(v/v)，2-8℃静置3小时以上，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次以上，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖溶于含脱氧胆酸钠的Tris-HCl缓冲液中，再加入一定量的EDTA，使多糖终浓度达到2～5mg/ml，再经过Captoadhere和DEAESepharoseTMFF串联柱层析，收集层析流穿液，用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钙溶液，使其终浓度为0.1mol/L，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次以上，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液；
根据2015版《中国药典》三部中“A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液经CDAP活化，加入1、6-己二酰肼(ADH)反应1-4小时后除去CDAP和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；检定合格后，将多糖衍生物与载体蛋白等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰水浴反应2-5小时，用0.2mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经SepharoseTM4FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即为A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液，于2-8℃保存；
(2)C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液的制备：C群脑膜炎球菌工作种子批采用发酵罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜的方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，使其终浓度为1mol/L，2-8℃搅拌3小时以上，待沉淀充分解离后，加入冷却的乙醇至终浓度25％(v/v)，2-8℃静置3小时以上，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次以上，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖溶于含脱氧胆酸钠的Tris-HCl缓冲液中，再加入一定量的EDTA，使多糖终浓度达到2～5mg/ml，再经过Captoadhere和DEAE SepharoseTMFF串联柱层析，收集层析流穿液，用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钠溶液，使其终浓度为0.2mol/L，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次以上，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液；
根据2015版《中国药典》三部中“A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液，加入1、6-己二酰肼(ADH)反应1-4小时后除去未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；检定合格后，将多糖衍生物与载体蛋白等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰水浴反应2-5小时，用0.2mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经SepharoseTM4FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即为C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液，于2-8℃保存；
(3)b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液：b型流感嗜血杆菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，澄清过滤后用100KD超滤膜包用10mmol/L PB超滤并浓缩至澄清液体积的1/10，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钠溶液，使其终浓度为1mol/L，2-8℃搅拌3小时以上，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至终浓度25％，2-8℃静置3小时以上，离心收集上清；于上清液中加入乙醇至终浓度75％，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖用注射水溶解后，加入等体积的Tris-NaCl缓冲溶液，充分混匀，再加入脱氧胆酸钠至终浓度2％，使多糖终浓度达到4-6mg/ml，充分搅匀，离心收集上清，上清用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钙溶液，使其终浓度为0.1mol/L，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液；
根据2015版《中国药典》三部中“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液，经高碘酸钠活化16-24小时，用10KD超滤膜包用注射水超滤，收集超滤液；检定合格后，将活化多糖与载体蛋白等质量混合，然后加入适量氰基硼氢化钠反应60-72小时，用0.15mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经Phenyl sepharose 6FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，用100KD超滤膜包用生理盐水超滤后除菌过滤，即为b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液，于2-8℃保存；
