KR102493192B1 - 살모넬라 타이피 유래의 피막 다당류-단백질 접합체를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents
살모넬라 타이피 유래의 피막 다당류-단백질 접합체를 포함하는 백신 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 살모넬라 타이피 유래의 피막 다당류-단백질 접합체를 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로, 살모넬라 타이피 생장 및 Vi 피막 다당류 발현에 최적인 배양 조건을 확립하고, 정제된 Vi 피막 다당류를 접합 단백질에 접합시켜 특정 평균분자량을 가지는 접합체를 제조하였으며, 본 발명의 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 면역원성이 우수한 것을 확인하였다. 본 발명의 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법, 이에 의해 제조된 접합체를 장티푸스 예방에 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 살모넬라 타이피 유래의 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법, 상기 제조 방법으로 제조된 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
장티푸스는 살모넬라 엔테리카 혈청형 타이피(Salmonella enterica serotype Typhi, Salmonella typhi)에 의해서 발병하는 전염병으로 알려져 있다. 현재 대부분의 장티푸스는 위생 환경이 좋지 않거나 깨끗한 물을 구하기 힘든 개발도상국이나 후진국에서 주로 발병하며, 해마다 수백만 명의 사람을 감염시킨다.
급성 장티푸스열을 보이는 환자의 혈액과 골수에서 분리한 모든 균주에서 Vi 다당류가 발현된다고 알려져 있다. Vi 피막 다당류(capsular polysaccharide, 이하 "Vi 다당류")는 장티푸스를 일으키는 병원성 인자로서 주요한 방어 항원이다.
Vi 다당류는 (α1-4)-2-데옥시-2-N-아세틸갈락투론산((α1-4)-2-deoxy-2-N-acetyl galacturonic acid)으로 다당류와 유사하게 반복되는 구조로 이루어져 있으며, 흉선 비의존성 항원으로 분류된다. 흉선 비의존성 항원은 T-세포 독립성 항원이며, 흉선 의존성 항원은 T-세포 의존성 항원이다. 흉선 의존성 항원은 단백질과 같은 화학적 성상을 가지며, 항체 반응시 B 세포를 활성화하기 위해 B 세포는 T 헬퍼 세포와의 직접적인 접촉을 필요로 하므로 T 세포에 의존적이며, 면역 기억에 의한 2차 반응이 가능하다. 반면 흉선 비의존성 항원은 다당류와 같은 화학적 성상을 가지며, T 세포가 면역 반응을 돕는 것이 불가능하므로 T 세포에 대해 독립적이다. 또한, 일부 항원에서만 면역 기억에 의한 2차 반응이 관찰된다.
즉, Vi 다당류는 흉선 비의존성 항원이므로, 2세 이하의 유아에게서는 면역원성이 크게 떨어지고, 면역기억 작용이 제한되며, 부스팅 효과도 없다고 알려져 있다. 따라서, Vi 다당류의 면역원성을 증진시키기 위해서는 IgM에서 IgG-분비 B 세포로의 전환에 필요한 활성화된 항원 특이적 CD4 T 보조 림프구와의 반응을 유도할 수 있어야 하고, 이는 Vi 다당류를 접합 단백질에 접합시킴으로써 달성된다.
장티푸스 백신에는 전세포 백신(whole cell vaccine), 약독화 생백신(live attenuated vaccine), 아단위 백신(subunit vaccine) 등이 있으며, 약독화 생백신으로는 Ty21 경구용 백신이 판매되고 있고, 아단위 백신으로는 Vi 다당류 백신이 세계적으로 상용화되어 판매되고 있으나, 장기적인 면역이 보장되지 않아 차세대 장티푸스 백신에 대한 요구가 크다.
Thiem 등에 의해 살모넬라 타이피의 피막 다당류가 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 재조합 외부단백질 A에 결합된 Vi-rEPA 접합체를 포함하는 장티푸스 접합 백신이 개발되었다(비특허문헌 1). 또한 F. Micoli 등의 논문에 시트로박터 프룬디(Citrobacter freundii) 유래의 Vi 다당류와 CRM197의 접합체의 장티푸스 백신이 개시되어 있다(비특허문헌 2). 하지만 접합 백신 형태의 제품은 출시되지 않은 실정이며 계속적인 개발을 필요로 하고 있다.
이에 본 발명에서는 디프테리아 톡소이드와 Vi 다당류를 화학적인 방법으로 접합하여 우수한 면역원성을 기대할 수 있는 백신 조성물을 개발하였다.
Thiem et al., Clin Vac. Immunol., 2011, 18, 730-735
Micoli et al., Vaccine. 2011, 30, 853-861
T-세포 독립성 항원인 살모넬라 타이피 균의 Vi 피막 다당류의 면역원성을 증진시키는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 측면은 하기 단계를 포함하는 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법을 제공한다: a) 살모넬라 타이피 균을 배양하여 배양액을 제조하는 단계; b-1) 배양액을 한외여과하는 단계; b-2) 세타블론을 이용하여 Vi 피막 다당류를 선택적으로 분리하는 단계; b-3) 에탄올 침전을 이용하여 Vi 피막 다당류를 정제하여 정제된 Vi 피막 다당류를 제조하는 단계; c) 접합 단백질을 유도체화하는 단계; 및 d) 상기 정제된 Vi 피막 다당류와 유도체화 접합 단백질을 접합하여 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 제조하는 단계.
본 발명의 다른 측면은, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체로서, 살모넬라 타이피 유래의 Vi 피막 다당류가 디프테리아 톡소이드에 접합된 접합체이고, 상기 Vi 피막 다당류의 평균분자량이 500kda 내지 1000kda이며, 상기 Vi 피막 다당류와 디프테리아 톡소이드가 접합된 접합체의 평균분자량은 2000kda 내지 4000kda인, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 장티푸스 예방용 면역원성 조성물을 제공한다. 또한, 상기 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 포유 동물에서 면역 반응을 발생시키기 위한 면역원성 조성물을 제공한다. 상기 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 포유 동물에서 항원 특이적 CD4 T 보조 림프구와의 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 장티푸스 예방용 면역원성 조성물의 제형화 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 약학적으로 허용되는 담체와 상기 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 대상체에서 장티푸스를 예방하기 위한 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 약학적으로 허용되는 담체와 상기 장티푸스 예방용 면역원성 조성물을 포함하는 대상체에서 장티푸스를 예방하기 위한 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 장티푸스 접합 백신 제조 방법을 이용하여 장기적인 면역력을 유도하며 2세 이하의 유아에서도 효력이 우수한 접합 백신을 제조할 수 있다.
도 1은 살모넬라 타이피의 본배양시 생장 곡선을 나타낸다.
도 2는 Vi 피막 다당류 농도, 세타블론 농도 및 pH에 따른 엔도톡신 함량과 수율에 대한 결과를 나타낸다.
도 3은 접합 공정 시 접합 단백질(DT) 및 Vi 피막 다당류(Vi)의 반응 비율에 따른 면역원성 확인 결과이다.
도 4는 접합체의 Vi 피막 다당류(S)와 접합 단백질(P)의 함량에 따른 면역원성 확인 결과이다.
도 5는 유리당류 함량에 따른 면역원성 확인 결과이다.
도 6은 접합체 내 Vi 피막 다당류의 O-acetyl 함량에 따른 면역원성 확인 결과이다.
도 2는 Vi 피막 다당류 농도, 세타블론 농도 및 pH에 따른 엔도톡신 함량과 수율에 대한 결과를 나타낸다.
도 3은 접합 공정 시 접합 단백질(DT) 및 Vi 피막 다당류(Vi)의 반응 비율에 따른 면역원성 확인 결과이다.
도 4는 접합체의 Vi 피막 다당류(S)와 접합 단백질(P)의 함량에 따른 면역원성 확인 결과이다.
도 5는 유리당류 함량에 따른 면역원성 확인 결과이다.
도 6은 접합체 내 Vi 피막 다당류의 O-acetyl 함량에 따른 면역원성 확인 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은 하기 단계를 포함하는 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법을 제공한다: a) 살모넬라 타이피 균을 배양하여 배양액을 제조하는 단계; b-1) 배양액을 한외여과하는 단계; b-2) 세타블론을 이용하여 Vi 피막 다당류를 선택적으로 분리하는 단계; b-3) 에탄올 침전을 이용하여 Vi 피막 다당류를 정제하여 정제된 Vi 피막 다당류를 제조하는 단계; c) 접합 단백질을 유도체화하는 단계; 및 d) 상기 정제된 Vi 피막 다당류와 유도체화 접합 단백질을 접합하여 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 제조하는 단계.
하기 "1. 살모넬라 타이피의 배양", "2. 살모넬라 타이피 유래 Vi 피막 다당류의 정제", "3. 접합 단백질의 유도체화 반응", "4. Vi 다당류와 접합 단백질의 접합 반응" 항목에서 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법에 대해 상세히 설명한다.
