TWI748810B - 包含結合之莢膜醣抗原的免疫原組合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於包含結合之肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )莢膜醣抗原(糖結合物)之新穎免疫原組合物及其用途。本發明之免疫原組合物通常將包含至少一種來自沒有出現在Prevnar、Synflorix及/或Prevnar 13中之肺炎鏈球菌血清型之糖結合物。本發明亦係關於使用該等新穎免疫原組合物針對肺炎球菌感染對人類個體，具體而言嬰兒及老年人進行疫苗接種。

Description

包含結合之莢膜醣抗原的免疫原組合物及其用途
本發明係關於包含結合之莢膜醣抗原(糖結合物)之新穎免疫原組合物及其用途。本發明之免疫原組合物通常將包含糖結合物，其中該醣係源自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae )之血清型。本發明亦係關於使用該等新穎免疫原組合物針對肺炎球菌感染對人類個體、具體而言嬰兒及老年人進行疫苗接種。
由肺炎球菌引起之感染係全世界發病率及死亡率之主要原因。肺炎、發熱性菌血症及腦膜炎係侵襲性肺炎球菌性疾病之最常見表現，而呼吸道內之細菌性擴散可導致中耳感染、鼻竇炎或復發性支氣管炎。與侵襲性疾病相比，非侵襲性表現通常較不嚴重，但更為常見。 在歐洲及美國，肺炎球菌性肺炎係最常見的社區獲得性細菌性肺炎，估計每年侵襲約100人/100,000名成人。發熱性菌血症及腦膜炎之相應數值分別為15-19人/100,000人及1-2人/100,000人。該等表現中之一或多者之風險在嬰兒及老年人以及任一年齡之免疫受損者中較高。即使在經濟發達地區，侵襲性肺炎球菌性疾病仍具有高死亡率；對於患有肺炎球菌性肺炎之成人，死亡率平均為10%-20%，而其在高風險群組中可能超過50%。迄今為止，肺炎係世界範圍內肺炎球菌性死亡之最常見原因。 肺炎球菌性疾病之致病因子肺炎鏈球菌(肺炎球菌)係由多醣被膜包圍之革蘭氏陽性包膜球菌。此被膜組成之差異容許約91種莢膜類型之間之血清學分化，其中之一些通常與肺炎球菌性疾病相關，其他很少與該疾病相關。侵襲性肺炎球菌感染包括肺炎、腦膜炎及發熱性菌血症；常見非侵襲性表現尤其係中耳炎、鼻竇炎及支氣管炎。 肺炎球菌結合物疫苗(PCV)係用於抵抗由肺炎鏈球菌(肺炎球菌)引起之疾病之肺炎球菌疫苗。目前在全球市場上存在三種可用PCV疫苗：PREVNAR® (在一些國家稱為Prevenar) (七價疫苗)、SYNFLORIX® (十價疫苗)及PREVNAR 13® (十三價疫苗)。 對基本抗生素之廣譜微生物抗性之最新發展及數量漸增之免疫受損者強調需要具有甚至更廣泛保護之肺炎球菌疫苗。 具體而言，醫學上仍需要覆蓋因在PREVNAR 13® 中未發現之血清型及可能的血清型隨時間替換所致之肺炎球菌性疾病。PREVNAR 13® 中超過13種導致疾病之特定血清型因地區、群體而有所變化，且可因獲得抗生素抗性、肺炎球菌疫苗引入及未知來源之長期趨勢所致隨時間變化。業內仍需要可用於誘導人類、且尤其不到2歲之兒童之針對其他肺炎鏈球菌血清型之免疫反應的免疫原組合物。 本發明之新穎免疫原組合物之目標係提供針對在PREVNAR 13® 中未發現之肺炎鏈球菌血清型之適當保護。在一態樣中，本發明免疫原組合物之目標係提供針對在PREVNAR® (七價疫苗)、SYNFLORIX® 及/或PREVNAR 13® 中未發現之肺炎鏈球菌血清型之適當保護，同時維持針對該等疫苗目前所覆蓋之血清型之免疫反應。
本發明係關於免疫原組合物，其包含至少一種選自由以下組成之群之糖結合物：來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物、來自肺炎鏈球菌血清型22F之糖結合物、來自肺炎鏈球菌血清型33F之糖結合物、來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物、來自肺炎鏈球菌血清型10A之糖結合物、來自肺炎鏈球菌血清型11A之糖結合物及來自肺炎鏈球菌血清型8之糖結合物。 在一態樣中，本發明提供免疫原組合物，其包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物、至少一種來自肺炎鏈球菌血清型22F之糖結合物及至少一種來自肺炎鏈球菌血清型33F之糖結合物。 在另一態樣中，本發明提供免疫原組合物，其包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物、至少一種來自肺炎鏈球菌血清型22F之糖結合物、至少一種來自肺炎鏈球菌血清型33F之糖結合物、至少一種來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物、至少一種來自肺炎鏈球菌血清型10A之糖結合物、至少一種來自肺炎鏈球菌血清型11A之糖結合物及至少一種來自肺炎鏈球菌血清型8之糖結合物。 在態樣中，上述免疫原組合物進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之糖結合物。 在另一態樣中，上述免疫原組合物進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、5及7F之糖結合物。 在另一態樣中，上述免疫原組合物進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型6A及19A之糖結合物。 在另一態樣中，上述免疫原組合物進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型3之糖結合物。 在另一態樣中，上述免疫原組合物進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型2、9N、17F、20及/或15C之糖結合物。 在態樣中，上述免疫原組合物不包含來自肺炎鏈球菌血清型9N、9A及/或9L之莢膜醣。 在態樣中，上述免疫原組合物係8價、9價、10價、11價、12價、13價、14價、15價、16價、17價、18價、19價或20價肺炎球菌結合物組合物。在態樣中，上述免疫原組合物係7價、8價、9價、10價、11價、12價、13價、14價、15價、16價、17價、18價、19價、20價、21價、22價、23價、24價或25價肺炎球菌結合物組合物。 在態樣中，糖結合物個別地結合至選自由以下組成之群之載體蛋白質：DT (白喉毒素)、TT (破傷風類毒素)、CRM197 、其他DT突變體、PD (流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)蛋白質D)或其免疫功能等效物。 在一態樣中，本發明提供填充有本文件中所定義之任一免疫原組合物之容器。 在一態樣中，本發明提供本文件中所定義之任一免疫原組合物，其用作藥劑、尤其用作疫苗。 在一態樣中，本發明提供預防、治療或改善個體之與肺炎鏈球菌相關之感染、疾病或病況的方法，其包含向個體投與免疫有效量之本文件中所定義之任一免疫原組合物。
針對來自匹配的疫苗接種之前及之後血清盤(N = 66)之血清型9N之OPA效價的逆累積分佈曲線，該血清盤經13價肺炎球菌結合物疫苗(研究6115A1-3005; ClinicalTrials.gov識別碼：NCT00546572)疫苗接種。該等曲線表示具有OPA正效價(即，≥1:8)之血清之百分數。1 本發明之免疫原組合物 本發明之免疫原組合物通常將包含結合之莢膜醣抗原(亦稱為糖結合物)，其中醣係源自肺炎鏈球菌之血清型。 較佳地，肺炎鏈球菌莢膜醣之數量可介於8種不同血清型(或「v」，效價)至20種不同血清型(20v)範圍內。在一個實施例中存在8種不同的血清型。在一個實施例中存在9種不同的血清型。在一個實施例中存在10種不同的血清型。在一個實施例中存在11種不同的血清型。在一個實施例中存在12種不同的血清型。在一個實施例中存在13種不同的血清型。在一個實施例中存在14種不同的血清型。在一個實施例中存在15種不同的血清型。在一個實施例中存在16種不同的血清型。在實施例中存在17種不同的血清型。在實施例中存在18種不同的血清型。在實施例中存在19種不同的血清型。在實施例中存在20種不同的血清型。莢膜醣結合至載體蛋白質以形成如下文所闡述之糖結合物。 若組合物中2種或更多種醣之蛋白質載體相同，則該等醣可結合至蛋白質載體之相同分子(載體分子具有與其結合之2種或更多種不同的醣) [例如，參見WO2004/083251]。 但在較佳實施例中，醣各自個別地結合至蛋白質載體之不同分子(蛋白質載體之每一分子僅具有與其結合之一種類型之醣)。在該實施例中，認為莢膜醣個別地結合至載體蛋白質。 出於本發明之目的，術語「糖結合物」指示共價連接至載體蛋白質之莢膜醣。在一個實施例中，莢膜醣直接連接至載體蛋白質。在第二實施例中，細菌醣經由間隔體/連接體連接至蛋白質。1.1 本發明之載體蛋白質 本發明糖結合物之組份係結合醣之載體蛋白質。術語「蛋白質載體」或「載體蛋白質」或「載體」在本文中可互換使用。載體蛋白質應能夠經受標準結合程序。 在較佳實施例中，糖結合物之載體蛋白質係選自由以下組成之群：DT (白喉毒素)、TT (破傷風類毒素)或TT之片段C、CRM197 (白喉毒素之無毒但抗原相同之變體)、其他DT突變體(例如CRM176、CRM228、CRM45 (Uchida等人(1973) J. Biol. Chem. 218:3838-3844)、CRM9、CRM102、CRM103或CRM107；以及Nicholls及Youle在Genetically Engineered Toxins，編輯：Frankel, Maecel Dekker公司(1992)中闡述之其他突變；缺失或Glu-148至Asp、Gln或Ser及/或Ala 158至Gly之突變及美國專利第4,709,017號及第4,950,740號中所揭示之其他突變；至少一或多個殘基Lys 516、Lys 526、Phe 530及/或Lys 534之突變及美國專利第5,917,017號及第6,455,673號中所揭示之其他突變；或美國專利第5,843,711號中所揭示之片段；肺炎球菌溶血素(ply) (Kuo等人(1995) Infect lmmun 63:2706-2713)，包括以某種方式去毒之ply，例如dPLY-GMBS (WO 2004/081515、WO 2006/032499)或dPLY-甲醛、PhtX，包括PhtA、PhtB、PhtD、PhtE (PhtA、PhtB、PhtD或PhtE之序列揭示於WO 00/37105及WO 00/39299中)；及Pht蛋白之融合物，例如PhtDE融合物、PhtBE融合物、Pht A-E (WO 01/98334、WO 03/054007、WO2009/000826)；OMPC (腦膜炎球菌外膜蛋白)，其通常係自腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis )血清群B提取(EP0372501)、PorB (來自腦膜炎雙球菌)、PD (流感嗜血桿菌蛋白質D；例如，參見EP0594610 B)或其免疫功能等效物；合成肽(EP0378881、EP0427347)、熱休克蛋白(WO 93/17712、WO 94/03208)、百日咳蛋白(WO 98/58668、EP0471177)、細胞介素、淋巴介質、生長因子或激素(WO 91/01146)；人工蛋白質，包含來自多種病原體源性抗原之多種人類CD4+ T細胞表位(Falugi等人(2001) Eur J Immunol 31:3816-3824)，例如N19蛋白(Baraldoi等人(2004) Infect lmmun 72:4884-4887)、肺炎球菌表面蛋白PspA (WO 02/091998)、鐵吸收蛋白(WO 01/72337)、難養芽孢梭菌(Clostridium difficile )之毒素A或B (WO 00/61761)、運鐵蛋白連結蛋白、肺炎球菌黏著蛋白(PsaA)、重組綠膿桿菌外毒素A (具體而言其無毒突變體(例如帶有麩胺酸553處之取代之外毒素A (Douglas等人(1987) J. Bacteriol. 169(11):4967-4971))。亦可使用其他蛋白質(例如卵白蛋白、鑰孔帽貝血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素之經純化蛋白質衍生物(PPD))作為載體蛋白質。其他適宜載體蛋白質包括失活之細菌毒素，例如霍亂類毒素(例如，如WO 2004/083251中所闡述)、大腸桿菌(Escherichia coli ) LT/大腸桿菌ST及來自綠膿桿菌之外毒素A。 在較佳實施例中，糖結合物之載體蛋白質係獨立地選自由以下組成之群：TT、DT、DT突變體(例如CRM197 )、流感嗜血桿菌蛋白質D、PhtX、PhtD、PhtDE融合物(尤其WO 01/98334及WO 03/054007中所闡述之彼等)、去毒肺炎球菌溶血素、PorB、N19蛋白、PspA、OMPC、難養芽孢梭菌之毒素A或B及PsaA。 在實施例中，本發明糖結合物之載體蛋白質係DT(白喉類毒素)。在另一實施例中，本發明糖結合物之載體蛋白質係TT (破傷風類毒素)。 在另一實施例中，本發明糖結合物之載體蛋白質係PD (流感嗜血桿菌蛋白質D；例如，參見EP0594610 B)。 在較佳實施例中，本發明之莢膜醣結合至CRM197 蛋白。CRM197 蛋白係白喉毒素之無毒形式，但在免疫上無異於白喉毒素。CRM197 係由感染不產毒素之噬菌體β197tox- 之白喉棒狀桿菌產生，該不產毒素之噬菌體β197tox- 係藉由亞硝基胍誘變產毒素之β棒狀噬菌體產生(Uchida等人(1971) Nature New Biology 233:8-11)。CRM197 蛋白具有與白喉毒素相同之分子量，但其不同之處在於結構基因中之單一鹼基變化(鳥嘌呤至腺嘌呤)。此單一鹼基變化引起成熟蛋白質中之胺基酸取代(麩胺酸對於甘胺酸)且消除白喉毒素之毒性性質。CRM197 蛋白係醣之安全且有效的T細胞依賴性載體。關於CRM197 及其產生之其他細節可參見例如美國專利第5,614,382號。 在實施例中，本發明之莢膜醣結合至CRM197 蛋白或CRM197 之A鏈(參見CN103495161)。在實施例中，本發明之莢膜醣結合至經由遺傳重組大腸桿菌之表現獲得之CRM197 A鏈(參見CN103495161)。在實施例中，本發明之莢膜醣皆結合至CRM197 。在實施例中，本發明之莢膜醣皆結合至CRM197 之A鏈。 因此，在常見實施例中，本發明之糖結合物包含CRM197 作為載體蛋白質，其中莢膜多醣共價連接至CRM197 。1.2 本發明之莢膜醣 術語「醣」在本說明書全篇中可指示多醣或寡醣且包括二者。在常見實施例中，該醣係多醣、尤其肺炎鏈球菌莢膜多醣。 莢膜多醣係藉由彼等熟習此項技術者已知之標準技術來製備。 在本發明中，莢膜多醣可自例如肺炎鏈球菌之血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F製備。通常藉由使每一肺炎鏈球菌血清型在培養基中(例如在基於大豆之培養基中)生長來產生莢膜多醣，然後自細菌培養物製備多醣。用於製備用於本發明糖結合物中之各別多醣之肺炎鏈球菌之細菌菌株可自已建立之培養物保藏中心或臨床樣本獲得。 通常將生物體(每一肺炎鏈球菌血清型)之群自一個種子小瓶按比例放大至多個種子瓶，且經由一或多個遞增體積之種子發酵罐傳代直至達到生產規模發酵體積。在生長週期結束時，使細胞溶解且然後收穫溶解液以供下游(純化)處理(例如，參見WO 2006/110381、WO2008/118752以及美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2006/0228381號、第2008/0102498號及第2008/0286838號)。 通常經由離心、沈澱、超濾及/或管柱層析純化個別多醣(例如，參見WO 2006/110352及WO 2008/118752)。 經純化多醣可經活化(例如，經化學活化)以使其能夠反應(例如，與eTEC間隔體)且然後納入本發明之糖結合物中，如本文進一步闡述。 肺炎鏈球菌莢膜多醣包含可含有至多8個糖殘基之重複寡醣單元。 在實施例中，本發明之莢膜醣可為一個寡醣單元或比重複寡醣單元之天然長度醣鏈短。在實施例中，本發明之莢膜醣為相關血清型之一個重複寡醣單元。 在實施例中，本發明之莢膜醣可係寡醣。寡醣具有較低重複單元數(通常5-15個重複單元)，且通常源自合成或多醣之水解。 但較佳地，本發明中及本發明之免疫原組合物中之所有莢膜醣皆為多醣。由於抗原表面上存在表位，高分子量莢膜多醣能夠誘導某些抗體免疫反應。在本發明之結合物、組合物及方法中較佳涵蓋高分子量莢膜多醣之分離及純化。 在一些實施例中，經純化多醣在結合前之分子量介於10 kDa與4,000 kDa之間。在其他該等實施例中，多醣之分子量介於50 kDa與4,000 kDa之間。在其他該等實施例中，多醣之分子量介於50 kDa與3,500 kDa之間；介於50 kDa與3,000 kDa之間；介於50 kDa與2,500 kDa之間；介於50 kDa與2,000 kDa之間；介於50 kDa與1,750 kDa之間；介於50 kDa與1,500 kDa之間；介於50 kDa與1,250 kDa之間；介於50 kDa與1,000 kDa之間；介於50 kDa與750 kDa之間；介於50 kDa與500 kDa之間；介於100 kDa與4,000 kDa之間；介於100 kDa與3,500 kDa之間；100 kDa與3,000 kDa之間；100 kDa與2,500 kDa之間；100 kDa與2,000 kDa之間；介於100 kDa與2,000 kDa之間；介於100 kDa與1,750 kDa之間；介於100 kDa與1,500 kDa之間；介於100 kDa與1,250 kDa之間；介於100 kDa與1,000 kDa之間；介於100 kDa與750 kDa之間；介於100 kDa與500 kDa之間；介於200 kDa與4,000 kDa之間；介於200 kDa與3,500 kDa之間；介於200 kDa與3,000 kDa之間；介於200 kDa與2,500 kDa之間；介於200 kDa與2,000 kDa之間；介於200 kDa與2,000 kDa之間；介於200 kDa與1,750 kDa之間；介於200 kDa與1,500 kDa之間；介於200 kDa與1,250 kDa之間；介於200 kDa與1,000 kDa之間；介於200 kDa與750 kDa之間；或介於200 kDa與500 kDa之間。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。 多醣之大小在正常純化程序期間可稍微減小。另外，如本文所闡述，可使多醣在結合前經受分篩技術。可採用機械或化學分篩。化學水解可使用乙酸來實施。機械分篩可使用高壓均質化剪切來實施。上文所提及之分子量範圍係關於結合前(例如，活化前)之經純化多醣。 在較佳實施例中，經純化多醣係來自肺炎鏈球菌之血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F或33F之莢膜多醣，其中莢膜多醣之分子量在如上文所闡述之分子量範圍內。 如本文所使用，術語多醣或載體蛋白質-多糖結合物之「分子量」係指藉由粒徑排阻層析(SEC)與多角雷射光散射檢測器(MALLS)組合計算之分子量。 在一些實施例中，將本發明之來自血清型9V、18C、11A、15B、22F及/或33F之肺炎球菌醣O-乙醯化。在一些實施例中，將本發明之來自血清型9V、11A、15B、22F及/或33F之肺炎球菌醣O-乙醯化。 對本文所闡述之經純化多醣實施化學活化以使該等醣能夠與載體蛋白質反應。該等肺炎球菌結合物係藉由單獨製程製備並可將其調配成如下文所闡述之單劑量調配物。1.2.1 來自肺炎鏈球菌血清型 1 、 3 、 4 、 5 、 6A 、 6B 、 7F 、 9V 、 14 、 18C 、 19A 、 19F 及 23F 之肺炎球菌多醣 來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F之莢膜醣可藉由彼等熟習此項技術者已知之標準技術來製備(例如，參見WO 2006/110381)。莢膜多醣可藉由使每一肺炎鏈球菌血清型在培養基中生長來產生；在生長週期結束時，使細胞溶解且然後收穫溶解液以供下游(純化)處理。通常經由離心、沈澱、超濾及/或管柱層析純化個別多醣(例如，參見WO 2006/110352及WO 2008/118752)。可如本文進一步闡述進一步處理經純化之多醣以製備本發明之糖結合物。 在一些實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及/或23F之經純化多醣在結合前之分子量介於10 kDa與4,000 kDa之間。在其他該等實施例中，多醣之分子量介於50 kDa與4,000 kDa之間；介於50 kDa與3,000 kDa之間或介於50 kDa與2,000 kDa之間。在其他該等實施例中，多醣之分子量介於50 kDa與3,500 kDa之間；介於50 kDa與3,000 kDa之間；介於50 kDa與2,500 kDa之間；介於50 kDa與2,000 kDa之間；50 kDa與1,750 kDa之間；介於50 kDa與1,500 kDa之間；介於50 kDa與1,250 kDa之間；介於50 kDa與1,000 kDa之間；介於50 kDa與750 kDa之間；介於50 kDa與500 kDa之間；介於100 kDa與4,000 kDa之間；介於100 kDa與3,500 kDa之間；介於100 kDa與3,000 kDa之間；介於100 kDa與2,500 kDa之間；介於100 kDa與2,000 kDa之間；介於100 kDa與1,750 kDa之間；介於100 kDa與1,500 kDa之間；介於100 kDa與1,250 kDa之間；介於100 kDa與1,000 kDa之間；介於100 kDa與750 kDa之間；介於100 kDa與500 kDa之間；介於200 kDa與4,000 kDa之間；介於200 kDa與3,500 kDa之間；介於200 kDa與3,000 kDa之間；介於200 kDa與2,500 kDa之間；介於200 kDa與2,000 kDa之間；介於200 kDa與1,750 kDa之間；介於200 kDa與1,500 kDa之間；介於200 kDa與1,250 kDa之間；介於200 kDa與1,000 kDa之間；介於200 kDa與750 kDa之間；或介於200 kDa與500 kDa之間。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。 多醣之大小在正常純化程序期間可稍微減小。另外，如本文所闡述，可使多醣在結合前經受分篩技術。上文所提及之分子量範圍與在最終分篩步驟後結合前(例如，活化前)之經純化多醣相關。 在一些實施例中，將本發明之來自血清型9V及/或18C之肺炎球菌醣O-乙醯化。在一些實施例中，將本發明之來自血清型9V之肺炎球菌醣O-乙醯化，且將本發明之來自血清型18C之肺炎球菌醣去-O-乙醯化。1.2.2 肺炎球菌多醣血清型 8 血清型8之多醣重複單元係由具有一個葡糖醛酸(Glcp A)、兩個吡喃葡萄糖(Glcp )及一個吡喃半乳糖(Galp )之直鏈四醣單元組成(Jones等人(1957) The Journal of the American Chemical Society. 79(11):2787-2793)。所有四個單醣皆經由1,4-鍵連接，如圖1所展示。 血清型8醣可使用熟習此項技術者已知之分離程序(例如，參見美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2006/0228381號、第2007/0184071號、第2007/0184072號、第2007/0231340號及第2008/0102498號以及第WO2008/118752號中所揭示之方法)自細菌直接獲得。另外，其可使用合成方案來產生。 血清型8肺炎鏈球菌菌株可自已建立之培養物保藏中心(例如Streptococcal Reference Laboratory (疾病控制及預防中心(Centers for Disease Control and Prevention)，Atlanta, GA))或臨床樣本獲得。 在一些實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型8之經純化多醣在結合前之分子量介於10 kDa與2,000 kDa之間。在一個實施例中，莢膜多醣之分子量介於50 kDa與1,000 kDa之間。在另一實施例中，莢膜多醣之分子量介於70 kDa與900 kDa之間。在另一實施例中，莢膜多醣之分子量介於100 kDa與800 kDa之間。 在其他實施例中，莢膜多醣之分子量為100 kDa至600 kDa；100 kDa至500 kDa；100 kDa至400 kDa；150 kDa至600 kDa；150 kDa至500 kDa；150 kDa至400 kDa；200 kDa至600 kDa；200 kDa至500 kDa；200 kDa至400 kDa；250 kDa至600 kDa；250 kDa至500 kDa；250 kDa至400 kDa；250 kDa至350 kDa；300 kDa至600 kDa；300 kDa至500 kDa；300 kDa至400 kDa；400 kDa至600 kDa；500 kDa至600 kDa；及類似期望分子量範圍。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。 多醣之大小在正常純化程序期間可稍微減小。另外，如本文所闡述，可使多醣在結合前經受分篩技術。上文所提及之分子量範圍係關於最終分篩步驟後結合前(例如，活化前)之經純化多醣。1.2.3 肺炎球菌多醣血清型 10A 血清型10A之多醣重複單元係由具有兩個呋喃半乳糖(Gal f )、三個吡喃半乳糖(Gal p )、一個N-乙醯基半乳糖胺(Gal p NAc)之具支鏈六醣重複單元及主鏈磷酸核糖醇組成(Jones, C. (2005) Carbohydrate Research 269(1):175-181)。在β-Galp NAc部分處存在兩個分枝單醣(β-3-Galp 及β-6-Galf )，如圖2所展示。 血清型10A醣可使用熟習此項技術者已知之分離程序(例如，參見美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2006/0228381號、第2007/0184071號、第2007/0184072號、第2007/0231340號及第2008/0102498號以及第WO2008/118752號中所揭示之方法)自細菌直接獲得。另外，其可使用合成方案來產生。 血清型10A肺炎鏈球菌菌株可自已建立之培養物保藏中心(例如Streptococcal Reference Laboratory (疾病控制及預防中心，Atlanta, GA))或臨床樣本獲得。 在一些實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型10A之經純化多醣在結合前之分子量介於10 kDa與2,000 kDa之間。在一個實施例中，莢膜多醣之分子量介於50 kDa與1,000 kDa之間。在另一實施例中，莢膜多醣之分子量介於70 kDa與900 kDa之間。在另一實施例中，莢膜多醣之分子量介於100 kDa與800 kDa之間。 在其他實施例中，莢膜多醣之分子量為100 kDa至600 kDa；100 kDa至500 kDa；100 kDa至400 kDa；150 kDa至600 kDa；150 kDa至500 kDa；150 kDa至400 kDa；200 kDa至600 kDa；200 kDa至500 kDa；200 kDa至400 kDa；250 kDa至600 kDa；250 kDa至500 kDa；250 kDa至400 kDa；250 kDa至350 kDa；300 kDa至600 kDa；300 kDa至500 kDa；300 kDa至400 kDa；400 kDa至600 kDa；500 kDa至600 kDa；及類似期望分子量範圍。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。 多醣之大小在正常純化程序期間可稍微減小。另外，如本文所闡述，可使多醣在結合前經受分篩技術。上文所提及之分子量範圍係關於最終分篩步驟後結合前(例如，活化前)之經純化多醣。1.2.4 肺炎球菌多醣血清型 11A 血清型11A之多醣重複單元係由直鏈四醣主鏈(兩個吡喃半乳糖(Gal p )及兩個吡喃葡萄糖(Glc p ))及殘基磷甘油(Richards等人(1988) Adv. Exp. Med. Biol. 228:595-597)組成，如圖3所展示。將多醣之多個位置O-乙醯化且基於文獻中所報導之數據(Calix等人(2011) J Bacteriol. 193(19):5271-5278)，11A多醣中之O-乙醯化總量為約2.6個O-乙醯基/多醣重複單元。 血清型11A醣可使用熟習此項技術者已知之分離程序(例如，參見美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2006/0228381號、第2007/0184071號、第2007/0184072號、第2007/0231340號及第2008/0102498號以及第WO2008/118752號中所揭示之方法)自細菌直接獲得。另外，其可使用合成方案來產生。 血清型11A肺炎鏈球菌菌株可自已建立之培養物保藏中心(例如Streptococcal Reference Laboratory (疾病控制及預防中心，Atlanta, GA))或臨床樣本獲得。 藉由純化來自肺炎鏈球菌溶解物之血清型11A多醣並視情況分篩經純化多醣獲得之經分離血清型11A莢膜多醣可藉由不同屬性來表徵，包括例如分子量(MW)及mM乙酸鹽/mM該血清型11A莢膜多醣。 在一些實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型11A之經純化多醣在結合前之分子量介於10 kDa與2,000 kDa之間。在一個實施例中，莢膜多醣之分子量介於50 kDa與1,000 kDa之間。在另一實施例中，莢膜多醣之分子量介於70 kDa與900 kDa之間。在另一實施例中，莢膜多醣之分子量介於100 kDa與800 kDa之間。 在其他實施例中，莢膜多醣之分子量為100 kDa至600 kDa；100 kDa至500 kDa；100 kDa至400 kDa；100 kDa至300 kDa；100 kDa至200 kDa；150 kDa至600 kDa；150 kDa至500 kDa；150 kDa至400 kDa；150 kDa至300 kDa；150 kDa至200 kDa；200 kDa至600 kDa；200 kDa至500 kDa；200 kDa至400 kDa；250 kDa至600 kDa；250 kDa至500 kDa；250 kDa至400 kDa；250 kDa至350 kDa；300 kDa至600 kDa；300 kDa至500 kDa；300 kDa至400 kDa；400 kDa至600 kDa；500 kDa至600 kDa；及類似期望分子量範圍。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。 多醣之大小在正常純化程序期間可稍微減小。另外，如本文所闡述，可使多醣在結合前經受分篩技術。上文所提及之分子量範圍係關於最終分篩步驟後結合前(例如，活化前)之經純化多醣。 在實施例中，藉由高壓均質化減小經純化血清型11A多醣之大小。高壓均質化係藉由將製程流泵送通過具有足夠小尺寸之流動路徑來達成高剪切速率。藉由使用較大施加均質壓力來增加剪切速率，且可藉由使進料流再循環通過均質機來延長暴露時間。 高壓均質化製程尤其適用於減小經純化血清型11A多醣之大小，同時保持多醣之結構特徵，例如O-乙醯基之存在。 經純化、分離或活化之血清型11A莢膜多醣或在血清型11A多醣-載體蛋白質結合物中O-乙醯基之存在表示為乙酸鹽mM數/mM該多醣或表示為O-乙醯基數/多醣重複單元。 在較佳實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型11A之經純化多醣具有至少0.2 µmol、0.4 µmol、0.6 µmol、0.8 µmol、1.0 µmol、1.2 µmol、1.4 µmol或1.6 µmol該血清型11A莢膜多醣。1.2.5 肺炎球菌多醣血清型 12F 血清型12F之多醣重複單元係由直鏈三醣主鏈(一個N-乙醯基岩藻糖胺(Fuc p NAc)、一個N-乙醯基半乳糖胺(Gal p NAc)及一個N-乙醯基甘露糖醛酸(Man p NAcA))組成，該直鏈三醣主鏈具有兩個分枝：連接至Fuc p NAc之C3處之側基α-吡喃半乳糖(Gal p )及連接至Man p NAcA之C3處的α-Glc p -(1→2)-α-Glc p 二醣分枝(Leontein等人(1983) Carbohydrate Research114(2):257-266。)，如圖4所展示。 血清型12F肺炎鏈球菌菌株可自已建立之培養物保藏中心(例如Streptococcal Reference Laboratory (疾病控制及預防中心，Atlanta, GA))或臨床樣本獲得。 來自肺炎鏈球菌血清型12F之莢膜醣係藉由彼等熟習此項技術者已知之標準技術來製備。通常藉由使每一肺炎鏈球菌血清型在培養基中(例如，在基於大豆之培養基中)生長來產生莢膜多醣，然後自細菌培養物製備多醣。通常將生物體(肺炎鏈球菌血清型12F)之群自種子小瓶按比例放大至種子瓶，且經由一或多個遞增體積之種子發酵罐傳代直至達到生產規模發酵體積。在生長週期結束時，使細胞溶解且然後收穫溶解液以供下游(純化)處理(例如，參見WO 2006/110381及WO2008/118752、美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2006/0228381號、第2008/0102498號及第US2008/0286838號)。通常經由離心、沈澱、超濾及/或管柱層析來純化多醣(例如，參見WO2006/110352及WO 2008/118752)。 來自血清型12F之經純化多醣可經活化(例如，經化學活化)以使其能夠反應，且然後引入本發明之糖結合物中，如本文進一步闡述。 在一些實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之經純化多醣在結合前之分子量介於10 kDa與2,000 kDa之間。在一個實施例中，莢膜多醣之分子量介於50 kDa與1,000 kDa之間。在另一實施例中，莢膜多醣之分子量介於50 kDa與300 kDa之間。在另一實施例中，莢膜多醣之分子量介於70 kDa與300 kDa之間。在其他實施例中，莢膜多醣之分子量為90 kDa至250 kDa；90 kDa至150 kDa；90 kDa至120 kDa；80 kDa至120 kDa；70 kDa至100 kDa；70 kDa至110 kDa；70 kDa至120 kDa；70 kDa至130 kDa；70 kDa至140 kDa；70 kDa至150 kDa；70 kDa至160 kDa；80 kDa至110 kDa；80 kDa至120 kDa；80 kDa至130 kDa；80 kDa至140 kDa；80 kDa至150 kDa；80 kDa至160 kDa；90 kDa至110 kDa；90 kDa至120 kDa；90 kDa至130 kDa；90 kDa至140 kDa；90 kDa至150 kDa；90 kDa至160 kDa；100 kDa至120 kDa；100 kDa至130 kDa；100 kDa至140 kDa；100 kDa至150 kDa；100 kDa至160 kDa；及類似期望分子量範圍。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。 多醣之大小在正常純化程序期間可稍微減小。另外，如本文所闡述，可使多醣在結合前經受分篩技術。上文所提及之分子量範圍係關於最終分篩步驟後結合前(例如，活化前)之經純化多醣。1.2.6 肺炎球菌多醣血清型 15B 如圖5所展示，血清型15B之多醣重複單元係由具支鏈三醣主鏈(一個N-乙醯基葡糖胺(Glc p NAc)、一個吡喃半乳糖(Gal p )及一個吡喃葡萄糖(Glc p ))組成，且αGal p -βGal p 二醣分枝連接至Glc p NAc之C4羥基。磷甘油連接至二醣分枝中之βGal p 殘基之C3羥基(Jones等人(2005) Carbohydrate Research 340(3):403-409)。來自血清型15C血清型之莢膜多醣具有與血清型15B相同之主鏈結構且缺乏O-乙醯化。 血清型15B多醣可使用熟習此項技術者已知之分離程序(例如，參見美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2006/0228381號、第2007/0184071號、第2007/0184072號、第2007/0231340號及第2008/0102498號以及第WO2008/118752號中所揭示之方法)自細菌直接獲得。其亦可使用熟習此項技術者已知之合成方案來產生。 血清型15B肺炎鏈球菌菌株可自已建立之培養物保藏中心(例如美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC, Manassas, VA USA) (例如，存儲菌株號ATCC10354)或Streptococcal Reference Laboratory (疾病控制及預防中心，Atlanta, GA USA))或自臨床樣本獲得。 使細菌細胞在培養基中、較佳在基於大豆之培養基中生長。在產生肺炎鏈球菌血清型15B莢膜多醣之細菌細胞發酵後，使細菌細胞溶解以產生細胞溶解物。然後可使用業內已知之純化技術自細胞溶解物分離血清型15B多醣，該等純化技術包括使用離心、深度過濾、沈澱、超濾、用活性碳處理、滲濾及/或管柱層析(例如，參見美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2006/0228381號、第2007/0184071號、第2007/0184072號、第2007/0231340號及第2008/0102498號以及第WO2008/118752號)。然後可使用經純化之血清型15B莢膜多醣來製備免疫原結合物。 藉由純化來自肺炎鏈球菌溶解物之血清型15B多醣並視情況分篩經純化多醣獲得之經分離血清型15B莢膜多醣可藉由不同參數來表徵，包括例如分子量(MW)、mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣及mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。 較佳地，為產生具有有利的濾過特徵及/或產率之15B結合物，在結合至載體蛋白質之前將多醣分篩至目標分子量範圍。有利地，減小經純化血清型15B多醣之大小，同時保持多醣結構之關鍵特徵，例如O-乙醯基之存在。較佳地，藉由機械均質化來減小經純化血清型15B多醣之大小。 在較佳實施例中，藉由高壓均質化來減小經純化血清型15B多醣之大小。高壓均質化藉由將製程流泵送通過具有足夠小尺寸之流動路徑來達成高剪切速率。藉由使用較大施加均質壓力來增加剪切速率，且可藉由使進料流再循環通過均質機來延長暴露時間。 高壓均質化製程尤其適用於減小經純化血清型15B多醣之大小，同時保持多醣之結構特徵，例如O-乙醯基之存在。 在較佳實施例中，經分離血清型15B莢膜多醣之分子量介於5 kDa與500 kDa之間、介於50 kDa與500 kDa之間、介於50 kDa與450 kDa之間、介於100 kDa與400 kDa之間及介於100 kDa與350 kDa之間。在較佳實施例中，經分離血清型15B莢膜多醣之分子量介於100 kDa與350 kDa之間。在較佳實施例中，經分離血清型15B莢膜多醣之分子量介於100 kDa與300 kDa之間。在較佳實施例中，經分離血清型15B莢膜多醣之分子量介於150 kDa與300 kDa之間。在較佳實施例中，經分離血清型15B莢膜多醣之分子量介於150 kDa與350 kDa之間。在其他實施例中，莢膜多醣之分子量為100 kDa至500 kDa；100 kDa至400 kDa；100 kDa至300 kDa；100 kDa至200 kDa；150 kDa至500 kDa；150 kDa至400 kDa；150 kDa至300 kDa；150 kDa至200 kDa；200 kDa至500 kDa；200 kDa至400 kDa；250 kDa至500 kDa；250 kDa至400 kDa；250 kDa至350 kDa；300 kDa至500 kDa；300 kDa至400 kDa；及類似期望分子量範圍。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。 將血清型15B多醣O-乙醯化，且O-乙醯化之總量為約0.8-0.9個O-乙醯基/多醣重複單元。可藉由業內已知之任一方法、例如藉由質子NMR來測定多醣之O-乙醯化程度(例如，參見Lemercinier等人(1996) Carbohydrate Research 296:83-96；Jones等人(2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30:1233-1247；WO 2005/033148及WO00/56357)。另一常用方法闡述於Hestrin, S. (1949) J. Biol. Chem. 180:249-261中。較佳地，藉由離子-HPLC分析測定O-乙醯基之存在。 經純化、分離或活化之血清型15B莢膜多醣或血清型15B多醣-載體蛋白質結合物中O-乙醯基之存在表示為乙酸鹽mM數/mM該多醣或O-乙醯基數/多醣重複單元。 在較佳實施例中，經分離之血清型15B莢膜多醣包含至少0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM或0.8 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，經分離之血清型15B莢膜多醣包含至少0.5 mM、0.6 mM或0.7 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，經分離之血清型15B莢膜多醣包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，經分離之血清型15B莢膜多醣包含至少0.7 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣。 在藉由用氫氟酸(HF)處理多醣使甘油釋放後，藉由使用高效陰離子交換層析與脈衝安培檢測(HPAEC-PAD)量測甘油來確定甘油磷酸酯側鏈之存在。經純化、分離或活化之血清型15B多醣或血清型15B多醣-載體蛋白質結合物中甘油之存在表示為甘油之mM數/mM血清型15B多醣。 