CN104225588B - b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种佐剂吸附b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法及冻干b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法，产品效果良好。本发明的制备方法，包括以下步骤：1)将b型流感嗜血杆菌多糖降解；2)对降解后的b型流感嗜血杆菌多糖进行活化；3)将活化的b型流感嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进行结合；4)对结合后的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物进行纯化。

Description

b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法

技术领域：

本发明涉及疫苗制备方法技术领域，提供了一种制备b型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合物的结合技术，基于此结合技术，制备出了具有较高免疫原性的b型流感嗜血杆菌结合疫苗。

背景技术：

b型流感嗜血杆菌(HaemophilusInfluenzaeTypeb，简称Hib)，是全世界儿童发病和死亡的主要原因之一，b型流感嗜血杆菌感染性疾病主要发生在5岁以下儿童，一旦被Hib感染，婴幼儿很有可能受到肺炎和脑膜炎等可怕疾病的侵袭，还可能并发严重的神经系统后遗症，包括耳聋、语言障碍或延迟、视力障碍、智力低下和运动功能异常等。目前研究发现，人类是Hib的唯一宿主，病菌的传播主要通过空气飞沫及与病菌携带者亲密接触。

Hib的荚膜多糖主要成分是多聚核糖基核糖醇磷酸盐(Polyriboseribitolphosphate，PRP)，是Hib的主要毒力因子之一，由此制备成的多糖疫苗具有一定的免疫预防效果，但由于多糖属于T细胞非依赖性抗原，因此抗体的产生与年龄具有相关性。成人接种后可产生免疫应答且抗体长期存在；2岁以上儿童接种疫苗后可产生抗体，但维持时间较短，并且重复接种也无加强反应；在免疫系统机能发育尚不完善的2岁以下婴幼儿中，不能有效刺激机体产生抗体。

Hib结合疫苗是将PRP以共价键的方式结合到具有免疫原性的蛋白载体上制备的。与多糖疫苗相比，Hib结合疫苗不仅能刺激婴幼儿机体产生强的免疫反应，而且再次接种也能加强反应，从而提高疫苗的保护性能。

多糖和蛋白质主要是通过化学方法进行偶联的，目前普遍运用的多糖蛋白结合物制备方法是：用CNBr活化Hib多糖并与己二酰肼连接制备衍生物，然后在碳二亚胺的作用下多糖衍生物通过己二酰肼的桥连作用与载体蛋白结合，最后经凝胶过滤层析纯化获得高分子多糖蛋白结合物。然而这种多糖蛋白结合物制备技术存在着以下不足：(1)工艺复杂，反应周期长；(2)EDAC在介导多糖ADH衍生物与载体蛋白结合的同时，容易引起载体蛋白的自身交联，形成载体蛋白的聚合物，从而降低多糖-蛋白的结合效率；(3)Hib荚膜多糖的分子大小分布不均，每个批次的分子大小分布存在较大差异，导致每批多糖蛋白结合疫苗的理化指标各异，影响生产工艺的稳定性、成品疫苗的批间稳定性和成品疫苗质量的一致性。

本发明提供了一种新的多糖蛋白结合方法，采用化学方法将Hib多糖降解成分子量均一的小分子多糖，减小多糖分子大小批间差异，生产工艺的稳定性和产品质量一致性显著提高。用CDAP活化多糖后直接与载体蛋白结合，不添加EDAC可避免载体蛋白的自身交联，缩短了生产周期，提高了结合物收率。

本发明还提供一种佐剂吸附b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法及冻干b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法，产品效果良好。

发明内容：

本发明提供了一种新的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物制备方法。

本发明进一步提供用本发明的方法制备的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗及其制剂。

本发明所述的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物的制备方法，包括以下步骤：

1)将b型流感嗜血杆菌多糖降解；

2)对降解后的b型流感嗜血杆菌多糖进行活化；

3)将活化的b型流感嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进行结合；

4)对结合后的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物进行纯化。

其中，步骤1)所述将b型流感嗜血杆菌多糖降解，方法为：

b型流感嗜血杆菌多糖用0.02mol/L～0.04mol/L乙酸钠溶液溶解(4～5mg/ml)，加入终浓度为0.5％～3％的过氧化氢，于50～60℃反应20～40分钟。用注射用水或2mol/L氯化钠溶液作为缓冲液，超滤或透析去除小分子物质，得到降解后的b型流感嗜血杆菌多糖。