(4)合并冻干：将A群、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按照1∶1∶1(w/w/w，以多糖计)混合后，加入蔗糖分装冻干，即得到A、C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗。
二.乙型脑炎灭活疫苗的制备
取乙脑工作细胞库中的Vero细胞，经复苏、扩增2-3代、与一定量的微载体Cytodex-1混合制备成细胞接种液；接种到生物反应罐内继续培养5-7天，然后按0.002MOI的比例接种乙脑毒种工作种子批，病毒感染后，连续收获病毒液；用0.65μm滤芯澄清病毒收获液，用300KD孔径膜包进行超滤浓缩，按终浓度1∶4000比例向病毒浓缩液中加入β-丙内酯灭活24小时，灭活结束后，将病毒灭活液置37℃下水解2小时；病毒灭活液经过SepharoseTM6FF进行柱层析或其它适宜的方法进行纯化，即为乙型脑炎灭活疫苗原液，于2-8℃保存；根据2015版《中国药典》三部中“冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)”中检定要求，对乙型脑炎灭活疫苗原液进行检定；检定合格的疫苗原液，经过配比稀释后即为乙型脑炎灭活疫苗。
三.分装：将上述制备的A群C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗与乙型脑炎灭活疫苗分别分装在两个独立的中硼西林瓶中，其中A群C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗为冻干制剂，乙型脑炎灭活疫苗为液体制剂。
四.成品检定：除水分含量测定外，吸取乙型脑炎灭活疫苗0.5ml加至冻干的A群C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗中复溶后进行其余各项检定。
成品检定如下：
1.物理检查
1.1外观：冻干制剂应为白色疏松体，按标示量加入乙型脑炎灭活疫苗后应迅速溶解为无色透明液体，无摇之不散的异物。
1.2装量差异：依法检查(2015版《中国药典》通则0102)，装量差异限度应≤±15％。
1.3鉴别试验：采用免疫双扩散法测定(2015版《中国药典》通则3403)，本品应分别与A群、C群脑膜炎奈瑟氏菌诊断血清、b型流感嗜血杆菌诊断血清及白喉抗毒素形成明显的沉淀线。采用酶联免疫法检查，应证明含有乙脑病毒抗原。
2.化学检查
2.1水分：应不高于3.0％(2015版《中国药典》通则0832)。
2.2 pH值：依法测定(2015版《中国药典》通则0631)，应为6.0-8.0。
2.3渗透压摩尔浓度：依法测定(2015版《中国药典》通则0632)，应为280-550mOsmol/kg。
2.4多糖含量：依法测定磷含量(2015版《中国药典》通则3103)，计算A群多糖含量；依法测定唾液酸含量(2015版《中国药典》通则3102)，以N-乙酰神经氨酸作为对照品，计算C群多糖含量；依法测定核糖含量(2015版《中国药典》通则3421)，计算b型流感嗜血杆菌多糖含量。每一次人用剂量含A群多糖10～15μg；C群多糖10～15μg；Hib多糖10～15μg。
2.5游离多糖含量：
A群：采用冷苯酚将结合物原液中与蛋白结合的多糖沉淀，分别测定沉淀前原液和沉淀后上清液中的磷含量(2015版《中国药典》通则3103)，计算A群游离多糖含量，应不高于20％。
C群：采用冷苯酚将结合物原液中与蛋白结合的多糖沉淀，分别测定沉淀前原液和沉淀后上清液中的唾液酸含量(2015版《中国药典》通则3102)，计算C群游离多糖含量，应不高于15％。
同法检测A群、C群多糖原液沉淀前后的磷含量和唾液酸含量，分别计算多糖回收率，应为80％～100％。
Hib：采用去氧胆酸钠(DOC)在酸性条件下能专一性地沉淀蛋白物质，多糖蛋白结合物在DOC-HCl的作用下沉淀下来，而游离多糖不被沉淀留存上清中。通过测定上清的核糖含量，以结合物总糖含量计算游离糖的比率，应不高于15％。
同法检测Hib活化多糖沉淀前后的多糖含量，分别计算多糖回收率，应为85％～115％。
3.效力试验：每批疫苗皮下注射12-14g NIH(或BaLb/c)小鼠，每组10只，另取同批小鼠10只作对照，注射生理氯化钠溶液，分别在第0天、第14天皮下注射1次，每次注射剂量分别含A群、C群、Hib多糖各2.5μg，于第一针后第21～28天采血，以Elisa法测定血清中抗A群、抗C群和抗Hib多糖IgG抗体滴度，以生理氯化钠溶液对照组小鼠血清的吸光度值求出Cutoff值。疫苗组抗体阳转率应不低于80％。
4.效价测定：采用免疫小鼠中和抗体测定法，以蚀斑减少中和试验测定中和抗体。参考疫苗(RA和RB)以及中和试验阳性血清由中国食品药品检定研究院提供。将被检疫苗(T)稀释成1∶32参考疫苗(R)按要求的稀释度稀释，分别腹腔免疫体重为12-14g小鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，间隔7天。第二次免疫后第7天采血，分离血清，同组小鼠血清等量混合，于56℃灭能30分钟。稀释阳性血清、被检疫苗血清和参考疫苗血清，分别与稀释病毒(约200PFU/0.4ml)等量混合，作为病毒对照，置37℃水浴90分钟，接种6孔细胞培养板BHK21细胞，每孔0.4ml，置37℃培养90分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，与37℃ 5％二氧化碳孵箱中培养5天，染色，蚀斑计数，计算被检疫苗和参考疫苗组对病毒对照组的蚀斑减少率。病毒对照组的蚀斑平均数应在50～150之间。
5.热稳定性试验：疫苗出厂前进行稳定性试验，于37℃放置7天，按上述效价测定方法进行效价测定，仍应合格。
6.牛血清白蛋白残留量：应不高于50ng/剂(2015版《中国药典》通则3411)。
7.抗生素残留量：采用酶联免疫法，应不高于50ng/剂。
8.Vero细胞DNA残留量：应不高于100pg/剂(2015版《中国药典》通则3407第一法)。
9.Vero细胞蛋白质残留量：采用酶联免疫法，应不高于2μg/ml。
10.无菌检查：应符合规定(2015版《中国药典》通则1101)。
11异常毒性检查：应符合规定(2015版《中国药典》通则1141)。
12.细菌内毒素检查：乙型脑炎灭活疫苗应不高于50EU/ml；A群C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗每1次人用剂量应不高于500EU(2015版《中国药典》通则1143)。