在較佳實施例中，經分離之血清型15B莢膜多醣包含至少0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM或0.8 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，經分離之血清型15B莢膜多醣包含至少0.5 mM、0.6 mM或0.7 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，經分離之血清型15B莢膜多醣包含至少0.6 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，經分離之血清型15B莢膜多醣包含至少0.7 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經分離血清型15B莢膜多醣之分子量介於100 kDa與350 kDa之間，且包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經分離血清型15B莢膜多醣之分子量介於100 kDa與350 kDa之間，且包含至少0.6 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經分離血清型15B莢膜多醣之分子量介於150 kDa與300 kDa之間，且包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經分離血清型15B莢膜多醣之分子量介於150 kDa與300 kDa之間，且包含至少0.6 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經分離血清型15B莢膜多醣之分子量介於150 kDa與350 kDa之間，且包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經分離血清型15B莢膜多醣之分子量介於150 kDa與350 kDa之間，且包含至少0.6 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經分離之血清型15B莢膜多醣包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣及至少0.6 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經分離血清型15B莢膜多醣之分子量介於100 kDa與350 kDa之間，且包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣及至少0.6 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經分離血清型15B莢膜多醣之分子量介於150 kDa與300 kDa之間，且包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣及至少0.6 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經分離血清型15B莢膜多醣之分子量介於150 kDa與350 kDa之間，且包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣及至少0.6 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。1.2.7 肺炎球菌多醣血清型 22F 如圖6所展示，血清型22F之多醣重複單元係由具支鏈五醣主鏈(一個葡糖醛酸(Glc p A)、一個吡喃葡萄糖(Glc p )、一個呋喃半乳糖(Gal f )及兩個吡喃鼠李糖(Rha p ))組成，且αGlc p 分枝連接至βRha p 之C3羥基(Richards等人(1989) Canadian Journal of Chemistry 67(6):1038-1050)。多醣重複單元中之βRha p 殘基之約80% C2羥基經O-乙醯化。 血清型22F多醣可使用熟習此項技術者已知之分離程序(例如，參見美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2006/0228381號、第2007/0184071號、第2007/0184072號、第2007/0231340號及第2008/0102498號以及第WO2008/118752號中所揭示之方法)自細菌直接獲得。另外，其可使用合成方案來產生。 血清型22F肺炎鏈球菌菌株可自已建立之培養物保藏中心(例如Streptococcal Reference Laboratory (疾病控制及預防中心，Atlanta, GA))或臨床樣本獲得。 藉由純化來自肺炎鏈球菌溶解物之血清型22F多醣並視情況分篩經純化多醣獲得之經分離血清型22F莢膜多醣可藉由不同參數來表徵，包括例如分子量(MW)及mM乙酸鹽/mM該血清型22F莢膜多醣。 較佳地，為產生具有有利的濾過特徵及/或產率之血清型22F結合物，在結合至載體蛋白質之前將多醣分篩至目標分子量範圍。有利地，減小經純化血清型22F多醣之大小，同時保持多醣結構之關鍵特徵，例如O-乙醯基之存在。較佳地，藉由機械均質化來減小經純化血清型22F多醣之大小。 在較佳實施例中，藉由高壓均質化來減小經純化多醣之大小。高壓均質化藉由將製程流泵送通過具有足夠小尺寸之流動路徑來達成高剪切速率。藉由使用較大施加均質壓力來增加剪切速率，且可藉由使進料流再循環通過均質機來延長暴露時間。 高壓均質化製程尤其適用於減小經純化血清型22F多醣之大小，同時保持多醣之結構特徵，例如O-乙醯基之存在。 在一些實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型22F之經純化多醣在結合前之分子量介於10 kDa與2,000 kDa之間。在一個實施例中，莢膜多醣之分子量介於50 kDa與1,000 kDa之間。在另一實施例中，莢膜多醣之分子量介於70 kDa至900 kDa之間。在另一實施例中，莢膜多醣之分子量介於100 kDa至800 kDa之間。在另一實施例中，莢膜多醣之分子量介於200 kDa至600 kDa之間。. 在另一實施例中，莢膜多醣之分子量介於400 kDa至700 kDa之間。 在其他實施例中，莢膜多醣之分子量為100 kDa至1,000 kDa；100 kDa至900 kDa；100 kDa至800 kDa；100 kDa至700 kDa；100 kDa至600 kDa；100 kDa至500 kDa；100 kDa至400 kDa；100 kDa至300 kDa；150 kDa至1,000 kDa；150 kDa至900 kDa；150 kDa至800 kDa；150 kDa至700 kDa；150 kDa至600 kDa；150 kDa至500 kDa；150 kDa至400 kDa；150 kDa至300 kDa；200 kDa至1,000 kDa；200 kDa至900 kDa；200 kDa至800 kDa；200 kDa至700 kDa；200 kDa至600 kDa；200 kDa至500 kDa；200 kDa至400 kDa；200 kDa至300 kDa；250 kDa至1,000 kDa；250 kDa至900 kDa；250 kDa至800 kDa；250 kDa至700 kDa；250 kDa至600 kDa；250 kDa至500 kDa；250 kDa至400 kDa；250 kDa至350 kDa；300 kDa至1,000 kDa；300 kDa至900 kDa；300 kDa至800 kDa; 300 kDa至700 kDa；300 kDa至600 kDa；300 kDa至500 kDa；300 kDa至400 kDa；400 kDa至1,000 kDa；400 kDa至900 kDa；400 kDa至800 kDa; 400 kDa至700 kDa; 400 kDa至600 kDa；500 kDa至600 kDa；及類似期望分子量範圍。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。 多醣之大小在正常純化程序期間可稍微減小。另外，如上文所闡述，可使22F多醣在結合前經受分篩技術。上文所提及之分子量範圍係關於最終分篩步驟後結合前(例如，活化前)之經純化多醣。 可藉由業內已知之任一方法、例如藉由質子NMR來測定多醣之O-乙醯化程度(Lemercinier等人(1996) Carbohydrate Research 296:83-96；Jones等人(2002) J. Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30:1233-1247；WO 2005/033148及WO00/56357)。另一常用方法闡述於Hestrin, S. (1949) J. Biol. Chem. 180:249-261中。較佳地，藉由離子-HPLC分析測定O-乙醯基之存在。 經純化、分離或活化之血清型22F莢膜多醣或血清型22F多醣-載體蛋白質結合物中O-乙醯基之存在表示為乙酸鹽mM數/mM該多醣或O-乙醯基數/多醣重複單元。 在較佳實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型22F之經純化多醣具有至少0.2 µmol、0.4 µmol、0.6 µmol、0.8 µmol、1 µmol、1.2 µmol、1.4 µmol或1.6 µmol該血清型22F莢膜多醣。1.2.8 肺炎球菌多醣血清型 33F 如圖7所展示，血清型33F之多醣重複單元係由具支鏈五醣主鏈(兩個吡喃半乳糖(Gal p )、兩個呋喃半乳糖(Gal f )及一個吡喃葡萄糖(Glc p )組成，且末端αGal p 連接至主鏈內之αGal p 殘基之C2羥基(Lemercinier等人(2006) Carbohydrate Research 341(1):68-74。)。在文獻中已報導主鏈3-β-Gal f 殘基之C2羥基經O-乙醯化。 血清型33F多醣可使用熟習此項技術者已知之分離程序(例如，參見美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2006/0228381號、第2007/0184071號、第2007/0184072號、第2007/0231340號及第2008/0102498號以及第WO2008/118752號中所揭示之方法)自細菌直接獲得。另外，其可使用合成方案來產生。 血清型33F肺炎鏈球菌菌株可自已建立之培養物保藏中心(例如Streptococcal Reference Laboratory (疾病控制及預防中心，Atlanta, GA))或臨床樣本獲得。 來自血清型33F之經純化多醣可經活化(例如，經化學活化)以使其能夠反應，且然後引入本發明之糖結合物中，如本文進一步闡述。 藉由純化來自肺炎鏈球菌溶解物之血清型33F多醣並視情況分篩經純化多醣獲得之經分離血清型33F莢膜多醣可藉由不同參數來表徵，包括例如分子量及mM乙酸鹽/mM該血清型33F莢膜多醣。 在一些實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型33F之經純化多醣在結合前之分子量介於介於10 kDa與2,000 kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50 kDa與2,000 kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50 kDa與1,750 kDa之間；介於50 kDa與1,500 kDa之間；介於50 kDa與1,250 kDa之間；介於50 kDa與1,000 kDa之間；介於50 kDa與750 kDa之間；介於50 kDa與500 kDa之間；介於100 kDa與2,000 kDa之間；介於100 kDa與1,750 kDa之間；介於100 kDa與1,500 kDa之間；介於100 kDa與1,250 kDa之間；介於100 kDa與1,000 kDa之間；介於100 kDa與750 kDa之間；介於100 kDa與500 kDa之間；介於200 kDa與2,000 kDa之間；介於200 kDa與1,750 kDa之間；介於200 kDa與1,500 kDa之間；介於200 kDa與1,250 kDa之間；介於200 kDa與1,000 kDa之間；介於200 kDa與750 kDa之間；或介於200 kDa與500 kDa之間。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。 多醣之大小在正常純化程序期間可稍微減小。另外，如本文所闡述，可使多醣在結合前經受分篩技術。上文所提及之分子量範圍係關於最終分篩步驟後結合前(例如，活化前)之經純化多醣。 經純化、分離或活化之血清型33F莢膜多醣或血清型33F多醣-載體蛋白質結合物中O-乙醯基之存在表示為乙酸鹽mM數/mM該多醣或O-乙醯基數/多醣重複單元。 在較佳實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型33F之經純化多醣具有至少0.2 µmol、0.4 µmol、0.6 µmol、0.8 µmol、1.0 µmol、1.2 µmol、1.4 µmol或1.6 µmol乙酸鹽/µmol該血清型33F莢膜多醣。1.3 本發明之糖結合物 對經純化之醣實施化學活化以使該等醣(即經活化之醣)能夠與載體蛋白質反應。活化後，每一莢膜醣立即單獨結合至載體蛋白質以形成糖結合物。在一個實施例中，每一莢膜醣結合至相同載體蛋白質。醣之化學活化及與載體蛋白質之後續結合可藉由本文所揭示之活化及結合方法來達成。1.3.1 來自肺炎鏈球菌血清型 1 、 3 、 4 、 5 、 6A 、 6B 、 7F 、 9V 、 14 、 18C 、 19A 、 19F 及 23F 之糖結合物 藉由彼等熟習此項技術者已知之標準技術製備來自肺炎鏈球菌之血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F之莢膜多醣(例如，參見WO2006/110381、WO2008/118752、WO2006/110352以及美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2006/0228381號、第2008/0102498號及第2008/0286838號)。 在實施例中，用1-氰基-4-二甲基胺基吡啶鎓四氟磷酸鹽(CDAP)活化多醣以形成氰酸酯。然後可使經活化之多醣直接或經由間隔體(連接體)基團偶合至載體蛋白質(較佳CRM197 )上之胺基。舉例而言，間隔體可係胱胺或半胱胺以獲得硫醇化多醣，該硫醇化多醣可在與馬來醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用N-[γ-馬來醯亞胺基丁醯基氧基]琥珀醯亞胺酯(GMBS))或鹵乙醯化載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺、溴乙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SBA；SIB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺基酯(SIAB)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸磺基琥珀醯亞胺基酯(磺基-SIAB)、碘乙酸N-琥珀醯亞胺基酯(SIA)或3-[溴乙醯胺基]丙酸琥珀醯亞胺基酯(SBAP))反應後經由所獲得之硫醚鍵偶合至載體。較佳地，使氰酸酯(視情況藉由CDAP化學製得)與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且使用碳化二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上之羧基使胺基衍生之醣結合至載體蛋白質(例如CRM197 )。該等結合物闡述於例如WO93/15760、WO 95/08348及WO 96/129094中。 其他適宜結合技術使用碳化二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多技術闡述於國際專利申請公開案第WO 98/42721號中。結合可能涉及羰基連接體，其可藉由以下方式來形成：使醣之游離羥基與1,1’-羰基二咪唑(CDI)反應(參見Bethell等人(1979)J. Biol. Chern. 254:2572-2574；Hearn等人(1981) J. Chromatogr. 218:509-518)，然後與蛋白質反應以形成胺基甲酸酯鍵。此可涉及將變旋異構末端還原成一級羥基，對一級羥基實施可選保護/去保護，使一級羥基與CDI反應以形成CDI胺基甲酸酯中間體及使CDI胺基甲酸酯中間體與蛋白質上之胺基偶合。 在較佳實施例中，來自肺炎鏈球菌之血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F之至少一種莢膜多醣藉由還原性胺化結合至載體蛋白質(例如美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2007/0231340號、第2007/0184071及第2007/0184072號、第WO2006/110381號、第WO2008/079653號及第WO2008/143709號中所闡述)。在較佳實施例中，來自肺炎鏈球菌之血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F之莢膜多醣藉由還原性胺化皆結合至載體蛋白質。 還原性胺化涉及兩個步驟，(1) 多醣之氧化，(2) 經活化多醣及載體蛋白質之還原以形成結合物。在氧化之前，視情況使多醣水解。可採用機械或化學水解。化學水解可使用乙酸來實施。氧化步驟可涉及與過碘酸鹽之反應。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸二者；該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO4 - )及原過碘酸鹽(IO6 5- )二者以及過碘酸鹽之多種鹽(例如，過碘酸鈉及過碘酸鉀)。 在實施例中，在偏過碘酸鹽存在下、較佳在過碘酸鈉(NaIO4 )存在下氧化來自肺炎鏈球菌之血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F或23F之莢膜多醣。在另一實施例中，在原過碘酸鹽存在下、較佳在過碘酸存在下氧化來自肺炎鏈球菌之血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F之莢膜多醣。 在多醣之氧化步驟後，認為該多醣被活化且在下文中稱為「經活化多醣」。經活化多醣與載體蛋白質可獨立地(分開凍乾)或一起(共凍乾)凍乾(冷凍-乾燥)。在一個實施例中，將經活化多醣與載體蛋白質共凍乾。在另一實施例中，將經活化多醣與載體蛋白質獨立地凍乾。 在一個實施例中，凍乾係在非還原糖存在下進行，可能的非還原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇及益壽糖。 結合方法之第二步驟係使用還原劑還原經活化之多醣及載體蛋白質以形成結合物(所謂的還原性胺化)。適宜還原劑包括氰基硼氫化物(例如氰基硼氫化鈉)、硼烷-吡啶或硼氫化物交換樹脂。在一個實施例中，還原劑係氰基硼氫化鈉。 在實施例中還原反應係在水性溶劑中實施，在另一實施例中該反應係在非質子溶劑中實施。在實施例中，還原反應係在DMSO (二甲基亞碸)或DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中實施。DMSO或DMF溶劑可用於再組成已經凍乾之經活化多醣及載體蛋白質。 在還原反應結束時，在結合物中可存在未反應之剩餘醛基團，可使用適宜封端劑對該等基團進行封端。在一個實施例中，此封端劑係硼氫化鈉(NaBH4 )。在結合(還原反應並視情況封端)後，可將糖結合物純化。可藉由滲濾及/或離子交換層析及/或粒徑排阻層析來純化糖結合物。在實施例中，糖結合物係藉由滲濾或離子交換層析或粒徑排阻層析來純化。在一個實施例中，糖結合物經無菌過濾。 在一些實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型9V及/或18C之糖結合物包含具有以下O-乙醯化程度之醣：介於10%與100%之間、介於20%與100%之間、介於30%與100%之間、介於40%與100%之間、介於50%與100%之間、介於60%與100%之間、介於70%與100%之間、介於75%與100%之間、介於80%與100%之間、介於90%與100%之間、介於50%與90%之間、介於60%與90%之間、介於70%與90%之間或介於80%與90%之間。在其他實施例中，O-乙醯化程度為≥ 10%、≥ 20%、≥ 30%、≥ 40%、≥ 50%、≥ 60%、≥ 70%、≥ 80%或≥ 90%或約100%。 在一些實施例中，將本發明之來自肺炎鏈球菌血清型9V及/或18C之糖結合物O-乙醯化。在一些實施例中，將來自肺炎鏈球菌血清型9V之糖結合物O-乙醯化，且將來自肺炎鏈球菌血清型18C之糖結合物去-O-乙醯化。1.3.2 來自肺炎鏈球菌血清型 22F 之糖結合物 在實施例中，血清型22F糖結合物係藉由以下方式獲得：使用1-氰基-4-二甲基胺基吡啶鎓四氟磷酸鹽(CDAP)活化多醣以形成氰酸酯。可使經活化之多醣直接或經由間隔體(連接體)基團偶合至載體蛋白質上之胺基。舉例而言，間隔體可為胱胺或半胱胺以獲得硫醇化多醣，該硫醇化多醣可在與馬來醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用GMBS)或鹵乙醯化載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺SIB、SIAB、磺基-SIAB、SIA或SBAP)反應後經由所獲得之硫醚鍵偶合至載體。較佳地，使氰酸酯(視情況藉由CDAP化學製得)與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且使用碳化二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上之羧基使胺基衍生之醣結合至載體蛋白質。該等結合物闡述於例如WO93/15760、WO 95/08348及WO 96/129094中。 其他適宜技術使用碳化二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多技術闡述於國際專利申請公開案第WO 98/42721號中。結合可涉及可藉由以下方式形成之羰基連接體：使醣之游離羥基與CDI反應(參見Bethell等人(1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574；Hearn等人(1981) J. Chromatogr. 218:509-518)，然後與蛋白質反應以形成胺基甲酸酯鍵。此可涉及將變旋異構末端還原成一級羥基，對一級羥基實施可選保護/去保護，使一級羥基與CDI反應以形成CDI胺基甲酸酯中間體及使CDI胺基甲酸酯中間體與蛋白質上之胺基偶合。 在較佳實施例中，本發明之血清型22F糖結合物係使用還原性胺化法製備。還原性胺化涉及兩個步驟，(1) 氧化多醣以自個別六醣單元中之鄰二醇產生醛官能基，(2) 還原經活化之多醣及載體蛋白質(例如，CRM197 )以形成結合物。 較佳地，在氧化之前，將血清型22F多醣分篩至目標分子量(MW)範圍。有利地，減小經純化血清型22F多醣之大小，同時保持多醣結構之關鍵特徵，例如O-乙醯基之存在。較佳地，藉由機械均質化來減小經純化血清型22F多醣之大小(參見上文部分1.2.7)。 在實施例中，藉由包含以下步驟之製程來活化(氧化)血清型多醣： (a) 使經分離之血清型22F多醣與氧化劑反應； (b) 藉由添加淬滅劑淬滅氧化反應，以產生經活化之血清型22F多醣。 在較佳實施例中，氧化劑係過碘酸鹽。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸二者；該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO4 - )及原過碘酸鹽(IO6 5- )二者以及過碘酸鹽之多種鹽(例如，過碘酸鈉及過碘酸鉀)。在較佳實施例中，氧化劑係過碘酸鈉。在較佳實施例中，用於氧化血清型22F多醣之過碘酸鹽係偏過碘酸鹽。在較佳實施例中，用於氧化血清型22F多醣之過碘酸鹽係偏過碘酸鈉。 在一個實施例中，淬滅劑係選自鄰二醇、1,2-胺基醇、胺基酸、麩胱甘肽、亞硫酸鹽、硫酸氫鹽、二硫亞磺酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽、亞磷酸鹽、次磷酸鹽或亞磷酸。 在一個實施例中，淬滅劑係式(I)之1,2-胺基醇：
Figure 02_image001
(I) 其中R1 係選自H、甲基、乙基、丙基或異丙基。 在一個實施例中，淬滅劑係選自亞硫酸鹽、硫酸氫鹽、二硫亞磺酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽、亞磷酸鹽、次磷酸鹽或亞磷酸之鈉鹽及鉀鹽。 在一個實施例中，淬滅劑係胺基酸。在該等實施例中，該胺基酸可選自絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、胱胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、羥基脯胺酸、色胺酸、酪胺酸及組胺酸。 在一個實施例中，淬滅劑係亞硫酸鹽，例如硫酸氫鹽、二硫亞磺酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽。 在一個實施例中，淬滅劑係包含兩個鄰羥基、即兩個羥基共價連接至兩個毗鄰碳原子之化合物(鄰二醇)。 較佳地，淬滅劑係式(II)化合物：
Figure 02_image003
(II) 其中R1 及R2 係各自獨立地選自H、甲基、乙基、丙基或異丙基。 在較佳實施例中，淬滅劑係甘油、乙二醇、丙-1,2-二醇、丁-1,2-二醇或丁-2,3-二醇或抗壞血酸。在較佳實施例中，淬滅劑係丁-2,3-二醇。 在較佳實施例中，經分離之血清型22F多醣係藉由包含以下步驟之製程來活化： (a) 使經分離之血清型22F多醣與過碘酸鹽反應； (b) 藉由添加丁-2,3-二醇淬滅氧化反應，以產生經活化之血清型22F多醣。 在多醣之氧化步驟後，認為該多醣被活化且在下文中稱為「經活化多醣」。 在較佳實施例中，將經活化之血清型22F多醣純化。經活化之血清型22F多醣係根據熟習此項技術者已知之方法純化，例如凝膠滲透層析(GPC)、透析或超濾/滲濾。舉例而言，使用超濾裝置藉由濃縮及滲濾純化經活化之22F多醣。 在較佳實施例中，經活化血清型22F多醣之氧化程度介於2與30之間、介於2與25之間、介於2與20之間、介於2與15之間、介於2與10之間、介於2與5之間、介於5與30之間、介於5與25之間、介於5與20之間、介於5與15之間、介於5與10之間、介於10與30之間、介於10與25之間、介於10與20之間、介於10與15之間、介於15與30之間、介於15與25之間、介於15與20之間、介於20至30之間或介於20至25之間。在較佳實施例中，經活化血清型22F多醣之氧化程度介於2與10之間、介於4與8之間、介於4與6之間、介於6與8之間、介於6與12之間、介於8與14之間、介於9與11之間、介於10與16之間、介於12與16之間、介於14與18之間、介於16與20之間、介於16與18之間、介於18與22之間或介於18與20之間。 在較佳實施例中，經活化血清型22F多醣之分子量介於25 kDa與1,000 kDa之間、介於100 kDa與1,000 kDa之間、介於300 kDa與800 kDa之間、介於300 kDa與700 kDa之間、介於300 kDa與600 kDa之間、介於400 kDa與1,000 kDa之間、介於400 kDa與800 kDa之間、介於400 kDa與700 kDa之間或介於400 kDa與600 kDa之間。在實施例中，經活化血清型22F多醣之分子量介於300 kDa與800 kDa之間。在實施例中，經活化血清型22F多醣之分子量介於400 kDa與600 kDa之間。在較佳實施例中，經活化血清型22F多醣之分子量介於400 kDa與600 kDa之間，且氧化程度介於10與25之間、介於10與20之間、介於12與20之間或介於14與18之間。在較佳實施例中，經活化血清型22F多醣之分子量介於400 kDa與600 kDa之間，且氧化程度介於10與20之間。 在較佳實施例中，經活化之血清型22F多醣包含至少0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM或0.7 mM或約0.8 mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣。在較佳實施例中，經活化之血清型22F多醣包含至少0.5 mM、0.6 mM或0.7 mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣。在較佳實施例中，經活化之血清型22F多醣包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣。在較佳實施例中，經活化之血清型22F多醣包含至少0.7 mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣。 在較佳實施例中，經活化血清型22F多醣之分子量介於400 kDa與800 kDa之間，且包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣。 在較佳實施例中，經活化血清型22F多醣之分子量介於400 kDa與800 kDa之間，氧化程度介於12與20之間且包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣。 經活化多醣及/或載體蛋白質可獨立地(分開凍乾)或一起(共凍乾)凍乾(冷凍-乾燥)。 在實施例中，視情況在醣存在下凍乾經活化之血清型22F多醣。在較佳實施例中，醣係選自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇及益壽糖。在較佳實施例中，醣係蔗糖。在一個實施例中，然後將凍乾之經活化多醣與包含載體蛋白質之溶液複合。 在另一實施例中，將經活化多醣與載體蛋白質共凍乾。在該等實施例中，將經活化之血清型22F多醣與載體蛋白質複合且視情況在醣存在下凍乾。在較佳實施例中，醣係選自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇及益壽糖。在較佳實施例中，醣係蔗糖。然後可將共凍乾之多醣及載體蛋白質重懸浮於溶液中且與還原劑反應。 結合方法之第二步驟係使用還原劑還原經活化之多醣及載體蛋白質以形成結合物(還原性胺化)。 經活化之血清型22F多醣可藉由包含以下步驟之製程結合至載體蛋白質： (c) 複合經活化之血清型22F多醣與載體蛋白質；及 (d) 使複合的經活化血清型22F多醣及載體蛋白質與還原劑反應，以形成血清型22F多醣-載體蛋白質結合物。 在實施例中還原反應係在水性溶劑中實施，在另一實施例中該反應係在非質子溶劑中實施。在實施例中，還原反應係在DMSO (二甲基亞碸)或DMF (二甲基甲醯胺))溶劑中實施。DMSO或DMF溶劑可用於再組成已經凍乾之經活化多醣及載體蛋白質。 與例如其中可顯著降低多醣之O-乙醯化程度的水相中之還原性胺化相比，藉由二甲基亞碸(DMSO)中之還原性胺化使經活化之血清型22F多醣與蛋白質載體結合適於保持多醣之O-乙醯基含量。因此在較佳實施例中，步驟(c)及步驟(d)係在DMSO中實施。 在實施例中，還原劑係氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉、在布氏酸(Bronsted acid)或路易斯酸(Lewis acid)存在下之硼氫化鈉或硼氫化鉀、胺硼烷(例如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲基胺-硼烷、t-BuMei PrN-BH3 、苄基胺-BH3 或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB))。在較佳實施例中，還原劑係氰基硼氫化鈉。 在還原反應結束時，在結合物中可存在未反應之剩餘醛基團，可使用適宜封端劑對該等基團進行封端。在一個實施例中，此封端劑係硼氫化鈉(NaBH4 )。 在血清型22F多醣結合至載體蛋白質後，可藉由熟習此項技術者已知之多種技術來純化糖結合物(相對於多醣-蛋白質結合物之量進行富集)。該等技術包括透析、濃縮/滲濾操作、切向流過濾沈澱/溶析、管柱層析(DEAE或疏水相互作用層析)及深度過濾。 在一些實施例中，本發明之血清型22F糖結合物包含分子量介於10 kDa與2,000 kDa之間之醣。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50 kDa與1,000 kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量介於70 kDa與900 kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量介於100 kDa與800 kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量介於200 kDa與600 kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量為100 kDa至1,000 kDa；100 kDa至900 kDa；100 kDa至800 kDa；100 kDa至700 kDa；100 kDa至600 kDa；100 kDa至500 kDa；100 kDa至400 kDa；100 kDa至300 kDa；150 kDa至1,000 kDa；150 kDa至900 kDa；150 kDa至800 kDa；150 kDa至700 kDa；150 kDa至600 kDa；150 kDa至500 kDa；150 kDa至400 kDa；150 kDa至300 kDa；200 kDa至1,000 kDa；200 kDa至900 kDa；200 kDa至800 kDa；200 kDa至700 kDa；200 kDa至600 kDa；200 kDa至500 kDa；200 kDa至400 kDa；200 kDa至300 kDa；250 kDa至1,000 kDa；250 kDa至900 kDa；250 kDa至800 kDa；250 kDa至700 kDa；250 kDa至600 kDa；250 kDa至500 kDa；250 kDa至400 kDa；250 kDa至350 kDa；300 kDa至1000 kDa；300 kDa至900 kDa；300 kDa至800 kDa；300 kDa至700 kDa；300 kDa至600 kDa；300 kDa至500 kDa；300 kDa至400 kDa；400 kDa至1,000 kDa；400 kDa至900 kDa；400 kDa至800 kDa；400 kDa至700 kDa；400 kDa至600 kDa；500 kDa至600 kDa。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。在一些該等實施例中，血清型22F糖結合物係使用還原性胺化法製備。 在一些實施例中，本發明血清型22F糖結合物之分子量介於400 kDa與15,000 kDa之間；介於500 kDa與10,000 kDa之間；介於2,000 kDa與10,000 kDa之間；介於3,000 kDa與8,000 kDa之間；或介於3,000 kDa與5,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型22F糖結合物之分子量介於500 kDa與10,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型22F糖結合物之分子量介於1,000 kDa與8,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型22F糖結合物之分子量介於2,000 kDa與8,000 kDa之間或介於3,000 kDa與7,000 kDa之間。在其他實施例中，本發明血清型22F糖結合物之分子量介於200 kDa與20,000 kDa之間；介於200 kDa與15,000 kDa之間；介於200 kDa與10,000 kDa之間；介於200 kDa與7,500 kDa之間；介於200 kDa與5,000 kDa之間；介於200 kDa與3,000 kDa之間；介於200 kDa與1,000 kDa之間；介於500 kDa與20,000 kDa之間；介於500 kDa與15,000 kDa之間；介於500 kDa與12,500 kDa之間；介於500 kDa與10,000 kDa之間；介於500 kDa與7,500 kDa之間；介於500 kDa與6,000 kDa之間；介於500 kDa與5,000 kDa之間；介於500 kDa與4,000 kDa之間；介於500 kDa與3,000 kDa之間；介於500 kDa與2,000 kDa之間；介於500 kDa與1,500 kDa之間；介於500 kDa與1,000 kDa之間；介於750 kDa與20,000 kDa之間；介於750 kDa與15,000 kDa之間；介於750 kDa與12,500 kDa之間；介於750 kDa與10,000 kDa之間；介於750 kDa與7,500 kDa之間；介於750 kDa與6,000 kDa之間；介於750 kDa與5,000 kDa之間；介於750 kDa與4,000 kDa之間；介於750 kDa與3,000 kDa之間；介於750 kDa與2,000 kDa之間；介於750 kDa與1,500 kDa之間；介於1,000 kDa與15,000 kDa之間；介於1,000 kDa與12,500 kDa之間；介於1,000 kDa與10,000 kDa之間；介於1,000 kDa與7,500 kDa之間；介於1,000 kDa與6,000 kDa之間；介於1,000 kDa與5,000 kDa之間；介於1,000 kDa與4,000 kDa之間；介於1,000 kDa與2,500 kDa之間；介於2,000 kDa與15,000 kDa之間；介於2,000 kDa與12,500 kDa之間；介於2,000 kDa與10,000 kDa之間；介於2,000 kDa與7,500 kDa之間；介於2,000 kDa與6,000 kDa之間；介於2,000 kDa與5,000 kDa之間；介於2,000 kDa與4,000 kDa之間；或介於2,000 kDa與3,000 kDa之間。 在其他實施例中，本發明血清型22F糖結合物之分子量介於3,000 kDa與20,000 kDa之間；介於3,000 kDa與15,000 kDa之間；介於3,000 kDa與10,000 kDa之間；介於3,000 kDa與7,500 kDa之間；介於3,000 kDa與5,000 kDa之間；介於4,000 kDa與20,000 kDa之間；介於4,000 kDa與15,000 kDa之間；介於4,000 kDa與12,500 kDa之間；介於4,000 kDa與10,000 kDa之間；介於4,000 kDa與7,500 kDa之間；介於4,000 kDa與6,000 kDa之間；或介於4,000 kDa與5,000 kDa之間。 在其他實施例中，本發明血清型22F糖結合物之分子量介於5,000 kDa與20,000 kDa之間；介於5,000 kDa與15,000 kDa之間；介於5,000 kDa與10,000 kDa之間；介於5,000 kDa與7,500 kDa之間；介於6,000 kDa與20,000 kDa之間；介於6,000 kDa與15,000 kDa之間；介於6,000 kDa與12,500 kDa之間；介於6,000 kDa與10,000 kDa之間或介於6,000 kDa與7,500 kDa之間。 糖結合物之分子量係藉由SEC-MALLS來量測。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。 在較佳實施例中，本發明之血清型22F糖結合物包含至少0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM或0.7 mM或約0.8 mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣。在較佳實施例中，糖結合物包含至少0.5 mM、0.6 mM或0.7 mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣。在較佳實施例中，糖結合物包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣。在較佳實施例中，糖結合物包含至少0.7 mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣。 在較佳實施例中，糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣對經分離多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣的比率係至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。在較佳實施例中，糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣對經分離多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣的比率係至少0.7。在較佳實施例中，糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣對經分離多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣的比率係至少0.9。 在較佳實施例中，糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣對經活化多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣的比率係至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。在較佳實施例中，糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣對經活化多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣的比率係至少0.7。在較佳實施例中，糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣對經活化多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型22F多醣的比率係至少0.9。 表徵本發明之血清型22F糖結合物之另一方式係藉助載體蛋白質(例如，CRM197 )中結合至醣之離胺酸殘基數，此可表徵為所結合離胺酸之範圍(結合度)。可使用彼等熟習此項技術者已知之常規方法藉由胺基酸分析獲得因共價連接至多醣所致之載體蛋白質之離胺酸修飾之證據。結合使得與用於產生結合材料之CRM197 蛋白起始材料相比，所回收之離胺酸殘基數減少。在較佳實施例中，本發明血清型22F糖結合物之結合度介於2與15之間、介於2與13之間、介於2與10之間、介於2與8之間、介於2與6之間、介於2與5之間、介於2與4之間、介於3與15之間、介於3與13之間、介於3與10之間、介於3與8之間、介於3與6之間、介於3與5之間、介於3與4之間、介於5與15之間、介於5與10之間、介於8與15之間、介於8與12之間、介於10與15之間或介於10與12之間。在實施例中，本發明血清型22F糖結合物之結合度為約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14或約15。在較佳實施例中，本發明血清型22F糖結合物之結合度介於4與7之間。在一些該等實施例中，載體蛋白質係CRM197 。 本發明之血清型22F糖結合物亦可藉由醣對載體載體蛋白質之比率(重量/重量)來表徵。在一些實施例中，糖結合物中血清型22F多醣對載體蛋白質之比率(w/w)介於0.5與3.0之間(例如，約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9或約3.0)。在其他實施例中，醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於0.5與2.0之間、介於0.5與1.5之間、介於0.8與1.2之間、介於0.5與1.0之間、介於1.0與1.5之間或介於1.0與2.0之間。在其他實施例中，醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於0.8與1.2之間。在較佳實施例中，結合物中血清型22F莢膜多醣對載體蛋白質之比率介於0.9與1.1之間。在一些該等實施例中，載體蛋白質係CRM197 。 本發明之血清型22F糖結合物及免疫原組合物可含有不與載體蛋白質共價結合，但仍存在於糖結合物組合物中之游離醣。游離醣可與糖結合物非共價締合(即，非共價連結至該糖結合物中、吸附至該糖結合物或包埋於該糖結合物中或與其一起包埋)。 在較佳實施例中，相對於血清型22F多醣之總量計，血清型22F糖結合物包含小於約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%或15%之游離血清型22F多醣。在較佳實施例中，相對於血清型22F多醣之總量計，血清型22F糖結合物包含小於約40%之游離血清型22F多醣。在較佳實施例中，相對於血清型22F多醣之總量計，血清型22F糖結合物包含小於約25%之游離血清型22F多醣。在較佳實施例中，相對於血清型22F多醣之總量計，血清型22F糖結合物包含小於約20%之游離血清型22F多醣。在較佳實施例中，相對於血清型22F多醣之總量計，血清型22F糖結合物包含小於約15%之游離血清型22F多醣。 血清型22F糖結合物亦可藉由其分子大小分佈(Kd )來表徵。結合物之相對分子大小分佈可使用粒徑排阻層析介質(CL-4B)來測定。將粒徑排阻層析(SEC)用於重力進料管柱中以剖析結合物之分子大小分佈。自介質中之孔排阻之大分子比小分子溶析更快速。使用部分收集器來收集管柱溶析物。藉由醣分析以比色方式測試該等部分。為測定Kd ，對管柱進行校準以確立分子被完全排阻時之部分(V0 ) (Kd =0)及代表最大滯留之部分(Vi ) (Kd =1)。達到指定樣品屬性時之部分(Ve )與Kd 相關，表示為Kd = (Ve - V0 )/ (Vi - V0 )。 在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少30%之血清型22F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少40%之糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%之血清型22F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少60%之血清型22F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於50%與80%之間之血清型22F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於65%與80%之間之血清型22F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。1.3.3 來自肺炎鏈球菌血清型 33F 之糖結合物 在實施例中，血清型33F糖結合物係藉由以下方式來獲得：使用1-氰基-4-二甲基胺基吡啶鎓四氟磷酸鹽(CDAP)活化多醣以形成氰酸酯。可使經活化之多醣直接或經由間隔體(連接體)基團偶合至載體蛋白質上之胺基。舉例而言，間隔體可為胱胺或半胱胺以獲得硫醇化多醣，該硫醇化多醣可在與馬來醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用GMBS)或鹵乙醯化載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺、SIB、SIAB、磺基-SIAB、SIA或SBAP)反應後經由所獲得之硫醚鍵偶合至載體。較佳地，使氰酸酯(視情況藉由CDAP化學製得)與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且使用碳化二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上之羧基使胺基衍生之醣結合至載體蛋白質。該等結合物闡述於例如WO93/15760、WO 95/08348及WO 96/129094中。 其他適宜技術使用碳化二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多技術闡述於國際專利申請公開案第WO 98/42721號中。結合可涉及可藉由以下方式形成之羰基連接體：使醣之游離羥基與CDI反應(參見Bethell等人(1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574；Hearn等人(1981) J. Chromatogr. 218:509-518)，然後與蛋白質反應以形成胺基甲酸酯鍵。此可涉及將變旋異構末端還原成一級羥基，對一級羥基實施可選保護/去保護，使一級羥基與CDI反應以形成CDI胺基甲酸酯中間體及使CDI胺基甲酸酯中間體與蛋白質上之胺基偶合。 在某些實施例中，本發明之血清型33F糖結合物係使用還原性胺化法製備。在該實施例中，本發明之血清型33F糖結合物可使用水相(RAC/水溶液)中之還原性胺化法製備。水相中之還原性胺化已成功地適用於產生肺炎球菌結合物疫苗(例如，參見WO 2006/110381)。但較佳地，在使用還原性胺化時，血清型33F糖結合物係經由DMSO (RAC/DMSO)中之還原性胺化法製備。鑒於與使用RAC/水溶液製程保持O-乙醯基官能基相關之挑戰，DMSO中之還原性胺化較佳。RAC/DMSO已成功地適用於產生肺炎球菌結合物疫苗(例如，參見WO 2006/110381)。 在較佳實施例中，本發明之血清型33F糖結合物係使用例如闡述於實例1、2及3以及WO 2014/027302中之eTEC結合物(在下文中為「血清型33F eTEC連接之糖結合物」)來製備。該等33F糖結合物包含經由一或多個eTEC間隔體共價結合至載體蛋白質之醣，其中該醣經由胺基甲酸酯鍵共價結合至eTEC間隔體，且其中該載體蛋白質經由醯胺鍵共價結合至eTEC間隔體。本發明之eTEC連接之糖結合物可由通式(III)來表示：