其中，步骤2)所述对降解后的b型流感嗜血杆菌多糖进行活化，方法为

取降解后的多糖溶液，浓度控制在4-20mg/ml，加入CDAP，多糖投入量与CDAP比例为1:0.25～1:2，维持反应20～300秒。加入过量的三乙胺溶液，反应溶液pH值控制在8.5～10.5之间，冰浴或室温反应5～8分钟后，调pH值至8.3～8.9之间。

其中，步骤3)所述将活化的b型流感嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进行结合，

方法为：

根据多糖投入量，按1:0.5～1:3的比例加入纯化破伤风类毒素原液(以蛋白含量计算)，混匀后维持pH在8.3～8.9之间反应1～2小时。反应结束后调pH值至4.8～5.2之间，加入过量的甘氨酸溶液，30～60分钟后终止反应，用0.02～0.2mol/L氯化钠溶液作为缓冲液，超滤或透析去除小分子物质。

其中，步骤4)所述对结合后的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物进行纯化，方法为：

用0.02～0.2mol/L氯化钠溶液作为流动相，多糖-蛋白结合物经SephacrylS-400HR层析纯化，上样量不能超过柱体积的10％，收集K_D≤0.4的洗脱液段，适当稀释后经0.2μm无菌滤器除菌过滤后即得b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物。

本发明所述的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物的制备方法，优选的

步骤1)所述多糖降解，其中所述乙酸钠溶液浓度为0.01mol/L～0.10mol/L，最佳为0.02mol/L～0.04mol/L；所述多糖溶解浓度为1～10mg/ml，最佳为4～5mg/ml；所述加入的过氧化氢浓度为0.1～5％，最佳为0.5～3％，

步骤2)所述多糖活化，其中所述多糖投入量与CDAP比例为1:0.25～1:2(g/g)，维持反应20-300秒；诉述加入三乙胺浓度为0.2mol/L，反应时间5～8分钟，维持pH值8.5～10.5之间，后将溶液的pH值调至8.3～8.9之间，

步骤3)所述多糖蛋白结合，其中所述多糖与蛋白质加入的质量混合比例为1:0.5～1:3，更佳为1:0.8～1:1.5，最佳为1：1；所述维持pH值在8.0～9.0之间，更佳为8.3～8.9范围；所述反应时间为0.5～4小时，更佳为1～2小时；所述调整pH值4.5～6.0之间，更佳为4.8～5.2之间；所述过量甘氨酸溶液为1g多糖加入50～120g的1mol/L甘氨酸溶液；所述氯化钠溶液浓度为0.02～0.2mol/L，

步骤4)所述多糖蛋白结合物纯化，其中所述氯化钠溶液浓度为0.02～0.2mol/L；所述层析介质为SephacrylS-400HR凝胶；所述收集洗脱液为K_D≤0.4的洗脱液段。

本发明进一步包括，将上述纯化步骤所得的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物作为疫苗制剂的活性成分，根据制剂学的要求制备成疫苗制剂。

本发明优选的疫苗制剂为冻干剂型，其组分包括b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物、乳糖，氯化钠，其中，各组分的浓度为：

b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物(以多糖含量计)17～30μg/ml

乳糖0.6～1.4mg/ml

其制备方法包括如下步骤：

a)取检定合格的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液。

b)向b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液内加入赋形剂乳糖溶液，用注射用水稀释定容。

c)分装后置入冻干机中进行冻干得到b型流感嗜血杆菌结合疫苗。

本发明的疫苗制剂也可以为液体剂型，组分包括b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物、氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂，氯化钠，其中，各组分的浓度为：

b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物(以多糖含量计)17～30μg/ml

铝离子0.2～0.8mg/ml

氯化钠7.0～10.0mg/ml

其制备方法包括如下步骤：

a)取检定合格的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液。

b)制备氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂，检测佐剂铝离子含量及氯化钠浓度。

c)向b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液内加入佐剂、氯化钠溶液，用注射用水稀释定容。

d)2-8℃吸附过夜，分装，得到b型流感嗜血杆菌结合疫苗。

以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果。

传统b型流感嗜血杆菌-破伤风类毒素结合物原液的制备方法主要有两种：一种是传统的CNBr方法，即用CNBr活化Hib多糖并与己二酰肼连接制备衍生物，然后在碳二亚胺的作用下多糖衍生物通过己二酰肼的桥连作用与载体蛋白结合；另一种是传统的CDAP活化方法，与溴化氰方法相比，只是采用了较温和的活化剂CDAP。