1.
살모넬라 타이피의 배양
본 항목에서는 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법 중 'a) 살모넬라 타이피 균을 배양하여 배양액을 제조하는 단계'에 대해서 설명한다.
본 발명에 사용된 균주는 살모넬라 타이피(Salmonella typhi)를 포함한다.
살모넬라 타이피의 배양에 사용되는 복합 배지의 조성은 인산염 완충액과 탄소원, 질소원, 효모추출물, 미량원소로 이루어져 있다. 인산염 완충액은 NaH2PO4, Na2HPO4, 또는 K2HPO4, KH2PO4 일 수 있다.
탄소원은 글루코스(glucose), 프럭토스(fructose), 수크로스(sucrose), 락토스(lactose), 갈락토스(galactose), D-소비톨(D-sorbitol)를 사용할 수 있고, 글루코스를 주로 사용한다.
질소원은 카제인이 사용되며 산분해 카제인 또는 효소분해 카제인일 수 있고, 구체적으로 효소분해 카제인일 수 있다. 효소분해 카제인이 살모넬라 타이피의 생장 및 Vi 피막 다당류 발현에 효과적이다. 본 발명의 일 실시태양에서는 산분해 카제인 및 효소분해 카제인을 각각 사용한 살모넬라 타이피 배양에서, 효소분해 카제인을 사용하면 산분해 카제인을 사용한 경우에 비해서 살모넬라 타이피의 생장이 증가하고, Vi 피막 다당류 발현에 효과적인 것을 확인하였다(실시예 1 및 비교예 1 참조).
효모추출물은 한외 여과(ultra filtration) 처리를 가한 것 또는 처리를 하지 않은 것을 포함하며, 질소원으로 사용한다.
미량원소는 KH2PO4, K2HPO4, NaH2PO4, Na2HPO4, FeSO4, MgSO4, MgCl2, CaCl2, CuSO4, ZnSO4, MnSO4, MnCl2, FeCl3, NaHCO3, KHSO4, KCl, NaCl 및 CaCO3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 상기 미량원소는 전체 배지 조성물에 대해 1 내지 15 mM로 포함될 수 있다.
배양액 제조시 사용되는 추가 배지는 탄소원과 질소원으로 주로 이루어져 있다. 탄소원은 주로 포도당을 사용하며 질소원은 효소분해 카제인과 효모추출물을 사용한다.
배양 공정은 살모넬라 타이피의 성장을 위한 조건을 제공하고, 목표하는 생물학적 활성 성분인 Vi 다당류를 생산하기 위해서 설계될 수 있다. 배양은 균주 해동 단계, 플라스크 및 증식용 배양기가 사용되는 종배양(seed culture) 단계, 대용량 생산용 배양기가 사용되는 본배양(production culture) 단계로 구성된다. 종배양 단계는 균주 접종을 시작으로 본배양을 위한 초기 농도에 충분히 도달할 때까지 증식시키는 것이 목적이다. 본배양 단계에서는 증식된 균을 주입하고, 온도, pH, 산소 농도, 배지 농도 등의 조건을 조절하며 균의 농도, 잔류 배지 농도, 활성 성분 농도 등을 모니터링하여 다음 공정으로의 진행을 결정할 수 있다.
살모넬라 타이피 균 배양시 종배양 단계에서 OD 600nm에서 흡광도 값이 2.0 이상, 2.2 이상, 2.4 이상, 2.6 이상, 2.8 이상, 3.0 이상, 3.2 이상, 3.4 이상, 3.6 이상, 3.8 이상일 때 배양을 종료할 수 있고, OD 600nm에서 흡광도 값이 2.0 이상, 2.2 이상, 2.4 이상, 2.6 이상일 때, 배양을 종료할 수 있다. 종배양을 OD 600nm에서 흡광도 값이 2.0 미만일 때 종료하면 살모넬라 타이피 수득 수율이 현저히 감소하여, Vi 피막 다당류 수율도 감소된다. 본 발명의 일 실시태양에서는 종배양은 OD 600nm에서 흡광도 값이 2.0일 때 종료하였고, 살모넬라 타이피 수득 수율이 우수하였다(실시예 1 참조).
본배양의 추가 배지 공급은 시작 배지의 탄소원이 고갈되는 시점에서 시작하고, 특정 흡광도까지 균체의 생장이 도달하면 정지기를 시작한다. 본배양 시 회분식, 유가식 모두 적용 가능하며, 본배양 시작시에는 회분식 배양 방법을 적용하고, 그 후에는 유가식 배양 방법을 적용할 수 있다. 본 발명에서 정지기란 균체의 생장과 사멸이 평형을 이루는 단계를 말하며 공기 및 산소 주입과 영양분의 공급을 조절하여 인위적으로 실시하는 것을 의미한다.
본 발명에서 균체의 불활화에 사용된 용액의 처리는 포르말린을 이용하며, 0.5~1.0%의 농도로 처리할 수 있다.
2.
살모넬라 타이피 유래 Vi 피막 다당류의 정제
본 항목에서는 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법 중 Vi 침전 공정인 'b-1) 배양액을 한외여과하는 단계; b-2) 세타블론을 이용하여 Vi 피막 다당류를 선택적으로 분리하는 단계; b-3) 에탄올 침전을 이용하여 Vi 피막 다당류를 정제하여 정제된 Vi 피막 다당류를 제조하는 단계'에 대해서 설명한다.
본 발명에 사용되는 용어 "Vi", "Vi 다당류", "Vi 피막 다당류"는 살모넬라 타이피로부터 유래된 살모넬라 엔테리카 혈청형 타이피의 캡슐 다당류를 나타낸다. Vi 다당류는 살모넬라 타이피로부터 유래된 Vi 다당류와 항원적, 면역학적 차이가 없는 피막 다당류라면 살모넬라 타이피 외에 다른 세균으로부터 수득한 Vi 다당류도 본 발명의 Vi 다당류에 포함된다. 상기 "Vi", "Vi 다당류", "Vi 피막 다당류"를 세타블론을 사용한 정제 공정을 거쳐 "정제된 Vi 피막 다당류"를 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "한외여과"는 용액 중 분자들을 식별하고 더 적은 용액 부피로 분자를 농축시키기 위해 적당한 물리적 및 화학적 성질을 가지는 반투과성 막을 사용하는 것을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 용어 "정용여과"는 용액으로부터 소분자를 제거하기 위해 물리적 및 화학적 성질을 가지는 반투과성 막을 사용하는 것을 나타낸다.
살모넬라 타이피 균을 배양하여 제조된 배양액은 b-1) 단계에서, Vi 피막 다당류를 정제하기 위하여 한외여과된다. 한외여과 공정에 사용된 한외여과의 멤브레인 필터는 30kDa(kilo dalton) 내지 100kDa, 30kDa 내지 90kDa, 30kDa 내지 80kDa, 30kDa 내지 70kDa, 30kDa 내지 60kDa, 30kDa 내지 50kDa, 30kDa 내지 40kDa일 수 있고, 30kDa일 수 있다. 한외여과시 멤브레인 필터의 크기가 하한값 미만일 때 세포에서 유래하거나, 배지 성분에서 유래하는 불순물이 제거되지 않을 수 있고, 상한값을 초과할 때 Vi 피막 다당류가 소실 될 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에서는 살모넬라 타이피 균 배양액을 30kDa 크기의 멤브레인 필터를 이용하여 한외여과하고 정용여과하여 Vi 피막 다당류를 수득하였다(실시예 2 참고).
b-2) 단계에서, 세타블론을 이용하여 Vi 피막 다당류 분리시 다당류의 농도를 50㎍/ml 내지 100㎍/ml, 53㎍/ml 내지 97㎍/ml, 56㎍/ml 내지 94㎍/ml, 59㎍/ml 내지 91㎍/ml, 60㎍/ml 내지 90㎍/ml, 62㎍/ml 내지 88㎍/ml, 65㎍/ml 내지 85㎍/ml, 68㎍/ml 내지 82㎍/ml, 70㎍/ml 내지 80㎍/ml로 조절하여 수행될 수 있고, 70㎍/ml 내지 80㎍/ml로 조절하여 수행될 수 있다. 다당류의 농도가 하한값 미만일 경우 Vi 피막 다당류의 수율이 감소할 수 있다. 다당류의 농도가 높게 되면, 이에 따라 불순물의 함량도 증가하게 된다. 따라서, 다당류의 농도가 상한값을 초과할 경우, 상대적으로 불순물의 함량이 높은 상태에서 공정이 진행되므로 불순물의 함량이 증가할수 있다. 본 발명의 일 실시태양에서는 살모넬라 타이피 균 배양액을 30kDa 크기의 멤브레인 필터를 이용하여 한외여과하여 배양액을 농축하고, 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)을 배양 농축액 대비 10배 사용하여 정용여과하여 정용여과 회수액을 얻고, 정용여과 회수액과 세타블론을 1시간 동안 반응시켜 침전을 유발시켰다. 세타블론 반응에서 다당류의 농도는 인산염 완충액을 이용하여 50㎍/ml로 조절하여 수행하였다(실시예 2 참고).