Figure 02_image005
其中中心框線中含有構成eTEC間隔體之原子。 eTEC間隔體包括七個直鏈原子(即，-C(O)NH(CH2 )2 SCH2 C(O)-)且在醣與載體蛋白質之間提供穩定的硫醚及醯胺鍵。eTEC連接之糖結合物之合成涉及使醣之經活化羥基與硫烷基胺試劑(例如胱胺或半胱胺酸胺或其鹽)之胺基反應，與醣形成胺基甲酸酯鍵以提供硫醇化醣。藉由與還原劑反應產生一或多個游離硫氫基以提供經活化之硫醇化醣。使經活化硫醇化醣之游離硫氫基與在含胺殘基上具有一或多個α-鹵乙醯胺基團之經活化載體蛋白質反應，產生硫醚鍵以形成結合物，其中載體蛋白質經由醯胺鍵附接至eTEC間隔體。 在本發明之血清型33F糖結合物中，醣可係多醣或寡醣。載體蛋白質可選自如本文所闡述或彼等熟習此項技術者已知之任何適宜載體。在常見實施例中，醣係多醣。在一些該等實施例中，載體蛋白質係CRM197 。在一些該等實施例中，eTEC連接之糖結合物包含肺炎鏈球菌血清型33F莢膜多醣。 在尤佳實施例中，eTEC連接之糖結合物包含經由eTEC間隔體共價結合至CRM197 之Pn-33F莢膜多醣(血清型33F eTEC連接之糖結合物)。 在一些實施例中，本發明之血清型33F糖結合物包含分子量介於10 kDa與2,000 kDa之間之醣。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50 kDa與2,000 kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50 kDa與1,750 kDa之間；介於50 kDa與1,500 kDa之間；介於50 kDa與1,250 kDa之間；介於50 kDa與1,000 kDa之間；介於50 kDa與750 kDa之間；介於50 kDa與500 kDa之間；介於100 kDa與2,000 kDa之間；介於100 kDa與1,750 kDa之間；介於100 kDa與1,500 kDa之間；介於100 kDa與1,250 kDa之間；介於100 kDa與1,000 kDa之間；介於100 kDa與750 kDa之間；介於100 kDa與500 kDa之間；介於200 kDa與2,000 kDa之間；介於200 kDa與1,750 kDa之間；介於200 kDa與1,500 kDa之間；介於200 kDa與1,250 kDa之間；介於200 kDa與1,000 kDa之間；介於200 kDa與750 kDa之間；或介於200 kDa與500 kDa之間。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。 在一些實施例中，本發明之血清型33F糖結合物之分子量介於50 kDa與20,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型33F糖結合物之分子量介於500 kDa與10,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型33F糖結合物之分子量介於200 kDa與10,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型33F糖結合物之分子量介於1,000 kDa與3,000 kDa之間。 在其他實施例中，本發明之血清型33F糖結合物之分子量介於200 kDa與20,000 kDa之間；介於200 kDa與15,000 kDa之間；介於200 kDa與10,000 kDa之間；介於200 kDa與7,500 kDa之間；介於200 kDa與5,000 kDa之間；介於200 kDa與3,000 kDa之間；介於200 kDa與1,000 kDa之間；介於500 kDa與20,000 kDa之間；介於500 kDa與15,000 kDa之間；介於500 kDa與12,500 kDa之間；介於500 kDa與10,000 kDa之間；介於500 kDa與7,500 kDa之間；介於500 kDa與6,000 kDa之間；介於500 kDa與5,000 kDa之間；介於500 kDa與4,000 kDa之間；介於500 kDa與3,000 kDa之間；介於500 kDa與2,000 kDa之間；介於500 kDa與1,500 kDa之間；介於500 kDa與1,000 kDa之間；介於750 kDa與20,000 kDa之間；介於750 kDa與15,000 kDa之間；介於750 kDa與12,500 kDa之間；介於750 kDa與10,000 kDa之間；介於750 kDa與7,500 kDa之間；介於750 kDa與6,000 kDa之間；介於750 kDa與5,000 kDa之間；介於750 kDa與4,000 kDa之間；介於750 kDa與3,000 kDa之間；介於750 kDa與2,000 kDa之間；介於750 kDa與1,500 kDa之間；介於1,000 kDa與15,000 kDa之間；介於1,000 kDa與12,500 kDa之間；介於1,000 kDa與10,000 kDa之間；介於1,000 kDa與7,500 kDa之間；介於1,000 kDa與6,000 kDa之間；介於1,000 kDa與5,000 kDa之間；介於1,000 kDa與4,000 kDa之間；介於1,000 kDa與2,500 kDa之間；介於2,000 kDa與15,000 kDa之間；介於2,000 kDa與12,500 kDa之間；介於2,000 kDa與10,000 kDa之間；介於2,000 kDa與7,500 kDa之間；介於2,000 kDa與6,000 kDa之間；介於2,000 kDa與5,000 kDa之間；介於2,000 kDa與4,000 kDa之間；介於2,000 kDa與3,000 kDa之間；介於3,000 kDa與20,000 kDa之間；介於3,000 kDa與15,000 kDa之間；介於3,000 kDa與12,500 kDa之間；介於3,000 kDa與10,000 kDa之間；介於3,000 kDa與9,000 kDa之間；介於3,000 kDa與8,000 kDa之間；介於3,000 kDa與7,000 kDa之間；介於3,000 kDa與6,000 kDa之間；介於3,000 kDa與5,000 kDa之間或介於3,000 kDa與4,000 kDa之間。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。 表徵本發明血清型33F糖結合物之另一方式係藉助載體蛋白質(例如，CRM197 )中結合至醣之離胺酸殘基數，此可表徵為所結合離胺酸之範圍(結合度)。 在較佳實施例中，本發明血清型33F糖結合物之結合度介於2與20之間、介於4與16之間、介於2與15之間、介於2與13之間、介於2與10之間、介於2與8之間、介於2與6之間、介於2與5之間、介於2與4之間、介於3與15之間、介於3與13之間、介於3與10之間、介於3與8之間、介於3與6之間、介於3與5之間、介於3與4之間、介於5與15之間、介於5與10之間、介於8與15之間、介於8與12之間、介於10與15之間或介於10與12之間。在實施例中，本發明血清型33F糖結合物之結合度為約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19或約20。在較佳實施例中，本發明血清型33F糖結合物之結合度介於4與16之間。在一些該等實施例中，載體蛋白質係CRM197 。 在較佳實施例中，載體蛋白質包含含有39個離胺酸殘基之CRM197 。在一些該等實施例中，在CRM197 所包含之39個離胺酸殘基中可有4至16個共價連接至醣。表示此參數之另一方式係約10%至約41%之CRM197 離胺酸共價連接至醣。在另一該實施例中，在CRM197 所包含之39個離胺酸殘基中可有2至20個共價連接至醣。表示此參數之另一方式係約5%至約50%之CRM197 離胺酸共價連接至醣。在一些實施例中，在CRM197 所包含之39個離胺酸殘基中可有約4個、約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個或約16個共價連接至醣。 在常見實施例中，載體蛋白質經由與載體蛋白質上之離胺酸殘基之一或多個ε-胺基的醯胺鍵共價結合至eTEC間隔體。在一些該等實施例中，載體蛋白質包含2至20個共價結合至醣之離胺酸殘基。在其他該等實施例中，載體蛋白質包含4至16個共價結合至醣之離胺酸殘基。 本發明之血清型33F糖結合物亦可藉由醣對載體載體蛋白質之比率(重量/重量)來表徵。在一些實施例中，醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於0.2與4.0之間(例如，約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9或約4.0)。在其他實施例中，醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於1.0與2.5之間。在其他實施例中，醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於0.4與1.7之間。在一些該等實施例中，載體蛋白質係CRM197 。 醣鏈至載體蛋白質上之離胺酸之附接頻率係用於表徵本發明之血清型33F糖結合物之另一參數。舉例而言，在一些實施例中，多醣之每4個醣重複單元出現至少一個載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結。在另一實施例中，在多醣之每10個醣重複單元中，載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結出現至少一次。在另一實施例中，在多醣之每15個醣重複單元中，載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結出現至少一次。在另一實施例中，在多醣之每25個醣重複單元中，載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結出現至少一次。 在常見實施例中，載體蛋白質係CRM197 ，且在多醣之每4個、10個、15個或25個醣重複單元中CRM197 與多醣之間之經由eTEC間隔體的共價鏈結出現至少一次。 在其他實施例中，結合物之每5至10個醣重複單元；每2至7個醣重複單元；每3至8個醣重複單元；每4至9個醣重複單元；每6至11個醣重複單元；每7至12個醣重複單元；每8至13個醣重複單元；每9至14個醣重複單元；每10至15個醣重複單元；每2至6個醣重複單元；每3至7個醣重複單元；每4至8個醣重複單元；每6至10個醣重複單元；每7至11個醣重複單元；每8至12個醣重複單元；每9至13個醣重複單元；每10至14個醣重複單元；每10至20個醣重複單元；每4至25個醣重複單元或每2至25個醣重複單元包含至少一個載體蛋白質與醣之間之共價鏈結。在常見實施例中，載體蛋白質係CRM197 。 在另一實施例中，多醣之每2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24或25個醣重複單元出現至少一個載體蛋白質與醣之間之鍵。在實施例中，載體蛋白質係CRM197 。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。 結合期間之重要考慮係出現以下情況：容許保留個別組份之可形成醣表位之一部分之可能敏感的非醣取代基官能基，例如O-醯基、磷酸酯或甘油磷酸酯側鏈。 在一個實施例中，本發明之血清型33F糖結合物包含O-乙醯化程度介於10%與100%之間之醣。在一些該等實施例中，醣之O-乙醯化程度介於50%與100%之間。在其他該等實施例中，醣之O-乙醯化程度介於75%與100%之間。在其他實施例中，醣之O-乙醯化程度大於或等於70% (≥70%)。 在較佳實施例中，本發明之血清型33F糖結合物包含至少0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM或0.8 mM乙酸鹽/mM血清型33F莢膜多醣。在較佳實施例中，糖結合物包含至少0.5 mM、0.6 mM或0.7 mM乙酸鹽/mM血清型33F莢膜多醣。在較佳實施例中，糖結合物包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM血清型33F莢膜多醣。在較佳實施例中，糖結合物包含至少0.7 mM乙酸鹽/mM血清型33F莢膜多醣。在較佳實施例中，藉由離子-HPLC分析測定O-乙醯基之存在。 在較佳實施例中，糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型33F多醣對經分離多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型33F多醣的比率係至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。在較佳實施例中，糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型33F多醣對經分離多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型33F多醣的比率係至少0.7。在較佳實施例中，糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型33F多醣對經分離多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型33F多醣的比率係至少0.9。 在較佳實施例中，糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型33F多醣對經活化多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型33F多醣的比率係至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。在較佳實施例中，糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型33F多醣對經活化多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型33F多醣的比率係至少0.7。在較佳實施例中，糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型33F多醣對經活化多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型33F多醣的比率係至少0.9。 本發明之血清型33F糖結合物及免疫原組合物可含有不與載體蛋白質共價結合，但仍存在於糖結合物組合物中之游離醣。游離醣可與糖結合物非共價締合(即，非共價連結至該糖結合物中、吸附至該糖結合物中或包埋於該糖結合物中或與其一起包埋)。 在一些實施例中，相對於血清型33F多醣之總量計，本發明之血清型33F糖結合物包含小於約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%之游離血清型33F多醣。較佳地，血清型33F糖結合物包含小於15%之游離醣，更佳小於10%之游離醣，且仍更佳小於5%之游離醣。在較佳實施例中，相對於血清型33F多醣之總量計，血清型33F糖結合物包含小於約25%之游離血清型33F多醣。在較佳實施例中，相對於血清型33F多醣之總量計，血清型33F糖結合物包含小於約20%之游離血清型33F多醣。在較佳實施例中，相對於血清型33F多醣之總量計，血清型33F糖結合物包含小於約15%之游離血清型33F多醣。 在某些較佳實施例中，本發明提供血清型33F糖結合物，其具有以下特徵單獨或組合中之一或多者：多醣之分子量介於50 kDa與2,000 kDa之間；糖結合物之分子量介於500 kDa至10,000 KDa之間；載體蛋白質包含2至20個共價連接至醣之離胺酸殘基；醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於0.2與4.0之間；糖結合物的多醣之每4個、10個、15個或25個醣重複單元包含至少一個載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結；醣之O-乙醯化程度介於75%與100%之間；結合物包含相對於總多醣小於約15%之游離多醣；載體蛋白質係CRM197 。 血清型33F糖結合物亦可藉由其分子大小分佈(Kd )來表徵。結合物之相對分子大小分佈可使用粒徑排阻層析介質(CL-4B)來測定，如上文所提及。 在實施例中，在CL-4B管柱中，至少15%之本發明血清型33F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在實施例中，在CL-4B管柱中，至少15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%或90%之本發明血清型33F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。 在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少35%之本發明血清型33F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%之本發明血清型33F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少60%之本發明血清型33F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少70%之本發明血清型33F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。 在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於40%與90%之間之血清型33F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於50%與90%之間之血清型33F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於65%與80%之間之血清型33F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。1.3.4 來自肺炎鏈球菌血清型 15B 之糖結合物 在實施例中，血清型15B糖結合物係藉由以下方式來獲得：使用1-氰基-4-二甲基胺基吡啶鎓四氟磷酸鹽(CDAP)活化多醣以形成氰酸酯。可使經活化之多醣直接或經由間隔體(連接體)基團偶合至載體蛋白質上之胺基。舉例而言，間隔體可為胱胺或半胱胺以獲得硫醇化多醣，該硫醇化多醣可在與馬來醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用GMBS)或鹵乙醯化載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺、SIB、SIAB、磺基-SIAB、SIA或SBAP)反應後經由所獲得之硫醚鍵偶合至載體。較佳地，使氰酸酯(視情況藉由CDAP化學製得)與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且使用碳化二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上之羧基使胺基衍生之醣結合至載體蛋白質。該等結合物闡述於例如WO93/15760、WO 95/08348及WO 96/129094中。 其他適宜技術使用碳化二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多技術闡述於國際專利申請公開案第WO 98/42721號中。結合可涉及可藉由以下方式形成之羰基連接體：使醣之游離羥基與CDI反應(參見Bethell等人(1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574；Hearn等人(1981) J. Chromatogr. 218:509-518)，然後與蛋白質反應以形成胺基甲酸酯鍵。此可涉及將變旋異構末端還原成一級羥基，對一級羥基實施可選保護/去保護，使一級羥基與CDI反應以形成CDI胺基甲酸酯中間體及使CDI胺基甲酸酯中間體與蛋白質上之胺基偶合。 在較佳實施例中，本發明之血清型15B糖結合物係使用還原性胺化法製備。還原性胺化涉及兩個步驟，(1) 氧化多醣以自個別六醣單元中之鄰二醇產生醛官能基，(2) 還原經活化之多醣及載體蛋白質以形成結合物。 較佳地，在氧化之前，將血清型15B多醣分篩至目標分子量(MW)範圍。有利地，減小經純化血清型15B多醣之大小，同時保持多醣結構之關鍵特徵，例如O-乙醯基之存在。較佳地，經純化血清型15B多醣之大小係藉由機械均質化來減小(參見上文部分1.2.6)。 氧化步驟可涉及與過碘酸鹽之反應。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸二者；該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO4 - )及原過碘酸鹽(IO6 5- )二者以及過碘酸鹽之多種鹽(例如，過碘酸鈉及過碘酸鉀)。在較佳實施例中，用於氧化血清型15B莢膜多醣之過碘酸鹽係偏過碘酸鹽。在較佳實施例中，用於氧化血清型15B莢膜多醣之過碘酸鹽係偏過碘酸鈉。 在較佳實施例中，使多醣與0.01至10.0莫耳當量、0.05至5.0莫耳當量、0.1至1.0莫耳當量、0.5至1.0莫耳當量、0.7至0.8莫耳當量、0.05至0.5莫耳當量、0.1至0.3莫耳當量之氧化劑反應。在較佳實施例中，使多醣與約0.1莫耳當量、0.15莫耳當量、0.2莫耳當量、0.25莫耳當量、0.3莫耳當量、0.35莫耳當量、0.4莫耳當量、0.45莫耳當量、0.5莫耳當量、0.55莫耳當量、0.6莫耳當量、0.65莫耳當量、0.7莫耳當量、0.75莫耳當量、0.8莫耳當量、0.85莫耳當量、0.9莫耳當量、0.95莫耳當量之氧化劑反應。在較佳實施例中，使多醣與約0.15莫耳當量之氧化劑反應。在較佳實施例中，使多醣與約0.25莫耳當量之氧化劑反應。在較佳實施例中，使多醣與約0.5莫耳當量之氧化劑反應。在較佳實施例中，使多醣與約0.6莫耳當量之氧化劑反應。在較佳實施例中，使多醣與約0.7莫耳當量之氧化劑反應。 在較佳實施例中，反應之持續時間介於1小時與50小時之間、介於10小時與30小時之間、介於15小時與20小時之間、介於15小時與17小時之間或約16小時。 在較佳實施例中，將反應之溫度維持在15℃與45℃之間、15℃與30℃之間、20℃與25℃之間。在較佳實施例中，將反應之溫度維持在約23℃下。 在較佳實施例中，氧化反應係在選自磷酸鈉、磷酸鉀、2-(N-嗎啉基)乙烷磺酸(MES)或Bis-Tris之緩衝液中實施。在較佳實施例中，緩衝液係磷酸鉀。 在較佳實施例中，緩衝液之濃度介於1 mM與500 mM之間、介於1 mM與300 mM之間或介於50 mM與200 mM之間。在較佳實施例中，緩衝液之濃度為約100 mM。 在較佳實施例中，氧化反應係在介於4.0與8.0之間、介於5.0與7.0之間或介於5.5與6.5之間的pH下實施。在較佳實施例中，pH為約6.0。 在較佳實施例中，經活化之血清型15B莢膜多醣係藉由以下方式來獲得：在介於20℃與25℃之間之溫度下，使0.5 mg/mL至5 mg/mL之經分離之血清型15B莢膜多醣與0.2至0.3莫耳當量之過碘酸鹽反應。 在較佳實施例中，將經活化之血清型15B莢膜多醣純化。經活化之血清型15B莢膜多醣係根據熟習此項技術者已知之方法來純化，例如凝膠滲透層析(GPC)、透析或超濾/滲濾。舉例而言，使用超濾裝置藉由濃縮及滲濾來純化經活化之莢膜多醣。 在較佳實施例中，經活化血清型15B莢膜多醣之氧化程度介於2與20之間、介於2與15之間、介於2與10之間、介於2與5之間、介於5與20之間、介於5與15之間、介於5與10之間、介於10與20之間、介於10與15之間或介於15與20之間。在較佳實施例中，經活化血清型15B莢膜多醣之氧化程度介於2與10之間、介於4與8之間、介於4與6之間、介於6與8之間、介於6與12之間、介於8與12之間、介於9與11之間、介於10與16之間、介於12與16之間、介於14與18之間、介於16與20之間、介於16與18之間或介於18與20之間。 在較佳實施例中，經活化血清型15B莢膜多醣之分子量介於5 kDa與500 kDa之間、介於50 kDa與500 kDa之間、介於50 kDa與450 kDa之間、介於100 kDa與400 kDa之間、介於100 kDa與350 kDa之間。在較佳實施例中，經活化血清型15B莢膜多醣之分子量介於100 kDa與350 kDa之間。在較佳實施例中，經活化血清型15B莢膜多醣之分子量介於100 kDa與300 kDa之間。在較佳實施例中，經活化血清型15B莢膜多醣之分子量介於100 kDa與250 kDa之間。 在較佳實施例中，經活化之血清型15B莢膜多醣包含至少0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM或0.8 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，經活化之血清型15B莢膜多醣包含至少0.5 mM、0.6 mM或0.7 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，經活化之血清型15B莢膜多醣包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，經活化之血清型15B莢膜多醣包含至少0.7 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經活化之血清型15B莢膜多醣包含至少0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM或0.8 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，經活化之血清型15B莢膜多醣包含至少0.5 mM、0.6 mM或0.7 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，經活化之血清型15B莢膜多醣包含至少0.6 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，經活化之血清型15B莢膜多醣包含至少0.7 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經活化血清型15B莢膜多醣之分子量介於100 kDa與250 kDa之間，且包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經活化血清型15B莢膜多醣之分子量介於100 kDa與250 kDa之間，且包含至少0.6 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經活化之血清型15B莢膜多醣包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣及至少0.6 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。 在較佳實施例中，經活化血清型15B莢膜多醣之分子量介於100 kDa與250 kDa之間，且包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM該血清型15B莢膜多醣及至少0.6 mM甘油/mM該血清型15B莢膜多醣。 在實施例中，視情況在醣存在下凍乾經活化之血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，醣係選自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇及益壽糖。在較佳實施例中，醣係蔗糖。然後可將凍乾之經活化莢膜多醣與包含載體蛋白質之溶液複合。 在另一實施例中，將經活化之血清型15B莢膜多醣與載體蛋白質複合且視情況在醣存在下凍乾。在較佳實施例中，醣係選自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇及益壽糖。在較佳實施例中，醣係蔗糖。然後可將共凍乾之多醣及載體蛋白質重懸浮於溶液中且與還原劑反應。 經活化之血清型15B莢膜多醣可藉由包含以下步驟之製程結合至載體蛋白質： (a) 複合經活化之血清型15B莢膜多醣與載體蛋白質，及 (b) 使複合的經活化血清型15B莢膜多醣及載體蛋白質與還原劑反應，以形成血清型15B莢膜多醣-載體蛋白質結合物。 與例如其中可顯著降低多醣之O-乙醯化程度的水溶液中之還原性胺化相比，藉由二甲基亞碸(DMSO)中之還原性胺化使經活化之血清型15B莢膜多醣與蛋白質載體結合適於保持多醣之O-乙醯基含量。在較佳實施例中，步驟(a)及步驟(b)係在DMSO中實施。 在較佳實施例中，步驟(a)包含將凍乾之血清型15B莢膜多醣溶解於包含載體蛋白質及DMSO之溶液中。在較佳實施例中，步驟(a)包含將共凍乾之血清型15B莢膜多醣及載體蛋白質溶解於DMSO中。 當在水溶液中實施步驟(a)及(b)時，步驟(a)及(b)係在介於6.0與8.5之間、介於7.0與8.0之間或介於7.0與7.5之間的pH下、較佳選自以下各項之緩衝液中實施：PBS、MES、HEPES、Bis-tris、ADA、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、DIPSO、MOBS、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、二羥乙甘胺酸或HEPB。在較佳實施例中，緩衝液係PBS。在較佳實施例中，pH為約7.3。 在較佳實施例中，步驟(b)中經活化血清型15B莢膜多醣之濃度介於0.1 mg/mL與10 mg/mL之間、介於0.5 mg/mL與5 mg/mL之間或介於0.5 mg/mL與2 mg/mL之間。在較佳實施例中，步驟(b)中經活化血清型15B莢膜多醣之濃度為約0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL、1.3 mg/mL、1.4 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.7 mg/mL、1.8 mg/mL、1.9 mg/mL、2.0 mg/mL、2.1 mg/mL、2.2 mg/mL、2.3 mg/mL、2.4 mg/mL、2.5 mg/mL、2.6 mg/mL、2.7 mg/mL、2.8 mg/mL、2.9 mg/mL或3.0 mg/mL。 在較佳實施例中，經活化血清型15B莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比(重量:重量)介於5:1與0.1:1之間、介於2:1與0.1:1之間、介於2:1與1:1之間、介於1.5:1與1:1之間、介於0.1:1與1:1之間、介於0.3:1與1:1之間或介於0.6:1與1:1之間。 在較佳實施例中，經活化血清型15B莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比為約0.6:1至1:1。在另一實施例中，經活化血清型15B莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比為約0.6:1至1.5:1。該初始輸入比尤其適用於獲得糖結合物中低含量之游離多醣。 在較佳實施例中，經活化血清型15B莢膜多醣對載體蛋白質之初始輸入比為約0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1。 在實施例中，還原劑係氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉、在布氏酸或路易斯酸存在下之硼氫化鈉或硼氫化鉀、胺硼烷(例如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲基胺-硼烷、t-BuMeiPrN-BH3、苄基胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB))。在較佳實施例中，還原劑係氰基硼氫化鈉。在較佳實施例中，還原劑係2-甲吡啶硼烷鈉。 在較佳實施例中，用於步驟(b)中之還原劑之量介於約0.1與10.0莫耳當量之間、介於0.5與5.0莫耳當量之間或介於1.0與2.0莫耳當量之間。在較佳實施例中，用於步驟(b)中之還原劑之量為約1.0莫耳當量、1.1莫耳當量、1.2莫耳當量、1.3莫耳當量、1.4莫耳當量、1.5莫耳當量、1.6莫耳當量、1.7莫耳當量、1.8莫耳當量、1.9莫耳當量或2.0莫耳當量。 在較佳實施例中，步驟(b)之持續時間介於1小時與60小時之間、介於10小時與50小時之間、介於40小時與50小時之間或介於42小時與46小時之間。在較佳實施例中，步驟(b)之持續時間為約44小時。 在較佳實施例中，將步驟(b)中之反應溫度維持在10℃與40℃之間、15℃與30℃之間或20℃與26℃之間。在較佳實施例中，將步驟(b)中之反應溫度維持在約23℃下。 在較佳實施例中，用於製備包含共價連接至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型15B莢膜多醣之糖結合物的製程進一步包含藉由添加NaBH4 封端未反應之醛(淬滅)之步驟(步驟(c))。 在較佳實施例中，用於步驟(c)中之NaBH4 之量介於0.1與10莫耳當量之間、介於0.5與5.0莫耳當量之間或介於1.0與3.0莫耳當量之間。在較佳實施例中，用於步驟(c)中之NaBH4 之量為約2莫耳當量。 在較佳實施例中，步驟(c)之持續時間介於0.1小時與10小時、0.5小時與5小時之間或介於2小時與4小時之間。在較佳實施例中，步驟(c)之持續時間為約3小時。 在較佳實施例中，將步驟(c)中之反應溫度維持在15℃與45℃之間、15℃與30℃之間或20℃與26℃之間。在較佳實施例中，將步驟(c)中之反應溫度維持在約23℃下。 在較佳實施例中，結合步驟之產率大於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。在較佳實施例中，結合步驟(步驟b)之產率大於60%。在較佳實施例中，結合步驟(步驟b)之產率大於70%。產率係結合物中血清型15B多醣之量×100) / 用於結合步驟中之經活化多醣之量。 在較佳實施例中，用於製備包含共價連接至載體蛋白質之肺炎鏈球菌血清型15B莢膜多醣之糖結合物的製程包含以下步驟： (a) 藉由高壓均質化分篩經純化之血清型15B多醣； (b) 使所篩分之血清型15B多醣與氧化劑反應； (c) 複合經活化之血清型15B多醣與載體蛋白質； (d) 使複合的經活化血清型15B多醣及載體蛋白質與還原劑反應，以形成血清型15B多醣-載體蛋白質結合；及 (e) 藉由添加NaBH4 封端未反應之醛(淬滅)。 在較佳實施例中，上述製程之結合步驟(步驟d)之產率大於50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%。在較佳實施例中，結合步驟(步驟d)之產率大於60%。在較佳實施例中，結合步驟(步驟d)之產率大於70%。產率係結合物中血清型15B多醣之量×100) / 用於結合步驟中之經活化多醣之量。 在血清型15B莢膜多醣結合至載體蛋白質後，可藉由熟習此項技術者已知之多種技術純化多醣-蛋白質結合物(相對於多醣-蛋白質結合物之量進行富集)。該等技術包括透析、濃縮/滲濾操作、切向流過濾、沈澱/溶析、管柱層析(DEAE或疏水相互作用層析)及深度過濾。 在實施例中，載體蛋白質係如部分1.1所定義。在實施例中，載體蛋白質係選自由以下組成之群：DT (白喉毒素)、TT (破傷風類毒素)、CRM197 、其他DT突變體、PD (流感嗜血桿菌蛋白質D)或其免疫功能等效物。在實施例中，載體蛋白質係CRM197 。 在一些實施例中，本發明之血清型15B糖結合物結合至載體蛋白質(例如，CRM197 )且包含分子量介於5 kDa與1,500 kDa之間之醣。在其他該等實施例中，醣之分子量介於10 kDa與1,500 kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50 kDa與1,500 kDa之間；介於50 kDa與1,250 kDa之間；介於50 kDa與1,000 kDa之間；介於50 kDa與750 kDa之間；介於50 kDa與500 kDa之間；介於50 kDa與250 kDa之間；介於100 kDa與1,500 kDa之間；介於100 kDa與1,250 kDa之間；介於100 kDa與1,000 kDa之間；介於100 kDa與750 kDa之間；介於100 kDa與500 kDa之間；介於100 kDa與250 kDa之間；介於200 kDa與1,500 kDa之間；介於200 kDa與1,250 kDa之間；介於200 kDa與1,000 kDa之間；介於200 kDa與750 kDa之間；或介於200 kDa與500 kDa之間；或介於200 kDa與400 kDa之間。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。在一些實施例中，本發明之血清型15B糖結合物之分子量介於50 kDa與20,000 kDa之間。在一些實施例中，本發明之血清型15B糖結合物之分子量介於1,000 kDa與20,000 kDa之間。在較佳實施例中，本發明之血清型15B糖結合物之分子量介於3,000 kDa與20,000 kDa之間、介於5,000 kDa與10,000 kDa之間、介於5,000 kDa與20,000 kDa之間、介於8,000 kDa與20,000 kDa之間、介於8,000 kDa與16,000 kDa之間或介於10,000 kDa與16,000 kDa之間。 