13.热源检查：依法检查(2015版《中国药典》通则1142)。注射剂量按家兔体重每1kg注射1ml，含多糖1μg(含A群多糖1.0μg、C群多糖1.0μg、Hib多糖1.0μg)。
检查结果
实施例3：
一.制备A群、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液：
(1)A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液的制备：A群脑膜炎球菌工作种子批采用发酵罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜的方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，使其终浓度为1mol/L，2-8℃搅拌3小时以上，待沉淀充分解离后，加入冷却的乙醇至终浓度25％(v/v)，2-8℃静置3小时以上，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次以上，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖溶于含脱氧胆酸钠的Tris-HCl缓冲液中，再加入一定量的EDTA，使多糖终浓度达到2～5mg/ml，再经过Captoadhere和DEAE SepharoseTMFF串联柱层析，收集层析流穿液，用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钙溶液，使其终浓度为0.1mol/L，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次以上，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液；
根据2015版《中国药典》三部中“A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液经CDAP活化，加入1、6-己二酰肼(ADH)反应1-4小时后除去CDAP和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；检定合格后，将多糖衍生物与载体蛋白等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰水浴反应2-5小时，用0.2mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经SepharoseTM4FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即为A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液，于2-8℃保存；
(2)C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液的制备：C群脑膜炎球菌工作种子批采用发酵罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜的方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，使其终浓度为1mol/L，2-8℃搅拌3小时以上，待沉淀充分解离后，加入冷却的乙醇至终浓度25％(v/v)，2-8℃静置3小时以上，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次以上，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖溶于含脱氧胆酸钠的Tris-HCl缓冲液中，再加入一定量的EDTA，使多糖终浓度达到2～5mg/ml，再经过Captoadhere和DEAE SepharoseTMFF串联柱层析，收集层析流穿液，用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钠溶液，使其终浓度为0.2mol/L，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次以上，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液；
根据2015版《中国药典》三部中“A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液，加入1、6-己二酰肼(ADH)反应1-4小时后除去未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；检定合格后，将多糖衍生物与载体蛋白等质量混合，然后加入过量的碳二亚胺(EDAC)冰水浴反应2-5小时，用0.2mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经SepharoseTM4FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即为C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液，于2-8℃保存；
(3)b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液：b型流感嗜血杆菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，澄清过滤后用100KD超滤膜包用10mmol/L PB超滤并浓缩至澄清液体积的1/10，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钠溶液，使其终浓度为1mol/L，2-8℃搅拌3小时以上，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至终浓度25％，2-8℃静置3小时以上，离心收集上清；于上清液中加入乙醇至终浓度75％，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖用注射水溶解后，加入等体积的Tris-NaCl缓冲溶液，充分混匀，再加入脱氧胆酸钠至终浓度2％，使多糖终浓度达到4-6mg/ml，充分搅匀，离心收集上清，上清用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钙溶液，使其终浓度为0.1mol/L，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤各2次，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液；