상기 b-2) 단계에서 Vi 피막 다당류 정제 공정에 사용되는 세타블론의 농도는 0.2 내지 0.8%(W/V), 0.25 내지 0.75%(W/V), 0.3 내지 0.7%(W/V), 0.35 내지 0.65%(W/V), 0.4 내지 0.6%(W/V), 0.45 내지 0.55%(W/V), 0.45 내지 0.5%(W/V)일 수 있고, 0.25 내지 0.75%(W/V), 0.5 내지 0.7%(W/V)일 수 있다. 세타블론의 농도가 하한값 미만일 경우에는 Vi 다당류 수율이 낮을 수 있고, 상한값을 초과할 경우에는 엔도톡신 함량이 증가하므로 불순물이 많아지는 문제점이 있다. 본 발명의 일 실시태양에서는 다당류 정제 공정시 세타블론의 농도를 0.5%(W/V)로 사용하였을 때, 엔도톡신 함량이 적으면서도 수율이 우수한 것을 알 수 있었다(실시예 및 도 2 참조).
b-1) 및 b-2) 단계에서 pH는 6.8 내지 7.6, 6.9 내지 7.5, 7.0 내지 7.4, 7.1 내지 7.3, 7.2일 수 있고, 7.1 내지 7.3, 7.2일 수 있다. pH가 하한값 미만일 경우 Vi 피막 다당류 수율이 감소할 수 있다. pH가 상한값을 초과할 경우 내독소, 숙주 유래의 단백질과 같은 불순물이 증가할 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에서는 살모넬라 타이피 균 배양액을 30kDa 크기의 멤브레인 필터를 이용하여 한외여과하여 배양액을 농축하고, 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)을 배양 농축액 대비 10배 사용하여 정용여과하여 Vi 피막 다당류를 수득하였다(실시예 2 참고).
상기 b-1) 단계에서 배양된 세포로부터 Vi 피막 다당류가 분리될 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에서는 살모넬라 타이피 균 배양액을 30kDa 크기의 멤브레인 필터를 이용하여 한외여과하여 Vi 피막 다당류를 수득하였다(실시예 2 참고).
배양액을 한외여과한 후에 정용여과하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 정용여과시 인산나트륨(Na-P) 완충액을 사용할 수 있다. 정용여과시 인산나트륨 완충액의 농도는 10mM 내지 30mM, 12mM 내지 28mM, 14mM 내지 26mM, 16mM 내지 24mM, 18mM 내지 22mM, 20mM일 수 있고, 18mM 내지 22mM, 20mM일 수 있다. 인산나트륨 완충액의 농도가 하한값 미만일 경우 정용여과 과정을 거치더라도 Vi 피막 다당류 수율이 감소할 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에서는 살모넬라 타이피 균 배양액을 30kDa 크기의 멤브레인 필터를 이용하여 한외여과하고 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)으로 농축액 대비 10배 정용여과하여 Vi 피막 다당류를 수득하였다(실시예 2 참고).
세타블론 반응액은 0.2 또는 0.45㎛ 멤브레인 필터를 이용하여 캡쳐를 실시할 수 있고, 0.2㎛ 멤브레인 필터를 이용할 수 있다. Vi 다당류-세타블론 결합체가 캡쳐된 멤브레인 필터는 에탄올이 함유된 아세트산 나트륨 완충액을 이용하여 세척 및 용출을 수행할 수 있다.
b-3) 단계에서, 상기 용출액은 염화나트륨 처리와 에탄올 처리를 통하여 침전을 유발하며, 에탄올의 농도는 75% 내지 100%일 수 있다. 침전물은 에탄올을 이용하여 세척하고 주사용수로 용해될 수 있다. Vi 피막 다당류 용해액은 100kDa의 멤브레인 필터로 한외여과 할 수 있으며 분리된 Vi 피막 다당류의 분자량 분포는 크기배제크로마토그래피(Sepharose CL-4B, GE healthcare)상에서 0.2kd 이상이 50%, 53%, 55%, 57%, 60% 이상이 될 수 있다.
b-3) 단계에서 에탄올 침전으로 분리된 Vi 피막 다당류의 평균분자량이 200kDa 내지 1300kDa, 230kDa 내지 1270kDa, 260kDa 내지 1240kDa, 290kDa 내지 1210kDa, 320kDa 내지 1180kDa, 350kDa 내지 1150kDa, 380kDa 내지 1120kDa, 410kDa 내지 1090kDa, 440kDa 내지 1060kDa, 470kDa 내지 1030kDa, 500kDa 내지 1000kDa일 수 있고, 470kDa 내지 1030kDa, 500kDa 내지 1000kDa일 수 있다. Vi 피막 다당류가 상기 범위 내의 평균 분자량을 가짐으로써 최종 제조되는 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 면역원성이 개선될 수 있다. Vi 피막 다당류의 평균 분자량이 상기 범위 밖일 경우에는 접합체 제조 시 수율 저하가 발생할 가능성이 있다. 본 발명의 일 실시태양에서는 살모넬라 타이피 균 배양액을 30kDa 크기의 멤브레인 필터를 이용하여 한외여과하여 배양액을 농축하고, 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.2)을 배양 농축액 대비 10배 사용하여 정용여과하여 정용여과 회수액을 얻고, 정용여과 회수액과 세타블론을 1시간 동안 반응시켜 침전을 유발시켰다. 세타블론 반응에서 다당류의 농도는 인산염 완충액을 이용하여 50㎍/ml로 조절하여 수행하였다. 반응 종료 후 0.2㎛ 멤브레인 필터를 이용하여 필터에 캡쳐하였다. Vi 다당류-세타블론 결합체가 캡쳐된 멤브레인 필터는 아세트산 나트륨 에탄올 완충액으로 세척 및 용출시켜주었다. 상기 방식으로 정제된 다당류는 500kDa 내지 1000kDa의 분자량을 갖는다(실시예 1 및 2 참조).
상기 Vi 피막 다당류는 대부분 O-아세틸화되며, O-아세틸화 정도는 94%, 95%, 96%, 98%일 수 있다. O-아세틸화는 1H NMR, Hestrin 비색 방법과 같은 표준 측정에 의해 결정될 수 있다.
3.
접합 단백질의 유도체화 반응
본 항목에서는 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법 중 'c) 접합 단백질을 유도체화하는 단계'에 대해서 설명한다.
본 발명의 방법에서 정제가 완료된 Vi 피막 다당류는 접합 백신을 만들기 위해 단백질과 가교(linkage)를 이룬다. 접합 단백질은 디프테리아 톡소이드(Diphtheria toxoid, DT), 파상풍 톡소이드(tetanus toxoid, TT) 또는 파상풍 톡소이드의 단편 C, DT CRM197 (DT 돌연변이), CRM176, CRM228, CRM 45, CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103, CRM107, Glu-148에서 Asp, Gin 또는 Ser로 및/또는 Ala 158에서 Gly로의 결실 또는 돌연변이(US 4709017A, US 4950740A 참고) Lys 516, Lys 526, Phe 530 및/또는 Lys 534에서 적어도 하나 이상의 잔기의 돌연변이(US 5917017A, US 6455673B1, US 5843711A 참고), dPLY-GMBS, dPLY-formol, PhtX(PhtA, PhtB, PhtD, PhtE, PhtDE 융합 단백질, PhtBE 융합 단백질을 포함함), OMPC, PorB, PD, 합성 펩타이드, 열충격 단백질, 백일해 단백질, 사이토카인, 림포카인, 성장 인자 또는 호르몬, N19 단백질, 폐렴구균 표면 단백질 PspA, 철 흡수 단백질, 독소 C의 A형 또는 B형일 수 있고, 디프테리아 톡소이드일 수 있다.
본 발명의 방법에서 접합 단백질은 접합반응이 일어날 수 있도록 유도체화 반응을 실시한다. 여기서 유도체화(derivatization)란, 카보디이미드(carbodiimide)에 의한 접합 단백질의 카르복실기와 다이하이드라자이드(dihydrazide)의 아민기(amine group)의 아마이드화를 의미한다. 카보디이미드는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, 이하 "EDC") 또는 대안적으로, 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸)카르보디이미드 메토-p-톨루엔설포네이트가 이용될 수 있다.