本发明采用双氧水降解Hib多糖，采用CDAP活化降解多糖后直接与载体蛋白结合的方法与传统结合技术相比具有周期短、收率高，免疫原性好的特点，效果对比如表1所示：

表1传统结合技术与本发明技术效果对比结果

结合物液态保存，稳定性不高，存在易降解，游离糖逐渐升高，分子量逐渐变小的趋势。本发明通过将新结合技术制备所得的结合物用佐剂吸附或冻干方式来延长结合物的保存有效期，进而提高结合物的稳定性，同时能增强结合物的免疫效果。结合物及b型流感嗜血杆菌结合疫苗有效性对比实验结果如表2所示。

表2结合物及b型流感嗜血杆菌结合疫苗有效性对比实验结果

经过上述实验数据的比较发现本发明优点如下：

1)本发明提供了一种新的多糖蛋白结合方法，采用化学方法将Hib多糖降解成分子量均一的小分子多糖，用CDAP活化降解后的多糖并直接与载体蛋白结合。采用化学方法对多糖进行降解，减小多糖分子大小批间差异，生产工艺的稳定性和产品质量一致性显著提高，不添加EDAC可避免载体蛋白的自身交联，缩短了生产周期，提高了结合物收率。

2)本发明采用佐剂吸附b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液，与无佐剂b型流感嗜血杆菌结合疫苗相比，疫苗稳定性好，抗体滴度提高了4.9倍，佐剂吸附结合疫苗免疫原性显著提高。

3)本发明提供了一种冻干b型流感嗜血杆菌结合疫苗制备方法，与传统液体疫苗相比，具有稳定性好、有效期长，保存运输方便的特点。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：

实施例1：b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物制备

用0.02～0.04mol/L乙酸钠溶液将b型流感嗜血杆菌多糖溶解，使多糖浓度为4～5mg/ml。将溶液温度调至50～60℃，加入过氧化氢至终浓度0.5～3％，维持反应20～40分钟，用注射用水或2mol/L氯化钠溶液透析或超滤去除小分子物质。

取超滤后的b型流感嗜血杆菌多糖溶液，浓度控制在4～25mg/ml范围内，按照多糖(以多糖含量计算)与CDAP成1:0.25～1:2的比例加入CDAP，维持反应20～300秒。用0.2mol/L三乙胺溶液调节pH值至8.5～10.5之间，冰浴反应60秒，室温反应5分钟，将溶液的pH值调节至8.3～8.9之间。

按照多糖含量与蛋白含量成1:0.5～1:3(g/g)的比例称取破伤风类毒素原液，加入到活化的多糖溶液内混匀，维持溶液的pH值在8.3～8.9范围内反应1～2小时。按照1g多糖加入50～120g甘氨酸溶液的比例加入1mol/L甘氨酸溶液，维持溶液的pH值在4.8～5.2范围内反应30～60分钟，用0.02～0.2mol/L氯化钠溶液透析或超滤去除小分子物质。

采用SephacrylS-400HR凝胶对透析后的结合物进行纯化，0.02～0.2mol/L氯化钠溶液为缓冲溶液，上样量不超过柱体积的10％，收集K_D≤0.4的洗脱液段，适当稀释后用0.2μm除菌滤器除菌过滤，即得b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物。