在其他實施例中，本發明之血清型15B糖結合物之分子量為約1,000 kDa、約1,500 kDa、約2,000 kDa、約2,500 kDa、約3,000 kDa、約3,500 kDa、約4,000 kDa、約4,500 kDa、約5,000 kDa、約5,500 kDa、約6,000 kDa、約6,500 kDa、約7,000 kDa、約7,500 kDa、約8,000 kDa、約8,500 kDa、約9,000 kDa、約9,500 kDa、約10,000 kDa、約10,500 kDa、約11,000 kDa、約11,500 kDa、約12,000 kDa、約12,500 kDa、約13,000 kDa、約13,500 kDa、約14,000 kDa、約14,500 kDa、約15,000 kDa、約15,500 kDa、約16,000 kDa、約16,500 kDa、約17,000 kDa、約17,500 kDa、約18,000 kDa、約18,500 kDa、約19,000 kDa、約19,500 kDa或約20,000 kDa。 在其他實施例中，本發明之血清型15B糖結合物之分子量介於1,000 kDa與20,000 kDa之間；介於1,000 kDa與15,000 kDa之間；介於1,000 kDa與10,000 kDa之間；介於1,000 kDa與7,500 kDa之間；介於1,000 kDa與5,000 kDa之間；介於1,000 kDa與4,000 kDa之間；介於1,000 kDa與3,000 kDa之間；介於2,000 kDa與20,000 kDa之間；介於2,000 kDa與15,000 kDa之間；介於2,000 kDa與12,500 kDa之間；介於2,000 kDa與10,000 kDa之間；介於2,000 kDa與7,500 kDa之間；介於2,000 kDa與6,000 kDa之間；介於2,000 kDa與5,000 kDa之間；介於2,000 kDa與4,000 kDa之間；或介於2,000 kDa與3,000 kDa之間。 在其他實施例中，本發明之血清型15B糖結合物之分子量介於3,000 kDa與20,000 kDa之間；介於3,000 kDa與15,000 kDa之間；介於3,000 kDa與10,000 kDa之間；介於3,000 kDa與7,500 kDa之間；介於3,000 kDa與5,000 kDa之間；介於3,000 kDa與4,000 kDa之間；介於4,000 kDa與20,000 kDa之間；介於4,000 kDa與15,000 kDa之間；介於4,000 kDa與12,500 kDa之間；介於4,000 kDa與10,000 kDa之間；介於4,000 kDa與7,500 kDa之間；介於4,000 kDa與6,000 kDa之間或介於4,000 kDa與5,000 kDa之間。在其他實施例中，本發明之血清型15B糖結合物之分子量介於5,000 kDa與20,000 kDa之間；介於5,000 kDa與15,000 kDa之間；介於5,000 kDa與10,000 kDa之間；介於5,000 kDa與7,500 kDa之間；介於6,000 kDa與20,000 kDa之間；介於6,000 kDa與15,000 kDa之間；介於6,000 kDa與12,500 kDa之間；介於6,000 kDa與10,000 kDa之間或介於6,000 kDa與7,500 kDa之間。 糖結合物之分子量係藉由SEC-MALLS來量測。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。在實施例中，該等血清型15B糖結合物係使用還原性胺化法製備。 本發明之血清型15B糖結合物亦可藉由醣對載體載體蛋白質之比率(重量/重量)來表徵。在較佳實施例中，結合物中血清型15B莢膜多醣對載體蛋白質之比率(重量:重量)介於0.5與3.0之間(例如，約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9或約3.0)。在較佳實施例中，結合物中血清型15B莢膜多醣對載體蛋白質之比率介於0.4與2之間。在較佳實施例中，結合物中血清型15B莢膜多醣對載體蛋白質之比率介於0.5與2.0、0.5與1.5、0.5與1.0、1.0與1.5、1.0與2.0之間。在較佳實施例中，結合物中血清型15B莢膜多醣對載體蛋白質之比率介於0.7與0.9之間。 本發明之血清型15B糖結合物及免疫原組合物可含有不與載體蛋白質共價結合，但仍存在於糖結合物組合物中之游離醣。游離醣可與糖結合物非共價締合(即，非共價連結至該糖結合物中、吸附至該糖結合物中或包埋於該糖結合物中或與其一起包埋)。 在較佳實施例中，相對於血清型15B莢膜多醣之總量計，本發明之血清型15B糖結合物包含小於約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%或15%之游離血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，相對於血清型15B莢膜多醣之總量計，本發明之血清型15B糖結合物包含小於約25%之游離血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，相對於血清型15B莢膜多醣之總量計，本發明之血清型15B糖結合物包含小於約20%之游離血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，相對於血清型15B莢膜多醣之總量計，本發明之血清型15B糖結合物包含小於約15%之游離血清型15B莢膜多醣。 血清型15B糖結合物亦可藉由其分子大小分佈(Kd )來表徵。結合物之相對分子大小分佈可使用粒徑排阻層析介質(CL-4B)來測定，如上文所提及。 在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少20%之本發明血清型15B糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少30%之免疫原結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少40%之本發明血清型15B糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%之本發明血清型15糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少60%之本發明血清型15B糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少70%之本發明血清型15B糖結合物之Kd 小於或等於0.3。 在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於40%與90%之間之血清型15B糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於50%與90%之間之血清型15B糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於65%與80%之間之血清型15B糖結合物之Kd 小於或等於0.3。 在較佳實施例中，本發明之血清型15B糖結合物包含至少0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM或0.8 mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，糖結合物包含至少0.5 mM、0.6 mM或0.7 mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，糖結合物包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，糖結合物包含至少0.7 mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，藉由離子-HPLC分析測定O-乙醯基之存在。 在較佳實施例中，血清型15B糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣對經分離多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣的比率係至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。在較佳實施例中，血清型15B糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣對經分離多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣的比率係至少0.7。在較佳實施例中，血清型15B糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣對經分離多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣的比率係至少0.9。在較佳實施例中，藉由離子-HPLC分析測定O-乙醯基之存在。 在較佳實施例中，血清型15B糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣對經活化多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣的比率係至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。在較佳實施例中，血清型15B糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣對經活化多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣的比率係至少0.7。在較佳實施例中，血清型15B糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣對經活化多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣的比率係至少0.9。在較佳實施例中，藉由離子-HPLC分析測定O-乙醯基之存在。 在較佳實施例中，本發明之血清型15B糖結合物包含至少0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM或0.8 mM甘油/mM血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，本發明之血清型15B糖結合物包含至少0.5 mM、0.6 mM或0.7 mM甘油/mM血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，本發明之血清型15B糖結合物包含至少0.6 mM甘油/mM血清型15B莢膜多醣。在較佳實施例中，本發明之血清型15B糖結合物包含至少0.7 mM甘油/mM血清型15B莢膜多醣。 表徵本發明血清型15B糖結合物之另一方式係藉助載體蛋白質(例如，CRM197 )中結合至醣之離胺酸殘基數，此可表徵為所結合離胺酸之範圍(結合度)。可使用彼等熟習此項技術者已知之常規方法藉由胺基酸分析獲得因共價連接至多醣所致之載體蛋白質之離胺酸修飾之證據。結合使得與用於產生結合材料之CRM197 蛋白起始材料相比，所回收之離胺酸殘基數減少。 在較佳實施例中，本發明血清型15B糖結合物之結合度介於2與15之間、介於2與13之間、介於2與10之間、介於2與8之間、介於2與6之間、介於2與5之間、介於2與4之間、介於3與15之間、介於3與13之間、介於3與10之間、介於3與8之間、介於3與6之間、介於3與5之間、介於3與4之間、介於5與15之間、介於5與10之間、介於8與15之間、介於8與12之間、介於10與15之間或介於10與12之間。在實施例中，本發明血清型15B糖結合物之結合度為約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14或約15。在較佳實施例中，本發明血清型15B糖結合物之結合度介於2與5之間。1.3.5 來自肺炎鏈球菌血清型 12F 之糖結合物 在本發明之來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物中，醣係選自由多醣及寡醣組成之群，且載體蛋白質係選自如本文所闡述或彼等熟習此項技術者已知之任一適宜載體。在一些較佳實施例中，醣係來自血清型12F肺炎鏈球菌之多醣。 在實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物係使用CDAP來製備。使用1-氰基-4-二甲基胺基吡啶鎓四氟磷酸鹽(CDAP)活化多醣以形成氰酸酯。然後可使經活化之多醣直接或經由間隔體(連接體)基團偶合至載體蛋白質(較佳CRM197 )上之胺基。舉例而言，間隔體可為胱胺或半胱胺以獲得硫醇化多醣，該硫醇化多醣可在與馬來醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用GMBS)或鹵乙醯化載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺、SIB、SIAB、磺基-SIAB、SIA或SBAP)反應後經由所獲得之硫醚鍵偶合至載體。較佳地，使氰酸酯(視情況藉由CDAP化學製得)與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且使用碳化二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上之羧基使胺基衍生之醣結合至載體蛋白質(例如CRM197 )。 其他結合技術使用碳化二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多技術闡述於國際專利申請公開案第WO 98/42721號中。結合可涉及可藉由以下方式形成之羰基連接體：使醣之游離羥基與CDI反應(參見Bethell等人(1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574；Hearn等人(1981) J. Chromatogr. 218:509-518)，然後與蛋白質反應以形成胺基甲酸酯鍵。此可涉及將變旋異構末端還原成一級羥基，對一級羥基實施可選保護/去保護，使一級羥基與CDI反應以形成CDI胺基甲酸酯中間體及使CDI胺基甲酸酯中間體與蛋白質上之胺基偶合。 在實施例中，來自血清型12F肺炎鏈球菌之莢膜多醣藉由還原性胺化結合至載體蛋白質。還原性胺化涉及兩個步驟，(1) 氧化多醣以自個別六醣單元中之鄰二醇產生醛官能基，(2) 還原經活化之多醣及載體蛋白質以形成結合物。 在氧化之前，視情況使血清型12F多醣水解(分篩)。可採用機械或化學水解。化學水解可使用乙酸來實施。 在實施例中，氧化劑係過碘酸鹽。術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸二者(參見下文)。 在較佳實施例中，氧化劑係2,2,6,6-四甲基-1-六氫吡啶基氧基(TEMPO)自由基及作為輔助氧化劑之N-氯琥珀醯亞胺(NCS)。在該實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物係藉由以下方式來製備：使用2,2,6,6-四甲基-1-六氫吡啶基氧基(TEMPO)自由基使用N-氯琥珀醯亞胺(NCS)作為輔助氧化劑將醣之一級醇氧化成醛(下文稱為「TEMPO/NCS氧化」)，例如實例7及WO 2014/097099中所闡述。因此在一態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物可藉由包含以下步驟之方法獲得：a) 在水性溶劑中使12F醣與2,2,6,6-四甲基-1-六氫吡啶基氧基(TEMPO)及N-氯琥珀醯亞胺(NCS)反應以產生經活化之醣；及b) 使經活化之醣與包含一或多個胺基團之載體蛋白質反應(下文稱為「TEMPO/NCS還原性胺化」)。在一態樣中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物係藉由該方法獲得。在實施例中，經活化12F醣之氧化程度介於以下範圍內：1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至5、3至40、3至30、3至20、3至10、4至40、4至30、4至20、4至10、5至30、5至25、5至20、5至10、6至50、6至40、6至30、6至20、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、7至40、7至30、7至20、7至15、7至14、7至13、7至12、7至11、7至10、8至40、8至30、8至20、8至15、8至14、8至13、8至13、8至12、8至11、8至10、9至40、9至30、9至20、9至15、10至40、10至30、10至20或10至15。在另一態樣中，經活化醣之氧化程度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。較佳地，載體蛋白質係CRM197 。 在實施例中，在步驟a)之前，使12F醣水解成介於100 kDa至400 kDa範圍內之分子量。舉例而言，在一態樣中，分子量介於以下範圍內：100 kDa至350 kDa、100 kDa至300 kDa、100 kDa至250 kDa、100 kDa至200 kDa、100 kDa至150 kDa、200 kDa至400 kDa、200 kDa至350 kDa、200 kDa至300 kDa、200 kDa至250 kDa、300 kda至400 kDa或300 kDa至350 kDa。 在另一態樣中，該方法進一步包含在步驟b)之前純化經活化多醣之步驟。在另一態樣中，該等方法進一步包含在步驟b)之後添加還原劑之步驟。在一態樣中，還原劑係NaCNBH3 。在另一態樣中，該等方法進一步包含在添加NaCNBH3 後添加NaBH4 之步驟。在另一態樣中，該方法包含添加NaBH4 後之純化步驟。 在另一態樣中，本發明提供可藉由上文所揭示之任一方法產生或獲得之來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物。舉例而言，在一態樣中，本發明提供包含結合至載體蛋白質之醣之來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物，其可藉由包含以下步驟之方法產生或獲得：a) 在水性溶劑中使醣與2,2,6,6-四甲基-1-六氫吡啶基氧基(TEMPO)及N-氯琥珀醯亞胺(NCS)反應以產生經活化之醣；及b) 使經活化之醣與包含一或多個胺基團之載體蛋白質反應。 在一個實施例中，本發明之來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物之分子量介於約50 kDa與約20,000 kDa之間。在另一實施例中，糖結合物之分子量介於約200 kDa與約10,000 kDa之間。在另一實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物之分子量介於約500 kDa與約5,000 kDa之間。在一個實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物之分子量介於約1,000 kDa與約3,000 kDa之間。在其他實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物之分子量介於約600 kDa與約2,800 kDa之間；介於約700 kDa與約2,700 kDa之間；介於約1,000 kDa與約2,000 kDa之間；介於約1,800 kDa與約2,500 kDa之間；介於約1,100 kDa與約2,200 kDa之間；介於約1,900 kDa與約2,700 kDa之間；介於約1,200 kDa與約2,400 kDa之間；介於約1,700 kDa與約2,600 kDa之間；介於約1,300 kDa與約2,600 kDa之間；介於約1,600 kDa與約3,000 kDa之間。 在其他實施例中，本發明之血清型12F糖結合物之分子量介於1,000 kDa與20,000 kDa之間；介於1,000 kDa與15,000 kDa之間；介於1,000 kDa與10,000 kDa之間；介於1,000 kDa與7,500 kDa之間；介於1,000 kDa與5,000 kDa之間；介於1,000 kDa與4,000 kDa之間；介於1,000 kDa與3,000 kDa之間；介於2,000 kDa與20,000 kDa之間；介於2,000 kDa與15,000 kDa之間；介於2,000 kDa與12,500 kDa之間；介於2,000 kDa與10,000 kDa之間；介於2,000 kDa與7,500 kDa之間；介於2,000 kDa與6,000 kDa之間；介於2,000 kDa與5,000 kDa之間；介於2,000 kDa與4,000 kDa之間；或介於2,000 kDa與3,000 kDa之間。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。在一些該等實施例中，載體蛋白質係CRM197 。在一些該等實施例中，血清型12F糖結合物藉由TEMPO/NCS還原性胺化結合至載體蛋白質。 表徵本發明血清型12F糖結合物之另一方式係藉助載體蛋白質(例如，CRM197 )中結合至醣之離胺酸殘基數，此可表徵為所結合離胺酸之範圍(結合度)。 在較佳實施例中，本發明血清型12F糖結合物之結合度介於2與20之間、介於4與16之間、介於4與15之間、介於2與15之間、介於2與13之間、介於2與10之間、介於2與8之間、介於2與6之間、介於2與5之間、介於2與4之間、介於3與15之間、介於3與13之間、介於3與10之間、介於3與8之間、介於3與6之間、介於3與5之間、介於3與4之間、介於5與15之間、介於5與10之間、介於8與15之間、介於8與12之間、介於10與15之間或介於10與12之間。在實施例中，本發明血清型12F糖結合物之結合度為約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19或約20。 載體蛋白質中結合至醣之離胺酸殘基數亦可表示為莫耳比。舉例而言，在其中CRM197 之4至15個離胺酸殘基共價連接至醣之糖結合物中，糖結合物中所結合離胺酸對CRM197 之莫耳比介於約10:1至約40:1之間。在其中CRM197 之2至20個離胺酸殘基共價連接至醣之免疫原組合物中，糖結合物中所結合離胺酸對CRM197 之莫耳比介於約5:1與約50:1之間。在一個實施例中，在本發明之來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物中，所結合離胺酸對載體蛋白質之莫耳比為約10:1至約25:1。在一些該等實施例中，載體蛋白質係CRM197 。在一些實施例中，在CRM197 所包含之39個離胺酸殘基中可有約4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個或16個共價連接至醣。在一些該等實施例中，血清型12F糖結合物藉由TEMPO/NCS還原性胺化結合至載體蛋白質。 在一個實施例中，在來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物中醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於0.2與4之間(例如，約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9或約4.0)。在另一實施例中，在來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物中醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於1.1與1.7之間。在其他實施例中，醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於0.8與1.8之間(例如，約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7或約1.8)。在一些該等實施例中，載體蛋白質係CRM197 。在一些該等實施例中，載體蛋白質係CRM197 。在一些該等實施例中，血清型12F糖結合物藉由TEMPO/NCS還原性胺化結合至載體蛋白質。 醣鏈至載體蛋白質上之離胺酸之附接頻率係用於表徵本發明血清型12F糖結合物之另一參數。舉例而言，在一個實施例中，多醣之每100個醣重複單元存在至少一個載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結。在一個實施例中，多醣之每50個醣重複單元存在至少一個載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結。在一個實施例中，多醣之每25個醣重複單元存在至少一個載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結。在另一實施例中，在多醣之每4個醣重複單元中，載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結出現至少一次。在另一實施例中，在多醣之每10個醣重複單元中，載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結出現至少一次。在另一實施例中，在多醣之每15個醣重複單元中，載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結出現至少一次。在常見實施例中，載體蛋白質係CRM197 ，且在多醣之每4個、10個、15個或25個醣重複單元中，CRM197 與多醣之間之共價鏈結出現至少一次。 在其他實施例中，結合物之每5至10個醣重複單元；每2至7個醣重複單元；每3至8個醣重複單元；每4至9個醣重複單元；每6至11個醣重複單元；每7至12個醣重複單元；每8至13個醣重複單元；每9至14個醣重複單元；每10至15個醣重複單元；每2至6個醣重複單元；每3至7個醣重複單元；每4至8個醣重複單元；每6至10個醣重複單元；每7至11個醣重複單元；每8至12個醣重複單元；每9至13個醣重複單元；每10至14個醣重複單元；每10至20個醣重複單元；每4至25個醣重複單元或每2至25個醣重複單元包含至少一個載體蛋白質與醣之間之共價鏈結。在常見實施例中，載體蛋白質係CRM197 。 在另一實施例中，多醣之每2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個或25個醣重複單元出現至少一個CRM197 與醣之間之鍵。在一些該等實施例中，血清型12F糖結合物藉由TEMPO/NCS還原性胺化結合至載體蛋白質。 在一個實施例中，本發明之來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物的多醣之每25個醣重複單元包含至少一個載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結。在另一實施例中，在多醣之每4個醣重複單元中，載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結出現至少一次。在另一實施例中，在多醣之每10個醣重複單元中，載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結出現至少一次。在另一實施例中，在多醣之每15個醣重複單元中，載體蛋白質與多醣之間之共價鏈結出現至少一次。在一些該等實施例中，血清型12F糖結合物藉由TEMPO/NCS還原性胺化結合至載體蛋白質。 本發明之血清型12F糖結合物及免疫原組合物可含有不與載體蛋白質共價結合，但仍存在於糖結合物組合物中之游離醣。游離醣可與糖結合物非共價締合(即，非共價連結至該糖結合物中、吸附至該糖結合物中或包埋於該糖結合物中或與其一起包埋)。 在一些實施例中，相對於血清型12F多醣之總量計，本發明之血清型12F糖結合物包含小於約50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%之游離血清型12F多醣。在一個實施例中，相對於血清型12F多醣之總量計，來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物包含小於約50%之游離血清型12F多醣。在一個實施例中，相對於血清型12F多醣之總量計，來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物包含小於約45%之游離血清型12F多醣。在另一實施例中，相對於血清型12F多醣之總量計，糖結合物包含小於約30%之游離血清型12F多醣。在另一實施例中，相對於血清型12F多醣之總量計，來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物包含小於約20%之游離血清型12F多醣。在另一實施例中，相對於血清型12F多醣之總量計，糖結合物包含小於約10%之游離血清型12F多醣。在另一實施例中，相對於血清型12F多醣之總量計，來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物包含小於約5%之游離血清型12F多醣。在一些該等實施例中，血清型12F糖結合物藉由TEMPO/NCS還原性胺化結合至載體蛋白質。 在一些實施例中，本發明之血清型12F糖結合物包含分子量介於10 kDa與2,000 kDa之間之醣。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50 kDa與2,000 kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50 kDa與1,750 kDa之間；介於50 kDa與1,500 kDa之間；介於50 kDa與1,250 kDa之間；介於50 kDa與1,000 kDa之間；介於50 kDa與750 kDa之間；介於50 kDa與500 kDa之間；介於100 kDa與2,000 kDa之間；介於100 kDa與1,750 kDa之間；介於100 kDa與1,500 kDa之間；介於100 kDa與1,250 kDa之間；介於100 kDa與1,000 kDa之間；介於100 kDa與750 kDa之間；介於100 kDa與500 kDa之間；介於200 kDa與2,000 kDa之間；介於200 kDa與1,750 kDa之間；介於200 kDa與1,500 kDa之間；介於200 kDa與1,250 kDa之間；介於200 kDa與1,000 kDa之間；介於200 kDa與750 kDa之間；或介於200 kDa與500 kDa之間；或介於200 kDa與400 kDa之間。在一些該等實施例中，血清型12F糖結合物藉由TEMPO/NCS還原性胺化結合至載體蛋白質。 血清型12F糖結合物亦可藉由其分子大小分佈(Kd )來表徵。結合物之相對分子大小分佈可使用粒徑排阻層析介質(CL-4B)來測定，如上文所提及。 在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少35%之本發明血清型12F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%之本發明血清型12F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少60%之本發明血清型12F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少70%之本發明血清型12F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。 在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於40%與90%之間之血清型12F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於50%與90%之間之血清型12F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於65%與80%之間之血清型12F糖結合物之Kd 小於或等於0.3。1.3.6 來自肺炎鏈球菌血清型 10A 之糖結合物 在實施例中，血清型10A糖結合物係藉由以下方式來獲得：使用1-氰基-4-二甲基胺基吡啶鎓四氟磷酸鹽(CDAP)活化多醣以形成氰酸酯。可使經活化之多醣直接或經由間隔體(連接體)基團偶合至載體蛋白質上之胺基。舉例而言，間隔體可為胱胺或半胱胺以獲得硫醇化多醣，該硫醇化多醣可在與馬來醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用GMBS)或鹵乙醯化載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺、SIB、SIAB、磺基-SIAB、SIA或SBAP)反應後經由所獲得之硫醚鍵偶合至載體。較佳地，使氰酸酯(視情況藉由CDAP化學製得)與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且使用碳化二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上之羧基使胺基衍生之醣結合至載體蛋白質。該等結合物闡述於例如WO93/15760、WO 95/08348及WO 96/129094中。 其他適宜技術使用碳化二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多技術闡述於國際專利申請公開案第WO 98/42721號中。結合可涉及可藉由以下方式形成之羰基連接體：使醣之游離羥基與CDI反應(參見Bethell等人(1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574；Hearn等人(1981) J. Chromatogr. 218:509-518)，然後與蛋白質反應以形成胺基甲酸酯鍵。此可涉及將變旋異構末端還原成一級羥基，對一級羥基實施可選保護/去保護，使一級羥基與CDI反應以形成CDI胺基甲酸酯中間體及使CDI胺基甲酸酯中間體與蛋白質上之胺基偶合。 在較佳實施例中，本發明之血清型10A糖結合物係使用還原性胺化法製備。還原性胺化涉及兩個步驟，(1) 氧化多醣以自個別六醣單元中之鄰二醇產生醛官能基，(2) 還原經活化之多醣及載體蛋白質以形成結合物。 在氧化之前，視情況使血清型10A多醣水解(分篩)。可採用機械或化學水解。化學水解可使用乙酸來實施。 在實施例中，藉由包含以下步驟之製程來活化(氧化)血清型多醣： (a) 使經分離之血清型10A多醣與氧化劑反應； (b) 藉由添加淬滅劑淬滅氧化反應，以產生經活化之血清型10A多醣。 在較佳實施例中，氧化劑係過碘酸鹽。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸二者，該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO4 - )及原過碘酸鹽(IO6 5- )二者以及過碘酸鹽之多種鹽(例如，過碘酸鈉及過碘酸鉀)。在較佳實施例中，氧化劑係過碘酸鈉。在較佳實施例中，用於氧化血清型10A多醣之過碘酸鹽係偏過碘酸鹽。在較佳實施例中，用於氧化血清型10A多醣之過碘酸鹽係偏過碘酸鈉。 在一個實施例中，淬滅劑係選自鄰二醇、1,2-胺基醇、胺基酸、麩胱甘肽、亞硫酸鹽、硫酸氫鹽、二硫亞磺酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽、亞磷酸鹽、次磷酸鹽或亞磷酸。 在一個實施例中，淬滅劑係式(I)之1,2-胺基醇：
Figure 02_image001
(I) 其中R1 係選自H、甲基、乙基、丙基或異丙基。 在一個實施例中，淬滅劑係選自亞硫酸鹽、硫酸氫鹽、二硫亞磺酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽、亞磷酸鹽、次磷酸鹽或亞磷酸之鈉鹽及鉀鹽。 在一個實施例中，淬滅劑係胺基酸。在該等實施例中，該胺基酸可選自絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、胱胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、羥基脯胺酸、色胺酸、酪胺酸及組胺酸。 在一個實施例中，淬滅劑係亞硫酸鹽，例如硫酸氫鹽、二硫亞磺酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽。 在一個實施例中，淬滅劑係包含兩個鄰羥基、即兩個羥基共價連接至兩個毗鄰碳原子之化合物(鄰二醇)。 較佳地，淬滅劑係式(II)化合物：
Figure 02_image003
(II) 其中R1 及R2 係各自獨立地選自H、甲基、乙基、丙基或異丙基。 在較佳實施例中，淬滅劑係甘油、乙二醇、丙-1,2-二醇、丁-1,2-二醇或丁-2,3-二醇、抗壞血酸。在較佳實施例中，淬滅劑係丁-2,3-二醇。 在較佳實施例中，經分離之血清型10A多醣係藉由包含以下步驟之製程來活化： (a) 使經分離之血清型10A多醣與過碘酸鹽反應； (b) 藉由添加丁-2,3-二醇淬滅氧化反應，以產生經活化之血清型10A多醣。 在多醣之氧化步驟後，認為該多醣被活化且在下文中稱為「經活化多醣」。 在較佳實施例中，將經活化之血清型10A多醣純化。經活化之血清型10A多醣係根據熟習此項技術者已知之方法來純化，例如凝膠滲透層析(GPC)、透析或超濾/滲濾。舉例而言，使用超濾裝置藉由濃縮及滲濾來純化經活化之10A多醣。 在較佳實施例中，經活化之血清型10A多醣之氧化程度介於2與30之間、介於2與25之間、介於2與20之間、介於2與15之間、介於2與10之間、介於2與5之間、介於5與30之間、介於5與25之間、介於5與20之間、介於5與15之間、介於5與10之間、介於10與30之間、介於10與25之間、介於10與20之間、介於10與15之間、介於15與30之間、介於15與25之間、介於15與20之間、介於20至30之間或介於20至25之間。在較佳實施例中，經活化之血清型10A多醣之氧化程度介於2與10之間、介於4與8之間、介於4與6之間、介於6與8之間、介於6與12之間、介於8與14之間、介於9與11之間、介於10與16之間、介於12與16之間、介於14與18之間、介於16與20之間、介於16與18之間、介於18與22之間或介於18與20之間。 在較佳實施例中，經活化血清型10A多醣之分子量介於50 kDa與400 kDa之間、介於50 kDa與350 kDa之間、介於50 kDa與300 kDa之間、介於50 kDa與250 kDa之間、介於50 kDa與200 kDa之間、介於100 kDa與300 kDa之間、介於100 kDa與250 kDa之間或介於100 kDa與200 kDa之間。在較佳實施例中，經活化血清型10A多醣之分子量介於50 kDa與300 kDa之間。在較佳實施例中，經活化血清型10A多醣之分子量介於100 kDa與200 kDa之間。在較佳實施例中，經活化血清型10A多醣之分子量介於100 kDa與200 kDa之間，且氧化程度介於5與20之間、介於5與15之間、介於8與14之間、介於8與12之間或介於9與11之間。在較佳實施例中，經活化血清型10A多醣之分子量介於100 kDa與200 kDa之間，且氧化程度介於9與11之間。 經活化多醣及/或載體蛋白質可獨立地(分開凍乾)或一起(共凍乾)凍乾(冷凍-乾燥)。 在實施例中，視情況在醣存在下將經活化之血清型10A多醣凍乾。在較佳實施例中，醣係選自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇及益壽糖。在較佳實施例中，醣係蔗糖。在一個實施例中，然後將凍乾之經活化多醣與包含載體蛋白質之溶液複合。 在另一實施例中，將經活化多醣與載體蛋白質共凍乾。在該等實施例中，將經活化之血清型10A多醣與載體蛋白質複合且視情況在醣存在下凍乾。在較佳實施例中，醣係選自蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇及益壽糖。在較佳實施例中，醣係蔗糖。然後可將共凍乾之多醣及載體蛋白質重懸浮於溶液中且與還原劑反應。 結合方法之第二步驟係使用還原劑還原經活化之多醣及載體蛋白質以形成結合物(還原性胺化)。 經活化之血清型10A多醣可藉由包含以下步驟之製程結合至載體蛋白質： (c) 複合經活化之血清型10A多醣與載體蛋白質；及 (d) 使複合的經活化血清型10A多醣及載體蛋白質與還原劑反應，以形成血清型10A多醣-載體蛋白質結合物。 在實施例中還原反應係在水性溶劑中實施，在另一實施例中該反應係在非質子溶劑中實施。在實施例中，還原反應係在DMSO (二甲基亞碸)或DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中實施。DMSO或DMF溶劑可用於再組成已經凍乾之經活化多醣及載體蛋白質。 在實施例中，還原劑係氰基硼氫化鈉、三乙醯氧基硼氫化鈉、在布氏酸或路易斯酸存在下之硼氫化鈉或硼氫化鉀、胺硼烷(例如吡啶硼烷、2-甲吡啶硼烷、2,6-二硼烷-甲醇、二甲基胺-硼烷、t-BuMeiPrN-BH3、苄基胺-BH3或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(PEMB))。在較佳實施例中，還原劑係氰基硼氫化鈉。 在還原反應結束時，在結合物中可存在未反應之剩餘醛基團，可使用適宜封端劑對該等基團進行封端。在一個實施例中，此封端劑係硼氫化鈉(NaBH4 )。 在血清型10A多醣結合至載體蛋白質後，可藉由熟習此項技術者已知之多種技術來純化糖結合物(相對於多醣-蛋白質結合物之量進行富集)。該等技術包括透析、濃縮/滲濾操作、切向流過濾沈澱/溶析、管柱層析(DEAE或疏水相互作用層析)及深度過濾。 在一些實施例中，本發明之血清型10A糖結合物包含分子量介於10 kDa與2,000 kDa之間之醣。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50 kDa與2,000 kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50 kDa與1,750 kDa之間；介於50 kDa與1,500 kDa之間；介於50 kDa與1,250 kDa之間；介於50 kDa與1,000 kDa之間；介於50 kDa與750 kDa之間；介於50 kDa與500 kDa之間；介於100 kDa與2,000 kDa之間；介於100 kDa與1,750 kDa之間；介於100 kDa與1,500 kDa之間；介於100 kDa與1,250 kDa之間；介於100 kDa與1,000 kDa之間；介於100 kDa與750 kDa之間；介於100 kDa與500 kDa之間；介於200 kDa與2,000 kDa之間；介於200 kDa與1,750 kDa之間；介於200 kDa與1,500 kDa之間；介於200 kDa與1,250 kDa之間；介於200 kDa與1,000 kDa之間；介於200 kDa與750 kDa之間；或介於200 kDa與500 kDa之間；或介於200 kDa與400 kDa之間。在一些該等實施例中，血清型10A糖結合物係使用還原性胺化法製備。 在一些實施例中，本發明之血清型10A糖結合物之分子量介於50 kDa與20,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型10A糖結合物之分子量介於50 kDa與15,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型10A糖結合物之分子量介於500 kDa與15,000 kDa之間、介於500 kDa與10,000 kDa之間；介於2,000 kDa與10,000 kDa之間；或介於3,000 kDa與8,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型10A糖結合物之分子量介於1,000 kDa與10,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型10A糖結合物之分子量介於1,000 kDa與8,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型10A糖結合物之分子量介於2,000 kDa與8,000 kDa之間或介於3,000 kDa與7,000 kDa之間。