CN111588842A - 一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，包括多糖‑蛋白偶联物的制备；所述多糖为单价肺炎球菌荚膜多糖；所述蛋白为白喉CRM197蛋白；所述多糖‑蛋白偶联物的具体制备步骤包括：将白喉CRM197蛋白原液调节pH至4.0～7.0，加入活化剂(碳化二亚胺EDC)、偶联剂(N‑羧基琥珀酰亚胺sNHS)，活化反应后，得活化液；再将活化液加入单价肺炎球菌荚膜多糖原液中，偶联反应后，纯化，即完成多糖‑蛋白偶联物的制备。本发明可以有效解决肺炎球菌结合疫苗制备工艺中，肺炎球菌荚膜多糖、结合蛋白、多糖蛋白偶联物的制备，并最终配制成肺炎球菌结合疫苗。

Description

一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体是一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法。
背景技术
肺炎球菌(又称肺炎链球菌)是一种广泛定植于人类鼻咽部，它是引起社区获得性肺炎的主要因素。肺炎球菌引起的疾病是导致全球5岁以下儿童死亡的重要原因，据估计，在中国每年有大约3万名5岁以下儿童死于各种肺炎球菌性疾病。在欠发达的中、低经济收入国家，肺炎球菌在幼儿群体中的定植时间早于发达国家，成人的携带率也明显高于发达国家，可达到40％；发达国家儿童鼻咽部肺炎球菌携带率为27％，而在发展中国家达到85％；在欧洲国家和美国，30％～50％成人获得性肺炎是由肺炎球菌引起的。另外，随着肺炎球菌多重耐药问题的日益严重，肺炎球菌性疾病的临床治疗也愈发困难。因此，接种肺炎疫苗来抵御肺炎球菌的危害是非常必要的。
肺炎球菌的荚膜多糖可以作为抗原成分，其可以制备成多糖疫苗或者多糖蛋白结合疫苗。
肺炎球菌多糖疫苗，是以经过纯化的肺炎球菌荚膜多糖作为主要成分制备的疫苗。把不同血清型的荚膜多糖混合在一起，则制备成多价疫苗。自从上世纪80年代23价肺炎球菌多糖疫苗问世至今，对于预防肺炎球菌的感染起到了非常积极的作用。但是，这种荚膜多糖为非T细胞依赖抗原，多糖疫苗存在一定的局限性：免疫原性较弱，不能产生免疫记忆；过了免疫保护期(一般5年)后，再次接种时，出现免疫抑制，无免疫应答；对于免疫系统处在发育阶段的婴幼儿免疫原性不足；在某些特定人群中免疫应答会受到影响，如人类免疫缺陷病毒感染者、恶性血液病患者和骨髓移植者；不能降低鼻咽部肺炎球菌带菌率，而不能防御黏膜肺炎球菌感染以及耐药肺炎球菌传播。
肺炎球菌结合疫苗，是把免疫原性较弱的荚膜多糖抗原与载体蛋白共价结合后制备的疫苗。同样，也可以把多种血清型的荚膜多糖蛋白结合物混合在一起，制备成多价结合疫苗。Wyeth公司的13价结合疫苗Prevenarl3在2010年获批上市，展示出良好的免疫原性。目前，世界上澳大利亚、日本、美国及一些欧洲国家已经把肺炎球菌结合疫苗纳入计划免疫中。
最近几年，我国的肺炎疫苗的研制也有较快的进展，但是结合疫苗的研制对技术要求极高。因此，开发出肺炎球菌结合疫苗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，以解决肺炎球菌结合疫苗制备工艺中，肺炎球菌荚膜多糖、结合蛋白、多糖蛋白偶联物的制备，并最终配制成肺炎球菌结合疫苗。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，具体制备步骤包括：多糖-蛋白偶联物的制备；
所述多糖为单价肺炎球菌荚膜多糖；所述蛋白为白喉CRM197蛋白；
所述多糖-蛋白偶联物的具体制备步骤包括：将白喉CRM197蛋白原液调节pH至4.0～7.0，加入活化剂、偶联剂，活化反应后得活化液；再将活化液加入单价肺炎球菌荚膜多糖原液中，偶联反应后纯化，即完成多糖-蛋白偶联物的制备。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
上述技术方案对肺炎球菌荚膜多糖-白喉CRM197蛋白偶联，在酸性条件下CRM197上的羧基可被活化，形成活化的中间体，此中间体可以迅速被转化成相对稳定的结构，在碱性条件下与肺炎荚膜多糖的氨基结合，形成多糖-蛋白偶联物，再经纯化可以去除掉未参与反应的物质和未结合的成分，即可获得纯偶联物；