根据2015版《中国药典》三部中“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液，经高碘酸钠活化16-24小时，用10KD超滤膜包用注射水超滤，收集超滤液；检定合格后，将活化多糖与载体蛋白等质量混合，然后加入适量氰基硼氢化钠反应60-72小时，用0.15mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经Phenyl sepharose 6FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，用100KD超滤膜包用生理盐水超滤后除菌过滤，即为b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液，于2-8℃保存；
(4)合并冻干：将A群、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按照1∶1∶1(w/w/w，以多糖计)混合后，加入蔗糖分装冻干，即得到A、C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗。
二.乙型脑炎灭活疫苗的制备
取乙脑工作细胞库中的Vero细胞，经复苏、扩增2-3代、与一定量的微载体Cytodex-1混合制备成细胞接种液；接种到生物反应罐内继续培养5-7天，然后按0.002MOI的比例接种乙脑毒种工作种子批，病毒感染后，连续收获病毒液；用0.65μm滤芯澄清病毒收获液，用300KD孔径膜包进行超滤浓缩，按终浓度1∶4000比例向病毒浓缩液中加入β-丙内酯灭活24小时，灭活结束后，将病毒灭活液置37℃下水解2小时；病毒灭活液经过SepharoseTM6FF进行柱层析或其它适宜的方法进行纯化，即为乙型脑炎灭活疫苗原液，于2-8℃保存；根据2015版《中国药典》三部中“冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)”中检定要求，对乙型脑炎灭活疫苗原液进行检定；检定合格的疫苗原液，经过配比稀释后即为乙型脑炎灭活疫苗。
三.分装：将上述制备的A群C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗与乙型脑炎灭活疫苗分别分装在两个独立的中硼西林瓶中，其中A群C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗为冻干制剂，乙型脑炎灭活疫苗为液体制剂。
四.成品检定：除水分含量测定外，吸取乙型脑炎灭活疫苗0.5ml加至冻干的A群C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗中复溶后进行其余各项检定。
成品检定如下：
1.物理检查
1.1外观：冻干制剂应为白色疏松体，按标示量加入乙型脑炎灭活疫苗后应迅速溶解为无色透明液体，无摇之不散的异物。
1.2装量差异：依法检查(2015版《中国药典》通则0102)，装量差异限度应≤±15％。
1.3鉴别试验：采用免疫双扩散法测定(2015版《中国药典》通则3403)，本品应分别与A群、C群脑膜炎奈瑟氏菌诊断血清、b型流感嗜血杆菌诊断血清及白喉抗毒素形成明显的沉淀线。采用酶联免疫法检查，应证明含有乙脑病毒抗原。
2.化学检查
2.1水分：应不高于3.0％(2015版《中国药典》通则0832)。
2.2 pH值：依法测定(2015版《中国药典》通则0631)，应为6.0-8.0。
2.3渗透压摩尔浓度：依法测定(2015版《中国药典》通则0632)，应为280-550mOsmol/kg。
2.4多糖含量：依法测定磷含量(2015版《中国药典》通则3103)，计算A群多糖含量；依法测定唾液酸含量(2015版《中国药典》通则3102)，以N-乙酰神经氨酸作为对照品，计算C群多糖含量；依法测定核糖含量(2015版《中国药典》通则3421)，计算b型流感嗜血杆菌多糖含量。每一次人用剂量含A群多糖10～15μg；C群多糖10～15μg；Hib多糖10～15μg。
2.5游离多糖含量：
A群：采用冷苯酚将结合物原液中与蛋白结合的多糖沉淀，分别测定沉淀前原液和沉淀后上清液中的磷含量(2015版《中国药典》通则3103)，计算A群游离多糖含量，应不高于20％。
C群：采用冷苯酚将结合物原液中与蛋白结合的多糖沉淀，分别测定沉淀前原液和沉淀后上清液中的唾液酸含量(2015版《中国药典》通则3102)，计算C群游离多糖含量，应不高于15％。
同法检测A群、C群多糖原液沉淀前后的磷含量和唾液酸含量，分别计算多糖回收率，应为80％～100％。
Hib：采用去氧胆酸钠(DOC)在酸性条件下能专一性地沉淀蛋白物质，多糖蛋白结合物在DOC-HCl的作用下沉淀下来，而游离多糖不被沉淀留存上清中。通过测定上清的核糖含量，以结合物总糖含量计算游离糖的比率，应不高于15％。
同法检测Hib活化多糖沉淀前后的多糖含量，分别计算多糖回收率，应为85％～115％。
3.效力试验：每批疫苗皮下注射12-14g NIH(或BaLb/c)小鼠，每组10只，另取同批小鼠10只作对照，注射生理氯化钠溶液，分别在第0天、第14天皮下注射1次，每次注射剂量分别含A群、C群、Hib多糖各2.5μg，于第一针后第21～28天采血，以Elisa法测定血清中抗A群、抗C群和抗Hib多糖IgG抗体滴度，以生理氯化钠溶液对照组小鼠血清的吸光度值求出Cutoff值。疫苗组抗体阳转率应不低于80％。
4.效价测定：采用免疫小鼠中和抗体测定法，以蚀斑减少中和试验测定中和抗体。参考疫苗(RA和RB)以及中和试验阳性血清由中国食品药品检定研究院提供。将被检疫苗(T)稀释成1∶32参考疫苗(R)按要求的稀释度稀释，分别腹腔免疫体重为12-14g小鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，间隔7天。第二次免疫后第7天采血，分离血清，同组小鼠血清等量混合，于56℃灭能30分钟。稀释阳性血清、被检疫苗血清和参考疫苗血清，分别与稀释病毒(约200PFU/0.4ml)等量混合，作为病毒对照，置37℃水浴90分钟，接种6孔细胞培养板BHK21细胞，每孔0.4ml，置37℃培养90分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，与37℃ 5％二氧化碳孵箱中培养5天，染色，蚀斑计数，计算被检疫苗和参考疫苗组对病毒对照组的蚀斑减少率。病毒对照组的蚀斑平均数应在50～150之间。