在其他實施例中，本發明之血清型10A糖結合物之分子量介於200 kDa與20,000 kDa之間；介於200 kDa與15,000 kDa之間；介於200 kDa與10,000 kDa之間；介於200 kDa與7,500 kDa之間；介於200 kDa與5,000 kDa之間；介於200 kDa與3,000 kDa之間；介於200 kDa與1,000 kDa之間；介於500 kDa與20,000 kDa之間；介於500 kDa與15,000 kDa之間；介於500 kDa與12,500 kDa之間；介於500 kDa與10,000 kDa之間；介於500 kDa與7,500 kDa之間；介於500 kDa與6,000 kDa之間；介於500 kDa與5,000 kDa之間；介於500 kDa與4,000 kDa之間；介於500 kDa與3,000 kDa之間；介於500 kDa與2,000 kDa之間；介於500 kDa與1,500 kDa之間；介於500 kDa與1,000 kDa之間；介於750 kDa與20,000 kDa之間；介於750 kDa與15,000 kDa之間；介於750 kDa與12,500 kDa之間；介於750 kDa與10,000 kDa之間；介於750 kDa與7,500 kDa之間；介於750 kDa與6,000 kDa之間；介於750 kDa與5,000 kDa之間；介於750 kDa與4,000 kDa之間；介於750 kDa與3,000 kDa之間；介於750 kDa與2,000 kDa之間；介於750 kDa與1,500 kDa之間；介於1,000 kDa與15,000 kDa之間；介於1,000 kDa與12,500 kDa之間；介於1,000 kDa與10,000 kDa之間；介於1,000 kDa與7,500 kDa之間；介於1,000 kDa與6,000 kDa之間；介於1,000 kDa與5,000 kDa之間；介於1,000 kDa與4,000 kDa之間；介於1,000 kDa與2,500 kDa之間；介於2,000 kDa與15,000 kDa之間；介於2,000 kDa與12,500 kDa之間；介於2,000 kDa與10,000 kDa之間；介於2,000 kDa與7,500 kDa之間；介於2,000 kDa與6,000 kDa之間；介於2,000 kDa與5,000 kDa之間；介於2,000 kDa與4,000 kDa之間；或介於2,000 kDa與3,000 kDa之間。 在其他實施例中，本發明血清型10A糖結合物之分子量介於3,000 kDa與20,000 kDa之間；介於3,000 kDa與15,000 kDa之間；介於3,000 kDa與10,000 kDa之間；介於3,000 kDa與7,500 kDa之間；介於3,000 kDa與5,000 kDa之間；介於4,000 kDa與20,000 kDa之間；介於4,000 kDa與15,000 kDa之間；介於4,000 kDa與12,500 kDa之間；介於4,000 kDa與10,000 kDa之間；介於4,000 kDa與7,500 kDa之間；介於4,000 kDa與6,000 kDa之間；或介於4,000 kDa與5,000 kDa之間。在其他實施例中，本發明血清型10A糖結合物之分子量介於5,000 kDa與20,000 kDa之間；介於5,000 kDa與15,000 kDa之間；介於5,000 kDa與10,000 kDa之間或介於5,000 kDa與7,500 kDa之間。在其他實施例中，本發明血清型10A糖結合物之分子量介於6,000 kDa與20,000 kDa之間；介於6,000 kDa與15,000 kDa之間；介於6,000 kDa與10,000 kDa之間或介於6,000 kDa與7,500 kDa之間。在其他實施例中，本發明血清型10A糖結合物之分子量介於7,000 kDa與20,000 kDa之間；介於7,000 kDa與15,000 kDa之間；介於7,000 kDa與10,000 kDa之間或介於7,000 kDa與8,000 kDa之間。在其他實施例中，本發明血清型10A糖結合物之分子量介於8,000 kDa與20,000 kDa之間；介於8,000 kDa與15,000 kDa之間；或介於8,000 kDa與10,000 kDa之間。 涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。糖結合物之分子量係藉由SEC-MALLS來量測。 表徵本發明之血清型10A糖結合物之另一方式係藉助載體蛋白質(例如，CRM197 )中結合至醣之離胺酸殘基數，此可表徵為所結合離胺酸之範圍(結合度)。可使用彼等熟習此項技術者已知之常規方法藉由胺基酸分析獲得因共價連接至多醣所致之載體蛋白質之離胺酸修飾之證據。結合使得與用於產生結合材料之CRM197 蛋白起始材料相比，所回收之離胺酸殘基數減少。 在較佳實施例中，血清型10A糖結合物之結合度介於2與15之間、介於2與13之間、介於2與10之間、介於2與8之間、介於2與6之間、介於2與5之間、介於2與4之間、介於3與15之間、介於3與13之間、介於3與10之間、介於3與8之間、介於3與6之間、介於3與5之間、介於3與4之間、介於5與15之間、介於5與10之間、介於8與15之間、介於8與12之間、介於10與15之間或介於10與12之間。在較佳實施例中，血清型10A糖結合物之結合度介於6與8之間。在較佳實施例中，載體蛋白質係CRM197 。 本發明之血清型10A糖結合物亦可藉由醣對載體載體蛋白質之比率(重量/重量)來表徵。在一些實施例中，醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於0.5與3.0之間(例如，約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9或約3.0)。在較佳實施例中，結合物中血清型10A醣對載體載體蛋白質之比率介於0.5與2.0、0.5與1.5、0.5與1.0、1.0與1.5或1.0與2.0之間。在較佳實施例中，結合物中血清型10A多醣對載體蛋白質之比率介於0.8與1.4之間。在較佳實施例中，結合物中血清型10A莢膜多醣對載體蛋白質之比率介於0.8與1.2之間(例如，約0.8、約0.9約1.0、約1.1或約1.2)。在一些該等實施例中，載體蛋白質係CRM197 。 本發明之血清型10A糖結合物及免疫原組合物可含有不與載體蛋白質共價結合，但仍存在於糖結合物組合物中之游離醣。游離醣可與糖結合物非共價締合(即，非共價連結至該糖結合物中、吸附至該糖結合物中或包埋於該糖結合物中或與其一起包埋)。 在一些實施例中，相對於10A醣之總量，本發明之血清型10A糖結合物包含小於約50%之游離醣、小於約45%之游離醣、小於約40%之游離醣、小於約35%之游離醣、小於約30%之游離醣、小於約25%之游離醣、小於約20%之游離醣、小於約15%之游離醣、小於約10%之游離醣或小於約5%游離醣。較佳地，血清型10A糖結合物包含小於15%游離醣、更佳小於10%游離醣、且仍更佳小於5%之游離醣。 血清型10A糖結合物亦可藉由其分子大小分佈(Kd )來表徵。結合物之相對分子大小分佈可使用粒徑排阻層析介質(CL-4B)來測定，如上文所提及。 在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少30%之本發明血清型10A糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少40%之本發明血清型10A糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%之本發明血清型10A糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少60%之血清型10A糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於50%與80%之間之本發明血清型10A糖結合物之Kd 小於或等於0.3。1.3.7 來自肺炎鏈球菌血清型 11A 之糖結合物 在實施例中，血清型11A糖結合物係藉由以下方式來獲得：使用1-氰基-4-二甲基胺基吡啶鎓四氟磷酸鹽(CDAP)活化多醣以形成氰酸酯。可使經活化之多醣直接或經由間隔體(連接體)基團偶合至載體蛋白質上之胺基。舉例而言，間隔體可為胱胺或半胱胺以獲得硫醇化多醣，該硫醇化多醣可在與馬來醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用GMBS)或鹵乙醯化載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺、SIB、SIAB、磺基-SIAB、SIA或SBAP)反應後經由所獲得之硫醚鍵偶合至載體。較佳地，使氰酸酯(視情況藉由CDAP化學製得)與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且使用碳化二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上之羧基使胺基衍生之醣結合至載體蛋白質。該等結合物闡述於例如WO93/15760、WO 95/08348及WO 96/129094中。 其他適宜技術使用碳化二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多技術闡述於國際專利申請公開案第WO 98/42721號中。結合可涉及可藉由以下方式形成之羰基連接體：使醣之游離羥基與CDI反應(參見Bethell等人(1979). Biol. Chern. 254:2572-2574；Hearn等人(1981) J. Chromatogr. 218:509-518)，然後與蛋白質反應以形成胺基甲酸酯鍵。此可涉及將變旋異構末端還原成一級羥基，對一級羥基實施可選保護/去保護，使一級羥基與CDI反應以形成CDI胺基甲酸酯中間體及使CDI胺基甲酸酯中間體與蛋白質上之胺基偶合。 在較佳實施例中，本發明之血清型11A糖結合物係使用還原性胺化法製備。還原性胺化涉及兩個步驟，(1) 氧化多醣以自個別六醣單元中之鄰二醇產生醛官能基，(2) 還原經活化之多醣及載體蛋白質以形成結合物。 在氧化之前，視情況使血清型11A多醣水解以降低其黏度。可採用機械或化學水解。化學水解可使用乙酸來實施。機械分篩可使用高壓均質化剪切來實施。 氧化步驟可涉及與過碘酸鹽之反應。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸二者；該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO4 - )及原過碘酸鹽(IO6 5- )二者以及過碘酸鹽之多種鹽(例如，過碘酸鈉及過碘酸鉀)。在實施例中，在偏過碘酸鹽存在下、較佳在過碘酸鈉(NaIO4 )存在下氧化來自肺炎鏈球菌血清型11A之莢膜多醣。在另一實施例中，在原過碘酸鹽存在下、較佳在過碘酸存在下氧化來自血清型11A之莢膜多醣。 在多醣之氧化步驟後，認為該多醣被活化且在下文中稱為「經活化多醣」。可將經活化之多醣純化及凍乾(冷凍-乾燥)。 經活化多醣與載體蛋白質可獨立地(分開凍乾)或一起(共凍乾)凍乾(冷凍-乾燥)。在一個實施例中，將經活化多醣與載體蛋白質共凍乾。在另一實施例中，將經活化多醣與載體蛋白質獨立地凍乾。 在一個實施例中，凍乾係在非還原糖存在下進行，可能的非還原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇及益壽糖。 結合方法之第二步驟係使用還原劑還原經活化之多醣及載體蛋白質以形成結合物(還原性胺化)。適宜還原劑包括氰基硼氫化物(例如氰基硼氫化鈉)、硼烷-吡啶或硼氫化物交換樹脂。在一個實施例中，還原劑係氰基硼氫化鈉。 在實施例中還原反應係在水性溶劑中實施，在另一實施例中該反應係在非質子溶劑中實施。在實施例中，還原反應係在DMSO (二甲基亞碸)或DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中實施。DMSO或DMF溶劑可用於再組成已經凍乾之經活化多醣及載體蛋白質。 在一個實施例中，在還原反應中使用介於0.1與3.0莫耳當量之間、介於0.15與2.0莫耳當量之間、介於0.2與2.0莫耳當量之間或介於0.5與1.5莫耳當量之間的氰基硼氫化鈉。在一個實施例中，在還原反應中使用約0.2莫耳當量、0.3莫耳當量、0.4莫耳當量、0.5莫耳當量、0.6莫耳當量、0.7莫耳當量、0.8莫耳當量、0.9莫耳當量、1.0莫耳當量、1.1莫耳當量、1.2莫耳當量、1.3莫耳當量、1.4莫耳當量、1.5莫耳當量、1.6莫耳當量、1.7莫耳當量、1.8莫耳當量、1.9莫耳當量、2.0莫耳當量、2.1莫耳當量、2.2莫耳當量、2.3莫耳當量、2.4莫耳當量、2.5莫耳當量、2.6莫耳當量、2.9莫耳當量或3.0莫耳當量之氰基硼氫化鈉。 在一個實施例中，還原劑係三乙醯氧基硼氫化鈉，在另一實施例中，在還原反應中使用介於1.0與6.0莫耳當量之間、介於2.0與5.0莫耳當量之間或約3.0莫耳當量之三乙醯氧基硼氫化鈉。 在還原反應結束時，在結合物中可存在未反應之剩餘醛基團，可使用適宜封端劑對該等基團進行封端。在一個實施例中，此封端劑係硼氫化鈉(NaBH4 )。在實施例中，封端係藉由混合還原反應物與介於0.5與5.0莫耳當量之間之NaBH4 、例如約1莫耳當量、1.5莫耳當量、2莫耳當量、2.5莫耳當量或3莫耳當量之NaBH4 來達成。 在結合(還原反應並視情況封端)後，可將糖結合物純化。可藉由滲濾及/或離子交換層析及/或粒徑排阻層析來純化糖結合物。在實施例中，糖結合物係藉由滲濾或離子交換層析或粒徑排阻層析來純化。 在一個實施例中，糖結合物經無菌過濾。 在一些實施例中，本發明之血清型11A糖結合物結合至載體蛋白質(例如，CRM197 )且包含分子量介於10 kDa與2,000 kDa之間之醣。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50 kDa與2,000 kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50 kDa與1,750 kDa之間；介於50 kDa與1,500 kDa之間；介於50 kDa與1,250 kDa之間；介於50 kDa與1,000 kDa之間；介於50 kDa與750 kDa之間；介於50 kDa與500 kDa之間；介於50 kDa與400 kDa之間；介於50 kDa與300 kDa之間；介於50 kDa與200 kDa之間；介於50 kDa與100 kDa之間；介於100 kDa與2,000 kDa之間；介於100 kDa與1,750 kDa之間；介於100 kDa與1,500 kDa之間；介於100 kDa與1,250 kDa之間；介於100 kDa與1,000 kDa之間；介於100 kDa與750 kDa之間；介於100 kDa與500 kDa之間；介於100 kDa與400 kDa之間；介於100 kDa與300 kDa之間；介於100 kDa與200 kDa之間；介於200 kDa與2,000 kDa之間；介於200 kDa與1,750 kDa之間；介於200 kDa與1,500 kDa之間；介於200 kDa與1,250 kDa之間；介於200 kDa與1,000 kDa之間；介於200 kDa與750 kDa之間；或介於200 kDa與500 kDa之間；介於200 kDa與400 kDa之間或介於200 kDa與300 kDa之間。 在一些實施例中，本發明之血清型11A糖結合物之分子量介於50 kDa與20,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型11A糖結合物之分子量介於50 kDa與15,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型11A糖結合物之分子量介於500 kDa與10,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型11A糖結合物之分子量介於200 kDa與10,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型11A糖結合物之分子量介於1,000 kDa與8,000 kDa之間或介於2,000 kDa與8,000 kDa之間。 在其他實施例中，本發明之血清型11A糖結合物之分子量介於200 kDa與20,000 kDa之間；介於200 kDa與17,500 kDa之間；介於200 kDa與15,000 kDa之間；介於200 kDa與10,000 kDa之間；介於200 kDa與7,500 kDa之間；介於200 kDa與5,000 kDa之間；介於200 kDa與3,000 kDa之間；介於200 kDa與2,000 kDa之間；介於200 kDa與1,000 kDa之間；介於500 kDa與20,000 kDa之間；介於500 kDa與17,500 kDa之間；介於500 kDa與15,000 kDa之間；介於500 kDa與12,500 kDa之間；介於500 kDa與10,000 kDa之間；介於500 kDa與7,500 kDa之間；介於500 kDa與6,000 kDa之間；介於500 kDa與5,000 kDa之間；介於500 kDa與4,000 kDa之間；介於500 kDa與3,000 kDa之間；介於500 kDa與2,000 kDa之間；介於500 kDa與1,500 kDa之間；介於500 kDa與1,000 kDa之間；介於700 kDa與20,000 kDa之間；介於700 kDa與17,500 kDa之間；介於700 kDa與15,000 kDa之間；介於700 kDa與12,500 kDa之間；介於700 kDa與10,000 kDa之間；介於700 kDa與7,500 kDa之間；介於700 kDa與6,000 kDa之間；介於700 kDa與5,000 kDa之間；介於700 kDa與4,500 kDa之間；介於700 kDa與4,000 kDa之間；介於700 kDa與3,500 kDa之間；介於700 kDa與3,000 kDa之間；介於700 kDa與2,000 kDa之間；介於700 kDa與1,500 kDa之間；介於1,000 kDa與20,000 kDa之間；介於1,000 kDa與17,500 kDa之間；介於1,000 kDa與15,000 kDa之間；介於1,000 kDa與12,500 kDa之間；介於1,000 kDa與10,000 kDa之間；介於1,000 kDa與7,500 kDa之間；介於1,000 kDa與6,000 kDa之間；介於1,000 kDa與5,000 kDa之間；介於1,000 kDa與4,000 kDa之間；介於1,000 kDa與2,500 kDa之間；介於2,000 kDa與20,000 kDa之間；介於2,000 kDa與17,500 kDa之間；介於2,000 kDa與15,000 kDa之間；介於2,000 kDa與12,500 kDa之間；介於2,000 kDa與10,000 kDa之間；介於2,000 kDa與7,500 kDa之間；介於2,000 kDa與6,000 kDa之間；介於2,000 kDa與5,000 kDa之間；介於2,000 kDa與4,000 kDa之間；或介於2,000 kDa與3,000 kDa之間。 在其他實施例中，本發明之血清型11A糖結合物之分子量介於3,000 kDa與20,000 kDa之間；介於3,000 kDa與17,500 kDa之間；介於3,000 kDa與15,000 kDa之間；介於3,000 kDa與10,000 kDa之間；介於3,000 kDa與7,500 kDa之間；介於3,000 kDa與5,000 kDa之間；介於4,000 kDa與20,000 kDa之間；介於4,000 kDa與17,500 kDa之間；介於4,000 kDa與15,000 kDa之間；介於4,000 kDa與12,500 kDa之間；介於4,000 kDa與10,000 kDa之間；介於4,000 kDa與7,500 kDa之間；介於4,000 kDa與6,000 kDa之間；或介於4,000 kDa與5,000 kDa之間。在其他實施例中，本發明之血清型11A糖結合物之分子量介於5,000 kDa與20,000 kDa之間；介於5,000 kDa與17,500 kDa之間；介於5,000 kDa與15,000 kDa之間；介於5,000 kDa與10,000 kDa之間或介於5,000 kDa與7,500 kDa之間。 在實施例中，該等血清型11A糖結合物係使用還原性胺化法製備。 在較佳實施例中，本發明之血清型11A糖結合物包含至少0.3 mM、0.5 mM、0.6 mM、1.0 mM、1.4 mM、1.8 mM、2.2 mM、2.6 mM、3.0 mM、3.4 mM、3.8 mM、4.2 mM、4.6 mM或5 mM乙酸鹽/mM血清型11A多醣。在較佳實施例中，血清型11A糖結合物包含至少1.8 mM、2.2 mM或2.6 mM乙酸鹽/mM血清型11A多醣。在實施例中，糖結合物包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM血清型11A多醣。在較佳實施例中，本發明之血清型11A糖結合物包含至少0.6 mM、1 mM、1.4 mM、1.8 mM、2.2 mM、2.6 mM、3 mM、3.4 mM、3.8 mM、4.2 mM或4.6 mM乙酸鹽/mM血清型11A多醣及小於約5 mM乙酸鹽/mM血清型11A多醣。在實施例中，本發明之血清型11A糖結合物包含至少0.6 mM、1.0 mM、1.4 mM、1.8 mM、2.2 mM、2.6 mM或3.0 mM乙酸鹽/mM血清型11A多醣及小於約3.4 mM乙酸鹽/mM血清型11A多醣。在實施例中，本發明之血清型11A糖結合物包含至少0.6 mM、1 mM、1.4 mM、1.8 mM、2.2 mM、2.6 mM或約3.0 mM乙酸鹽/mM血清型11A多醣及小於約3.3 mM乙酸鹽/mM血清型11A多醣。涵蓋上述數值中之任一者作為本發明之實施例。 在較佳實施例中，血清型11A糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型11A莢膜多醣對經分離多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型11A莢膜多醣的比率係至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。在較佳實施例中，血清型11A糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型11A莢膜多醣對經分離多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型11A莢膜多醣的比率係至少0.7。在較佳實施例中，血清型11A糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型11A莢膜多醣對經分離多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型11A莢膜多醣的比率係至少0.9。在較佳實施例中，藉由離子-HPLC分析測定O-乙醯基之存在。 在較佳實施例中，血清型11A糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型11A莢膜多醣對經活化多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型11A莢膜多醣的比率係至少0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95。在較佳實施例中，血清型11A糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型11A莢膜多醣對經活化多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型11A莢膜多醣的比率係至少0.7。在較佳實施例中，血清型11A糖結合物中之mM乙酸鹽/mM血清型11A莢膜多醣對經活化多醣中之mM乙酸鹽/mM血清型11A莢膜多醣的比率係至少0.9。在較佳實施例中，藉由離子-HPLC分析測定O-乙醯基之存在。 在較佳實施例中，本發明之血清型11A糖結合物包含至少0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM或1.0 mM甘油/mM血清型11A多醣。在較佳實施例中，血清型11A糖結合物包含至少0.2 mM、0.3 mM或0.4 mM甘油/mM血清型11A多醣。在較佳實施例中，本發明之血清型11A糖結合物包含至少0.1 mM、0.2 mM、0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM或0.9 mM甘油/mM血清型11A多醣及小於約1.0 mM甘油/mM血清型11A多醣。在較佳實施例中，本發明之血清型11A糖結合物包含至少0.3 mM、0.4 mM、0.5 mM、0.6 mM或0.7 mM甘油/mM血清型11A多醣及小於約0.8 mM甘油/mM血清型11A多醣。涵蓋上述數值中之任一者作為本發明之實施例。 表徵本發明血清型11A糖結合物之另一方式係藉助載體蛋白質(例如，CRM197 )中結合至醣之離胺酸殘基數，此可表徵為所結合離胺酸之範圍(結合度)。 可使用彼等熟習此項技術者已知之常規方法藉由胺基酸分析獲得因共價連接至多醣所致之載體蛋白質之離胺酸修飾之證據。結合使得與用於產生結合材料之CRM197 蛋白起始材料相比，所回收之離胺酸殘基數減少。 在較佳實施例中，本發明血清型11A糖結合物之結合度介於1與15之間、介於1與13之間、介於1與10之間、介於1與8之間、介於1與6之間、介於1與5之間、介於1與4之間、介於2與15之間、介於2與13之間、介於2與10之間、介於2與8之間、介於2與6之間、介於2與5之間、介於2與4之間、介於5與15之間、介於5與10之間、介於8與15之間、介於8與12之間、介於10與15之間或介於10與12之間。在實施例中，本發明血清型11A糖結合物之結合度為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14或約15。在較佳實施例中，本發明血清型11A糖結合物之結合度介於1與6之間或介於2與5之間。在一些該等實施例中，載體蛋白質係CRM197 。 本發明之血清型11A糖結合物亦可藉由醣對載體載體蛋白質之比率(重量/重量)來表徵。在一些實施例中，醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於0.2與4之間(例如，約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9或約4.0)。在其他實施例中，醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於0.7與2.5之間、介於0.8與2.0之間、介於0.7與2.0之間、介於0.8與1.5之間、介於0.7與1.5、0.7與1.4之間、介於0.8與1.4之間、介於0.7與1.45之間或介於0.8與1.45之間。在其他實施例中，醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於0.8與1.6之間(例如，約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5或約1.6)。在一些該等實施例中，載體蛋白質係CRM197 。在實施例中，該等血清型11A糖結合物係使用還原性胺化法製備。 本發明之血清型11A糖結合物及免疫原組合物可含有不與載體蛋白質共價結合，但仍存在於糖結合物組合物中之游離醣。游離醣可與糖結合物非共價締合(即，非共價連結至該糖結合物中、吸附至該糖結合物中或包埋於該糖結合物中或與其一起包埋)。 在一些實施例中，本發明之血清型11A糖結合物包含與血清型11A莢膜多醣之總量相比小於約50%之游離血清型11A莢膜多醣、小於約45%之游離醣、小於約40%之游離醣、小於約35%之游離醣、小於約30%之游離醣、小於約25%之游離醣、小於約20%之游離醣、小於約15%之游離醣、小於約10%之游離醣或與血清型11A莢膜多醣之總量相比小於約5%之游離血清型11A莢膜多醣。較佳地，血清型11A糖結合物包含小於15%游離醣、更佳小於10%游離醣、且仍更佳小於5%之游離醣。 血清型11A糖結合物亦可藉由其分子大小分佈(Kd )來表徵。結合物之相對分子大小分佈可使用粒徑排阻層析介質(CL-4B)來測定，如上文所提及。 在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少30%之本發明血清型11A糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%之本發明血清型11A糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少60%之本發明血清型11A糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少65%之本發明血清型11A糖結合物之Kd 小於或等於0.3。1.3.8 來自肺炎鏈球菌血清型 8 之糖結合物 在實施例中，血清型8糖結合物係藉由以下方式來獲得：使用1-氰基-4-二甲基胺基吡啶鎓四氟磷酸鹽(CDAP)活化多醣以形成氰酸酯。可使經活化之多醣直接或經由間隔體(連接體)基團偶合至載體蛋白質上之胺基。舉例而言，間隔體可為胱胺或半胱胺以獲得硫醇化多醣，該硫醇化多醣可在與馬來醯亞胺活化之載體蛋白質(例如使用GMBS)或鹵乙醯化載體蛋白質(例如使用碘乙醯亞胺、SIB、SIAB、磺基-SIAB、SIA或SBAP)反應後經由所獲得之硫醚鍵偶合至載體。較佳地，使氰酸酯(視情況藉由CDAP化學製得)與己二胺或己二酸二醯肼(ADH)偶合，且使用碳化二亞胺(例如EDAC或EDC)化學經由蛋白質載體上之羧基使胺基衍生之醣結合至載體蛋白質。該等結合物闡述於例如WO93/15760、WO 95/08348及WO 96/129094中。 其他適宜技術使用碳化二亞胺、醯肼、活性酯、降莰烷、對-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀醯亞胺、S-NHS、EDC、TSTU。許多技術闡述於國際專利申請公開案第WO 98/42721號中。結合可涉及可藉由以下方式形成之羰基連接體：使醣之游離羥基與CDI反應(參見Bethell等人(1979) J. Biol. Chern. 254:2572-2574；Hearn等人(1981) J. Chromatogr. 218:509-518)，然後與蛋白質反應以形成胺基甲酸酯鍵。此可涉及將變旋異構末端還原成一級羥基，對一級羥基實施可選保護/去保護，使一級羥基與CDI反應以形成CDI胺基甲酸酯中間體及使CDI胺基甲酸酯中間體與蛋白質上之胺基偶合。 在較佳實施例中，本發明之血清型8糖結合物係使用還原性胺化法製備。還原性胺化涉及兩個步驟，(1) 氧化多醣以自個別六醣單元中之鄰二醇產生醛官能基，(2) 還原經活化之多醣及載體蛋白質以形成結合物。 在氧化之前，視情況使血清型8多醣水解以降低其黏度。可採用機械或化學水解。化學水解可使用乙酸來實施。 氧化步驟可涉及與過碘酸鹽之反應。出於本發明之目的，術語「過碘酸鹽」包括過碘酸鹽及過碘酸二者；該術語亦包括偏過碘酸鹽(IO4 - )及原過碘酸鹽(IO6 5- )二者以及過碘酸鹽之多種鹽(例如，過碘酸鈉及過碘酸鉀)。在實施例中，在偏過碘酸鹽存在下、較佳在過碘酸鈉(NaIO4 )存在下氧化來自肺炎鏈球菌血清型8之莢膜多醣。在另一實施例中，在原過碘酸鹽存在下、較佳在過碘酸存在下氧化來自血清型8之莢膜多醣。 在多醣之氧化步驟後，認為該多醣被活化且在下文中稱為「經活化多醣」。可將經活化之多醣純化及凍乾(冷凍-乾燥)。 經活化多醣與載體蛋白質可獨立地(分開凍乾)或一起(共凍乾)凍乾(冷凍-乾燥)。在一個實施例中，將經活化多醣與載體蛋白質共凍乾。在另一實施例中，將經活化多醣與載體蛋白質獨立地凍乾。 在一個實施例中，凍乾係在非還原糖存在下進行，可能的非還原糖包括蔗糖、海藻糖、棉子糖、水蘇糖、松三糖、聚葡萄糖、甘露醇、乳糖醇及益壽糖。 結合方法之第二步驟係使用還原劑還原經活化之多醣及載體蛋白質以形成結合物(還原性胺化)。適宜還原劑包括氰基硼氫化物(例如氰基硼氫化鈉)、硼烷-吡啶或硼氫化物交換樹脂。在一個實施例中，還原劑係氰基硼氫化鈉。 在實施例中還原反應係在水性溶劑中實施，在另一實施例中該反應係在非質子溶劑中實施。在實施例中，還原反應係在DMSO (二甲基亞碸)或DMF (二甲基甲醯胺)溶劑中實施。DMSO或DMF溶劑可用於再組成已經凍乾之經活化多醣及載體蛋白質。 在一個實施例中，在還原反應中使用介於0.1與3.0莫耳當量之間、介於0.15與2.0莫耳當量之間、介於0.2與1.0莫耳當量之間或介於0.25與0.5莫耳當量之間的氰基硼氫化鈉。在一個實施例中，在還原反應中使用約0.2莫耳當量、0.3莫耳當量、0.4莫耳當量、0.5莫耳當量、0.6莫耳當量、0.7莫耳當量、0.8莫耳當量、0.9莫耳當量、1.0莫耳當量、1.1莫耳當量、1.2莫耳當量、1.3莫耳當量、1.4莫耳當量、1.5莫耳當量、1.6莫耳當量、1.7莫耳當量、1.8莫耳當量、1.9莫耳當量、2.0莫耳當量、2.1莫耳當量、2.2莫耳當量、2.3莫耳當量、2.4莫耳當量、2.5莫耳當量、2.6莫耳當量、2.9莫耳當量或3.0莫耳當量之氰基硼氫化鈉。 在一個實施例中，還原劑係三乙醯氧基硼氫化鈉。在另一實施例中，在還原反應中使用介於1.0與6.0莫耳當量之間、介於2.0與5.0莫耳當量之間或約3.0莫耳當量之三乙醯氧基硼氫化鈉。 在還原反應結束時，在結合物中可存在未反應之剩餘醛基團，可使用適宜封端劑對該等基團進行封端。在一個實施例中，此封端劑係硼氫化鈉(NaBH4 )。在實施例中，封端係藉由混合還原反應物與介於0.5與5.0莫耳當量之間之NaBH4 、例如約1.0莫耳當量、1.5莫耳當量、2.0莫耳當量、2.5莫耳當量或3.0莫耳當量之NaBH4 來達成。 在結合(還原反應並視情況封端)後，可將糖結合物純化。可藉由滲濾及/或離子交換層析及/或粒徑排阻層析來純化糖結合物。在實施例中，糖結合物係藉由滲濾或離子交換層析或粒徑排阻層析來純化。 在一個實施例中，糖結合物經無菌過濾。 在一些實施例中，本發明之血清型8糖結合物結合至載體蛋白質(例如，CRM197 )且包含分子量介於10 kDa與2,000 kDa之間之醣。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50 kDa與2,000 kDa之間。在其他該等實施例中，醣之分子量介於50 kDa與1,750 kDa之間；介於50 kDa與1,500 kDa之間；介於50 kDa與1,250 kDa之間；介於50 kDa與1,000 kDa之間；介於50 kDa與750 kDa之間；介於50 kDa與500 kDa之間；介於100 kDa與2,000 kDa之間；介於100 kDa與1,750 kDa之間；介於100 kDa與1,500 kDa之間；介於100 kDa與1,250 kDa之間；介於100 kDa與1,000 kDa之間；介於100 kDa與750 kDa之間；介於100 kDa與500 kDa之間；介於200 kDa與2,000 kDa之間；介於200 kDa與1,750 kDa之間；介於200 kDa與1,500 kDa之間；介於200 kDa與1,250 kDa之間；介於200 kDa與1,000 kDa之間；介於200 kDa與750 kDa之間；或介於200 kDa與500 kDa之間；或介於200 kDa與400 kDa之間。在實施例中，該等血清型8糖結合物係使用還原性胺化法製備。 在一些實施例中，本發明之血清型8糖結合物之分子量介於50 kDa與20,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型8糖結合物之分子量介於50 kDa與15,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型8糖結合物之分子量介於500 kDa與10,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型8糖結合物之分子量介於200 kDa與10,000 kDa之間。在其他實施例中，血清型8糖結合物之分子量介於1,000 kDa與8,000 kDa之間或介於2,000 kDa與8,000 kDa之間。 在其他實施例中，本發明之血清型8糖結合物之分子量介於200 kDa與20,000 kDa之間；介於200 kDa與15,000 kDa之間；介於200 kDa與10,000 kDa之間；介於200 kDa與7,500 kDa之間；介於200 kDa與5,000 kDa之間；介於200 kDa與3,000 kDa之間；介於200 kDa與1,000 kDa之間；介於500 kDa與20,000 kDa之間；介於500 kDa與15,000 kDa之間；介於500 kDa與12,500 kDa之間；介於500 kDa與10,000 kDa之間；介於500 kDa與7,500 kDa之間；介於500 kDa與6,000 kDa之間；介於500 kDa與5,000 kDa之間；介於500 kDa與4,000 kDa之間；介於500 kDa與3,000 kDa之間；介於500 kDa與2,000 kDa之間；介於500 kDa與1,500 kDa之間；介於500 kDa與1,000 kDa之間；介於750 kDa與20,000 kDa之間；介於750 kDa與15,000 kDa之間；介於750 kDa與12,500 kDa之間；介於750 kDa與10,000 kDa之間；介於750 kDa與7,500 kDa之間；介於750 kDa與6,000 kDa之間；介於750 kDa與5,000 kDa之間；介於750 kDa與4,000 kDa之間；介於750 kDa與3,000 kDa之間；介於750 kDa與2,000 kDa之間；介於750 kDa與1,500 kDa之間；介於1,000 kDa與15,000 kDa之間；介於1,000 kDa與12,500 kDa之間；介於1,000 kDa與10,000 kDa之間；介於1,000 kDa與7,500 kDa之間；介於1,000 kDa與6,000 kDa之間；介於1,000 kDa與5,000 kDa之間；介於1,000 kDa與4,000 kDa之間；介於1,000 kDa與2,500 kDa之間；介於2,000 kDa與15,000 kDa之間；介於2,000 kDa與12,500 kDa之間；介於2,000 kDa與10,000 kDa之間；介於2,000 kDa與7,500 kDa之間；介於2,000 kDa與6,000 kDa之間；介於2,000 kDa與5,000 kDa之間；介於2,000 kDa與4,000 kDa之間；或介於2,000 kDa與3,000 kDa之間。 在其他實施例中，本發明血清型8糖結合物之分子量介於3,000 kDa與20,000 kDa之間；介於3,000 kDa與15,000 kDa之間；介於3,000 kDa與10,000 kDa之間；介於3,000 kDa與7,500 kDa之間；介於3,000 kDa與5,000 kDa之間；介於4,000 kDa與20,000 kDa之間；介於4,000 kDa與15,000 kDa之間；介於4,000 kDa與12,500 kDa之間；介於4,000 kDa與10,000 kDa之間；介於4,000 kDa與7,500 kDa之間；介於4,000 kDa與6,000 kDa之間；或介於4,000 kDa與5,000 kDa之間。在其他實施例中，本發明血清型8糖結合物之分子量介於5,000 kDa與20,000 kDa之間；介於5,000 kDa與15,000 kDa之間；介於5,000 kDa與10,000 kDa之間或介於5,000 kDa與7,500 kDa之間。在其他實施例中，本發明血清型8糖結合物之分子量介於6,000 kDa與20,000 kDa之間；介於6,000 kDa與15,000 kDa之間；介於6,000 kDa與10,000 kDa之間或介於6,000 kDa與7,500 kDa之間。 在其他實施例中，本發明血清型8糖結合物之分子量介於7,000 kDa與20,000 kDa之間；介於7,000 kDa與15,000 kDa之間；介於7,000 kDa與10,000 kDa之間或介於7,000 kDa與8,000 kDa之間。在其他實施例中，本發明血清型8糖結合物之分子量介於8,000 kDa與20,000 kDa之間；介於8,000 kDa與15,000 kDa之間；或介於8,000 kDa與10,000 kDa之間。 在實施例中，該等血清型8糖結合物係使用還原性胺化法製備。 表徵本發明血清型8糖結合物之另一方式係藉助載體蛋白質(例如，CRM197 )中結合至醣之離胺酸殘基數，此可表徵為所結合離胺酸之範圍(結合度)。 可使用彼等熟習此項技術者已知之常規方法藉由胺基酸分析獲得因共價連接至多醣所致之載體蛋白質之離胺酸修飾之證據。在常見實施例中，載體蛋白質經由與載體蛋白質上之離胺酸殘基之一或多個ε-胺基的胺鍵共價結合至經活化多醣。在一些該等實施例中，載體蛋白質包含2至20個共價結合至醣之離胺酸殘基。在其他該等實施例中，載體蛋白質包含4至16個或6至14個共價結合至醣之離胺酸殘基。 在較佳實施例中，本發明血清型8糖結合物之結合度介於2與20之間、介於2與15之間、介於2與13之間,介於2與10之間、介於2與8之間、介於2與6之間、介於2與5之間、介於2與4之間、介於3與15之間、介於3與13之間、介於3與10之間、介於3與8之間、介於3與6之間、介於3與5之間、介於3與4之間、介於5與15之間、介於5與10之間、介於8與15之間、介於8與12之間、介於10與15之間或介於10與12之間。在實施例中，本發明血清型8糖結合物之結合度為約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14或約15。在較佳實施例中，本發明血清型8糖結合物之結合度介於4與16之間或介於6與14之間。在一些該等實施例中，載體蛋白質係CRM197 。 在較佳實施例中，載體蛋白質包含含有39個離胺酸殘基之CRM197 。在一些該等實施例中，在CRM197 所包含之39個離胺酸殘基中可有介於4個與16個之間或介於6個與14個之間共價連接至醣。表示此參數之另一方式係約10%至約41%或約15%至約36%之CRM197 離胺酸共價連接至醣。在另一該實施例中，在CRM197 所包含之39個離胺酸殘基中可有2至20個共價連接至醣。表示此參數之另一方式係約5%至約50%之CRM197 離胺酸共價連接至醣。在一些該等實施例中，在CRM197 所包含之39個離胺酸殘基中可有約4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個或16個共價連接至醣。 本發明之血清型8糖結合物亦可藉由醣對載體載體蛋白質之比率(重量/重量)來表徵。在一些實施例中，醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於0.2與4.0之間(例如，約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9或約4.0)。在其他實施例中，醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於0.7與2.5之間。在其他實施例中，醣對載體載體蛋白質比率(w/w)介於0.8與1.5之間(例如，約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4或約1.5)。在一些該等實施例中，載體蛋白質係CRM197 。在實施例中，該等血清型8糖結合物係使用還原性胺化法製備。 本發明之血清型8糖結合物及免疫原組合物可含有不與載體蛋白質共價結合，但仍存在於糖結合物組合物中之游離醣。