采用EDC/sNHS组合进行肺炎荚膜多糖和白喉CRM197蛋白组合的偶联，具有无毒、细胞相容性好、效率高、反应条件温和、多种离子强度和pH条件下均可反应的优点。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，具体制备步骤包括：多糖-蛋白偶联物的制备；
所述多糖为单价肺炎球菌荚膜多糖；所述蛋白为白喉CRM197蛋白；
上述技术方案选用的白喉CRM197蛋白是经改良后变为无毒的白喉毒素，但仍然保留白喉毒素的生物特性，更适宜做为蛋白结合载体。
所述多糖-蛋白偶联物的具体制备步骤包括：将白喉CRM197蛋白原液调节pH至4.0～7.0，加入活化剂、偶联剂，活化反应后得活化液；再将活化液加入单价肺炎球菌荚膜多糖原液中，偶联反应后纯化，即完成多糖-蛋白偶联物的制备。
进一步的，所述活化剂为碳化二亚胺(EDC)，所述偶联剂为N-羧基琥珀酰亚胺(sNHS)。
进一步的，所述白喉CRM197蛋白为无毒的白喉毒素。
上述技术方案选用碳化二亚胺(EDC)和N-羧基琥珀酰亚胺(sNHS)组合进行多糖-蛋白偶联，EDC在酸性条件下活化CRM197上的羧基，形成活化中间体，此中间体可以迅速被sNHS转化成相对稳定的sNHS-ester，在碱性条件下与肺炎荚膜多糖的氨基结合，形成多糖-蛋白偶联物。经柱层析纯化去掉未结合的成分，即可获得纯偶联物。
进一步的，所述具体制备步骤包括：肺炎球菌荚膜多糖原液制备。
进一步的，所述肺炎球菌荚膜多糖原液制备包括：肺炎菌种复苏；菌种扩增；发酵罐接种；收获杀菌；多糖纯化。
进一步的，所述多糖纯化包括：用乙醇溶液沉淀多糖，离心后收集沉淀，经复溶后进行浓缩，再进行层析纯化，收集多糖峰，经膜除菌过滤即为肺炎球菌荚膜多糖原液。
上述技术方案的纯化工艺中，使用乙醇沉淀能去除核酸以及杂蛋白，超滤浓缩后利用色谱柱方法会获得更纯的多糖。
进一步的，所述肺炎球菌荚膜多糖原液制备过程中，采用的培养基配方包括以下重量份数的原料组成：20～30份蛋白胨，2～4份葡萄糖，0.4～0.6份磷酸氢二钠，2.5～3.0份碳酸氢钠，800～1000份水。
上述技术方案在筛选培养基组分的过程中，创造性的选用上述几种组分的组合，能适宜肺炎球菌的生长；
进一步的，所述浓缩为：浓缩至复溶后溶液体积的1/20-1/60。
进一步的，所述具体制备步骤包括：白喉CRM197蛋白的制备。
进一步的，所述白喉CRM197蛋白的制备包括：菌种复苏；菌种扩增；发酵罐接种；收获；纯化。
实施例1
肺炎菌种复苏：菌种自-80℃冰箱取出后，无菌操作用培养基融化，并转移至装有培养基的试管中，130rpm、37℃条件下培养。
菌种扩增：复苏菌种经生长，密度达到对数生长后期，按照1：10比例转种至摇瓶中，130rpm、37℃条件下培养。
发酵罐接种：当菌种液数量足够时，按照1：10比例转种至发酵罐中，80rpm、37℃条件下培养。
收获杀菌：当细菌生长至对数生长后期或静止前期停止培养，向菌液中加入终浓度为0.1％去氧胆酸钠，搅拌2小时杀菌。离心后，收集上清。
多糖纯化：用浓度为75％的乙醇溶液沉淀多糖，离心后收集沉淀，经复溶后进行浓缩，浓缩至复溶后溶液体积的1/20，再进行层析纯化，收集多糖峰，经膜除菌过滤即为肺炎球菌荚膜多糖原液；-20℃以下保存。
b.白喉CRM197蛋白的制备
CRM197菌种复苏：菌种自-80℃冰箱取出后，无菌操作用培养基融化，并转移至装有培养基的试管中，130rpm、37℃条件下培养。
菌种扩增：复苏菌种经生长，密度达到对数生长后期，按照1：10比例转种至摇瓶中，130rpm、37℃条件下培养。
发酵罐接种：当菌种液数量足够时，按照1：10比例转种至发酵罐中，80rpm、37℃条件下培养。
收获：当细菌生长至对数生长后期停止培养，离心后收集上清。
纯化：上清用饱和硫酸铵沉淀，收集上清用30kD膜包进行3倍浓缩，经膜除菌过滤即为白喉CRM197原液；-20℃以下保存。
c.多糖-蛋白偶联物的制备
CRM197活化：将CRM197原液用1M HCl调pH值至4.0，加入碳化二亚胺(EDC)和N-羧基琥珀酰亚胺(sNHS)，200rpm条件下，室温反应15分钟。
多糖-蛋白偶联：按照1：1的比例将CRM197活化物迅速加入单价肺炎球菌荚膜多糖原液中，200rpm条件下，室温反应2小时。
纯化：将上述偶联产物经分子筛层析纯化后，即获得多糖-蛋白偶联物原液。
d.制剂
半成品配制：将多种单价多糖-蛋白偶联物逐一按照荚膜多糖终含量2μg/mL混合，并加入磷酸铝，搅拌均匀，即为半成品。