다이하이드라자이드는 아디프산 다이하이드라자이드(adipic acid dihydrazide, ADH) 또는 다른 다이하이드라자이드일 수 있다.
접합 단백질은 유도체화 반응을 위하여 농축되며, 농축된 접합 단백질에 순차적으로 다이하이드라자이드와 카보디이미드를 순차적으로 첨가하여 유도체화 반응을 실시한다. 상기 반응을 통하여 가교(cross linkage)를 위한 기능기(functional group)를 결합시킨다.
상기 c) 단계에서, 접합 단백질 유도체화시에 EDC를 1mg/ml 이상 내지 4mg/ml 미만, 1.2mg/ml 이상 내지 4mg/ml 미만, 1.4mg/ml 이상 내지 4mg/ml 미만, 1.6mg/ml 이상 내지 4mg/ml 미만, 1.8mg/ml 이상 내지 4mg/ml 미만, 2mg/ml 이상 내지 4mg/ml 미만, 2mg/ml 이상 내지 3mg/ml, 2mg/ml의 농도로 사용할 수 있고, 2mg/ml 이상 내지 3mg/ml, 2mg/ml의 농도로 사용할 수 있다. EDC의 농도가 하한값 미만일 경우 접합 단백질이 유도체가 되지 않으므로 Vi 피막 다당류와의 접합이 어렵고 이에 따라 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 수율이 낮아질 수 있다. EDC의 농도가 상한값을 초과할 경우 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 수율이 낮아질 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에서는 접합 단백질인 디프테리아 톡소이드 유도체화시 EDC를 2 mg/ml 이용하였고, 유도체가 된 접합 단백질과 Vi 피막 다당류를 접합시켜 접합체를 제조하였다(실시예 3 및 4 참조).
유도체화 반응의 잔류 링커와 반응 시액은 투석에 의해 제거가 될 수 있으며, 이때의 투석막의 공극 크기(pore size)는 30kDa 이하이다. 결합된 기능기는 접합 반응을 위한 부위가 되며, 링커의 함량은 피크릴설폰산과의 발색 반응을 이용한 흡광도 측정을 통해 정량적으로 분석할 수 있다.
4.
정제된 Vi 다당류와 접합 단백질의 접합 반응
본 항목에서는 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법 중 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체 제조 단계인 'd) 상기 정제된 Vi 피막 다당류와 유도체화 접합 단백질을 접합하여 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 제조하는 단계'에 대해서 설명한다.
본 발명의 방법에서 유도체화 접합 단백질은 Vi 피막 다당류와 접합 반응(conjugation reaction)을 진행할 수 있다. Vi 피막 다당류와 접합 단백질의 접합 반응 또한 유도체화와 동일한 카보디이미드에 의해 Vi 피막 다당류의 카르복실기와 접합 단백질의 아민기의 아마이드화를 통하여 이루어진다. Vi 피막 다당류와 카보디이미드가 결합된 화합물에 접합 단백질의 아민기가 결합하여 아마이드화된다. 접합 반응시 접합 단백질과 Vi 피막 다당류의 반응 비율은 2:1 내지 1:1 일 수 있다.
정제된 Vi 피막 다당류와 유도체화 접합 단백질의 접합 반응은 카보디이미드에 이루어지며, 모르폴리노 에탄설폰산(MES) 완충액에 의한 pH 완충 작용 내에서 이루어진다. 상기 pH는 4 내지 6 미만, 4.2 내지 5.9, 4.4 내지 5.8, 4.6 내지 5.7, 4.8 내지 5.6, 5 내지 5.6, 5.2 내지, 5.6, 5.4 내지 5.6일 수 있고, 5.2 내지, 5.6, 5.4 내지 5.6일 수 있다. pH가 상한값을 초과할 경우 접합 단백질의 유도체화 정도가 감소될 수 있다. 카보디이미드는 상기 "3. 접합 단백질의 유도체화 반응"에 언급하였으므로 추가적인 기재를 생략한다.
상기 d) 단계에서, 정제된 Vi 피막 다당류와 유도체화 접합 단백질을 접합시 EDC를 1mg/ml 미만, 0.1mg/ml 내지 0.9mg/ml, 0.2mg/ml 내지 0.8mg/ml, 0.3mg/ml 내지 0.7mg/ml, 0.4mg/ml 내지 0.6mg/ml, 0.5mg/ml 내지 0.6mg/ml의 농도로 첨가할 수 있고, 0.1mg/ml 내지 0.5mg/ml, 0.2mg/ml 내지 0.5mg/ml의 농도로 첨가할 수 있다. EDC가 하한값 미만의 농도로 포함될 경우 당류와 단백질의 접합이 이루어지지 않아 최종 수득되는 Vi 피막 다당류-접합 단백질의 접합체의 수율이 감소된다. EDC가 상한값을 초과하여 포함될 경우 Vi 피막 다당류와 유도체화 접합 단백질이 접합된 접합체의 수율이 현저히 감소할 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에서는 접합 반응을 위해 모르폴리노 에탄설폰산 완충액에 Vi 피막 다당류를 첨가하고, 희석된 당류에 EDC를 0.5 mg/ml (<1mg/ml)의 농도로 첨가한 후, 이어서 접합 단백질을 첨가하여 접합 반응을 수행하였다(실시예 4 참조).
접합 반응으로 인해 이루어진 접합체 외의 잔류 다당류와 단백질 및 반응시액은 최종 완충액의 투석으로 제거를 실시할 수 있다. 이때 최종 완충액은 인산염 완충액으로 구성될 수 있다.
Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 다당류와 접합 단백질의 함량비는 1:2 내지는 2:1로 이루어진다.
또한, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 평균분자량은 2000kDa 내지 4000kDa, 2100kDa 내지 3900kDa, 2200kDa 내지 3800kDa, 2300kDa 내지 3700kDa, 2400kDa 내지 3600kDa, 2500kDa 내지 3500kDa, 2600kDa 내지 3400kDa, 2700kDa 내지 3300kDa, 2800kDa 내지 3200kDa일 수 있다. Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 평균분자량이 상기 범위일 때, 면역원성이 향상되는 효과가 있다. Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 평균분자량이 상기 범위를 벗어나는 경우, 면역원성이 감소될 수 있다.
상기 장티푸스 백신의 장티푸스 피막 다당류 함량 측정은 HPAEC-PAD(high performance anion exchange chromatography pulsed with amperometric detection)를 사용하여 수행될 수 있다. 분자량 분포는 크기배제 크로마토그래피(Sepharose CL-4B, GE healthcare)상에서 0.2kd 이상이 70% 이상이 될 수 있으며, 평균분자량의 측정은 Multi Angle Light Scattering(MALS)를 이용한 분석으로 실시할 수 있다.
정제된 Vi 피막 다당류와 유도체화 접합 단백질 접합 반응 시, 상기 Vi 피막 다당류가 유도체화 접합 단백질의 1중량부 기준으로, 0.1중량부 내지 3중량부, 0.3중량부 내지 2.8중량부, 0.5중량부 내지 2.6중량부, 0.7중량부 내지 2.4중량부, 0.9중량부 내지 2.2중량부, 1.1중량부 내지 2중량부, 1.3중량부 내지 1.8중량부, 1.5중량부로 첨가될 수 있고, 0.76 중량부, 1.5중량부로 첨가될 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에서, DT:Vi에서 Vi 피막 다당류의 양이 접합 단백질의 양에 비해 1.5배 이하일 경우 면역원성이 우수하였다. Vi 피막 다당류의 양이 접합 단백질의 양보다 5배 이상 많아지면 면역원성이 낮아지는 것으로 확인되었다(실시예 6-1 및 도 3 참조).
Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 구성하는 정제된 Vi 피막 다당류는 유도체화 접합 단백질 1중량부 기준으로, 0.1중량부 내지 1.4중량부, 0.2중량부 내지 1.3중량부, 0.3중량부 내지 1.2중량부, 0.4중량부 내지 1.1중량부, 0.5중량부 내지 1.0중량부, 0.6중량부 내지 0.9중량부로 포함될 수 있고, 0.5중량부 내지 1.2중량부로 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에서, Vi 피막 다당류(S)/접합 단백질(P)가 1.6 미만인 접합체가 면역원성이 우수하였고, 1.6 이상이 되면 면역원성이 현저히 낮아지는 것으로 확인되었다(실시예 6-2 및 도 4 참조).
Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체에 포함된 유리당류의 함량이 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 유리당류를 포함하지 않을 수 있고, 유리당류의 함량이 10% 이하일 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에서, 유리당류가 10% 이하이면 면역원성이 우수하였고, 유리당류가 많아질수록 면역원성이 감소하는 것으로 나타났다(실시예 6-3 및 도 5 참조).
Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체에 포함된 Vi 피막 다당류의 O-acetyl(VI-O-acetyl) 함량은 1.4 mmol/g 내지 4.5 mmol/g, 1.5 mmol/g 내지 4.4 mmol/g, 1.6 mmol/g 내지 4.3 mmol/g, 1.7 mmol/g 내지 4.2 mmol/g, 1.8 mmol/g 내지 4.1 mmol/g, 1.9 mmol/g 내지 4 mmol/g, 2.0 mmol/g 내지 3.9 mmol/g, 2.1 mmol/g 내지 3.8 mmol/g, 2.2 mmol/g 내지 3.7 mmol/g, 2.3 mmol/g 내지 3.7 mmol/g, 2.4 mmol/g 내지 3.7 mmol/g일 수 있고, 1.4 mmol/g 내지 3.7 mmol/g, 또는 2.4 mmol/g 내지 3.7 mmol/g일 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 접합체 내 VI-O-acetyl 함량이 1.4 mmol/g ~ 3.7 mmol/g일 때 면역원성이 우수하였고, 바람직하게는 2.4 mmol/g ~ 3.7mmol/g일 때 더욱 우수하게 나타났다(실시예 6-4 및 도 6 참조).
본 발명은 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체로서, 살모넬라 타이피 유래의 Vi 피막 다당류가 디프테리아 톡소이드에 접합된 접합체이고, 상기 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 제조하는 데에 사용되는 정제된 Vi 피막 다당류의 평균분자량이 500kda 내지 1000kda이며, 상기 Vi 피막 다당류와 디프테리아 톡소이드가 접합된 접합체의 평균분자량은 2000kda 내지 4000kda인, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 제공한다.
상기 Vi 피막 다당류의 평균분자량에 대해서는 "2. 살모넬라 타이피 유래 Vi 피막 다당류의 정제"에 언급하였으므로 추가적인 기재를 생략한다.
상기 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 평균분자량에 대해서는 "4. Vi 다당류와 접합 단백질의 접합 반응"에 언급하였으므로 추가적인 기재를 생략한다.
5.
Vi 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물
본 발명은 "1. 살모넬라 타이피의 배양 ~ 4. Vi 다당류와 접합 단백질의 접합 반응"에서 제조된 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 장티푸스 예방용 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명서 사용되는 용어 "예방"은 면역원성 조성물의 투여에 의해 살모넬라 타이피 감염증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 나타낸다.
본 발명에 사용되는 용어 "면역원성"은 특정 면역 반응을 유도하는데 도움이 되는 것을 나타낸다.
본 발명의 면역원성 조성물은 면역학적 유효량의 다당류 면역원을 포함한다. "면역학적 유효량"은 단일 용량 또는 일련의 용량의 일부로서 개체로의 상기 양의 투여가 예방에 효과적임을 의미한다. 이러한 양은 치료되는 개체의 건강 및 신체 상태, 치료되는 개체의 연령, 분류 집단(예를 들어, 비-인간 영장류, 영장류 등), 항체를 합성하는 개체의 면역계의 능력, 요망되는 보호의 정도, 백신의 제형화, 치료 의사의 의학적 상태의 평가, 및 다른 관련 요인에 따라 변한다. 상기 양은 비교적 광범위한 범위 내에 해당될 것이며, 이는 통상적인 시험을 통해 결정될 수 있음이 예상된다. 투여량 처리는 단일 용량 스케줄 또는 다수 용량 스케줄(예를 들어, 부스터 용량을 포함함)일 수 있다. 조성물은 다른 면역조절 작용제와 함께 투여될 수 있다.
면역원성 조성물에는 항원으로서 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체가 1회 용량으로 20㎍ 내지 30㎍, 21㎍ 내지 29㎍, 22㎍ 내지 28㎍, 23㎍ 내지 27㎍, 24㎍ 내지 26㎍, 25㎍ 내지 30㎍, 25㎍ 포함될 수 있고, 25㎍으로 포함될 수 있다. 상기 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 용량은 Vi 피막 다당류 함량 기준이다. 1회 용량이 하한값 미만일 경우 면역원성 조성물을 투여하더라도 면역반응이 유도되지 않을 수 있다. 1회 용량이 상한값을 초과할 경우 예측되지 않은 면역반응 또는 부작용 등이 초래될 수 있다.
면역원성 조성물은 보존제로 2-페녹시에탄올, 포름알데히드, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나를 포함할 수 있고, 2-페녹시에탄올을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에서는 2-페녹시에탄올을 보존제로 사용한 경우, 다른 보존제를 사용하였을 때보다 수은으로 인한 위험성이 적고 항원의 면역원성 보존 효과가 우수한 것으로 나타났다.
본 발명의 면역원성 조성물은 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 애쥬번트는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 본 발명의 조성물과 함께 투여되어 면역 반응을 증강시킬 수 있는 애쥬번트는 임의의 다양한 애쥬번트를 포함한다. 상기 애쥬번트는 면역원성 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다. 본 발명에 있어서, 애쥬번트는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 및 알루미늄 하이드록사이드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 알루미늄 포스페이트일 수 있다.
본 발명은 "1.살모넬라 타이피의 배양 ~ 4.Vi 다당류와 접합 단백질의 접합 반응"에서 제조된 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 포유 동물에서 면역 반응을 발생시키기 위한 면역원성 조성물을 제공한다.
포유 동물은, 예를 들어, 영장류(예를 들어, 인간, 남성 또는 여성, 유아), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스, 어류, 조류 등을 나타내며, 영장류일 수 있고, 유아일 수 있다.
Vi 피막 다당류 면역화 후에 항체 반응을 평가하기 위한 방법은 본 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, ELISA 검정(효소 결합 면역흡착 측정법)이 항 Vi IgG 반응을 평가하기 위해 일반적으로 이용된다. 항체 반응은 바람직하게는 글리코컨쥬게이트 백신의 특징인 IgM로부터 IgG로의 통상적인 아이소형 스위칭(isotype switching)을 갖는 IgG 반응이다. 면역 반응은 통상적으로 예방적 면역 반응이다.
본 발명은 "1.살모넬라 타이피의 배양 ~ 4.Vi 다당류와 접합 단백질의 접합 반응"에서 제조된 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 포유 동물에서 항원 특이적 CD4 T 보조 림프구와의 반응을 유도하기 위한 면역원성 조성물을 제공한다.
6.
Vi 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물의 제형화 방법
본 발명은 "5. Vi 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물"의 장티푸스 예방용 면역원성 조성물 및 보존제를 혼합하는 단계를 포함하는 장티푸스 예방용 면역원성 조성물의 제형화 방법을 제공한다.
장티푸스 예방용 면역원성 조성물은 보존제로 2-페녹시에탄올, 포름알데히드, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나를 포함할 수 있다. 보존제에 대해서는 "5. Vi 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물"에 언급하였으므로 추가적인 기재를 생략한다.
장티푸스 예방용 면역원성 조성물은 항원으로서 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 1회 용량으로 20㎍ 내지 30㎍ 포함할 수 있다. Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체가 1회 용량에 대해서는 "5. Vi 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물"에 언급하였으므로 추가적인 기재를 생략한다.
장티푸스 예방용 면역원성 조성물은 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 1회 용량 0.5ml 중에 제형화될 수 있다.
장티푸스 예방용 면역원성 조성물은 멸균 액제로 제형화될 수 있다. 면역원성 조성물은 pH 6 내지 pH 8, 일반적으로 약 pH 7로 완충될 수 있다.
장티푸스 예방용 면역원성 조성물은 1회 용량 또는 5회 용량 투여용으로 제형화될 수 있고, 필요에 따라 2회, 3회, 4회, 5회 이상으로 제형화될 수 있다.
7.
Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 백신
본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 "1.살모넬라 타이피의 배양 ~ 4.Vi 다당류와 접합 단백질의 접합 반응"에서 제조된 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 대상체에서 장티푸스를 예방하기 위한 백신 조성물을 제공한다.
본 발명은 약학적으로 허용되는 담체와 "5. Vi 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물"에서 제조된 면역원성 조성물을 포함하는 대상체에서 장티푸스를 예방하기 위한 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장성 작용제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물 안정화제, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 착향제, 염료 등 및 이들의 조합물을 포함한다. 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립되지 않는 것을 제외하고는, 치료 또는 약학적 조성물에서의 이의 용도가 고려된다.
본 발명의 백신 조성물은 보조제 외에도 추가적으로 용매 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 물질이라면, 본 발명의 백신의 작용을 억제하지 않는 한, 제한 없이 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "대상체"는 동물을 나타낸다. 동물은 포유 동물일 수 있다. 포유 동물은, 예를 들어, 영장류(예를 들어, 인간, 남성 또는 여성, 유아), 소, 양, 염소, 말, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스, 어류, 조류 등을 나타내며, 영장류일 수 있고, 유아일 수 있다.