游離醣可與糖結合物非共價締合(即，非共價連結至該糖結合物中、吸附至該糖結合物中或包埋於該糖結合物中或與其一起包埋)。 在一些實施例中，相對於血清型8醣之總量，本發明之血清型8糖結合物包含小於約50%之游離醣、小於約45%之游離醣、小於約40%之游離醣、小於約35%之游離醣、小於約30%之游離醣、小於約25%之游離醣、小於約20%之游離醣、小於約15%之游離醣、小於約10%之游離醣或小於約5%之游離醣。較佳地，血清型8糖結合物包含小於15%游離醣、更佳小於10%游離醣、且仍更佳小於5%之游離醣。 血清型8糖結合物亦可藉由其分子大小分佈(Kd )來表徵。結合物之相對分子大小分佈可使用粒徑排阻層析介質(CL-4B)來測定。將粒徑排阻層析(SEC)用於重力進料管柱中以剖析結合物之分子大小分佈。自介質中之孔排阻之大分子比小分子溶析更快速。使用部分收集器來收集管柱溶析物。藉由醣分析以比色方式測試該等部分。為測定Kd ，對管柱進行校準以確立分子被完全排阻時之部分(V0 ) (Kd =0)及代表最大滯留之部分(Vi ) (Kd =1)。達到指定樣品屬性時之部分(Ve )與Kd 相關，表示為Kd = (Ve - V0 )/ (Vi - V0 )。 在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少40%之本發明血清型8糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%之本發明血清型8糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少60%之本發明血清型8糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，至少70%之本發明血清型8糖結合物之Kd 小於或等於0.3。 在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於40%與90%之間之血清型8糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於50%與90%之間之血清型8糖結合物之Kd 小於或等於0.3。在較佳實施例中，在CL-4B管柱中，介於65%與80%之間之血清型8糖結合物之Kd 小於或等於0.3。1.4 本發明糖結合物之組合 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含本文所揭示之任一糖結合物。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種選自由以下組成之群之糖結合物：來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)、來自肺炎鏈球菌血清型22F之糖結合物(例如上述部分1.3.2之糖結合物)、來自肺炎鏈球菌血清型33F之糖結合物(例如上述部分1.3.3之糖結合物)、來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物(例如上述部分1.3.5之糖結合物)、來自肺炎鏈球菌血清型10A之糖結合物(例如上述部分1.3.6之糖結合物)、來自肺炎鏈球菌血清型11A之糖結合物(例如上述部分1.3.7之糖結合物)及來自肺炎鏈球菌血清型8之糖結合物(例如上述部分1.3.8之糖結合物)。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物，例如上述部分1.3.4之糖結合物。在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型22F之糖結合物，例如揭示於上述部分1.3.2中者。在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型33F之糖結合物，例如揭示於上述部分1.3.3中者。在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物，例如揭示於上述部分1.3.5中者。在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型10A之糖結合物，例如揭示於上述部分1.3.6中者。在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型11A之糖結合物，例如揭示於上述部分1.3.7中者。在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型8之糖結合物，例如揭示於上述部分1.3.8中者。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種具有選自由以下組成之群之兩種肺炎鏈球菌血清型中之每一者的糖結合物：15B及22F、15B及33F、15B及12F、15B及10A、15B及11A、15B及8、22F及33F、22F及12F、22F及10A、22F及11A、22F及8、33F及12F、33F及10A、33F及11A、33F及8、12F及10A、12F及11A、12F及8、10A及11A、10A及8以及11A及8。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種以下三種肺炎鏈球菌血清型中之每一者的糖結合物： 15B及22F及33F， 15B及22F及12F， 15B及22F及10A， 15B及22F及11A， 15B及22F及8， 15B及33F及12F， 15B及33F及10A， 15B及33F及11A， 15B及33F及8， 15B及12F及10A， 15B及12F及11A， 15B及12F及8， 15B及10A及11A， 15B及10A及8， 15B及11A及8， 22F及33F及12F， 22F及33F及10A， 22F及33F及11A， 22F及33F及8， 22F及12F及10A， 22F及12F及11A， 22F及12F及8， 22F及10A及11A， 22F及10A及8， 22F及11A及8， 33F及12F及10A， 33F及12F及11A， 33F及12F及8， 33F及10A及11A， 33F及10A及8， 33F及11A及8， 12F及10A及11A， 12F及10A及8， 12F及11A及8，或 10A及11A及8。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種以下四種肺炎鏈球菌血清型中之每一者的糖結合物： 15B及22F及33F及12F， 15B及22F及33F及10A， 15B及22F及33F及11A， 15B及22F及33F及8， 15B及22F及12F及10A， 15B及22F及12F及11A， 15B及22F及12F及8， 15B及22F及10A及11A， 15B及22F及10A及8， 15B及22F及11A及8， 15B及33F及12F及10A， 15B及33F及12F及11A， 15B及33F及12F及8， 15B及33F及10A及11A， 15B及33F及10A及8， 15B及33F及11A及8， 15B及12F及10A及11A， 15B及12F及10A及8， 15B及12F及11A及8， 15B及10A及11A及8， 22F及33F及12F及10A， 22F及33F及12F及11A， 22F及33F及12F及8， 22F及33F及10A及11A， 22F及33F及10A及8， 22F及33F及11A及8， 22F及12F及10A及11A， 22F及12F及10A及8， 22F及12F及11A及8， 22F及10A及11A及8， 33F及12F及10A及11A， 33F及12F及10A及8， 33F及12F及11A及8， 33F及10A及11A及8，或 12F及10A及11A及8。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種以下五種肺炎鏈球菌血清型中之每一者的糖結合物： 15B及22F及33F及12F及10A， 15B及22F及33F及12F及11A， 15B及22F及33F及12F及8， 15B及22F及33F及10A及11A， 15B及22F及33F及10A及8， 15B及22F及33F及11A及8， 15B及22F及12F及10A及11A， 15B及22F及12F及10A及8， 15B及22F及12F及11A及8， 15B及22F及10A及11A及8， 15B及33F及12F及10A及11A， 15B及33F及12F及10A及8， 15B及33F及12F及11A及8， 15B及33F及10A及11A及8， 15B及12F及10A及11A及8， 22F及33F及12F及10A及11A， 22F及33F及12F及10A及8， 22F及33F及12F及11A及8， 22F及33F及10A及11A及8， 22F及12F及10A及11A及8，或 33F及12F及10A及11A及8。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種以下六種肺炎鏈球菌血清型中之每一者的糖結合物： 15B及22F及33F及12F及10A及11A， 15B及22F及33F及12F及10A及8， 15B及22F及33F及12F及11A及8， 15B及22F及33F及10A及11A及8， 15B及22F及12F及10A及11A及8， 15B及33F及12F及10A及11A及8，或 22F及33F及12F及10A及11A及8。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種以下七種肺炎鏈球菌血清型中之每一者的糖結合物：15B及22F及33F及12F及10A及11A及8。 在實施例中，此部分中所定義之任一免疫原組合物之來自肺炎鏈球菌血清型15B、22F、33F、12F、10A、11A及/或8之糖結合物係如上述部分1.3.2至1.3.8中所揭示。 在實施例中，上述任一免疫原組合物另外包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之糖結合物(例如上述部分1.3.1之糖結合物)。 在實施例中，上述任一免疫原組合物另外包含來自肺炎鏈球菌血清型1、5及7F之糖結合物(例如上述部分1.3.1之糖結合物)。 在實施例中，上述任一免疫原組合物另外包含來自肺炎鏈球菌血清型6A及19A之糖結合物(例如上述部分1.3.1之糖結合物)。 在實施例中，上述任一免疫原組合物另外包含來自肺炎鏈球菌血清型3之糖結合物(例如上述部分1.3.1之糖結合物)。 較佳地，上述免疫原組合物之所有糖結合物皆個別地結合至載體蛋白質。 在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型22F之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型33F之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型10A之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型11A之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型8之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型1、5及7F之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型6A及19A之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之糖結合物結合至CRM197 。 在實施例中，任一上述免疫原組合物之糖結合物皆個別地結合至CRM197 。 在實施例中，任一上述免疫原組合物之來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及/或23F之糖結合物個別地結合至PD。 在實施例中，任一上述免疫原組合物之來自肺炎鏈球菌血清型18C之糖結合物結合至TT。 在實施例中，任一上述免疫原組合物之來自肺炎鏈球菌血清型19F之糖結合物結合至DT。 在實施例中，任一上述免疫原組合物之來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及/或23F之糖結合物個別地結合至PD，來自肺炎鏈球菌血清型18C之糖結合物結合至TT，且來自肺炎鏈球菌血清型19F之糖結合物結合至DT。 在實施例中，上述免疫原組合物包含肺炎鏈球菌之8至20種不同血清型。在一個實施例中，上述免疫原組合物包含來自12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種或20種不同血清型之糖結合物。在一個實施例中，上述免疫原組合物包含來自16種或20種不同血清型之糖結合物。 在實施例中，上述免疫原組合物係8價、9價、10價、11價、12價、13價、14價、15價、16價、17價、18價、19價或20價肺炎球菌結合物組合物。在實施例中，上述免疫原組合物係14價、15價、16價、17價、18價或19價肺炎球菌結合物組合物。在實施例中，上述免疫原組合物係16價肺炎球菌結合物組合物。在實施例中，上述免疫原組合物係19價肺炎球菌結合物組合物。 1. 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物，例如上述部分1.3.4之糖結合物。 2. 在另一實施例中，本發明之免疫原組合物除上述第1點外包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型22F之糖結合物，例如揭示於上述部分1.3.2中者。 3. 在另一實施例中，本發明之免疫原組合物除上述第1點或第2點外包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型33F之糖結合物，例如揭示於上述部分1.3.3中者。 4. 在另一實施例中，本發明之免疫原組合物除上述第1、第2或第3點外包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物，例如揭示於上述部分1.3.5中者。 5. 在另一實施例中，本發明之免疫原組合物除上述第1、第2、第3或第4點外包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型10A之糖結合物，例如揭示於上述部分1.3.6中者。 6. 在另一實施例中，本發明之免疫原組合物除上述第1、第2、第3、第4或第5點外包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型11A之糖結合物，例如揭示於上述部分1.3.7中者。 7. 在另一實施例中，本發明之免疫原組合物除上述第1、第2、第3、第4、第5或第6點外包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型8之糖結合物，例如揭示於上述部分1.3.8中者。 8. 在另一實施例中，本發明之免疫原組合物除上述第1、第2、第3、第4、第5、第6或第7點外包含來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之糖結合物，例如上述部分1.3.1之糖結合物。 9. 在另一實施例中，本發明之免疫原組合物除上述第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7或第8點外包含來自肺炎鏈球菌血清型1、5及7F之糖結合物，例如上述部分1.3.1之糖結合物。 10. 在另一實施例中，本發明之免疫原組合物除上述第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8或第9點外包含來自肺炎鏈球菌血清型6A及19A之糖結合物，例如上述部分1.3.1之糖結合物。 11. 在另一實施例中，本發明之免疫原組合物除上述第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9或第10點外包含來自肺炎鏈球菌血清型3之糖結合物，例如上述部分1.3.1之糖結合物。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖結合物。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖結合物。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含來自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之結合之肺炎鏈球菌醣。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含來自血清型1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之結合之肺炎鏈球菌醣。 在實施例中，本發明免疫原組合物之糖結合物係由來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖結合物組成。在實施例中，本發明免疫原組合物之糖結合物係由來自血清型1、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖結合物組成。在實施例中，本發明免疫原組合物之糖結合物係由來自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖結合物組成。在實施例中，本發明免疫原組合物之糖結合物係由來自1、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖結合物組成。 較佳地，本發明免疫原組合物之所有糖結合物(例如，上述第1點至第11點中之任一者)個別地結合至載體蛋白質。 在實施例中，上述第8點至第11點中任一者之來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及/或23F之糖結合物個別地結合至PD。 在實施例中，上述第8點至第11點中任一者之來自肺炎鏈球菌血清型18C之糖結合物結合至TT。 在實施例中，上述第8點至第11點中任一者之來自肺炎鏈球菌血清型19F之糖結合物結合至DT。 在上述第8點至第11點中任一者之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及/或23F之糖結合物個別地結合至PD，來自肺炎鏈球菌血清型18C之糖結合物結合至TT，且來自肺炎鏈球菌血清型19F之糖結合物結合至DT。 在上述第1點至第11點中任一者之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型22F之糖結合物結合至CRM197 。在上述第2點至第11點中任一者之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型33F之糖結合物結合至CRM197 。在上述第3點至第11點中任一者之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物結合至CRM197 。在上述第4點至第11點中任一者之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物結合至CRM197 。在上述第5點至第11點中任一者之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型10A之糖結合物結合至CRM197 。在上述第6點至第11點中任一者之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型11A之糖結合物結合至CRM197 。在上述第7點至第11點中任一者之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型8之糖結合物結合至CRM197 。在上述第8點至第11點中任一者之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之糖結合物結合至CRM197 。在上述第9點至第11點中任一者之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型1、5及7F之糖結合物結合至CRM197 。在上述第10點至第11點中任一者之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型6A及19A之糖結合物結合至CRM197 。在上述第11點之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之糖結合物結合至CRM197 。 在實施例中，上述第1至第11點之免疫原組合物之糖結合物個別地結合至CRM197 。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含肺炎鏈球菌之12至20種不同血清型。在一個實施例中，本發明之免疫原組合物包含來自12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種或20種不同血清型之糖結合物。在一個實施例中，本發明之免疫原組合物包含來自16種或20種不同血清型之糖結合物。 在實施例中，上述第1點至第11點之免疫原組合物係8價、9價、10價、11價、12價、13價、14價、15價、16價、17價、18價、19價或20價肺炎球菌結合物組合物。在實施例中，上述第1點至第11點之免疫原組合物係15價、16價、17價、18價或19價肺炎球菌結合物組合物。在實施例中，上述第1點至第11點之免疫原組合物係16價肺炎球菌結合物組合物。在實施例中，上述第1點至第11點之免疫原組合物係19價肺炎球菌結合物組合物。 使莢膜多醣與載體蛋白質結合後，可藉由多種技術來純化糖結合物(相對於多醣-蛋白質結合物之量進行富集)。該等技術包括濃縮/滲濾操作、沈澱/溶析、管柱層析及深度過濾(例如，參見美國專利申請公開案第2007/0184072號或第WO2008/079653號)。在將個別糖結合物純化後，使其複合以調配本發明之免疫原組合物。1.5 本發明糖結合物之其他組合 在實施例中，上述部分1.4中所定義之任一免疫原組合物進一步包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型9V之糖結合物。 在實施例中，上述部分1.4中所定義之任一免疫原組合物進一步包含至少一種具有選自由以下組成之群之兩種肺炎鏈球菌血清型中之每一者的糖結合物：9V及4、9V及6B、9V及14、9V及18C、9V及19F、9V及23F。 在實施例中，上述部分1.4中所定義之任一免疫原組合物進一步包含至少一種以下七種肺炎鏈球菌血清型中之每一者之糖結合物：9V、4、6B、14、18C、19F及23F。 在實施例中，上述部分1.4中所定義之任一免疫原組合物進一步包含至少一種以下八種肺炎鏈球菌血清型中之每一者的糖結合物： 9V及1及4及6B及14及18C及19F及23F， 9V及4及5及6B及14及18C及19F及23F，或 9V及4及6B及7F及14及18C及19F及23F。 在實施例中，上述部分1.4中所定義之任一免疫原組合物進一步包含至少一種以下十種肺炎鏈球菌血清型中之每一者的糖結合物：9V、1、5、4、6B、7F、14、18C、19F及23F。 在實施例中，上述部分1.4中所定義之任一免疫原組合物進一步包含至少一種以下11種肺炎鏈球菌血清型中之每一者的糖結合物： 9V及1及4及5及6A及6B及7F及14及18C及19F及23F，或 9V及1及4及5及6B及7F及14及18C及19A及19F及23F。 在實施例中，上述部分1.4中所定義之任一免疫原組合物進一步包含至少一種以下12種肺炎鏈球菌血清型中之每一者的糖結合物：9V、1、4、5、6A、6B、7F、14、18C、19A、19F及23F。 在實施例中，上述部分1.4中所定義之任一免疫原組合物進一步包含至少一種以下13種肺炎鏈球菌血清型中之每一者的糖結合物：9V、1、3、4、5、6A、6B、7F、14、18C、19A、19F及23F。 在實施例中，上述部分1.4中所定義之任一免疫原組合物另外包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型2之糖結合物。 在實施例中，上述部分1.4中所定義之任一免疫原組合物另外包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型17F之糖結合物。 在實施例中，上述部分1.4中所定義之任一免疫原組合物另外包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型20之糖結合物。 在實施例中，上述部分1.4中所定義之任一免疫原組合物另外包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15C之糖結合物。 在實施例中，上述部分1.4中所定義之任一免疫原組合物另外包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型9N之糖結合物。 較佳地，上述免疫原組合物之所有糖結合物皆個別地結合至載體蛋白質。 在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型9V之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、14、18C、19F及23F之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型1、5及7F之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型6A及19A之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型3之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型2之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型17F之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型20之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型15C之糖結合物結合至CRM197 。在任一上述免疫原組合物之實施例中，來自肺炎鏈球菌血清型9N之糖結合物結合至CRM197 。 在實施例中，上述免疫原組合物之糖結合物皆個別地結合至CRM197 。 在另一實施例中，任一上述免疫原組合物之來自肺炎鏈球菌血清型9V之糖結合物個別地結合至PD。 在實施例中，任一上述免疫原組合物之來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及/或23F之糖結合物個別地結合至PD。 在實施例中，任一上述免疫原組合物之來自肺炎鏈球菌血清型18C之糖結合物結合至TT。 在實施例中，任一上述免疫原組合物之來自肺炎鏈球菌血清型19F之糖結合物結合至DT。 在實施例中，任一上述免疫原組合物之來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及/或23F之糖結合物個別地結合至PD，來自肺炎鏈球菌血清型18C之糖結合物結合至TT，且來自肺炎鏈球菌血清型19F之糖結合物結合至DT。 在實施例中，上述免疫原組合物包含肺炎鏈球菌之7至25種不同血清型。在一個實施例中，上述免疫原組合物包含來自7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種、15種、16種、17種、18種、19種、20種、21種、22種、23種、24種或25種不同血清型之糖結合物。在一個實施例中，上述免疫原組合物包含來自16種或20種不同血清型之糖結合物。 在實施例中，上述免疫原組合物係8價、9價、10價、11價、12價、13價、14價、15價、16價、17價、18價、19價或20價肺炎球菌結合物組合物。在實施例中，上述免疫原組合物係14價、15價、16價、17價、18價或19價肺炎球菌結合物組合物。在實施例中，上述免疫原組合物係16價肺炎球菌結合物組合物。在實施例中，上述免疫原組合物係19價肺炎球菌結合物組合物。在實施例中，上述免疫原組合物係20價肺炎球菌結合物組合物。 使莢膜多醣與載體蛋白質結合後，可藉由多種技術來純化糖結合物(相對於多醣-蛋白質結合物之量進行富集)。該等技術包括濃縮/滲濾操作、沈澱/溶析、管柱層析及深度過濾(例如，參見美國專利申請公開案第2007/0184072號或第WO2008/079653號。在將個別糖結合物純化後，使其複合以調配本發明之免疫原組合物。1.6 本發明糖結合物之具體組合 在實施例中，上述部分1.4或1.5中所定義之任一免疫原組合物不包含來自肺炎鏈球菌血清型9N之莢膜醣。 在實施例中，上述部分1.4或1.5中所定義之任一免疫原組合物不包含來自肺炎鏈球菌血清型9A之莢膜醣。 在實施例中，上述部分1.4或1.5中所定義之任一免疫原組合物不包含來自肺炎鏈球菌血清型9L之莢膜醣。 在實施例中，上述部分1.4或1.5中所定義之任一免疫原組合物不包含來自肺炎鏈球菌血清型9N及9A之莢膜醣。 在實施例中，上述部分1.4或1.5中所定義之任一免疫原組合物不包含來自肺炎鏈球菌血清型9N及9L之莢膜醣。 在實施例中，上述部分1.4或1.5中所定義之任一免疫原組合物不包含來自肺炎鏈球菌血清型9A及9L之莢膜醣。 在實施例中，上述部分1.4或1.5中所定義之任一免疫原組合物不包含來自肺炎鏈球菌血清型9N、9A及9L之莢膜醣。2 免疫原組合物之劑量 各劑量中之糖結合物之量選擇成在典型疫苗接種者中誘導免疫保護性反應而無顯著不良副作用之量。該量將端視所採用之特異性免疫原及其呈遞方式而變化。2.1 糖結合物量 免疫原組合物中之具體糖結合物之量可基於用於該結合物之總多醣(結合及非結合)來計算。舉例而言，在100 µg多醣劑量中，含有20%游離多醣之糖結合物將具有約80 µg結合多醣及約20 µg非結合多醣。糖結合物之量可端視肺炎球菌血清型而變化。醣濃度可藉由糖醛酸來確定。 免疫原組合物中不同多醣組份之「免疫原量」可不同，且各自可包含約1 µg、約2 µg、約3 µg、約4 µg、約5 µg、約6 µg、約7 µg、約8 µg、約9 µg、約10 µg、約15 µg、約20 µg、約30 µg、約40 µg、約50 µg、約60 µg、約70 µg、約80 µg、約90 µg或約100 µg任一具體多醣抗原。 通常，對於給定血清型，每一劑量將包含0.1 µg至100 µg多醣、具體而言0.5 µg至20 µg、更具體而言1.0 µg至10 µg、且甚至更具體而言2.0 µg至5.0 µg。涵蓋任一上述範圍內之任一整數作為本發明之實施例。 在實施例中，對於每一特定糖結合物，每一劑量將包含約1.0 µg、約1.2 µg、約1.4 µg、約1.6 µg、約1.8 µg、約2.0 µg、約2.2 µg、約2.4 µg、約2.6 µg、約2.8 µg、約3.0 µg、約3.2 µg、約3.4 µg、約3.6 µg、約3.8 µg、約4.0 µg、約4.2 µg、約4.4 µg、約4.6 µg、約4.8 µg、約5.0 µg、約5.2 µg、約5.4 µg、約5.6 µg、約5.8 µg或約6.0 µg多醣。 在實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F之糖結合物，每一劑量將包含約1.1 µg、約1.2 µg、約1.3 µg、約1.4 µg、約1.5 µg、約1.6 µg、約1.7 µg、約1.8 µg、約1.9 µg、約2.0 µg、約2.1 µg、約2.2 µg、約2.3 µg、約2.4 µg、約2.5 µg、約2.6 µg、約2.7 µg、約2.8 µg、約2.9 µg或約3.0 µg多醣。 在實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及/或33F之糖結合物，每一劑量將包含約1.1 µg、約1.2 µg、約1.3 µg、約1.4 µg、約1.5 µg、約1.6 µg、約1.7 µg、約1.8 µg、約1.9 µg、約2.0 µg、約2.1 µg、約2.2 µg、約2.3 µg、約2.4 µg、約2.5 µg、約2.6 µg、約2.7 µg、約2.8 µg、約2.9 µg或約3.0 µg多醣。 在實施例中，對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物，每一劑量將包含約2.0 µg、約2.2 µg、約2.4 µg、約2.6 µg、約2.8 µg、約3.0 µg、約3.2 µg、約3.4 µg、約3.6 µg、約3.8 µg、約4.0 µg、約4.2 µg、約4.4 µg、約4.6 µg、約4.8 µg、約5.0、約5.2 µg、約5.4 µg、約5.6 µg、約5.8 µg或約6.0 µg多醣。 在實施例中，每一劑量對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一糖結合物將包含約1.5 µg至約3.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物將包含約3.0 µg至約6.0 µg多醣。 在實施例中，每一劑量對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一糖結合物將包含約2.0 µg至約2.5 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物將包含約4.0 µg至約4.8 µg多醣。 在實施例中，每一劑量對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一糖結合物將包含約2.2 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物包含約4.4 µg多醣。 在實施例中，每一劑量對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一糖結合物將包含約1.5 µg至約3.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物將包含約3 µg至約6 µg多醣。 在實施例中，每一劑量對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一糖結合物將包含約2.0 µg至約2.5 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物將包含約4.0 µg至約4.8 µg多醣。 在實施例中，每一劑量對於來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一糖結合物將包含約2.2 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物將包含約4.4 µg多醣。 在實施例中，每一劑量對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一糖結合物將包含約1.5 µg至約3.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物將包含約3.0 µg至約6.0 µg多醣。 在實施例中，每一劑量對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一糖結合物將包含約2.0 µg至約2.5 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物將包含約4.0 µg至約4.8 µg多醣。 在實施例中，每一劑量對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一糖結合物將包含約2.2 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物將包含約4.4 µg多醣。 在實施例中，每一劑量對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一糖結合物將包含約1.5 µg至約3.0 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物將包含約3.0 µg至約6.0 µg多醣。 在實施例中，每一劑量對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一糖結合物將包含約2.0 µg至約2.5 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物將包含約4.0 µg至約4.8 µg多醣。 在實施例中，每一劑量對於來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之每一糖結合物將包含約2.2 µg多醣，且對於來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物將包含約4.4 µg多醣。2.2 載體量 通常，每一劑量將包含10 µg至150 µg載體蛋白質、具體而言15 µg至100 µg載體蛋白質、更具體而言25 µg至75 µg載體蛋白質、且甚至更具體而言40 µg至60 µg載體蛋白質。在實施例中，該載體蛋白質係CRM197 。 在實施例中，每一劑量將包含約25 µg、約26 µg、約27 µg、約28 µg、約29 µg、約30 µg、約31 µg、約32 µg、約33 µg、約34 µg、約35 µg、約36 µg、約37 µg、約38 µg、約39 µg、約40 µg、約41 µg、約42 µg、約43 µg、約44 µg、約45 µg、約46 µg、約47 µg、約48 µg、約49 µg、約50 µg、約51 µg、約52 µg、約53 µg、約54 µg、約55 µg、約56 µg、約57 µg、約58 µg、約59 µg、約60 µg、約61 µg、約62 µg、約63 µg、約64 µg、約65 µg、約66 µg、約67 µg、約68 µg、約69 µg、約70 µg、約71 µg、約72 µg、約73 µg、約74 µg或約75 µg載體蛋白質。在實施例中，該載體蛋白質係CRM197 。3 其他抗原 本發明之免疫原組合物包含結合肺炎鏈球菌醣抗原(糖結合物)。其亦可進一步包括來自其他病原體、具體而言來自細菌及/或病毒之抗原。較佳其他抗原係選自：白喉類毒素(D)、破傷風類毒素(T)、百日咳抗原(P) (其通常為非細胞的(Pa))、B型肝炎病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)、A型肝炎病毒(HAV)抗原、結合之b型流感嗜血桿菌莢膜醣(Hib)、失活之脊髓灰白質炎病毒疫苗(IPV)。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含D-T-Pa。在實施例中，本發明之免疫原組合物包含D-T-Pa-Hib、D-T-Pa-IPV或D-T-Pa-HBsAg。在實施例中，本發明之免疫原組合物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV或D-T-Pa-HBsAg-Hib。在實施例中，本發明之免疫原組合物包含D-T-Pa-HBsAg-IPV-Hib。 百日咳抗原：百日咳嗜血桿菌引起哮咳。疫苗中之百日咳抗原係細胞(完整細胞，呈失活之百日咳嗜血桿菌細胞)或非細胞的。細胞百日咳抗原之製備在文獻中有充分記載(例如，其可藉由熱失活百日咳嗜血桿菌之I期培養物來獲得)。然而，較佳地，本發明使用非細胞抗原。在使用非細胞抗原時，較佳使用以下抗原中之一者、兩者或(較佳)三者：(1) 去毒百日咳毒素(百日咳類毒素或PT)；(2) 絲狀血球凝集素(FHA)；(3) 百日咳菌素(亦稱為69千道爾頓外膜蛋白)。FHA及百日咳菌素可在用於本發明之前用甲醛處理。較佳藉由用甲醛及/或戊二醛處理對PT去毒。較佳使非細胞百日咳抗原吸附至一或多種鋁鹽佐劑上。作為替代，其可以未吸附狀態添加。在添加百日咳菌素時，則其較佳已吸附至氫氧化鋁佐劑上。PT及FHA可吸附至氫氧化鋁佐劑或磷酸鋁上。最佳使PT、FHA及百日咳菌素中之所有吸附至氫氧化鋁。 失活之脊髓灰白質炎病毒疫苗：脊髓灰白質炎病毒引起脊髓灰質炎。本發明之較佳實施例使用IPV而非使用經口脊髓灰白質炎病毒疫苗。在投與患者之前，脊髓灰白質炎病毒必須失活，且此可藉由用甲醛處理來達成。脊髓灰質炎可由三種類型之脊髓灰白質炎病毒中之一者引起。該三種類型相似且引起相同症狀，但其抗原不同，且感染一種類型不會針對其他類型之感染進行保護。因此，在本發明中較佳使用三種脊髓灰白質炎病毒抗原：1型脊髓灰白質炎病毒(例如，Mahoney株)、2型脊髓灰白質炎病毒(例如，MEF-1株)及3型脊髓灰白質炎病毒(例如，Saukett株)。較佳使病毒個別地生長、純化及失活，且然後組合以獲得與本發明一起使用之三價本體混合物。 白喉類毒素：白喉棒狀桿菌引起白喉。可對白喉毒素進行處理(例如，使用福馬林或甲醛)以去除毒性，同時保留在注射後誘導特異性抗毒素抗體之能力。將該等白喉類毒素用於白喉疫苗中。較佳白喉類毒素係藉由甲醛處理製備之彼等。白喉類毒素可藉由使白喉棒狀桿菌於生長培養基中生長、然後藉由甲醛處理、超濾及沈澱來獲得。然後可藉由包含無菌過濾及/或透析之製程處理類毒素材料。使白喉類毒素較佳吸附至氫氧化鋁佐劑上。 破傷風類毒素：破傷風梭菌(Clostridium tetani )引起破傷風。可對破傷風毒素進行處理以獲得保護性類毒素。將該等類毒素用於破傷風疫苗中。較佳破傷風類毒素係藉由甲醛處理製備之彼等。破傷風類毒素可藉由使破傷風梭菌於生長培養基中生長、然後藉由甲醛處理、超濾及沈澱來獲得。然後可藉由包含無菌過濾及/或透析之製程處理該材料。 A型肝炎病毒抗原：A型肝炎病毒(HAV)係導致病毒性肝炎之已知藥劑中之一者。較佳HAV組份係基於失活之病毒，且失活可藉由福馬林處理來達成。 B型肝炎病毒(HBV)係導致病毒性肝炎之已知藥劑中之一者。衣殼之主要組份係蛋白質，稱為HBV表面抗原或更通常而言HBsAg，其通常係分子量為約24 kDa之226胺基酸多肽。所有現有B型肝炎疫苗皆含有HBsAg，且當將此抗原投與正常疫苗接種者時，其刺激針對HBV感染進行保護之抗HBsAg抗體之產生。 對於疫苗製造，已以兩種方式製得HBsAg：自慢性B型肝炎載體之血漿純化呈微粒形式之抗原或藉由重組DNA方法(例如，酵母細胞中之重組表現)表現該蛋白質。與天然HBsAg (即，作為血漿純化產物)不同，酵母表現之HBsAg通常未經糖基化，且此係與本發明一起使用之最佳HBsAg形式。 結合之b型流感嗜血桿菌抗原：b型流感嗜血桿菌(Hib)引起細菌性腦膜炎。Hib疫苗通常係基於莢膜醣抗原，該等疫苗之製備在文獻中有充分記載。Hib醣可結合至載體蛋白質以增強其在尤其兒童中之免疫原性。典型載體蛋白質係破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM197 、流感嗜血桿菌蛋白質D及來自血清群B腦膜炎球菌之外膜蛋白複合物。結合物之醣部分可包含如自Hib細菌製備之全長磷酸多核糖基核糖醇(PRP)及/或全長PRP之片段。Hib結合物可吸附或可不吸附至鋁鹽佐劑。 在實施例中，本發明之免疫原組合物進一步包括結合之腦膜炎雙球菌血清群Y莢膜醣(MenY)及/或結合之腦膜炎雙球菌血清群C莢膜醣(MenC)。 在實施例中，本發明之免疫原組合物進一步包括結合之腦膜炎雙球菌血清群A莢膜醣(MenA)、結合之腦膜炎雙球菌血清群W135莢膜醣(MenW135)、結合之腦膜炎雙球菌血清群Y莢膜醣(MenY)及/或結合之腦膜炎雙球菌血清群C莢膜醣(MenC)。 在實施例中，本發明之免疫原組合物進一步包括結合之腦膜炎雙球菌血清群W135莢膜醣(MenW135)、結合之腦膜炎雙球菌血清群Y莢膜醣(MenY)及/或結合之腦膜炎雙球菌血清群C莢膜醣(MenC)。4 佐劑 在一些實施例中，本文所揭示之免疫原組合物可進一步包含至少一種、兩種或三種佐劑。術語「佐劑」係指增強針對抗原之免疫反應之化合物或混合物。