分装：按0.5mL/剂进行分装，检定合格，包装后即为成品，2℃保存。
所述培养基包括以下重量份数的原料组成：20份蛋白胨，2份葡萄糖，0.4份磷酸氢二钠，2.5份碳酸氢钠，800份水。
实施例2
肺炎菌种复苏：菌种自-60℃冰箱取出后，无菌操作用培养基融化，并转移至装有培养基的试管中，100rpm、35℃条件下培养。
菌种扩增：复苏菌种经生长，密度达到对数生长后期，按照1：50比例转种至摇瓶中，100rpm、35℃条件下培养。
发酵罐接种：当菌种液数量足够时，按照1：50比例转种至发酵罐中，100rpm、36℃条件下培养。
收获杀菌：当细菌生长至对数生长后期或静止前期停止培养，向菌液中加入终浓度为0.2％去氧胆酸钠，搅拌3小时杀菌。离心后，收集上清。
多糖纯化：用浓度为85％的乙醇溶液沉淀多糖，离心后收集沉淀，经复溶后进行浓缩，浓缩至复溶后溶液体积的1/60，再进行分子筛层析纯化，收集多糖峰，经膜除菌过滤即为肺炎球菌荚膜多糖原液；-18℃以下保存。
b.白喉CRM197蛋白的制备
CRM197菌种复苏：菌种自-60℃冰箱取出后，无菌操作用培养基融化，并转移至装有培养基的试管中，100rpm、35℃条件下培养。
菌种扩增：复苏菌种经生长，密度达到对数生长后期，按照1：50比例转种至摇瓶中，100rpm、35℃条件下培养。
发酵罐接种：当菌种液数量足够时，按照1：50比例转种至发酵罐中，100rpm、35℃条件下培养。
收获：当细菌生长至静止前期停止培养，离心后收集上清。
纯化：上清用饱和硫酸铵沉淀，收集上清用50kD膜包进行5倍浓缩，经膜除菌过滤即为白喉CRM197原液；-18℃以下保存。
c.多糖-蛋白偶联物的制备
CRM197活化：将CRM197原液用1M HCl调pH值至5.0，加入碳化二亚胺(EDC)和N-羧基琥珀酰亚胺(sNHS)，300rpm条件下，室温反应25分钟。
多糖-蛋白偶联：按照1：1的比例将CRM197活化物迅速加入单价肺炎球菌荚膜多糖原液中，300rpm条件下，室温反应4小时。
纯化：将上述偶联产物经分子筛层析纯化后，即获得多糖-蛋白偶联物原液。
d.制剂
半成品配制：将多种单价多糖-蛋白偶联物按照终含量5μg/mL混合，并加入磷酸铝，搅拌均匀，即为半成品。
分装：按0.5mL/剂进行分装，检定合格，包装后即为成品，2℃保存。
所述培养基包括以下重量份数的原料组成：25份蛋白胨，3份葡萄糖，0.5份磷酸氢二钠，3.0份碳酸氢钠，900份水。
实施例3
肺炎菌种复苏：菌种自-70℃冰箱取出后，无菌操作用培养基融化，并转移至装有培养基的试管中，150rpm、38℃条件下培养。
菌种扩增：复苏菌种经生长，密度达到对数生长后期，按照1：100比例转种至摇瓶中，150rpm、38℃条件下培养。
发酵罐接种：当菌种液数量足够时，按照1：100比例转种至发酵罐中，180rpm、38℃条件下培养。
收获杀菌：当细菌生长至对数生长后期或静止前期停止培养，向菌液中加入终浓度为0.3％去氧胆酸钠，搅拌3小时杀菌。离心后，收集上清。
多糖纯化：用浓度为70％的乙醇溶液沉淀多糖，离心后收集沉淀，经复溶后进行浓缩，浓缩至复溶后溶液体积的1/50，再进行分子筛层析纯化，收集多糖峰，经膜除菌过滤即为肺炎球菌荚膜多糖原液；-22℃以下保存。
b.白喉CRM197蛋白的制备
CRM197菌种复苏：菌种自-70℃冰箱取出后，无菌操作用培养基融化，并转移至装有培养基的试管中，150rpm、38℃条件下培养。
菌种扩增：复苏菌种经生长，密度达到对数生长后期，按照1：100比例转种至摇瓶中，150rpm、38℃条件下培养。
发酵罐接种：当菌种液数量足够时，按照1：100比例转种至发酵罐中，180rpm、38℃条件下培养。
收获：当细菌生长至对数生长后期停止培养，离心后收集上清。
纯化：上清用饱和硫酸铵沉淀，收集上清用45kD膜包进行3倍浓缩，经膜除菌过滤即为白喉CRM197原液；-18℃以下保存。
c.多糖-蛋白偶联物的制备
CRM197活化：将CRM197原液用1M HCl调pH值至7.0，加入碳化二亚胺(EDC)和N-羧基琥珀酰亚胺(sNHS)，400rpm条件下，室温反应35分钟。
多糖-蛋白偶联：按照1：1的比例将CRM197活化物迅速加入单价肺炎球菌荚膜多糖原液中，500rpm条件下，室温反应5小时。