实施例2：冻干b型流感嗜血杆菌结合疫苗制备

取检定合格的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液，搅拌下加入赋形剂乳糖溶液，然后用注射用水稀释至终浓度每毫升含b型流感嗜血杆菌多糖17～30μg，乳糖6.0～14.0mg，调pH值在5.0～7.0之间，分装后置入冻干机中进行冻干。先-40～-50℃预冻2～6小时，预冻完成后开始抽真空处理，将真空状态的冻干机温度调至-30～-35℃，并保持4小时以上，搁板以3～5℃/小时的速度升温至30～32℃，并维持在30～32℃的温度8～12小时，制品压塞出箱，即获得成品。

实施例3：佐剂吸附b型流感嗜血杆菌结合疫苗制备及免疫原性研究

取检定合格的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液，搅拌下加入磷酸铝佐剂或氢氧化铝佐剂、8.5％氯化钠溶液，然后用注射用水稀释至终浓度每毫升含b型流感嗜血杆菌多糖17～30μg，铝离子0.2～0.8mg，氯化钠7.0～10.0mg，调pH值在5.0～7.0之间，2～8℃吸附过夜。半成品检定合格后进行分装，每瓶装量0.6ml。

本发明是以小鼠为模型证实结合疫苗的免疫原性。选用SPF级小鼠，每组十只，每组注射0.5ml，多糖、多糖-蛋白结合物、氢氧化铝吸附多糖-蛋白结合物、磷酸铝吸附多糖-蛋白结合物多糖含量均为2.5μg。于1、14天皮下注射2次，第21-28天采血。采用Elisa法测定HibIgG抗体，以生理氯化钠溶液对照组，试验结果见表3。

表3Hib多糖、Hib-TT结合物小鼠免疫原性测定结果

实施例4佐剂吸附b型流感嗜血杆菌结合疫苗临床试验研究

该疫苗进行免疫原性及临床安全性评价，共招募1970名受试者，分为2-5月龄、6-11月龄、12-59月龄三组，按接种程序进行接种。采用同类疫苗作为阳性对照组，试验组与对照组随机比例1:1，所有受试者均完成安全性观察，获得1872份有效血样，血清检测结果如表4所示：

表4佐剂吸附b型流感嗜血杆菌结合疫苗临床免疫结果

从以上结果得出结论：佐剂吸附b型流感嗜血杆菌结合疫苗免疫2月龄～5岁婴幼儿后血清检测结果分析显示，血清抗体阳性率大于90％，总体受试人群长期抗体保护水平抗体阳转率达到97.87％，试验苗非劣效于对照疫苗。

本次临床研究观察到的试验苗与对照苗不良反映率无显著统计学差异，局部反应症状主要为发红和肿胀，全身反应症状为发热、乏力(嗜睡)，并且大多数为轻微反应，并且大多为轻微反应，未收集到严重不良反应。

Claims (8)

1.b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物的制备方法，包括以下步骤：

1)将b型流感嗜血杆菌多糖降解；

2)对降解后的b型流感嗜血杆菌多糖进行活化；

3)将活化的b型流感嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进行结合；

4)对结合后的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物进行纯化；

其中，步骤1)所述将b型流感嗜血杆菌多糖降解，方法为：

b型流感嗜血杆菌多糖用0.02mol/L～0.04mol/L乙酸钠溶液溶解到浓度4～5mg/ml，加入终浓度为0.5％～3％的过氧化氢，于50～60℃反应20～40分钟，用注射用水或2mol/L氯化钠溶液作为缓冲液，超滤或透析去除小分子物质，得到降解后的b型流感嗜血杆菌多糖；

其中，步骤2)所述对降解后的b型流感嗜血杆菌多糖进行活化，方法为：

取降解后的多糖溶液，浓度控制在4-20mg/ml，加入CDAP，多糖投入量与CDAP比例为1:0.25～2，维持反应20～300秒，加入过量的三乙胺溶液，反应溶液pH值控制在8.5～10.5之间，冰浴或室温反应5～8分钟后，调pH值至8.3～8.9之间；

其中，步骤3)所述将活化的b型流感嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进行结合，方法为：

根据多糖投入量，按1:0.5～3的比例加入以蛋白含量计算的纯化破伤风类毒素原液，混匀后维持pH在8.3～8.9之间反应1～2小时，反应结束后调pH值至4.8～5.2之间，加入过量的甘氨酸溶液，30～60分钟后终止反应，用0.02～0.2mol/L氯化钠溶液作为缓冲液，超滤或透析去除小分子物质；