抗原可主要用作遞送系統、主要用作免疫調節劑或具有二者之較強特徵。適宜佐劑包括適用於哺乳動物、包括人類之彼等。 已知可用於人類中之適宜遞送系統型佐劑之實例包括(但不限於)明礬(例如，磷酸鋁、硫酸鋁或氫氧化鋁)、磷酸鈣、脂質體、水包油乳液(例如MF59 (4.3% w/v鯊烯/0.5% w/v聚山梨醇酯80 (Tween 80)/0.5% w/v去水山梨醇三油酸酯(Span 85)))、油包水乳液(例如Montanide)及聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯) (PLG)微粒或奈米粒子。 在實施例中，本文所揭示之免疫原組合物包含鋁鹽(明礬)作為佐劑(例如，磷酸鋁、硫酸鋁或氫氧化鋁)。在較佳實施例中，本文所揭示之免疫原組合物包含磷酸鋁或氫氧化鋁作為佐劑。在實施例中，本文所揭示之免疫原組合物包含0.1 mg/mL至1 mg/mL或0.2 mg/mL至0.3 mg/mL之呈磷酸鋁形式之元素鋁。在實施例中，本文所揭示之免疫原組合物包含約0.25 mg/mL之呈磷酸鋁形式之元素鋁。 已知可用於人類之適宜免疫調節劑型佐劑之實例包括(但不限於)來自阿奎拉(Aquilla)樹之樹皮之皂素提取物(QS21, Quil A)、TLR4激動劑(例如MPL (單磷醯基脂質A))、3DMPL (3-O-去醯基化MPL)或GLA-AQ、LT/CT突變體、細胞介素(例如各種介白素(例如，IL-2、IL-12)或GM-CSF)及諸如此類。 已知可用於人類之具有遞送及免疫調節劑特徵二者之適宜免疫調節劑型佐劑的實例包括(但不限於) ISCOMS (例如，參見Sjölander等人(1998) J. Leukocyte Biol. 64:713；WO90/03184、WO96/11711、WO 00/48630、WO98/36772、WO00/41720、WO2006/134423及WO2007/026190)或GLA-EM，其係TLR4激動劑與水包油乳液之組合。 對於獸醫應用(包括(但不限於)動物實驗)，可使用完全弗氏佐劑(Complete Freund’s Adjuvant，CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)、Emulsigen、N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-乙醯基-去甲胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(CGP 11637，稱為nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺(CGP 19835A，稱為MTP-PE)及含有三種自細菌提取之組份之RIBI、於2%鯊烯/Tween 80乳液中之單磷醯基脂質A、海藻糖二黴菌酸酯及細胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。 增強如本文所揭示之肺炎球菌疫苗之有效性之其他實例性佐劑包括(但不限於)：(1) 水包油乳液調配物(具或不具其他特異性免疫刺激劑，例如胞壁醯基肽(參見下文)或細菌細胞壁組份)，例如(a) SAF，其含有10% Squalane、0.4% Tween 80、5% pluronic嵌段聚合物L121及thr-MDP，將其微流化成次微米乳液或渦旋以產生較大粒徑乳液，及(b) RIBI™佐劑系統(RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT)，其含有2%鯊烯、0.2% Tween 80及一或多種細菌細胞壁組份，例如單磷醯脂質A (MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)及細胞壁骨架(CWS)，較佳MPL + CWS (DETOX™)；(2) 可使用皂素佐劑，例如QS21、STIMULON™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA)、ABISCO® (Isconova, Sweden)或ISCOMATRIX® (Commonwealth Serum Laboratories, Australia)，或自其產生之粒子，例如ISCOMs (免疫刺激複合物)，該ISCOMS可不含其他清潔劑(例如，WO00/07621)；(3) 完全弗氏佐劑(CFA)及不完全弗氏佐劑(IFA)；(4) 細胞介素，例如介白素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12 (例如，WO99/44636))、干擾素(例如，γ干擾素)、巨噬細胞菌落刺激因子(M-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)等；(5) 單磷醯基脂質A (MPL)或3-O-去醯基化MPL (3dMPL) (例如，參見GB-2220221、EP0689454)，當與肺炎球菌醣一起使用時視情況實質上缺乏明礬(例如，參見WO00/56358)；(6) 3dMPL與例如QS21及/或水包油乳液之組合(例如，參見EP0835318、EP0735898、EP0761231)；(7) 聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(例如，參見WO99/52549)；(8) 聚氧乙烯去水山梨醇酯表面活性劑與辛苯昔醇之組合(例如，WO01/21207)或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑與至少一種其他非離子型表面活性劑(例如辛苯昔醇)之組合(例如，WO01/21152)；(9) 皂素及免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸) (例如，WO00/62800)；(10) 免疫刺激劑及金屬鹽粒子(例如，參見WO00/23105)；(11) 皂素及水包油乳液(例如，WO99/11241)；(12) 皂素(例如，QS21) + 3dMPL + IM2 (視情況 + 固醇) (例如，WO98/57659)；(13) 作為免疫刺激劑起增強組合物效能作用之其他物質。胞壁醯基肽包括N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-25乙醯基-去甲胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸(nor-MDP)、N-乙醯基胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯基氧基)-乙胺MTP-PE)等。 在本發明之實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含CpG寡核苷酸作為佐劑。除非另外指明，否則如本文所使用之CpG寡核苷酸係指免疫刺激性CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)，且因此該等術語可互換使用。免疫刺激性CpG寡去氧核苷酸含有一或多個免疫刺激性CpG基序，其視情況在某些較佳鹼基背景內為未甲基化之胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸。CpG免疫刺激性基序之甲基化狀態通常係指二核苷酸中之胞嘧啶殘基。含有至少一個未甲基化CpG二核苷酸之免疫刺激性寡核苷酸係含有藉由磷酸酯鍵連接至3'鳥嘌呤之5'未甲基化胞嘧啶、且經由連結至類鐸受體9 (TLR-9)活化免疫系統之寡核苷酸。在另一實施例中，免疫刺激性寡核苷酸可含有一或多個甲基化CpG二核苷酸，其將經由TLR9活化免疫系統，但不如CpG基序未甲基化時強。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含一或多個進而可涵蓋CpG二核苷酸之迴文結構。CpG寡核苷酸已闡述於多個已頒佈專利、公開專利申請案及其他公開案中，包括美國專利第6,194,388號；第6,207,646號；第6,214,806號；第6,218,371號；第6,239,116號；第及6,339,068號。 在本發明之實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含WO2010/125480之第3頁、第22行至第12頁、第36行所闡述之任一CpG寡核苷酸。 業內已鑑別出CpG免疫刺激性寡核苷酸之不同類別。該等類別稱為A類、B類、C類及P類，且更詳細闡述於WO2010/125480之第3頁、第22行至第12頁、第36行中。本發明方法涵蓋該等不同類別之CpG免疫刺激性寡核苷酸之應用。 在本發明之實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含A類CpG寡核苷酸。較佳地，本發明之「A類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5’ GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3’ (SEQ ID NO: 1)。A類寡核苷酸之一些非限制性實例包括：5’ G*G*G_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_G*G*G*G*G*G 3’ (SEQ ID NO: 2)；其中「*」係指硫代磷酸酯鍵，且「_」係指磷酸二酯鍵。 在本發明之實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含B類CpG寡核苷酸。在一個實施例中，用於本發明中之CpG寡核苷酸係由至少下式表示之B類CpG寡核苷酸： 5' X1 X2 CGX3 X4 3’，其中X1、X2、X3及X4為核苷酸。在一個實施例中，X2 係腺嘌呤、鳥嘌呤或胸腺嘧啶。在另一實施例中，X3 係胞嘧啶、腺嘌呤或胸腺嘧啶。 本發明之B類CpG寡核苷酸序列係上文所廣泛闡述以及揭示於WO 96/02555、WO 98/18810及美國專利第6,194,388號；第6,207,646號；第6,214,806號；第6,218,371號；第6,239,116號及第6,339,068號中之彼等。實例性序列包括(但不限於)揭示於該等後續申請案及專利中之彼等。 在實施例中，本發明之「B類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列： 5’ TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3’ (SEQ ID NO: 3)，或 5’ TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3’ (SEQ ID NO: 4)，或 5’ TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’ (SEQ ID NO: 5)，或 5’ TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3’ (SEQ ID NO: 6)，或 5’ TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3’ (SEQ ID NO: 7)。 在該等序列中之任一者中，所有鍵皆可係硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，在該等序列中之任一者中，一或多個鍵可為磷酸二酯、較佳介於CpG基序之「C」與「G」之間，從而產生半軟CpG寡核苷酸。在該等序列中之任一者中，乙基-尿苷或鹵素可取代5' T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。 B類寡核苷酸之一些非限制性實例包括： 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3’ (SEQ ID NO: 8)，或 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3’ (SEQ ID NO: 9)，或 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 10)，或 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3’ (SEQ ID NO: 11)，或 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3’ (SEQ ID NO: 12)。 其中「*」係指硫代磷酸酯鍵。 在本發明之實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含C類CpG寡核苷酸。在實施例中，本發明之「C類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列： 5’ TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 13)，或 5’ TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 14)，或 5’ TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 15)，或 5’ TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 16)，或 5’ TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 17)，或 5’ TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 18)，或 5’ TCGACGTTCGGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 19)，或 5’ TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 20)，或 5’ TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 21)，或 5’ TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 22)，或 5’ TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 23)，或 5’ TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3’ (SEQ ID NO: 24)，或 5’ TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3’ (SEQ ID NO: 25)。 在該等序列中之任一者中，所有鍵皆可係硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，在該等序列中之任一者中，一或多個鍵可為磷酸二酯、較佳介於CpG基序之「C」與「G」之間，從而產生半軟CpG寡核苷酸。 C類寡核苷酸之一些非限制性實例包括： 5’ T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 26)，或 5’ T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 27)，或 5’ T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 28)，或 5’ T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 29)，或 5’ T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 30)，或 5’ T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 31)，或 5’ T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 32)，或 5’ T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 33)，或 5’ T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 34)，或 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 35)，或 5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 36)，或 5’ T*C*G*T*C_G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 37)，或 5’ T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3’ (SEQ ID NO: 38) 其中「*」係指硫代磷酸酯鍵，且「_」係指磷酸二酯鍵。 在該等序列中之任一者中，乙基-尿苷或鹵素可取代5' T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。 在本發明之實施例中，如本文所揭示之免疫原組合物包含P類CpG寡核苷酸。在實施例中，用於本發明中之CpG寡核苷酸係含有5' TLR活化結構域及至少兩個迴文區域之P類CpG寡核苷酸，一個迴文區域係長度為至少6個核苷酸之5'迴文區域且直接或經由間隔體銜接至長度為至少8個核苷酸之3'迴文區域，其中寡核苷酸包括至少一個YpR二核苷酸。在實施例中，該寡核苷酸不為T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G (SEQ ID NO: 27)。在一個實施例中，P類CpG寡核苷酸包括至少一個未甲基化CpG二核苷酸。在另一實施例中，TLR活化結構域係TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或TTTT。在另一實施例中，TLR活化結構域在5'迴文區域內。在另一實施例中，TLR活化結構域緊鄰5'迴文區域之5'端。 在實施例中，本發明之「P類」CpG寡核苷酸具有以下核酸序列：5’ TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID NO: 39)。 在該等序列中，所有鍵皆可係硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，一或多個鍵可為磷酸二酯、較佳介於CpG基序之「C」與「G」之間，從而產生半軟CpG寡核苷酸。在該等序列中之任一者中，乙基-尿苷或鹵素可取代5' T；鹵素取代之實例包括(但不限於)溴-尿苷或碘-尿苷取代。 P類寡核苷酸之非限制性實例包括： 5’ T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G 3’ (SEQ ID NO: 40) 其中「*」係指硫代磷酸酯鍵，且「_」係指磷酸二酯鍵。 在一個實施例中，寡核苷酸包括至少一個硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，寡核苷酸之所有核苷酸間鍵為硫代磷酸酯鍵。在另一實施例中，寡核苷酸包括至少一個磷酸二酯樣鍵。在另一實施例中，磷酸二酯樣鍵係磷酸二酯鍵。在另一實施例中，親脂性基團結合至寡核苷酸。在一個實施例中，親脂性基團係膽固醇。 在實施例中，本文所揭示CpG寡核苷酸之所有核苷酸間鍵係磷酸二酯鍵(「軟」寡核苷酸，如WO2007/026190中所闡述)。在另一實施例中，使本發明之CpG寡核苷酸抵抗降解(例如，經穩定)。「經穩定寡核苷酸」係指相對抵抗活體內降解(例如經由外切酶或內切酶)之寡核苷酸。核酸穩定可經由主鏈修飾來實現。具有硫代磷酸酯鍵之寡核苷酸提供最大活性且保護寡核苷酸免於細胞內外切酶及內切酶之降解。 免疫刺激性寡核苷酸可具有具磷酸二酯及硫代磷酸酯鍵之組合之嵌合主鏈。出於本發明之目的，嵌合主鏈係指部分穩定的主鏈，其中至少一個核苷酸間鍵係磷酸二酯鍵或磷酸二酯樣鍵，且其中至少一個其他核苷酸間鍵係穩定核苷酸間鍵，其中至少一個磷酸二酯或磷酸二酯樣鍵與至少一個穩定鍵不同。當磷酸二酯鍵優先位於CpG基序內時，該等分子稱為「半軟」分子，如WO2007/026190中所闡述。 其他經修飾之寡核苷酸包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯及/或對乙氧基鍵之組合。 混合主鏈經修飾之ODN可如WO2007/026190中所闡述來合成。 CpG寡核苷酸之大小(即，沿寡核苷酸長度之核苷酸殘基數)亦可影響寡核苷酸之刺激活性。為促進吸收至細胞中，本發明之CpG寡核苷酸較佳具有至少6個核苷酸殘基之長度。若存在足夠的免疫刺激性基序，則大於6個核苷酸(甚至許多kb長)之任一大小之寡核苷酸皆能夠誘導免疫反應，此乃因較大寡核苷酸會在細胞內部降解。在某些實施例中，CpG寡核苷酸之長度為6至100個核苷酸、較佳長度為8至30個核苷酸。在重要實施例中，本發明之核酸及寡核苷酸不為質體或表現載體。 在實施例中，本文所揭示之CpG寡核苷酸包含例如鹼基及/或糖之取代或修飾，如WO2007/026190之第134段至第147段中所闡述。 在實施例中，本發明之CpG寡核苷酸經化學修飾。化學修飾之實例為熟習此項技術者已知，且闡述於例如Uhlmann等人(1990) Chem. Rev. 90:543; S. Agrawal編輯，Humana Press, Totowa, USA 1993；Crooke等人(1996) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36:107-129；及Hunziker等人(1995) Mod. Synth. Methods 7:331-417中。與由天然DNA或RNA構成之相同序列之寡核苷酸相比，本發明之寡核苷酸可具有一或多個修飾，其中每一修飾位於特定磷酸二酯核苷間橋及/或特定β-D-核糖單元及/或特定天然核苷鹼基位置處。 在本發明之一些實施例中，可根據彼等熟習此項技術者已知之方法簡單地混合含有CpG之核酸與免疫原載體(例如，參見WO03/024480)。 在本發明之具體實施例中，本文所揭示之任一免疫原組合物包含2 μg至100 mg CpG寡核苷酸，較佳0.1 mg至50 mg CpG寡核苷酸，較佳0.2 mg至10 mg CpG寡核苷酸，較佳0.3 mg至5 mg CpG寡核苷酸，較佳0.3 mg至5 mg CpG寡核苷酸，甚至較佳0.5 mg至2 mg CpG寡核苷酸，甚至較佳0.75 mg至1.5 mg CpG寡核苷酸。在較佳實施例中，本文所揭示之任一免疫原組合物包含約1 mg CpG寡核苷酸。5 調配物 本發明之免疫原組合物可調配成液體形式(即，溶液或懸浮液)或凍乾形式。液體調配物可有利地直接自其封裝形式投與，且因此理想地用於注射而無需在水性介質中再組成為本發明凍乾組合物所需之其他形式。 本發明免疫原組合物之調配可使用業內公認之方法來完成。例如，可使用生理上可接受之媒劑調配個別肺炎球菌結合物以製備組合物。該等媒劑之實例包括(但不限於)水、緩衝鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及右旋糖溶液。 本發明提供免疫原組合物，其包含本文所揭示之糖結合物及醫藥上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑之任一組合。 在實施例中，本發明之免疫原組合物係呈液體形式，較佳呈水性液體形式。 本發明之免疫原組合物可包含以下各項中之一或多者：緩衝液、鹽、二價陽離子、非離子型清潔劑、低溫保護劑(例如糖)及抗氧化劑(例如自由基清除劑或螯合劑)或其任何多個組合。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含緩衝液。在實施例中，該緩衝液之pKa為約3.5至約7.5。在一些實施例中，緩衝液係磷酸鹽、琥珀酸鹽、組胺酸或檸檬酸鹽。在某些實施例中，緩衝液係最終濃度為1 mM至10 mM之琥珀酸鹽。在一具體實施例中，琥珀酸鹽緩衝液之最終濃度為約5 mM。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含鹽。在一些實施例中，鹽係選自由以下組成之群：氯化鎂、氯化鉀、氯化鈉及其組合。在一具體實施例中，鹽係氯化鈉。在一具體實施例中，本發明之免疫原組合物包含150 mM之氯化鈉。 在實施例中，本發明之免疫原組合物包含表面活性劑。在實施例中，表面活性劑係選自由以下組成之群：聚山梨醇酯20 (TWEENTM 20)、聚山梨醇酯40 (TWEENTM 40)、聚山梨醇酯60 (TWEEN™ 60)、聚山梨醇酯65 (TWEEN™ 65)、聚山梨醇酯80 (TWEEN™ 80)、聚山梨醇酯85 (TWEEN™ 85)、TRITON™ N-101、TRITON™ X-100、辛苯醇醚40、壬苯醇醚-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸酯、聚氧乙烯-660羥基硬脂酸酯(PEG-15、Solutol H 15)、聚氧乙烯-35-蓖麻油酸酯(CREMOPHOR® EL)、大豆卵磷脂及泊洛沙姆(poloxamer)。在一具體實施例中，表面活性劑係聚山梨醇酯80。在一些該實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係至少0.0001%至10%聚山梨醇酯80 (重量對重量，w/w)。在一些該等實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係至少0.001%至1%聚山梨醇酯80 (重量對重量，w/w)。在一些該等實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係至少0.01%至1%聚山梨醇酯80 (重量對重量，w/w)。在其他實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%聚山梨醇酯80 (w/w)。在另一實施例中，調配物中聚山梨醇酯80之最終濃度係1%聚山梨醇酯80 (w/w)。 在某些實施例中，本發明之免疫原組合物具有5.5至7.5之pH，更佳5.6至7.0之pH，甚至更佳5.8至6.0之pH。 在一個實施例中，本發明提供填充有本文所揭示之任一免疫原組合物之容器。在一個實施例中，容器係選自由以下組成之群：小瓶、注射器、燒瓶、發酵罐、生物反應器、袋、罐、安瓿、卡管及可棄式筆。在某些實施例中，容器經矽化。 在實施例中，本發明容器係由玻璃、金屬(例如，鋼、不銹鋼、鋁等)及/或聚合物(例如，熱塑性體、彈性物、熱塑性彈性物)製得。在實施例中，本發明容器係由玻璃製得。 在一個實施例中，本發明提供填充有本文所揭示之任一免疫原組合物之注射器。在某些實施例中，注射器經矽化及/或由玻璃製得。 用於注射之本發明免疫原組合物之典型劑量具有0.1 mL至2 mL、更佳0.2 mL至1 mL之體積，甚至更佳約0.5 mL之體積。 因此，如上文所定義之容器或注射器填充有0.1 mL至2 mL、更佳0.2 mL至1 mL體積、甚至更佳約0.5 mL體積之本文所定義之任一免疫原組合物。6 本發明免疫原組合物之應用 在實施例中，本文所揭示之免疫原組合物係用作藥劑。 本文所闡述之免疫原組合物可於多種治療或預防性方法中用於預防、治療或改善個體之細菌感染、疾病或病況。具體而言，本文所闡述之免疫原組合物可用於預防、治療或改善個體之肺炎鏈球菌感染、疾病或病況。 因此在一態樣中，本發明提供預防、治療或改善個體之與肺炎鏈球菌相關之感染、疾病或病況的方法，其包含向個體投與免疫有效量之本發明免疫原組合物。 在一些該等實施例中，感染、疾病或病況係選自由以下組成之群：肺炎、鼻竇炎、中耳炎、急性中耳炎、腦膜炎、菌血症、敗血症、胸膜積膿、結膜炎、骨髓炎、膿毒性關節炎、心內膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂巢組織炎、軟組織感染及腦膿瘍。 在實施例中，本發明提供誘導個體之針對肺炎鏈球菌之免疫反應的方法，其包含向個體投與免疫有效量之本發明免疫原組合物。 在實施例中，本文所揭示之免疫原組合物係用作疫苗。在該等實施例中，本文所闡述之免疫原組合物可用於預防個體之肺炎鏈球菌感染。因此在一態樣中，本發明提供預防個體之肺炎鏈球菌感染之方法，其包含向個體投與免疫有效量之本發明免疫原組合物。在一些該等實施例中，感染係選自由以下組成之群：肺炎、鼻竇炎、中耳炎、急性中耳炎、腦膜炎、菌血症、敗血症、胸膜積膿、結膜炎、骨髓炎、膿毒性關節炎、心內膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂巢組織炎、軟組織感染及腦膿瘍。在一態樣中，欲進行疫苗接種之個體係哺乳動物，例如人類、貓、綿羊、豬、馬、牛或狗。 在一態樣中，本文所揭示之免疫原組合物用於預防、治療或改善個體之與肺炎鏈球菌相關之感染、疾病或病況的方法中。在一些該等實施例中，感染、疾病或病況係選自由以下組成之群：肺炎、鼻竇炎、中耳炎、急性中耳炎、腦膜炎、菌血症、敗血症、胸膜積膿、結膜炎、骨髓炎、膿毒性關節炎、心內膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂巢組織炎、軟組織感染及腦膿瘍。 在實施例中，本文所揭示之免疫原組合物係用作疫苗。在該等實施例中，本文所闡述之免疫原組合物可用於預防個體之肺炎鏈球菌感染。因此在一態樣中，本文所揭示之免疫原組合物用於預防個體之肺炎鏈球菌感染的方法中。在一些該等實施例中，感染係選自由以下組成之群：肺炎、鼻竇炎、中耳炎、急性中耳炎、腦膜炎、菌血症、敗血症、胸膜積膿、結膜炎、骨髓炎、膿毒性關節炎、心內膜炎、腹膜炎、心包炎、乳突炎、蜂巢組織炎、軟組織感染及腦膿瘍。在一態樣中，欲進行疫苗接種之個體係哺乳動物，例如人類、貓、綿羊、豬、馬、牛或狗。 本發明之免疫原組合物可用於藉助經由全身或黏膜途徑投與該等免疫原組合物來保護易受肺炎球菌感染之人類或治療肺炎球菌感染。在實施例中，本文所揭示之免疫原組合物係藉由肌內、腹膜內、皮內或皮下途徑來投與。在實施例中，本文所揭示之免疫原組合物係藉由肌內、腹膜內、皮內或皮下注射來投與。在實施例中，本文所揭示之免疫原組合物係藉由肌內或皮下注射來投與。 在實施例中，在投與個體時，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物能夠誘導能夠連結至肺炎鏈球菌血清型15B、15A及/或15C之抗體的形成，如藉由標準ELISA分析所量測。在實施例中，在投與個體時，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物能夠誘導能夠連結至肺炎鏈球菌血清型15B及15C之抗體的形成，如藉由標準ELISA分析所量測。 在ELISA (酶聯免疫吸附分析)方法中，將來自疫苗接種個體之血清之抗體與已吸附至固體載體之多醣一起培育。使用酶結合之二級檢測抗體檢測所連結之抗體。 在實施例中，該標準ELISA分析係標準化(WHO) ELISA分析，如由WHO在「Training manual for Enzyme linked immunosorbent assay for the quantitation of Streptococcus pneumoniae serotype specific IgG (Pn PS ELISA).」(可自http://www.vaccine.uab.edu/ELISA%20protocol.pdf獲得；於2014年3月31日獲得)中所定義。 ELISA量測存在於人類血清中之類型特異性IgG抗肺炎鏈球菌莢膜多醣(PS)抗體。當將人類血清之稀釋物添加至類型特異性莢膜PS塗覆之微量滴定板中時，特異性針對該莢膜PS之抗體連結至微量滴定板。使用經鹼性磷酸酶標記之山羊抗人類IgG抗體、然後使用磷酸對硝基苯基酯受質檢測連結至該等板之抗體。有色終產物之光學密度與存在於血清中之抗莢膜PS抗體之量成正比。 在實施例中，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物能夠激發人類中之IgG抗體，該等抗體能夠以至少0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.2 μg/ml、0.3 μg/ml、0.35 μg/ml、0.4 μg/ml或0.5 μg/ml之濃度連結肺炎鏈球菌血清型15B多醣，如藉由ELISA分析所測定。 在實施例中，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物能夠激發人類中之IgG抗體，該等抗體能夠以至少0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.2 μg/ml、0.3 μg/ml、0.35 μg/ml、0.4 μg/ml或0.5 μg/ml之濃度連結肺炎鏈球菌血清型15C多醣，如藉由ELISA分析所測定。 在實施例中，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物能夠激發人類中之IgG抗體，該等抗體能夠以至少0.05 μg/ml、0.1 μg/ml、0.2 μg/ml、0.3 μg/ml、0.35 μg/ml、0.4 μg/ml或0.5 μg/ml之濃度連結肺炎鏈球菌血清型15B及15C多醣，如藉由ELISA分析所測定。 在實施例中，在投與個體時，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物能夠誘導能夠在如本文所揭示之調理吞噬分析(例如實例12之OPA分析)中殺死肺炎鏈球菌血清型15B之抗體的形成。 在實施例中，在如本文所揭示之OPA分析(例如實例12之OPA分析)中測試時，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物的OPA效價大於使用未經結合之天然肺炎鏈球菌血清型15B莢膜多醣獲得的OPA效價。 在實施例中，在投與個體時，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物能夠誘導能夠在如本文所揭示之調理吞噬分析(例如實例12之OPA分析)中殺死肺炎鏈球菌血清型15C之抗體的形成。在實施例中，在如本文所揭示之OPA分析(例如實例12之OPA分析)中測試時，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物的OPA效價大於使用未經結合之天然肺炎鏈球菌血清型15B莢膜多醣獲得的OPA效價。 認為量測在功能性抗體及補體存在下吞噬效應細胞對肺炎鏈球菌細胞之殺死的肺炎球菌調理吞噬分析(OPA)係用於評估肺炎球菌疫苗之有效性的重要替代方式。 調理吞噬分析(OPA)可藉由以下方式來實施：將肺炎鏈球菌細胞、欲測試之熱失活人類血清、分化的HL-60細胞(吞噬細胞)及外源補體來源(例如幼兔補體)之混合物一起培育。調理吞噬係在培育期間進行，且在調理吞噬後殺死經抗體及補體包覆之細菌細胞。藉由平鋪分析混合物來測定逃脫調理吞噬之存活細菌之菌落形成單位(cfu)。OPA效價定義為使細菌計數比不含測試血清之對照孔減少50%的倒數稀釋。OPA效價自兩種涵蓋此50%殺死截止值之稀釋物內插。 1:8或更高之終點效價視為該等殺死型OPA中之陽性結果。 在實施例中，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物能夠在至少50%之個體中激發針對肺炎鏈球菌血清型15B至少1:8之效價，如藉由調理吞噬殺死分析(OPA)所測定。在實施例中，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物能夠在至少60%、70%、80%、90%或至少93%之個體中激發針對肺炎鏈球菌血清型15B至少1:8之效價，如藉由調理吞噬殺死分析(OPA)所測定。 在實施例中，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物能夠在至少50%之個體中激發針對肺炎鏈球菌血清型15C至少1:8之效價，如藉由調理吞噬殺死分析(OPA)所測定。在實施例中，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物能夠在至少60%、70%、80%、90%或至少95%之個體中激發針對肺炎鏈球菌血清型15C至少1:8之效價，如藉由調理吞噬殺死分析(OPA)所測定。 在另一態樣中，本發明提供治療或預防個體之與肺炎鏈球菌血清型15A、15B及/或15C相關之肺炎鏈球菌感染、疾病或病況的方法，該方法包含以下步驟：投與治療或預防有效量之包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物中的任一者。在實施例中，在投與個體時，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物誘導能夠連結至肺炎鏈球菌血清型15B、15A及/或15C之抗體的形成。在實施例中，在投與個體時，包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物誘導能夠在如本文所揭示之調理吞噬分析(例如實例12之OPA分析)中殺死肺炎鏈球菌血清型15B、15C及/或15A之抗體的形成。 本發明之一實施例提供防護個體對抗肺炎鏈球菌血清型15C感染之方法或預防肺炎鏈球菌血清型15C感染之方法或減輕至少一種與肺炎鏈球菌血清型15C所引起之感染相關之症狀的嚴重程度或延遲其發作之方法，該等方法包含向個體投與免疫原量之包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物中的任一者。本發明之一實施例提供治療或預防個體之與肺炎鏈球菌血清型15A、15B及/或15C (較佳15B及/或15C、更佳15B)相關之肺炎鏈球菌感染、疾病或病況的方法，該方法包含以下步驟：向個體投與治療或預防有效量之包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物中的任一者。另一實施例提供治療或預防個體之與肺炎鏈球菌血清型15A、15B及/或15C (較佳15B及/或15C、更佳15B)相關之肺炎鏈球菌感染、疾病或病況的方法，該方法包含自包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物中之任一者產生多株或單株抗體製劑，及使用該抗體製劑賦予個體被動免疫。 在一個實施例中，本發明係關於包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物中的任一者之用途，其用於製造具有以下作用之藥劑：防護個體對抗肺炎鏈球菌感染，及/或預防肺炎鏈球菌感染，及/或減輕至少一種與肺炎鏈球菌所引起之感染相關之症狀的嚴重程度或延遲其發作，及/或防護個體對抗肺炎鏈球菌血清型15A、15B及/或15C (較佳15B及/或15C、更佳15B)感染，及/或預防肺炎鏈球菌血清型15A、15B及/或15C (較佳15B及/或15C、更佳15B)感染，及/或減輕至少一種與肺炎鏈球菌血清型15A、15B及/或15C (較佳15B及/或15C、更佳15B)所引起之感染相關之症狀的嚴重程度或延遲其發作。 在一個實施例中，本發明係關於包含至少一種來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物(例如上述部分1.3.4之糖結合物)之本發明免疫原組合物中的任一者之用途，其用於防護個體對抗肺炎鏈球菌感染，及/或預防肺炎鏈球菌感染，及/或減輕至少一種與肺炎鏈球菌所引起之感染相關之症狀的嚴重程度或延遲其發作，及/或防護個體對抗肺炎鏈球菌血清型15A、15B及/或15C (較佳15B及/或15C、更佳15B)感染及/或預防肺炎鏈球菌血清型15A、15B及/或15C (較佳15B及/或15C、更佳15B)感染，及/或減輕至少一種與肺炎鏈球菌血清型15A、15B及/或15C (較佳15B及/或15C、更佳15B)所引起之感染相關之症狀的嚴重程度或延遲其發作。7 欲使用本發明之免疫原組合物治療之個體 如本文所揭示，本文所闡述之免疫原組合物可於多種治療或預防性方法中用於預防、治療或改善個體之細菌感染、疾病或病況。 在較佳實施例中，該個體係人類。在最佳實施例中，該個體係新生兒(即，年齡在三個月以下)、嬰兒(即，年齡為3個月至一歲)或幼兒(即，年齡為一歲至四歲)。 在實施例中，本文所揭示之免疫原組合物係用作疫苗。 在該實施例中，欲進行疫苗接種之個體之年齡可小於1歲。舉例而言，欲進行疫苗接種之個體之年齡可為約1個月、約2個月、約3個月、約4個月、約5個月、約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月或約12個月。在實施例中，欲進行疫苗接種之個體之年齡為約2個月、約4個月或約6個月。在另一實施例中，欲進行疫苗接種之個體之年齡小於2歲。例如，欲進行疫苗接種之個體之年齡可為約12個月至約15個月。在一些情形下，需要少至一個劑量之本發明免疫原組合物，但在一些情況下，可給出第二、第三或第四劑量(參見下文部分8)。 在本發明之實施例中，欲進行疫苗接種之個體係年齡為50歲或以上之成年人類，更佳年齡為55歲或以上之成年人類。在實施例中，欲進行疫苗接種之個體係年齡為65歲或以上、年齡為70歲或以上、年齡為75歲或以上或年齡為80歲或以上之成年人類。 在實施例中，欲進行疫苗接種之個體係免疫受損之個體，具體而言人類。免疫受損之個體通常定義為展現減弱或降低的引起針對感染物之攻擊之正常體液或細胞防禦之能力的人。 在本發明之實施例中，欲進行疫苗接種之免疫受損個體患有損害免疫系統且引起不足以防護或治療肺炎球菌性疾病之抗體反應的疾病或病況。 在實施例中，該疾病係原發性免疫缺陷病症。較佳地，該原發性免疫缺陷病症係選自由以下組成之群：組合的T細胞及B細胞免疫缺陷、抗體缺陷、經明確定義之症候群、免疫失調疾病、吞噬細胞病症、固有免疫缺陷、自體發炎性病症及補體缺陷。在實施例中，該原發性免疫缺陷病症係選自WO2010/125480之第24頁、第11行至第25頁、第19行中所揭示者。 在本發明之具體實施例中，欲進行疫苗接種之免疫受損個體患有選自由以下組成之群之疾病：HIV感染、獲得性免疫缺陷症候群(AIDS)、癌症、慢性心臟或肺病症、鬱血性心臟衰竭、糖尿病、慢性肝疾病、酒精中毒、硬化、脊髓液洩露、心肌病、慢性支氣管炎、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(COPD)、脾功能障礙(例如鐮形血球疾病)、脾功能缺乏(無脾)、惡性血液病、白血病、多發性骨髓瘤、霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)、淋巴瘤、腎衰竭、腎病症候群及氣喘。 在本發明之實施例中，欲進行疫苗接種之免疫受損個體患有營養失調。 在本發明之具體實施例中，欲進行疫苗接種之免疫受損個體正服用降低身體對感染之抗性之藥物或治療。在實施例中，該藥物係選自WO2010/125480之第26頁、第33行至第26頁、第4行上所揭示者。 在本發明之具體實施例中，欲進行疫苗接種之免疫受損個體係吸煙者。 在本發明之具體實施例中，欲進行疫苗接種之免疫受損個體之白血細胞計數(白血球計數)小於5 × 109 個細胞/升或小於4 × 109 個細胞/升或小於3 × 109 個細胞/升或小於2 × 109 個細胞/升或小於1 × 109 個細胞/升或小於0.5 × 109 個細胞/升或小於0.3 × 109 個細胞/升或小於0.1 × 109 個細胞/升。 白血細胞計數(白血球計數)：血液中之白血細胞(WBC)數量。WBC通常係作為CBC (全血計數)之部分來量測。白血細胞係血液中之抗感染細胞且不同於紅(攜載氧)血細胞(稱為紅血球)。存在不同類型之白血細胞，包括嗜中性球(多形核白血球；PMN)、桿狀核細胞(稍不成熟之嗜中性球)、T型淋巴球(T細胞)、B型淋巴球(B細胞)、單核球、嗜伊紅血球及嗜鹼性球。白血細胞之所有類型係以白血細胞計數來反映。白血細胞計數之正常範圍通常介於4,300與10,800個細胞/立方毫米血液之間。