미생물 감염은 신체의 다양한 영역에 영향을 미치고, 따라서 본 발명의 백신 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 주사 가능하게 제조될 수 있다. 주사 전 액체 비히클 내 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 조성물은, 예를 들어, 연고, 크림 또는 분말로서 국소 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은, 예를 들어, 정제 또는 캡슐, 또는 시럽(임의로 착향된 시럽)으로서 경구 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은 미세 분말 또는 스프레이를 이용하여, 예를 들어, 흡입기로서 폐 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은 좌약 또는 페서리로서 제조될 수 있다. 조성물은, 예를 들어, 점적, 스프레이 또는 분말로서 코, 귀 또는 눈 투여를 위해 제조될 수 있다. 조성물은 함수제에 포함될 수 있다. 조성물은 동결 건조될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 비강, 경막외(eidural) 또는 다른 적절한 경로를 통하여 투여를 수행할 수 있으며, 근육 주사용으로 제조되어 근육내 경로로 투여될 수 있다.
8.
Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체
본 발명은 살모넬라 타이피 유래의 Vi 피막 다당류가 디프테리아 톡소이드에 접합된 접합체이고, 상기 Vi 피막 다당류의 평균분자량이 500kDa 내지 1000kDa이며, 상기 Vi 피막 다당류와 디프테리아 톡소이드가 접합된 접합체의 평균분자량은 2000kda 내지 4000kda인 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 제공한다. 본 발명의 일 실시태양에서, Vi 피막 다당류와 접합 단백질이 접합된 접합체의 평균분자량은 1318kDa 이상이며, 접합체의 평균분자량은 2000kDa 내지 4000kDa인 것을 확인하였다.
상기 Vi 피막 다당류의 평균분자량은 500kda 내지 1000kda일 수 있다. Vi 피막 다당류의 평균분자량은 "2. 살모넬라 타이피 유래 Vi 피막 다당류의 정제"에 언급하였으므로 추가적인 기재를 생략한다.
상기 접합 단백질은 디프테리아 톡소이드일 수 있다. 접합 단백질은 "3. 접합 단백질의 유도체화 반응"에 언급하였으므로 추가적인 기재를 생략한다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 살모넬라 타이피 균 배양
살모넬라 타이피를 10 mL 대두 카제인 소화 배지(Soybean Casein Digest Medium, SCDM (효소분해 카제인)에 접종하여 32℃에서 12시간 동안 배양하고(스테이지-I), 32℃에서 12시간 동안 각각 50 mL SCDM을 함유하는 2개 플라스크에 옮기고(스테이지-II), 최종적으로 각각 400 mL SCDM을 함유하는 4개 플라스크에 옮겨서 32℃에서 12시간 동안 인큐베이션하였다(스테이지-III). 종배양은 32℃에서 OD 600nm에서 흡광도의 값이 2.0일 때 종료했다. 모든 스테이지에서 종 배양의 오염 유무와 형태학적 특성을 그람 염색으로 확인하였다. OD는 600 nm에서 확인하였다.
본배양은 32℃에서 10시간 이상 진행했다. 본배양의 pH는 6.6~7.2로 조절하고, 용존 산소 농도(DO%)와 교반은 캐스케이드(cascade)로 유지하며 발효조에서 배양을 실시하였다. 용존산소량 조절을 위해서 교반속도가 조절되며, 교반속도가 최대가 되면 산소 투입을 통해 용존산소량이 조절된다. 추가 배지의 공급은 본배양 영양소의 고갈 이후 연속적으로 공급하였다. 추가 배지의 공급 속도는 매시간 증량하였다. 세포의 OD600 흡광도가 한 시간 동안 증가하지 않으면 인위적으로 정지기에 돌입하였다. 정지기에는 Air 공급과 추가 배지의 공급을 중단하였고, 용존 산소의 조절을 멈추었다. 정지기 완료 시 0.5%(v/v) 농도의 포르말린으로 불활화를 실시하였다.
비교예 1. 살모넬라 타이피 균 배양시 질소원으로 산분해 카제인 사용시 배양 결과
실시예 1과 동일한 방법으로 균을 배양하고, 질소원으로 효소분해 카제인 대신에 산분해 카제인을 사용하였다. 균 배양이 종료된 후 하기 실시예 2에 따른 방법으로 Vi 다당류를 정제하여 Vi 다당류 발현 정도를 확인하였다.
살모넬라 타이피의 본 배양시 생장 곡선을 도 1에 나타내었다. Enzymatic casein은 질소원으로 효소분해 카제인을 사용한 경우(실시예 1)의 생장 곡선이고, Acid casein은 질소원으로 산분해 카제인을 사용한 경우(비교예 1)의 생장 곡선이다.
그 결과, 도 1의 A에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 경우, 본배양 시작 후 15시간까지는 세포가 증식하였다(도 1의 A Enzymatic casein 생장 곡선 참조). 15시간 후 세포의 OD600 흡광도가 한 시간 동안 증가하지 않으면 인위적으로 정지기에 돌입하였고, 정지기 이후 세포 증식이 감소하였다. 또한, 도 1의 B에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 경우, Vi 다당류 발현량이 약 350㎍/ml인 것을 확인하였다(도 1의 B Enzymatic casein Vi 다당류 발현량 그래프 참조). 한편, 비교예 1의 경우, 본배양 시작 후 10시간 전까지는 질소원의 종류에 차이 없이 살모넬라 타이피의 생장 속도가 유사하였다. 그러나, 본배양 시작 후 10시간이 지났을 때부터는 질소원으로 산분해 카제인 사용시 본배양 시작 후 10시간이 지났을 때의 증식 정도를 유지할 뿐 추가적인 생장이 없었다(도 1의 A Acid casein 생장 곡선 참조). 또한, Vi 다당류 발현량이 약 50㎍/ml 이하로 현저히 감소하는 것으로 나타났다(도 1의 B Acid casein Vi 다당류 발현량 그래프 참조). 요약하면, 질소원으로 효소분해 카제인 사용시에는 본배양 시작 후 10시간이 지난 시점에서도 세포가 계속 증식하였고, Vi 다당류 발현량도 증가하였다. 이에 따라 살모넬라 타이피 생장, Vi 다당류 발현에는 효소분해 카제인이 적합한 질소원인 것을 알 수 있었다(도 1 참조).
실시예 2. Vi 피막 다당류 정제
2-1. 배양액을 한외여과하는 단계
균 배양액은 원심분리 이후 심층여과 필터와 0.2㎛ 여과 필터를 이용하여 균체를 제거했다. 분리된 배양 상등액은 30kDa 크기의 멤브레인 필터를 이용하여 1차 한외여과(ultra filtration)하여 배양 상등액을 농축하고, 20mM 인산나트륨(Na-P) 완충액(pH 7.2)을 배양 농축액 대비 10배 사용하여 정용여과(diafiltration)를 실시했다. 즉, Vi 다당류 침전 공정상의 pH를 7.2로 조절하였다. 배양액을 한외여과하고 정용여과함으로써 배양된 세포로부터 Vi 피막 다당류가 분리되며, 정용여과 후에 Vi 피막 다당류와 불순물이 함께 존재하는 정용여과 회수액을 얻었다.
2-2. 세타블론을 이용하여 Vi 피막 다당류를 선택적으로 분리하는 단계
상기 정용여과 회수액은 세타블론(hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB)과 1시간 동안 반응을 실시하여 Vi 피막 다당류의 침전을 유발시켰다. 세타블론 반응에서 Vi 피막 다당류의 농도는 인산염 완충액을 이용하여 50 ㎍/ml로 조절하여 실시했다. HPAEC-PAD에 의해 Vi 피막 다당류 함량을 측정하며, 측정된 함량을 기반으로 인산염 완충액을 통해 희석하여 농도를 조절하였다. 반응종료 후, 0.2㎛ 멤브레인 필터를 이용하여 필터에 캡쳐를 실시했다. Vi 피막 다당류-세타블론 결합체가 캡쳐된 멤브레인 필터는 아세트산 나트륨 에탄올 완충액으로 세척 및 용출시켰다.
2-3. 에탄올 침전을 이용하여 Vi 피막 다당류를 정제하여 정제된 Vi 피막 다당류를 제조하는 단계
상기 용출액을 염화나트륨으로 처리하여 Vi 피막 다당류-세타블론 결합체의 결합을 끊어 주었고, 에탄올을 첨가하여 침전시켰다. 침전물이 가라앉으면 상등액을 제거해 준 후 정제수로 용출시켰다. 용출액은 100kDa 사이즈의 멤브레인 필터를 이용하여 한외여과 및 정용여과를 실시했다. 정용여과는 정제수를 이용하여 실시했다.