其中，步骤4)所述对结合后的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物进行纯化，方法为：

用0.02～0.2mol/L氯化钠溶液作为流动相，多糖-蛋白结合物经SephacrylS-400HR层析纯化，上样量不能超过柱体积的10％，收集K_D≤0.4的洗脱液段，适当稀释后经0.2μm无菌滤器除菌过滤后即得b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物。

2.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，

其中，步骤1)所述多糖降解，其中所述乙酸钠溶液浓度为0.02mol/L～0.04mol/L，所述多糖溶解浓度为4～5mg/ml，所述加入的过氧化氢浓度为0.5％～3％，

其中，步骤2)所述多糖活化，其中所述多糖投入量与CDAP比例为1:0.25～1:2(g/g)，维持反应20-300秒；所述加入三乙胺浓度为0.2mol/L，反应时间5～8分钟，维持pH值8.5～10.5之间，后将溶液的pH值调至8.3～8.9之间，

其中，步骤3)所述多糖蛋白结合，其中所述多糖与蛋白质加入的质量混合比例为1:0.5～1:3，所述维持pH值在8.3～8.9之间，所述反应时间为1～2小时，所述调整pH值4.8～5.2之间，所述过量甘氨酸溶液为1g多糖加入50～120g的1mol/L甘氨酸溶液；所述氯化钠溶液浓度为0.02～0.2mol/L，

其中，步骤4)所述多糖蛋白结合物纯化，其中所述氯化钠溶液浓度为0.02～0.2mol/L；所述层析介质为SephacrylS-400HR凝胶；所述收集洗脱液为K_D≤0.4的洗脱液段。

3.如权利要求2中所述的制备方法，其特征在于，

其中，步骤1)所述多糖降解，其中所述乙酸钠溶液浓度为0.02mol/L～0.04mol/L；所述多糖溶解浓度为4～5mg/ml；所述加入的过氧化氢浓度为0.5～3％，

其中，步骤3)所述多糖蛋白结合，其中所述多糖与蛋白质加入的质量混合比例为1:0.8～1:1.5，所述维持pH值在8.3～8.9范围；所述反应时间为1～2小时；所述调整pH值为4.8～5.2之间；所述过量甘氨酸溶液为1g多糖加入50～120g的1mol/L甘氨酸溶液；所述氯化钠溶液浓度为0.02～0.2mol/L。

4.如权利要求3中所述的制备方法，其特征在于，

其中，步骤3)所述多糖蛋白结合，其中所述多糖与蛋白质加入的质量混合比例为1：1。

5.用权利要求1-4任何一项制备方法制备的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物。

6.以权利要求5所述的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物作为活性成分制备的疫苗制剂。

7.根据权利要求6所述的疫苗制剂，其特征在于，为冻干制剂，组分包括b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物、乳糖，其中，各组分的浓度为：

b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物以多糖含量计17～30μg/ml

乳糖0.6～1.4mg/ml

其制备方法，包括如下步骤：

1)取检定合格的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液，

2)向b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液内加入乳糖溶液，用注射用水稀释定容，

3)分装后置入冻干机中进行冻干：先-40～-50℃预冻2～6小时，预冻完成后开始抽真空处理，将真空状态的冻干机温度调至-30～-35℃，并保持4小时以上，搁板以3～5℃/小时的速度升温至30～32℃，并维持在30～32℃的温度8～12小时，制品压塞出箱，即获得成品。

8.根据权利要求7所述的疫苗制剂，其特征在于，为液体制剂，组分包括b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物、氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂，氯化钠，其中，各组分的浓度为：

b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物以多糖含量计17～30μg/ml

铝离子0.2～0.8mg/ml

氯化钠7.0～10.0mg/ml

其制备方法，包括如下步骤：

1)取检定合格的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液，

2)制备氢氧化铝佐剂或磷酸铝佐剂，检测佐剂铝离子含量及氯化钠浓度，

3)向b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物原液内加入佐剂、氯化钠溶液，用注射用水稀释定容，

4)2-8℃吸附过夜，分装得到b型流感嗜血杆菌结合疫苗。