5.热稳定性试验：疫苗出厂前进行稳定性试验，于37℃放置7天，按上述效价测定方法进行效价测定，仍应合格。
6.牛血清白蛋白残留量：应不高于50ng/剂(2015版《中国药典》通则3411)。
7.抗生素残留量：采用酶联免疫法，应不高于50ng/剂。
8.Vero细胞DNA残留量：应不高于100pg/剂(2015版《中国药典》通则3407第一法)。
9.Vero细胞蛋白质残留量：采用酶联免疫法，应不高于2μg/ml。
10.无菌检查：应符合规定(2015版《中国药典》通则1101)。
11异常毒性检查：应符合规定(2015版《中国药典》通则1141)。
12.细菌内毒素检查：乙型脑炎灭活疫苗应不高于50EU/ml；A群C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗每1次人用剂量应不高于500EU(2015版《中国药典》通则1143)。
13.热源检查：依法检查(2015版《中国药典》通则1142)。注射剂量按家兔体重每1kg注射1ml，含多糖1μg(含A群多糖1.0μg、C群多糖1.0μg、Hib多糖1.0μg)。。
检查结果
试验结果表明，A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌/乙型脑炎联合疫苗是安全、有效的，完全符合拟定的《A、C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌/乙型脑炎联合疫苗制造及检定规程的要求》，可投入实际应用，实现本发明的目的。

Claims (13)

1.一种联合疫苗，其特征在于，含有A群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖-蛋白结合物，C群流行性脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖-蛋白结合物，b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-蛋白结合物，乙型脑炎灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于：所述的A群、C群脑膜炎球菌多糖结合物，b型流感嗜血杆菌结合物按以下方法制备：
(1)制备A群、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液：
(I)A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液：A群脑膜炎球菌工作种子批采用发酵罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜的方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，待沉淀充分解离后，加入冷却的乙醇至终浓度25％(v/v)，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖溶于含脱氧胆酸钠的Tris-HCl缓冲液中，再经过Capto adhere和DEAE SepharoseTMFF串联柱层析，收集层析流穿液，用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钙溶液，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液：
根据2015版《中国药典》三部中“A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液经CDAP活化，加入1、6-己二酰肼(ADH)反应2-4小时后除去CDAP和未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；检定合格后，将多糖衍生物与载体蛋白等质量混合，然后加入适量碳二亚胺(EDAC)冰水浴反应2-5小时，用0.2mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经SepharoseTM4FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即为A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液，于2-8℃保存：
(II)C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液：C群脑膜炎球菌工作种子批采用发酵罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜的方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，待沉淀充分解离后，加入冷却的乙醇至终浓度25％(v/v)，离心收集上清；于上述上清液中加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖溶于含脱氧胆酸钠的Tris-HCl缓冲液中，再经过Capto adhere和DEAE SepharoseTMFF串联柱层析，收集层析流穿液，用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钠溶液，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液：
根据2015版《中国药典》三部中“A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液，加入1、6-己二酰肼(ADH)反应2-4小时后除去未衍生的ADH，可采用超滤或透析等方法；检定合格后，将多糖衍生物与载体蛋白等质量混合，然后加入适量碳二亚胺(EDAC)冰水浴反应2-5小时，用0.2mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经SepharoseTM4FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，除菌过滤，即为C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液，于2-8℃保存：