상기 방식으로 제조된, 정제된 Vi 피막 다당류는 헤스테린법으로 다당류 1mg 당 2 μmol 이상의 O-아세틸 함량을 가지는 것이 확인되었고, 90% 이상이 O-아세틸레이션되었다. 크기배제크로마토그래피(Sepharose CL-4B, GE healthcare) 분석 결과 0.2kd 이하의 함량이 50% 이상을 가지며, 500 내지 1000kda의 평균분자량을 갖는 것이 확인되었다.
2-4. 세타블론 처리 공정에서의 주요 공정 인자의 효과 확인
실험계획법에 의한 세타블론 처리 공정에서의 주요 공정 인자의 효과를 확인하였다. Vi 피막 다당류의 농도(도 2의 "Vi concentration(ug/mL)"), pH, 단위 막면적(0.1m2)에 적용되는 Vi 피막 다당류의 양(도 2의 "Vi(mg)/0.1m2 cassette")과 같은 인자들이 단위 공정의 품질 평가 항목에 미치는 영향을 통계학적으로 분석하였고, 정제된 Vi 피막 다당류 결과에 따라 적절한 인자의 조건을 설정하였다. 도 2에 세타블론(CTAB) 농도에 따른 엔도톡신 함량과 수율을 나타내었으며, 엔도톡신 함량과 수율은 공정 인자를 판단하는 속성에 해당한다. 도 2의 A는 엔도톡신 함량(endotoxin content) 결과를 나타낸다. 도 2의 B는 세타블론 처리 공정에서 얻어지는 결과물인 정제된 Vi 피막 다당류의 수율 결과(Process yeild(%))를 나타내는데, 이는 공정 진행 후 잔류하는 Vi 피막 다당류의 비율(Vi total/Vi input)을 가리킨다. 도 2에서 "Vi concentration(ug/mL)"은 반응 시의 Vi 피막 다당류의 농도를 나타낸다. 도 2에서 "Vi(mg)/0.1m2 cassette"는 단위 막면적(0.1m2)에 적용되는 Vi 피막 다당류의 양을 나타내며, 상기 실시예 2-3에서 Vi 피막 다당류-세타블론 결합체의 결합을 끊어 주고, 에탄올을 첨가하여 침전시킨 후, 침전물을 멤브레인 필터를 이용한 여과 진행시 특정 막면적에 적용되는 반응물의 양에 해당한다. 이 반응물의 양에 따라 나타나는 불순물 특성 등이 달라진다.
엔도톡신 함량은, Vi 피막 다당류의 농도가 50㎍/ml~75㎍/ml일 때, 단위 막면적(0.1m2)에 적용되는 Vi 피막 다당류의 양이 많을수록, 그리고 CTAB의 농도가 0.5%(W/V)로 사용될 때 낮았고, pH는 엔도톡신 함량에 영향을 주지 않았다(도 2의 A 참조). 정제된 Vi 피막 다당류의 수율은 Vi 피막 다당류의 농도가 50㎍/ml~100㎍/ml일 때 높고, 바람직하게는 60㎍/ml~90㎍/ml, 더욱 바람직하게는 70㎍/ml~80㎍/ml일 때 더 높게 나타났다. 또한 pH가 6.5~7.5 범위일 때, CTAB의 농도가 0.5%(W/V) 이상일 때 높았다(도 2의 B 참조).
실시예 3. 접합 단백질 유도체화
접합 단백질로는 디프테리아 톡소이드를 사용하였다. 접합 단백질은 40mg/ml의 농도로 한외여과/정용여과를 실시했으며 정용여과에 사용된 완충액은 모르폴리노 에탄설폰산(MES) 완충액이었다. 농축된 접합 단백질은 모르폴리노 에탄설폰산(MES) 조건에서 아디프산 다이하이드라자이드(adipic acid dihydrazide, ADH)로 유도체화를 실시했다. 유도체화 반응 시액은 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC)를 2mg/ml의 농도로 포함하며, 반응은 1시간 동안 상온 (18~28 ℃)에서 pH를 유지시키며 수행하였다. 반응의 종료는 NaOH를 이용하여 pH를 조절하여 실시했다. 반응 시액의 제거를 위해 유도체화 반응액은 0.2㎛ 멤브레인 필터로 여과 후, 30kDa 크기의 멤브레인 필터를 이용하여 모르폴리노 에탄설폰산으로 한외여과를 실시하였다. 유도체화 원액은 피크릴설폰산(picrylsulfonic acid)의 발색 반응을 이용한 TNBS 시험법을 통해 정량적으로 분석하였다. 하기 표 1에 접합 단백질의 유도체화 결과를 나타내고, 표 2에 접합 단백질의 유도체화 결과와 접합 결과를 함께 나타내었다. Vi 다당류와 접합 단백질의 접합은 하기 실시예 4에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
| 사용된 EDC 농도(mg/mL) | ADH/DT 비율 | 수율 |
| 4 | 4.24 | 99 |
| 2 | 3.89 | 100 |
| 1 | 3.07 | 94 |
| 반응 조건 | 유도체화 결과 |
접합 결과 |
|||||
| EDC 농도(mg/mL) | ADH/DT 비율(%) |
수율(%) | Vi 다당류/접합 단백질 비율 |
유리당 함량(%) |
평균분자량 (kDa) |
잔여 EDC 함량 (μg/mL) |
수율(%) |
| 4 | 4.2 | 99.4 | 0.5 | 8 | 3704 | 0.8 | 55 |
| 2 | 3.6 | 86.7 | 0.6 | 0 | 3398 | 0.3 | 57 |
| 2 | 3.8 | 83.8 | 0.6 | 7 | 3749 | 0.9 | 62 |
| 2 | 3.3 | 99.9 | 0.7 | 3 | 3178 | 0.3 | 59 |
표 1에 나타낸 바와 같이 접합 단백질 유도체화시 EDC의 농도를 다르게 한 경우 2mg/mL에서 수율이 가장 우수하였다. 또한, EDC의 농도에 따른 단백질 유도체화 결과가 접합 결과에 영향을 주는지 확인한 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이 접합 단백질 유도체화시 수율이 가장 우수하였던 EDC 2mg/mL 농도 조건이, 접합 결과에서도 접합 단백질 유도체화시 EDC 4mg/mL을 사용한 경우에 비해서 수율이 우수한 것을 알 수 있었다.
실시예 4. 정제된 Vi 피막 다당류와 접합 단백질의 접합 반응
접합 반응에 사용되는 정제된 Vi 피막 다당류는 멤브레인 필터를 이용하여 모르폴리노 에탄설폰산(MES) 완충액으로 한외여과를 실시한 것을 사용했다. 접합 반응을 위해 모르폴리노 에탄설폰산(MES) 완충액에 0.25mg/ml의 농도로 Vi 다당류를 첨가하였다. 희석된 다당류에 EDC를 0.5mg/ml (<1.0mg/mL)의 농도로 첨가한 후, 이어서 접합 단백질을 첨가하고 반응을 진행하였다. 0.45㎛ 필터로 여과를 진행한 반응액을 300kDa 멤브레인 필터로 한외여과 및 정용여과를 실시했으며 정용여과는 인산염 완충액(phosphate buffered saline)으로 실시했다.
접합체 원액의 Vi 다당류 함량은 접합체 원액을 NaOH에 혼합하고 110℃의 온도 조건에서 가수분해한 것을 HPAEC-PAD(high performance anion exchange chromatography pulsed with amperometric detection)에서 PA-10(Dionex) 컬럼을 사용하여 정량 분석했다. 접합체 원액의 Vi 다당류와 접합 단백질의 함량비는 상기 정량법과 로우리(Lowry) 단백질 정량 방법을 이용하여 각각 정량한 후 계산해 주었으며, 그 값은 0.5~1.0 사이였다. 유리당류의 함량은 Phenyl-HP(GE Healthcare) 컬럼을 이용한 소수성 반응 크로마토 그래피(Hydrophobic Interation Chromatography, HIC)를 이용한 방법으로 총 다당류 함량의 30% 이내의 값임을 확인했다. 접합체의 분자량은 크기배제크로마토그래피(Sepharose CL-4B, GE healthcare) 방법을 통해 분석한 결과 0.2kD 이내에서 70% 이상의 값을 가지며 1318kda의 이상이었고, 접합체의 평균분자량은 2000kDa 내지 4000kDa인 것을 확인하였다.