纯化：将上述偶联产物经层析纯化后，即获得多糖-蛋白偶联物原液。
d.制剂
半成品配制：将多种单价多糖-蛋白偶联物按照终含量3μg/mL混合，并加入磷酸铝，搅拌均匀，即为半成品。
分装：按0.5mL/剂进行分装，检定合格，包装后即为成品，8℃保存。
所述培养基包括以下重量份数的原料组成：20份蛋白胨，2份葡萄糖，0.4份磷酸氢二钠，2.5份碳酸氢钠，800份水。
实施例4
本实施例相比于实施例1而言，区别在于：培养基采用等质量的牛肉膏取代蛋白胨，其余条件不变。
实施例5
本实施例相比于实施例1而言，区别在于：采用等质量的乳糖取代肺炎荚膜多糖，其余条件保持不变。
实施例6
本实施例相比于实施例1而言，区别在于：未加入偶联剂，其余条件保持不变。
将实施例1-6所得产品进行性能测试，具体测试方式和测试结果如表1所示：
将等量的实施例1-6产品注射至小白鼠样本中，5天后，选取活体小白鼠，再对小白鼠注射等量的肺炎球菌，留观7天，观察小鼠是否发生肺炎症状，计算得到不同产品的肺炎球菌杀灭率。
表1：产品性能测试结果
Figure BDA0002478991660000121
Figure BDA0002478991660000131
由表1测试结果可知，采用本发明技术方案制备得到的产品产生了良好的免疫反应，对肺炎球菌具有良好的杀灭效果。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (10)

1.一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，具体制备步骤包括：多糖-蛋白偶联物的制备；
所述多糖为单价肺炎球菌荚膜多糖；所述蛋白为白喉CRM197蛋白；
所述多糖-蛋白偶联物的具体制备步骤包括：将白喉CRM197蛋白原液调节pH至4.0～7.0，加入活化剂、偶联剂，活化反应后得活化液；再将活化液加入单价肺炎球菌荚膜多糖原液中，偶联反应后，纯化，即完成多糖-蛋白偶联物的制备。
2.根据权利要求1所述的一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述活化剂为碳化二亚胺，所述偶联剂为N-羧基琥珀酰亚胺。
3.根据权利要求1所述的一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述白喉CRM197蛋白为无毒的白喉毒素。
4.根据权利要求1所述的一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述具体制备步骤包括：肺炎球菌荚膜多糖原液制备。
5.根据权利要求4所述的一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述肺炎球菌荚膜多糖原液制备包括：肺炎菌种复苏；菌种扩增；发酵罐接种；收获杀菌；多糖纯化。
6.根据权利要求5所述的一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述多糖纯化包括：用乙醇溶液沉淀多糖，离心后收集沉淀，经复溶后进行浓缩，再进行层析纯化，收集多糖峰，经膜除菌过滤即为肺炎球菌荚膜多糖原液。
7.根据权利要求4或5任一项所述的一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述肺炎球菌荚膜多糖原液制备过程中，采用的培养基配方包括以下重量份数的原料组成：20～30份蛋白胨，2～4份葡萄糖，0.4～0.6份磷酸氢二钠，2.5～3.0份碳酸氢钠，800～1000份水。
8.根据权利要求6所述的一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述浓缩为：浓缩至复溶后溶液体积的1/20～1/60。
9.根据权利要求1所述的一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述具体制备步骤包括：白喉CRM197蛋白的制备。
10.根据权利要求8所述的一种多价肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述白喉CRM197蛋白的制备包括：菌种复苏；菌种扩增；发酵罐接种；收获；纯化。
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