(III)b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液：b型流感嗜血杆菌工作种子批采用培养罐液体培养，于对数生长期后期或静止期前期终止培养。取样进行菌液浓度测定、纯菌检查，合格后进行杀菌，可在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌或采用加热等适宜方法杀菌；将已杀菌的培养液离心后收集上清，澄清过滤后用100KD超滤膜包用10mmol/L PB超滤并浓缩至澄清液体积的1/10，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钠溶液，待沉淀充分解离后，加入乙醇至终浓度25％，离心收集上清；于上清液中加入乙醇至终浓度75％，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤，干燥后的沉淀物即为粗制多糖。粗制多糖用注射水溶解后，加入等体积的Tris-HCl-NaCl溶液，充分混匀，再加入适量的脱氧胆酸钠，充分搅拌，离心收集上清，上清用100KD超滤膜包用注射水超滤脱盐，收集超滤液，加入适量的氯化钙溶液，加入冷却的乙醇至终浓度75％(v/v)，充分摇匀，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮洗涤，干燥后用注射水溶解，即为纯化多糖原液：
根据2015版《中国药典》三部中“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”中检定要求，对多糖原液进行检定；检定合格的多糖原液，经高碘酸钠活化16-24小时，用10KD超滤膜包用注射水超滤，收集超滤液；检定合格后，将活化多糖与载体蛋白等质量混合，然后加入适量氰基硼氢化钠反应60-72小时，用0.15mol/L NaCl溶液超滤或透析，收集的超滤液或透析液经Phenylsepharose 6FF层析纯化，收集洗脱峰处的结合物，用100KD超滤膜包用生理盐水超滤后除菌过滤，即为b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液，于2-8℃保存：
(2)合并冻干：将A群、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按照1∶1∶1(w/w/w，以多糖计)混合后，加入蔗糖分装冻干，得到A、C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗。
3.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于：所述的乙型脑炎灭活疫苗按以下方法制备：
取乙脑工作细胞库中的Vero细胞，经复苏、扩增2-3代、与一定量的微载体Cytodex-1混合制备成细胞接种液；接种到生物反应罐内继续培养5-7天，然后按0.002MOI的比例接种乙脑毒种工作种子批，病毒感染后，连续收获病毒液；用0.65μm滤芯澄清病毒收获液，用300KD孔径膜包进行超滤浓缩，按终浓度1∶4000比例向病毒浓缩液中加入β-丙内酯灭活24小时，灭活结束后，将病毒灭活液置37℃下水解2小时；病毒灭活液经过SepharoseTM6FF进行柱层析或其它适宜的方法进行纯化，即为乙型脑炎灭活疫苗原液，于2-8℃保存；根据2015版《中国药典》三部中“冻干乙型脑炎灭活疫苗(Vero细胞)”中检定要求，对乙型脑炎灭活疫苗原液进行检定；检定合格的疫苗原液，经过配比稀释后即为乙型脑炎灭活疫苗。
4.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述组分A、C群脑膜炎球菌多糖结合-b型流感嗜血杆菌结合疫苗重量比例是按多糖计算，每一单位给药剂量的制剂中含A群、C群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的量分别在10-15μg之间。
5.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述组分A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗-b型流感嗜血杆菌结合疫苗按照多糖比例1∶1∶1混合后冻干。
6.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述组分A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗-b型流感嗜血杆菌结合疫苗中冻干辅料为蔗糖。
7.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述组分乙型脑炎灭活疫苗每一单位给药剂量的制剂中含乙脑病毒蛋白质含量在6-9μg之间。
8.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述组分乙型脑炎灭活疫苗为液体制剂。
9.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述组分脑膜炎球菌荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖各自偶联至载体蛋白上，如偶联至白喉CRM197蛋白、破伤风类毒素蛋白等。
10.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述组分A群、C群脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白是通过共价键结合的，其中，多糖与蛋白的加入量为1∶1，偶联过程中可加入己二酰肼。
11.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，所述组分b型流感嗜血杆菌荚膜多糖与载体蛋白是通过共价键结合的，其中，多糖与蛋白的加入量为1∶1，偶联过程中可加入氰基硼氢化钠。
12.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，是注射剂，用于皮下或肌肉注射。
13.根据权利要求1所述的联合疫苗，其特征在于，用于预防A群、C群脑膜炎奈瑟氏菌、b型流感嗜血杆菌、乙型脑炎病毒引起的感染的疫苗中的应用。
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