또한, 하기 표 3에 접합시 사용된 EDC의 농도와 접합체 수율을 나타내었다.
| EDC 농도 (mg/mL) |
Vi 다당류/접합 단백질 비율 | 유리당 함량(%) | 분자 크기 분포 (>0.25kd, %) | 잔여 EDC 함량(μg/mL) | 수율(%) |
| 0.5 | 0.7 | 7 | 94 | < 5 | 60 |
| 1.0 | 0.7 | 6 | 90 | < 5 | 42 |
| 2.0 | 0.8 | 15 | 97 | < 5 | 35 |
| 0.2 | 0.6 | 0 | 100 | 1.62 | 58 |
| 0.4 | 0.6 | 1 | 96 | 2.18 | 52 |
| 1.0 | 0.6 | 12 | 100 | 2.73 | 49 |
| 2.0 | 0.6 | 30 | 97 | 4.21 | 47 |
| 4.0 | 0.8 | 34 | 100 | 2.71 | 27 |
표 3에 나타낸 바와 같이, 정제된 Vi 피막 다당류와 접합 단백질 접합시 EDC의 농도가 0.2 mg/mL 0.4 mg/mL, 0.5 mg/mL으로 사용될 때 수율이 우수한 것으로 나타났다. 반면, 1.0 mg/mL 이상일 경우 수율이 현저히 낮아지고 4.0 mg/mL 이상일 경우 30% 미만으로 수율이 감소하는 것으로 나타났다. 따라서, Vi 다당류와 접합 단백질 접합시 EDC의 농도는 1.0 mg/mL 미만으로 조절되어야 하는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. 백신 제형화
본 발명의 방법에서 장티푸스 접합 백신의 제형은 인산염 완충액(Phosphate buffered saline)에 Vi 다당류-접합 단백질로 이루어진 접합체 25㎍을 1 도즈(1회 용량)로 하여 제조했다. 백신 내에 Vi 다당류 함량은 실시예 4의 Vi 다당류와 접합 단백질의 함량비에 따라 12.5~25㎍이다. 추가로 멀티 도즈의 제형은 5 도즈를 용량으로 하여 제조했다. 보존제는 치메로살 또는 2-페녹시에탄올을 사용하였다. 보존력 시험 결과 치메로살은 EP(유럽약전) B 기준을 충족하였고, 2-페녹시에탄올은 EP(유럽약전) A 기준을 충족하였다.
실시예 6.
Vi 다당류-접합 단백질로 이루어진 접합체의 면역원성 확인
최종 제조된 Vi 다당류-접합 단백질로 이루어진 접합체를 제형화하고 면역원성에 대해 Balb/c 마우스에서 Vi 다당류 백신과 비교하여 시험하였다. 시험 결과, 본 발명의 Vi 다당류-접합 단백질 접합체 백신이 Vi 다당류 백신에 비해 항체를 더 많이 유도하는 것으로 나타났다.
6-1. 접합 공정 시 접합 단백질(DT) 및 Vi 피막 다당류(Vi)의 반응 비율에 따른 면역원성 확인
실시예 4와 동일하게 하고, DT:Vi 반응 비율을 다르게 하여 접합 단백질과 Vi 피막 다당류를 접합하였을 때, 면역원성 결과를 도 3에 나타낸다. DT:Vi에서 Vi 피막 다당류의 양이 접합 단백질의 양에 비해 1.5배 이하일 경우 면역원성이 우수하였다. Vi 피막 다당류의 양이 접합 단백질의 양보다 5배 이상 많아지면 면역원성이 낮아지는 것으로 확인되었다(도 3 참조).
6-2. 접합체의 Vi 피막 다당류(S)와 접합 단백질(P)의 함량에 따른 면역원성 확인
실시예 4에서 제조된 접합체의 Vi 피막 다당류(S)와 접합 단백질(P)의 함량을 확인하였다. S/P가 1.6 미만인 접합체가 면역원성이 우수하였고, 1.6 이상이 되면 면역원성이 현저히 낮아지는 것으로 확인되었다(도 4 참조).
6-3. 유리당류 함량에 따른 면역원성 확인
실시예 4에서 제조된 접합체에 포함된 불순물인 유리당류의 함량에 따른 면역원성을 확인하였다. 마우스를 네 그룹으로 나누어 면역원성을 ELISA unit으로 확인하였다. 유리당류가 10% 이하이면 면역원성이 우수하였고, 유리당류가 많아질수록 면역원성이 감소하는 것으로 나타났다(도 5 참조).
6-4. 접합체 내 VI-O-acetyl 함량에 따른 면역원성 확인
실시예 4에서 제조된 접합체 내 Vi 피막 다당류의 O-acetyl(VI-O-acetyl) 함량에 따른 면역원성을 확인하였다. 도 6에서, 각 그룹의 접합체 내 VI-O-acetyl 함량은 다음과 같다: G1; 3.7mmol/g, G2; 2.4mmol/g, G3; 1.4mmol/g, G4; 1.1mmol/g, G5; 0.7 mmol/g. 접합체 내 VI-O-acetyl 함량이 1.4 mmol/g ~ 3.7 mmol/g일 때 면역원성이 우수하였고, 바람직하게는 2.4 mmol/g ~ 3.7mmol/g일 때 더욱 우수하게 나타났다(도 6 참조).
Claims (29)
- a) 살모넬라 타이피 균을 배양하여 배양액을 제조하는 단계;
b-1) 배양액을 한외여과하는 단계;
b-2) 세타블론을 이용하여 Vi 피막 다당류를 선택적으로 분리하는 단계로서, Vi 피막 다당류 정제 공정에 사용되는 세타블론의 농도가 0.2 내지 0.8%(W/V)인 단계;
b-3) 에탄올 침전을 이용하여 Vi 피막 다당류를 정제하여 정제된 Vi 피막 다당류를 제조하는 단계;
c) 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC)를 사용하여 접합 단백질을 유도체화하는 단계; 및
d) 상기 정제된 Vi 피막 다당류와 유도체화 접합 단백질을 접합하여 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 제조하는 단계를 포함하며,
상기 접합 단백질이 디프테리아 톡소이드인, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
살모넬라 타이피 균 배양시 종배양 단계에서 OD 600nm에서 흡광도 값이 2.0 이상일 때 배양을 종료하는 것인, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
b-1) 단계에서 한외여과가 30kDa 내지 100kDa 크기의 멤브레인 필터로 수행되고,
b-2) 단계에서 세타블론을 이용하여 Vi 피막 다당류 분리시 다당류의 농도를 40㎍/ml 내지 60㎍/ml로 조절하여 수행되며,
상기 b-1) 및 b-2) 단계에서 pH가 6.8 내지 7.6으로 조절되는 것인, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
배양액을 한외여과한 후에 정용여과하는 단계를 추가로 포함하며, 정용여과시 농도가 10mM 내지 30mM인 인산나트륨 완충액을 사용하는 것인, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
b-3) 단계에서 에탄올 침전으로 분리된 Vi 피막 다당류의 평균분자량이 500kda 내지 1000kda인, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 c) 단계에서, 접합 단백질 유도체화시에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC)를 1mg/ml 이상 내지 4mg/ml 미만의 농도로 사용하는 것인, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 d) 단계에서, 정제된 Vi 피막 다당류와 유도체화 접합 단백질을 접합시 EDC를 1 mg/ml 미만의 농도로 첨가하는 것인, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 평균분자량이 2000kda 내지 4000kda인, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
Vi 피막 다당류와 유도체화 접합 단백질 접합 반응 시, 상기 Vi 피막 다당류가 유도체화 접합 단백질의 1중량부 기준으로, 0.1중량부 내지 3중량부로 첨가되는, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체에 포함된 유리당류의 함량이 10% 이하인, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법. - 제1항에 있어서,
Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체에 포함된 Vi 피막 다당류의 O-acetyl(VI-O-acetyl) 함량은 1.4 mmol/g 내지 4.5 mmol/g인, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체의 제조 방법. - 제1항 내지 제5항 및 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항의 제조 방법에 의하여 제조된 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체로서,
살모넬라 타이피 유래의 Vi 피막 다당류가 디프테리아 톡소이드에 접합된 접합체이고, 상기 Vi 피막 다당류의 평균분자량이 500kda 내지 1000kda이며, 상기 Vi 피막 다당류와 디프테리아 톡소이드가 접합된 접합체의 평균분자량은 2000kda 내지 4000kda인, Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체. - 제13항의 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는, 장티푸스 예방용 면역원성 조성물.
- 제14항에 있어서,
면역원성 조성물에는 항원으로서 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체가 1회 용량으로 20㎍ 내지 30㎍ 포함되는, 장티푸스 예방용 면역원성 조성물. - 제14항에 있어서,
면역원성 조성물이 보존제로 2-페녹시에탄올 또는 치메로살을 포함하는, 장티푸스 예방용 면역원성 조성물. - 제14항의 장티푸스 예방용 면역원성 조성물 및 보존제를 혼합하는 단계를 포함하는, 장티푸스 예방용 면역원성 조성물의 제형화 방법.
- 약학적으로 허용되는 담체와 제13항의 Vi 피막 다당류-접합 단백질 접합체를 포함하는, 대상체에서 장티푸스를 예방하기 위한 백신 조성물.
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