此亦可提及為白血球計數且可以國際單位表示為4.3 - 10.8 × 109 個細胞/升。 在本發明之具體實施例中，欲進行疫苗接種之免疫受損個體患有嗜中性球減少症。在本發明之具體實施例中，欲進行疫苗接種之免疫受損個體之嗜中性球計數小於2 × 109 個細胞/升或小於1 × 109 個細胞/升或小於0.5 × 109 個細胞/升或小於0.1 × 109 個細胞/升或小於0.05 × 109 個細胞/升。 低白血細胞計數或「嗜中性球減少症」係特徵在於循環血液中之嗜中性球量異常低的病況。嗜中性球係有助於預防及抵抗感染之特定類型之白血細胞。癌症患者經歷嗜中性球減少症之最常見原因在於化學療法之副作用。化學療法引起之嗜中性球減少症增加患者感染之風險且破壞癌症治療。 在本發明之具體實施例中，欲進行疫苗接種之免疫受損個體具有小於500/mm3 之CD4+細胞計數或小於300/mm3 之CD4+細胞計數或小於200/mm3 之CD4+細胞計數、小於100/mm3 之CD4+細胞計數、小於75/mm3 之CD4+細胞計數或小於50/mm3 之CD4+細胞計數。 CD4細胞測試通常報告為mm3 中之細胞數。正常CD4計數介於500與1,600之間，且CD8計數介於375與1,100之間。CD4計數在患有HIV之個人中顯著降低。 在本發明之實施例中，本文所揭示之任一免疫受損個體係男性或女性。8 方案 在一些情形下，需要少至一個劑量之本發明免疫原組合物，但在一些情況(例如較大免疫缺陷之病況)下，可給出第二、第三或第四劑量。在初始疫苗接種後，個體可接受一個或若干個適當間隔之加強免疫。 在實施例中，本發明免疫原組合物之疫苗接種之療程為單一劑量。在具體實施例中，該單一劑量方案用於年齡為至少2歲之健康個人。 在實施例中，本發明免疫原組合物之疫苗接種療程係多劑量療程。在具體實施例中，該多劑量療程係由一系列相隔約1個月至約2個月間隔之2個劑量組成。在具體實施例中，該多劑量療程係由一系列相隔約1個月間隔之2個劑量、或一系列相隔約2個月間隔之2個劑量組成。 在另一實施例中，該多劑量療程係由一系列相隔約1個月至約2個月間隔之3個劑量組成。在另一實施例中，該多劑量療程係由一系列相隔約1個月間隔之3個劑量、或一系列相隔約2個月間隔之3個劑量組成。 在另一實施例中，該多劑量療程係由一系列相隔約1個月至約2個月間隔之3個劑量、在第一劑量後約10個月至約13個月之第四劑量組成。在另一實施例中，該多劑量療程係由一系列相隔約1個月間隔之3個劑量、在第一劑量後約10個月至約13個月之第四劑量、或一系列相隔約2個月間隔之3個劑量、在第一劑量後約10個月至約13個月之第四劑量組成。 在實施例中，多劑量療程係由生命第一年中之至少一個劑量(例如，1個、2個或3個劑量)、隨後至少一個幼兒劑量組成。 在實施例中，多劑量療程係由一系列在年齡為2個月時開始之相隔約1個月至約2個月(例如劑量之間為28-56天)間隔之2個或3個劑量及隨後在年齡為12-18個月時之幼兒劑量組成。在實施例中，該多劑量療程係由一系列在年齡為2個月時開始之相隔約1個月至約2個月(例如劑量之間為28-56天)間隔之3個劑量及隨後在年齡為12-15個月時之幼兒劑量組成。在另一實施例中，該多劑量療程係由一系列在年齡為2個月時開始之相隔約2個月間隔之2個劑量及隨後在年齡為12-18個月時之幼兒劑量組成。 在實施例中，多劑量療程係由在年齡為2個月、4個月、6個月及12-15個月時疫苗之4劑量系列組成。 在實施例中，在第0天給予初次劑量，且以介於約2週至約24週範圍內之間隔、較佳使用4-8週之投藥間隔給予一或多個加強。 在實施例中，在第0天給予初次劑量，且在約3個月後給予加強。 如本文所使用，術語「約」意指在值之統計學上有意義之範圍內，例如所述濃度範圍、時段、分子量、溫度或pH。此一範圍可在一定數量級內，通常給定值或範圍之20%內、更通常10%內、且甚至更通常5%內或1%內。有時，此一範圍可在用於量測及/或確定給定值或範圍之標準方法之典型實驗誤差內。術語「約」所涵蓋之允許變化形式將端視研究下之具體系統而定，且可容易地為熟習此項技術者所瞭解。每當在本申請案內陳述範圍時，亦涵蓋在該範圍內之每個整數作為本發明之實施例。 發明者在本文中所用術語「包含(comprising、comprise及comprises)」意欲可在每一情況下視情況分別經術語「基本上由……組成(consisting essentially of、consist essentially of)」、「由……組成(consisting of、consist of及consists of)」取代。 本專利說明書中所引用之所有參考文獻或專利申請案以引用方式併入本文中。 在隨附實例中闡釋本發明。除非另有詳細闡述，否則以下實例係使用標準技術來實施，該等技術為彼等熟習此項技術者所熟知且係常規技術。該等實例具有闡釋性，但並不限制本發明。實例 實例 1. 用於製備 eTEC 連接之糖結合物之一般製程 醣之活化及使用胱胺二鹽酸鹽之硫醇化 於無水二甲基亞碸(DMSO)中再組成醣。藉由Karl Fischer (KF)分析測定溶液之水分含量且調節以達到介於0.1%與0.4%之間、通常0.2%之水分含量。 為起始活化，於DMSO中新鮮製備濃度為100 mg/mL之1,1’-羰基-二-1,2,4-三唑(CDT)或1,1’-羰基二咪唑(CDI)之溶液。使用不同量之CDT/CDI (1 - 10莫耳當量)活化醣，且使反應在23℃ ± 2℃下進行1小時。可藉由HPLC測定活化程度。於無水DMSO中新鮮製備濃度為50 mg/mL之胱胺二鹽酸鹽。使經活化之醣與1莫耳當量(mol. eq.)之胱胺二鹽酸鹽反應。或者，使經活化之醣與1 mol. eq.之半胱胺鹽酸鹽反應。使硫醇化反應在23℃ ± 2℃下進行21 ± 2小時，以產生硫醇化醣。藉由CDT/CDI之添加量測定硫醇化程度。 藉由添加100 mM四硼酸鈉(pH 9.0)溶液淬滅活化反應溶液中之殘餘CDT/CDI。實施計算以確定四硼酸鹽之添加量並將最終水分含量調節至總水溶液之至多1%-2%。經活化硫醇化醣之還原及純化 藉由添加至0.9%鹽水中之預冷的5 mM琥珀酸鈉(pH 6.0)中將硫醇化醣反應混合物稀釋10倍，且經由5 μm過濾器過濾。針對40倍滲濾體積之WFI實施硫醇化醣之滲濾。藉由10%體積之0.1M磷酸鈉緩衝液(pH 6.0)稀釋後，向滲餘物添加叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)之1 - 5 mol. eq.溶液。使此還原反應在5℃ ± 3℃下進行20 ± 2小時。較佳藉由針對預冷的10 mM磷酸二氫鈉(pH 4.3)之超濾/滲濾來純化經活化之硫醇化醣。或者，藉由標準粒徑排阻層析(SEC)程序或離子交換層析方法純化硫醇化醣。取出經活化硫醇化醣滲餘物之等份以確定醣濃度及硫醇含量(Ellman)分析。經活化硫醇化醣之替代性還原及純化 作為上述純化程序之替代，亦如下文純化經活化之硫醇化醣。 向硫醇化醣反應混合物添加叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)之5 - 10 mol. eq.溶液，且使其在23℃ ± 2℃下進行3 ± 1小時。然後藉由添加至0.9%鹽水中之預冷的5 mM琥珀酸鈉(pH 6.0)中將反應混合物稀釋5倍，且經由5 μm過濾器過濾。使用40倍滲濾體積之預冷的10 mM磷酸二氫鈉(pH 4.3)實施硫醇化醣之滲濾。取出經活化硫醇化醣滲餘物之等份以確定醣濃度及硫醇含量(Ellman)分析。溴乙醯化載體蛋白質之活化及純化 藉由與溴乙醯化劑(例如溴乙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(BAANS)、溴乙醯溴)或另一適宜試劑反應對載體蛋白質之游離胺基實施溴乙醯化。 在活化前，將載體蛋白質(於0.1M磷酸鈉(pH 8.0 ± 0.2)中)首先保持在8℃ ± 3℃、約pH 7下。向蛋白質溶液添加比率為0.25-0.5 BAANS:蛋白質(w/w)之溴乙酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(BAANS)作為二甲基亞碸(DMSO)原液(20 mg/mL)。在5℃ ± 3℃下將反應物溫和地混合30 - 60分鐘。使用10 mM磷酸鹽(pH 7.0)緩衝液藉由例如使用10 kDa MWCO膜超濾/滲濾來純化所得溴乙醯化(經活化)蛋白質。純化後，藉由Lowry蛋白質分析估計溴乙醯化載體蛋白質之蛋白質濃度。 藉由總溴分析藉由與阻抑導電率檢測偶合之離子交換液相層析(離子層析)來確定活化程度。使經活化之溴乙醯化蛋白質上之連結溴化物自分析樣品製劑中之蛋白質裂解，且與可存在之任何游離溴化物一起量化。藉由加熱鹼性2-巰基乙醇中之樣品轉化成離子型溴化物來釋放蛋白質上任何剩餘的共價連結之溴。溴乙醯化 CRM197 之活化及純化 使用10 mM磷酸鹽緩衝之0.9% NaCl (pH 7) (PBS)將CRM197 稀釋至5 mg/mL，且然後使用1 M原液製備0.1 M NaHCO3 (pH 7.0)。使用20 mg/mL DMSO之BAANS原液以CRM197 : BAANS比率1 : 0.35 (w:w)添加BAANS。在3℃與11℃之間將反應混合物培育30 min-1小時，然後使用10K MWCO膜及10 mM磷酸鈉/0.9% NaCl (pH 7.0)藉由超濾/滲濾純化。藉由Lowry分析來分析經純化之活化CRM197 以測定蛋白質濃度，且然後使用PBS稀釋至5 mg/mL。將蔗糖添加至5% wt/vol中作為低溫保護劑，且將經活化蛋白質冷凍並儲存在-25℃下直至為結合所需。 CRM197 之離胺酸殘基之溴乙醯化極一致，從而使得可活化39個離胺酸中之15至25個離胺酸。該反應產生經活化蛋白質之高產率。經活化硫醇化醣與溴乙醯化載體蛋白質之結合 在起始結合反應之前，將反應器皿預冷至5℃。隨後添加溴乙醯化載體蛋白質及經活化硫醇化醣，且以150-200 rpm之攪動速度混合。醣/蛋白質輸入比為0.9 ± 0.1。使用1 M NaOH溶液將反應pH調節至8.0 ± 0.1。在5℃下使結合反應進行20 ± 2小時。殘餘反應性官能基之封端 藉由在5℃下與作為封端試劑之2 mol. eq.之N-乙醯基-L-半胱胺酸反應3小時來淬滅載體蛋白質上未反應之溴乙醯化殘基。在5℃下使用4 mol. eq.之碘乙醯胺(IAA)將殘餘游離硫氫基封端20小時。eTEC 連接之糖結合物之純化 經由0.45 µm過濾器過濾結合反應(IAA封端後)混合物。針對5 mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)實施糖結合物之超濾/滲濾。然後經由0.2 µm過濾器過濾糖結合物滲餘物。取出糖結合物之等份以供分析。將剩餘糖結合物儲存在5℃下。實例 2. Pn-33F eTEC 結合物之製備 活化方法 Pn33F 多醣之活化 使Pn-33F多醣與500 mM 1,2,4-三唑(於WFI中)複合以獲得10克三唑/克多醣。在乾冰-乙醇浴中將混合物套管冷凍(shell-frozen)，且然後凍乾至乾燥。於無水二甲基亞碸(DMSO)中再組成凍乾之33F多醣。藉由Karl Fischer (KF)分析測定凍乾之33F/DMSO溶液之水分含量。藉由將WFI添加至33F/DMSO溶液中來調節水分含量以達到0.2%之水分含量。 為起始活化，新鮮製備1,1’-羰基-二-1,2,4-三唑(CDT)於DMSO中之100 mg/mL溶液。使用不同量之CDT活化Pn33F多醣，然後實施硫醇化步驟。在23℃ ± 2℃下實施1小時之CDT活化。藉由HPLC (A220/A205)測定活化程度。添加100 mM四硼酸鈉溶液(pH 9.0)以淬滅活化反應溶液中之任何殘餘CDT。實施計算以確定四硼酸鹽之添加量，且使最終水分含量為總水溶液之1.2%。使反應在23℃ ± 2℃下進行1小時。經活化 Pn-33F 多醣之硫醇化 於無水DMSO中新鮮製備胱胺二鹽酸鹽，且將1 mol. eq.胱胺二鹽酸鹽添加至經活化多醣反應溶液中。使反應在23℃ ± 2℃下進行21 ± 3小時。藉由添加至0.9%鹽水中之預冷的5 mM琥珀酸鈉(pH 6.0)中將硫醇化醣溶液稀釋10倍。經由5 μm過濾器過濾所稀釋之反應溶液。使用100K MWCO超濾膜箱使用注射用水(WFI)實施硫醇化Pn-33F多醣之滲濾。經活化硫醇化 Pn-33F 多醣之還原及純化 藉由10%體積之0.1M磷酸鈉緩衝液(pH 6.0)稀釋後，向滲餘物添加叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)之5 mol. eq.溶液。使此還原反應在23℃ ± 2℃下進行2 ± 1小時。使用100K MWCO超濾膜箱實施硫醇化33F多醣之滲濾。針對預冷的10 mM磷酸鈉(pH 4.3)實施滲濾.  取出硫醇化33F多醣滲餘物以供醣濃度及硫醇(Ellman)分析二者。經活化硫醇化 Pn-33F 多醣之替代性還原及純化 作為上述純化程序之替代，亦如下純化經活化硫醇化33F醣。 向硫醇化醣反應混合物添加叁(2-羧基乙基)膦(TCEP)之5 mol. eq.溶液，且使反應在23℃ ± 2℃下進行3 ± 1小時。然後藉由添加至0.9%鹽水中之預冷的5 mM琥珀酸鈉(pH 6.0)中將反應混合物稀釋5倍，且經由5 μm過濾器過濾。使用40倍滲濾體積之預冷的10 mM磷酸二氫鈉(pH 4.3)與100K MWCO超濾膜箱實施硫醇化醣之滲濾。取出硫醇化33F多醣滲餘物以供醣濃度及硫醇(Ellman)分析二者。活化方法之流程圖提供於圖8(A)中。結合方法 硫醇化 Pn33F 多醣與溴乙醯化 CRM197 之結合 藉由溴乙醯化單獨活化CRM197 載體蛋白質，如實例1中所闡述，且然後與經活化之Pn-33F多醣反應用於結合反應。在起始結合反應之前，將反應器皿預冷至5℃。在反應器皿中以150-200 rpm之攪動速度將溴乙醯化CRM197 及硫醇化33F多醣混合在一起。醣/蛋白質輸入比為0.9 ± 0.1。將反應pH調節至8.0 - 9.0。使結合反應在5℃下進行20 ± 2小時。溴乙醯化 CRM197 及硫醇化 Pn33F 多醣上反應性基團之封端 藉由在5℃下與2 mol. eq.之N-乙醯基-L-半胱胺酸反應3小時對CRM197 蛋白上未反應之溴乙醯化殘基實施封端，然後在5℃下使用4 mol. eq.之碘乙醯胺(IAA)將硫醇化33F多醣之任何殘餘游離硫氫基封端20小時。eTEC 連接之 Pn-33F 糖結合物之純化 經由0.45 µm或5 µm過濾器過濾結合物溶液。使用300K MWCO超濾膜箱實施33F糖結合物之滲濾。針對5 mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)實施滲濾。然後經由0.22 µm過濾器過濾Pn-33F糖結合物300K滲餘物，且儲存在5℃下。結合方法之流程圖提供於圖8(B)中。結果 若干批Pn-33F eTEC糖結合物之反應參數及表徵數據展示於表1中。使用胱胺二鹽酸鹽之CDT活化-硫醇化會產生具有63%至90%醣產率及＜1%至13%游離醣之糖結合物。表 1. Pn33F eTEC 結合物之實驗參數及表徵數據
結合批次 33F-1A 33F-2B 33F-3C 33F-4D 33F-5E 33F-6F 33F-7G
活化程度 (mol 硫醇 /mol 多醣 ) 0.21 0.13 0.164 0.103 0.183 0.22 0.19
活化程度 (% 硫醇 ) 21 13 16.4 10.3 18.3 22 19
醣 / 蛋白質 ( 輸入 ) 比率 0.75 1.0 0.75 1.0 1.0 0.75 0.80
醣 產率 (%) 69% 63% 71% 63% 69% 82% 90%
醣 / 蛋白質比率 1.3 1.7 1.2 1.9 1.6 1.1 1.5
游離醣 12.9% 7.7% 4.4% 7.2% 7.3% ＜ 4% ＜ 4 %
藉由 SEC-MALLS 獲得之 MW (kDa) 2627 2561 4351 2981 3227 3719 5527
CMCA/CMC 14.4/0 13.4/0 6.8/1.9 2.7/0.6 5.9/0.6 8.2/0 11.4/0.6
Kd % ( ≤ 0.3) N/A 85% 88% 75% 68% 67% 76%
乙醯化程度 (mol 乙酸鹽 /mol 多醣 ) 0.89 1.16 0.99 0.85 0.81 0.85 1.01
N/A= 未獲得Pn-33F eTEC 糖結合物針對 CRM197 之 OPA 效價 在標準條件下測定小鼠中之Pn-33F OPA效價(類似於下文針對10A及22F結合物闡述之OPA程序)。四週及七週時之OPA效價(具有95% CI之GMT)展示於表2中，此展示在鼠類免疫原性模型中血清型33F Pn糖結合物激發OPA效價。表 2. Pn-33F OPA 效價 ( 具有 95% CI 之 GMT)
33F Pn 結合物 0.001 µg 0.01 µg 0.1 µg
第 4 週 4 (4, 5) 37 (17, 82) 414 (234, 734)
第 7 週 8 (5, 13) 131 (54, 314) 17567 (9469, 32593)
實例 3. 其他 Pn-33F eTEC 結合物之製備 其他Pn-33F eTEC結合物係使用實例2中所闡述之製程來產生。該等其他批Pn-33F eTEC糖結合物之反應參數及表徵數據展示於表3中。表 3. 其他 Pn33F eTEC 結合物之實驗參數及表徵數據
結合批次 33F-8H 33F-9I 33F-10J 33F-11K 33F-12L 33F-13M 33F-14N 33F-15O 33F-16P
活化程度 (mol 硫醇 /mol 多醣 ) 0.22 0.11 0.11 0.13 0.14 0.13 0.06 0.13 0.11
醣 / 蛋白質 ( 輸入 ) 比率 0.75 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8
醣 產率 (%) 78% 88% 89% 67% 69% 86% 81% 91% 88%
醣 / 蛋白質比率 1.0 2.2 2.1 1.4 1.4 1.4 2.2 1.9 1.9
游離醣 ＜ 1% 6.8% 5.9% 2.3% 3.6% LOQ 8.2% 3.6% 6.6%
藉由 SEC-MALLS 獲得之 MW (kDa) 4729 3293 3295 2246 2498 5539 3070 6009 3789
CMCA/ CMC 6.6/ LOQ 14.2/2.1 15.4/2.1 5.5/1 5.4/ 1.1 NA/LOQ 1.7/ 1.2 4.1/ 2.2 2.2/1.2
Kd % ( ≤ 0.3) 69% N/A N/A N/A N/A 88% 87% 87% 85%
乙醯化程度 (mol 乙酸鹽 /mol 多醣 ) 0.86 0.93 0.87 1.01 0.99 0.71 0.78 0.8 0.82
LOQ=量化之限值；N/A= 未獲得。 如上文及表3中所展示，使用上述eTEC結合物獲得若干Pn-33F結合物。eTEC化學允許製備具有高產率、低游離醣%及高結合度(結合離胺酸)之結合物。另外，可使用eTEC結合方法保持大於80%之乙醯基官能基。實例 4. Pn-33F eTEC 糖結合物穩定性之評估：游離醣趨勢 % 將結合批次33F-2B之等份(參見表1)分配於聚丙烯管中，且分別儲存在4℃、25℃及37℃下並監測游離醣%之趨勢。數據(游離醣%)展示於表4中。如此表中所展示，游離醣%無顯著變化。表 4. Pn-33F eTEC 糖結合物在 4 ℃ 、 25 ℃ 及 37 ℃ 下之游離醣 % 穩定性
批號 游離醣 (%)
時間
33F-2B 0 1wk 3wk 1M 2M 3M 6M
4 ℃
7.7 N/A 8.3 N/A 9.7 11.2 13
25 ℃
7.7 N/A 10.8 N/A 11.8 N/A N/A
37 ℃
7.7 12.1 N/A 13.4 N/A N/A N/A
wk= 週；M=月；N/A= 未獲得。 亦在37℃下使另一結合批(批次33F-3C)之加速穩定性實施至多1個月。如表5中所展示，在37℃下游離醣%至多1個月無顯著變化。表 5. Pn-33F eTEC 糖結合物在 37 ℃ 下之游離醣 % 穩定性
批號 游離醣 (%)
時間
33F-3C 0 1 天 1wk 2wk 1M
37 ℃
4.4 5.9 6.4 7.1 7.2
為進一步確認eTEC結合物之穩定性，將儲存在4℃下之其他結合批次(33F-3C及33F-5E (參見表1))監測至多約一年，用於游離醣%之潛在趨勢。如表6中所展示，儲存在4℃下之結合物之游離醣含量%在至多約一年之延長時段內無顯著變化。表 6. Pn-33F eTEC 糖結合物在 4 ℃ 下之游離醣 % 穩定性結果
批號 游離醣 (%)
時間
0 3M 4M 12M 14M
4 ℃
33F-3C 4.4 N/A 5.3 N/A 7.6
33F-5E 7.3 6.3 N/A 7.4 N/A
M=月；N/A= 未獲得 展示藉由33F eTEC化學產生之血清型33F結合物係穩定的且無可注意到之降解，如藉由不同溫度下之游離醣趨勢所監測(實時及加速)。實例 5. CRM197 之 Pn-8 結合物之製備 Pn-8 RAC/DMSO糖結合物之製備 將冷凍之多醣解凍且轉移至反應器皿。將2M乙酸及WFI (注射用水)添加至多醣溶液中以達成約2.5 g/L之最終多醣濃度及0.2M之最終乙酸濃度。 多醣之水解 在活化之前將天然多醣以化學方式水解。將經稀釋之多醣溶液加熱至70℃，且然後在此溫度下保持3.5小時。 多醣之氧化 藉由添加過碘酸鈉溶液起始多醣之氧化且保持反應在23℃下進行20 hr。 經活化多醣之純化 使用超濾箱濃縮經活化之多醣。針對20倍滲濾體積之WFI實施滲濾。 凍乾 將經活化多醣與蔗糖複合至25克蔗糖/克經活化多醣之比率。將含有經活化醣及蔗糖之瓶套管冷凍於乙醇浴中且凍乾。 經活化多醣與CRM197 之結合及封端 於DMSO中將凍乾之經活化多醣再組成至2 mg/mL。將DMSO添加至凍乾的CRM197 中用於再組成。將再組成的CRM197 添加至再組成的經活化多醣中。然後藉由將氰基硼氫化鈉添加至反應混合物中起始結合，且在23℃下培育24 hr。藉由添加2 MEq硼氫化鈉來終止結合反應。使此封端反應在23℃下進行3 hr。 結合物之純化 然後將結合物溶液稀釋至經冷卻之5 mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)中，過濾，使用300K纖維素膜濃縮至2 - 4 g/L，且針對5 mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)實施第一階段滲濾。藉由使用5 mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)緩衝液滲濾來實施最終純化步驟。完成滲濾後，經由0.22 μm過濾器將經純化之結合物轉移至收集罐。 單價本體結合物之稀釋 使用5 mM琥珀酸鹽/ 0.9%鹽水(pH 6)將結合物進一步稀釋至0.5 mg/mL之目標醣濃度。完成最終0.22 μm過濾步驟以製備單價本體結合物(MBC)產物用於調配。 使用上述方法藉由改變不同參數(例如，醣-蛋白質輸入比、反應濃度及氰基硼氫化鈉之Meq)來獲得若干結合物。關於CRM197 之代表性Pn-8糖結合物之表徵提供於表7中。表 7. Pn8-CRM197 結合物之表徵
樣品編號 1 2 3 4 5 6 7 8 9
藉由 MALLS 獲得之經活化醣 MW (kDa) 267 270 352 65 233 340 113 250 230
醣 / 蛋白質比率 0.81 0.84 0.5 2.7 1.15 1.0 0.81 0.64 0.42
藉由 SEC-MALLS 獲得之 MW (kDa) 12200 8670 3460 3379 4748 4255 5470 9924 6787
在標準條件下在小鼠中測定小鼠中之血清型8-CRM197 結合物之調理吞噬活性(OPA)效價(類似於下文針對10A及22F結合物闡述之OPA程序)。在四週時在不同劑量下之OPA效價(具有95%信賴區間(CI)之幾何平均效價(GMT))展示於表8及9 (兩個單獨實驗)中，此展示在鼠類免疫原性模型中血清型8結合物(樣品1-9；亦參見關於該等結合物的表徵數據之表7)激發OPA效價。 如表8中所展示，展示血清型8結合物具有與具有較低抗體效價之未經結合之對照多醣相比，顯著較高之抗體效價。表 8. 血清型 8-CRM197 結合物之免疫原性
   OPA GMT (95% CI)
樣品編號 0.001 µg 0.01 µg 0.1 µg
1 17 (10, 30) 88 (47, 165) 1344 (896, 2016)
2 7 (4, 11) 184 (87, 387) 1934 (1313, 2847)
3 4 (4, 4) 17 (9, 30) 779 (345, 1757)
4 5 (4, 7) 74 (41, 136) 558 (311, 1001)
未經結合之 PS       13 (3, 55)
表 9. 血清型 8-CRM197 結合物之免疫原性
OPA GMT (95% CI)
樣品編號 0.001 µg 0.01 µg
5 8 (5, 12) 322 (208, 498)
6 12 (8, 19) 264 (129, 537)
7 12 (7, 21) 521 (366, 743)
8 19 (10, 38) 404 (238, 687)
9 33 (14, 80) 686 (380, 1237)
2 13 (7, 23) 177 (94, 336)
自藉由上述還原性胺化製程製備之結合物產生之總體數據展示允許製備具有良好結合產率、低游離醣%及具有良好穩定性之結合物。另外，在鼠類免疫原性模型中所製備之結合物激發良好的OPA效價。實例 6. 血清型 10A 多醣 -CRM197 結合物之製備 經分離肺炎鏈球菌血清型10A多醣之製備 血清型10A莢膜多醣可使用熟習此項技術者已知之分離程序(例如，參見美國專利申請公開案第2006/0228380號、第2006/0228381號、第2007/0184071號、第2007/0184072號、第2007/0231340號及第2008/0102498號以及第WO2008/118752號中所揭示之方法)自細菌直接獲得。使肺炎鏈球菌血清型10A於種子瓶中生長，且然後轉移至種子發酵罐。達到目標光學密度後，立即將細胞轉移至生產發酵罐。藉由添加N-月桂醯肌胺酸使發酵培養液失活且藉由超濾及滲濾來純化。 經分離之肺炎鏈球菌血清型10A莢膜多醣之氧化 將經計算體積之0.1M磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)及注射用水(WFI)添加至多醣溶液中以達成2.5g/L之最終多醣濃度及25 mM磷酸鉀緩衝液之最終濃度，若需要將pH調節至約6.0。然後將經稀釋之多醣冷卻至5℃。藉由添加0.25莫耳當量(MEq)之過碘酸鈉溶液來起始氧化。在5℃下之氧化反應時間為約4 hr。在5℃下持續攪拌1-2 hr用1 MEq之2,3-丁二醇淬滅氧化反應。 達到目標反應時間後，使用30K MWCO Millipore超濾箱濃縮經活化之多醣。然後針對20倍滲濾體積之WFI實施滲濾。將經純化經活化之多醣儲存在5℃下。尤其藉由(i) 藉由SEC-MALLS獲得之分子量及(ii) 氧化程度來表徵經純化經活化之醣。 經活化之肺炎鏈球菌血清型10A多醣與CRM197 之結合 結合方法係由以下步驟組成： a. 與蔗糖賦形劑複合並凍乾； b. 經凍乾多醣與CRM197 之再組成； c. 經活化多醣與CRM197 之結合及封端；及 d. 結合物之純化 a. 與蔗糖複合 將經活化多醣與蔗糖複合至25 g蔗糖/克經活化多醣之比率。然後將複合混合物之瓶凍乾。凍乾後，將含有凍乾的經活化多醣之瓶儲存在-20℃下。 b. 凍乾的經活化多醣與CRM197 蛋白之再組成 將凍乾的經活化多醣於無水二甲基亞碸(DMSO)中再組成。在多醣完全溶解後，將相同量之DMSO添加至經計算CRM197 中用於再組成。 c. 經活化多醣與CRM197 之結合及封端 在結合反應器中將再組成的CRM197 (於DMSO中)添加至再組成的經活化多醣中。最終多醣濃度係1 g/L。藉由將1.2 MEq之氰基硼氫化鈉添加至反應混合物中來實施結合。在23℃下將反應物培育24 hr。藉由添加2 MEq硼氫化鈉來終止結合反應。在23℃下將封端反應物培育3 hr。 藉由添加2 MEq硼氫化鈉來終止結合反應。使此封端反應在23℃下進行3 hr。 d. 結合物之純化 然後將結合物溶液稀釋至5× (以體積計)經冷卻之5 mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)中，且使用5 mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)實施20×滲濾。完成初始滲濾後，經由0.22 μm過濾器轉移結合物滲餘物。使用5 mM琥珀酸鹽/ 0.9%鹽水(pH 6)進一步稀釋結合物，且在最終0.22 μm過濾步驟後將其儲存在2℃-8℃下。 使用上述方法藉由改變不同參數(例如，醣-蛋白質輸入比、反應濃度及氰基硼氫化鈉之MEq)來獲得若干結合物。使上述化學產生血清型10A結合物，其經展示為穩定的且無可注意到之降解，如藉由不同溫度下之游離醣趨勢所監測(實時及加速)。CRM197 之代表性Pn-10A糖結合物之表徵提供於表10中。表 10. Pn-10A-CRM197 結合物之表徵
結合物編號 1 2 3 4 5 6
DO 12.2 19.5 5.2 10.3 10.8 10.5
經活化之醣 MW, kDa 191 240 80 170 170 170
輸入比 1.0 1.0 1.0 1.1 1.1 1.1
產率 % 56 28.5 65 82 73 66
游離醣 % 6.8 10.0 6.7 6.8 6.4 9.7
結合物 MW, kDa 3838 5810 4630 4034 3463 5540
醣 / 蛋白質比率 0.82 0.88 0.85 1.1 1.2 1.0
Lys 修飾 AAA 7.4 3.7 13.1 6.9 6.7 6.1
在標準條件下測定小鼠中血清型10A-CRM197 結合物之調理吞噬活性(OPA)效價。在第0週時，使用0.001 µg、0.01 µg或0.1 µg測試結合物經由皮下途徑對36-37週齡之雌性瑞士韋伯斯特(Swiss Webster)小鼠之群實施免疫。在第3週時使用相同劑量之結合物對小鼠實施加強免疫，且然後在第4週時採血。對第4週血清樣品實施血清型特異性OPA。 使用調理吞噬活性(OPA)分析來量測鼠類血清中特異性針對肺炎鏈球菌血清型10A之功能性抗體。在分析反應中設定測試血清，該等分析反應量測莢膜多醣特異性免疫球蛋白調理細菌、觸發補體沈積、由此促進吞噬作用及吞噬細胞殺死細菌的能力。OPA效價定義為使細菌計數比不含測試血清之對照孔減少50%的倒數稀釋。OPA效價自兩種涵蓋此50%殺死截止值之稀釋物內插。 OPA程序係基於具有以下修改之Hu等人(2005) Clin Diagn Lab Immunol 12 (2):287-295中所闡述之方法。將測試血清連續稀釋2.5倍且添加至微量滴定分析板中。將活血清型10A目標細菌菌株添加至孔中，且在37℃下將板振盪30分鐘。將分化的HL-60細胞(吞噬細胞)及幼兔血清(3至4週齡，PEL-FREEZ®, 12.5%最終濃度)添加至孔中，且在37℃下將板振盪60分鐘。為終止反應，將80 µL 0.9% NaCl添加至所有孔中，混合，且將10 µL等份轉移至含有200 µL水之MULTISCREEN® HTS HV過濾板(MILLIPORE®)之孔中。在真空下經由板過濾液體，且將150 µL HYSOY®培養基添加至每孔中並過濾。然後在37℃、5% CO2 下將過濾板培育過夜，且然後使用脫色溶液(Bio-Rad Laboratories公司, Hercules, CA)固定。然後用考馬斯藍(Coomassie Blue)對板進行染色且脫色一次。使菌落成像且列舉於Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, OH) IMMUNOSPOT®分析儀上。使用生菌落計數來繪製殺死曲線並計算OPA效價。 在四週時在不同劑量下之OPA效價(具有95%信賴區間(CI)之幾何平均效價(GMT))展示於表11中，此展示在鼠類免疫原性模型中血清型10A結合物(樣品1-3；亦參見關於該等結合物的表徵數據之表10)激發OPA效價。如表11中所展示，展示血清型10A結合物具有與具有較差OPA反應之未經結合之對照多醣相比顯著較高之OPA效價。表 11. 血清型 10A-CRM197 結合物之免疫原性
   OPA GMT (95% CI)
樣品編號 0.001 µg 0.01 µg 0.1 µg
1 858 (556, 1324) 1015 (610, 1691) 4461 (3065, 6494)
2 1411 (737, 2703) 796 (460, 1378) 2873 (1768, 4842)
3 322 (180, 574) 1062 (528, 2135) 2618 (1415, 4842)
未經結合之 PS       602 (193, 1882)
實例 7. 使用 TEMPO/NCS 之 Pn 血清型 -12F 之結合 為改良血清型12F-CRM197 糖結合物之穩定性，探究使用2,2,6,6-四甲基-1-六氫吡啶基氧基自由基(TEMPO)及作為輔助氧化劑之N-氯琥珀醯亞胺(NCS)以將一級醇氧化成醛基團之替代化學。GC/MS分析展示氧化位點與過碘酸鹽介導之氧化位點不同。在TEMPO-NCS氧化之情形下，α-D-Glcp及2-Glcp皆經氧化，而在使用過碘酸鹽時α-D-Galp係主要氧化位點(參見圖4)。如本文進一步詳細闡述，TEMPO係以催化量(≤ 0.1莫耳當量)來使用，且期望氧化程度(DO)係藉由改變所用NCS之量來達成。隨後合成並表徵若干結合物。一般而言，在若干時期中如下實施血清型12F糖結合物之製造： a) 使血清型12F多醣水解成分子量50 kDa至500 kDa b) 用TEMPO/NCS活化血清型12F多醣； c) 純化經活化多醣； d) 使經活化之血清型12F結合至CRM197 蛋白；及 e) 純化血清型12F-CRM197 結合物。 血清型12F之水解及氧化 通常在酸性條件下藉由加熱來實施多醣之水解以獲得介於100 kDa至350 kDa之期望範圍內之平均分子量。典型實驗闡述於下文中。 水解 將血清型12F多醣溶液添加至夾套反應器皿中。向此器皿中添加所需體積之0.30 M乙酸及注射用水(WFI)以維持約0.1 M乙酸濃度。使用1 N NaOH或冰乙酸將溶液之pH調節至3.2 ± 0.3。將反應混合物之溫度升高至70℃ ± 5℃。在70℃ ± 5℃下將反應混合物攪拌90-120分鐘。將反應混合物冷卻至23℃ ± 2℃且藉由添加1 M NaOH溶液中和(pH 7.0)。使用30K MWCO膜藉由針對WFI之超濾/滲濾純化水解多醣。經由0.22 µm過濾器過濾溶液且儲存在2℃至8℃下直至氧化。藉由SEC-MALLS分析水解多醣之分子量以確保分子量滿足100 kDa至350 kDa之目標範圍。 部分氧化 在一實驗中，使用壓力均質化使用微流化器機械分篩血清型12F多醣以使分子量減小至約100 kDa至500 kDa。將所分篩多醣以4.0 mg/mL之濃度添加至反應器皿中，且以1:1 v/v之比率與碳酸氫鹽/碳酸鹽緩衝液(0.5 M NaHCO3 /0.05 M Na2 CO3 緩衝液，pH 8.6)混合。向攪拌混合物添加≤ 0.1 mol當量之TEMPO。藉由添加0.6至1.0 mol當量之NCS來起始反應。在室溫下將反應混合物攪拌2小時，然後使用30K超濾膜使用WFI藉由滲濾純化經活化之多醣。收集經純化之多醣，且藉由定量量測醛(使用3-甲基-2-噻黴酮腙(MBTH)分析)及多醣(使用蒽酮分析)確定氧化程度(DO)。 在另一實驗中，將血清型12F多醣水解以使分子量減小至約100 kDa至500 kDa之分子量。將血清型12F多醣添加至反應器皿中，且以1:1 v/v之比率與0.5 M NaHCO3 /0.05 M Na2 CO3 緩衝液(pH 8.6)混合。向攪拌混合物中添加0.6至1.0莫耳當量之溶解於WFI中之NCS。藉由添加約0.1莫耳當量之溶解於WFI中之TEMPO起始活化。在室溫下將反應混合物攪拌2小時，然後使用30K超濾膜使用WFI藉由滲濾純化經活化之多醣。經由0.2 µm過濾器過濾經純化經活化之多醣且儲存在4℃以供後續使用。 亦在pH為6.5、7.0、7.5及8.0之磷酸鈉緩衝液中實施TEMPO/NCS介導之氧化。在一些活化實驗中，使用一級醇(例如正丙醇)來淬滅試劑以避免醣過度氧化。在另一組實驗中，使化學水解之多醣直接經受氧化，而不使用超濾/滲濾純化步驟。 血清型12F氧化多醣之結合 在一實驗中，將經純化氧化之血清型12F多醣添加至反應器皿中，然後添加0.5 M磷酸鈉緩衝液(pH 6.5)以達到0.1 M之最終緩衝液濃度。向此溶液中添加先前凍乾之CRM197 ，並充分混合以獲得均質溶液。使用稀HCl或1N NaOH溶液將pH調節至6.8。然後向此溶液中添加1.5莫耳當量之NaCNBH3 。將反應混合物在室溫(23℃)下攪拌24小時且在37℃下攪拌2.5天。然後用1× 0.9%鹽水稀釋反應混合物，並使用2莫耳當量之硼氫化鈉對未反應之醛基團進行「封端」。封端反應時間為3小時。 在另一實驗中，將經純化經活化之血清型12F添加至反應器皿中，然後添加0.5M磷酸鈉緩衝液(pH 6.5)以達到0.1 M之最終緩衝液濃度。向此溶液中添加先前凍乾之CRM197 且充分混合以獲得均質溶液。使用稀HCl或1N NaOH溶液將pH調節至6.8。然後向此溶液中添加3莫耳當量之NaCNBH3 。將反應混合物在23℃下攪拌24小時且在37℃下攪拌48 hr。然後用1× 0.9%鹽水且在攪拌的同時稀釋反應混合物，使用1莫耳當量硼氫化鈉NaBH4 對未反應之醛基團進行「封端」。封端反應時間為3小時。 在另一實驗中，將經純化經活化之血清型12F添加至反應器皿中且與CRM197 溶液混合。將混合物凍乾且將粉末溶解於0.1 M磷酸鈉緩衝液(pH 6.8)中以達到5 mg/mL之最終醣濃度。若需要，使用稀HCl或1N NaOH溶液將pH調節至6.8。然後向此溶液中添加3莫耳當量NaCNBH3 。將反應混合物在23℃下攪拌24小時且在37℃下攪拌48 hr。然後用1× 0.9%鹽水稀釋反應混合物，使用1莫耳當量硼氫化鈉NaBH4 對未反應之醛基團實施「封端」。封端反應時間為3小時。 結合物純化 使用5 µm過濾器過濾經封端之反應混合物，且然後使用100K MWCO超濾膜純化。首先使用10 mM琥珀酸鹽/0.9%鹽水(pH 6.0)緩衝液對結合物實施滲濾。然後經由0.45/0.22 µm過濾器過濾經純化之結合物以獲得本體結合物。 氧化程度 使用TEMPO/NCS系統達成血清型12F多醣中一級醇之成功氧化。藉由調節NCS輔助氧化劑之量將水解之血清型12F多醣氧化至不同氧化程度(DO)值。使用不同多醣批次及分子量之不同量之NCS對DO之效應展示於圖9中。通常，氧化反應係在2小時內完成，此乃因在2小時後未觀察到DO之顯著變化。 使用TEMPO/NCS氧化多醣產生並表徵若干血清型12F結合物。結果概述於表12中。表 12. 肺炎球菌血清型 12F-CRM197 結合物
結合批次 12F-84A 12F-97B 12F-147C 12F-171D 12F-177-6E 12F-181F
氧化時間 (hr) 2 2 4 2 2 2
氧化程度 (DO) 12.0 6.0 9.6 12.0 11.5 11.5
經活化之醣產率 % 80 71 70 89 86 86
藉由 MALLS 獲得之經活化醣 MW (kDa) 137 155 170 190 240 240
結合方法 Lyo-CRM Lyo-CRM Lyo-CRM Lyo-CRM Lyo-CRM Co-Lyo
結合結果                  
醣 產率 (%) 51.6 76.8 53.6 76.3 65.8 40.7
醣 / 蛋白質比率 1.2 0.9 1.0 1.1 1.4 0.9
游離醣 % 24 10 17 20 23 14
藉由 SEC-MALLS 獲得之 MW (kDa) 2050 3000 3600 1500 2400 2100
實例 8. 使用 TEMPO/NCS 氧化方法之 Pn- 血清型 12F-CRM197 結合物之免疫原性 在標準條件下在小鼠中測定小鼠中血清型12F-CRM197 結合物之調理吞噬活性(OPA)效價。在四週及七週時之OPA效價(具有95%信賴區間(CI)之幾何平均效價(GMT))展示於表13中，此展示在鼠類免疫原性模型中血清型12F-CRM197 結合物(批次12F-97B；亦參見關於此結合物之表徵數據之表12)激發OPA效價。藉由TEMPO-NCS產生之結合物比自過碘酸鹽氧化產生之對照結合物(171B)更具免疫原性。表 13. 血清型 12F-CRM197 結合物之免疫原性
結合樣品 / 劑量 0.001 µg 0.01 µg 0.1 µg
過碘酸鹽氧化 (171B) 對照 4 16 172
TEMPO/NCS 氧化 (12F-97B) 40 417 880
實例 9 . Pn-12F 糖結合物穩定性之評估 藉由比較過碘酸鹽氧化相對於TEMPO/NCS氧化產生之結合物之穩定性(在25℃下)(參見圖10)展示藉由氧化Pn-12F多醣產生之結合物相對更穩定。如圖10中所展示，在25℃下對藉由Pn-12F多醣之過碘酸鹽氧化產生之糖結合物觀察到游離醣隨時間增加。相比之下，使用Pn-12F多醣之TEMPO/NCS氧化製備之糖結合物展示在類似條件下游離醣無顯著趨勢。實例 10. 血清型 15B 多醣 -CRM197 結合物之製備 經分離肺炎鏈球菌血清型15B多醣之製備 血清型15B莢膜多醣可使用熟習此項技術者已知之分離程序自細菌直接獲得。使肺炎鏈球菌血清型15B於種子瓶中生長，且然後轉移至種子發酵罐。達到目標光學密度後，立即將細胞轉移至生產發酵罐。藉由添加N-月桂醯肌胺酸使發酵培養液失活且藉由超濾及滲濾來純化。 然後使用PANDA 2K®均質機(GEA Niro Soavi, Parma, Italy)藉由高壓均質化分篩經純化之肺炎鏈球菌血清型15B多醣以產生經分離之肺炎鏈球菌血清型15B多醣。 較佳地，藉由上述製程獲得之經分離之肺炎鏈球菌血清型15B莢膜多醣包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣，且具有介於50 kDa與500 kDa之間、較佳150 kDa至350 kDa之間之分子量。 經分離肺炎鏈球菌血清型15B莢膜多醣之氧化 在100 mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)中藉由相繼添加所計算量之500 mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)及WFI來實施多醣氧化以獲得2.0 g/L之最終多醣濃度。若需要，將反應pH調節至約pH 6.0。調節pH後，將反應溫度調節至23℃。藉由添加約0.25莫耳當量之過碘酸鈉來起始氧化。在23℃下在約16 hr期間實施氧化反應。 使用10K MWCO超濾箱實施經活化多醣之濃縮及滲濾。針對20倍滲濾體積之WFI實施滲濾。然後將經純化經活化之多醣儲存在5℃下。尤其藉由以下各項來表徵經純化經活化之醣：(i) 藉由比色分析之醣濃度；(ii) 藉由比色分析之醛濃度；(iii) 氧化程度；(iv) 藉由SEC-MALLS獲得之分子量及(v) O-乙醯基及甘油之存在。 使用SEC-MALLS來測定多醣及多醣-蛋白質結合物之分子量。根據流體力學體積使用SEC來分離多醣。使用折射率(RI)及多角雷射光散射(MALLS)檢測器來確定分子量。當光與物質相互作用時會散射，且散射光之量與濃度、dn/dc之平方(比折射率增量)及物質之莫耳質量相關。該分子量量度係基於來自MALLS檢測器之散射光信號及來自RI檢測器之濃度信號的讀數來計算。 如下確定經活化多醣之氧化程度(DO = 醣重複單元之莫耳數/醛之莫耳數)： 藉由多種比色方法、藉由使用蒽酮方法之實例來測定醣重複單元之莫耳數。首先藉由硫酸及加熱之作用使多醣分解成單醣。使蒽酮試劑與己糖反應以形成黃綠色複合物，在625 nm下以分光光度計法讀取其吸光度。在分析之範圍內，吸光度與所存在己糖之量成正比。 亦同時使用MBTH比色方法來測定醛之莫耳數。MBTH分析涉及藉由使醛基團(來自給定樣品)與3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH分析試劑)反應形成吖嗪化合物。使過量3-甲基-2-苯并噻唑酮腙氧化形成反應性陽離子。使反應性陽離子與吖嗪反應形成藍色發色團。然後在650 nm下以光譜方式讀取所形成之發色團。 較佳地，藉由上述製程獲得之經活化之肺炎鏈球菌血清型15B莢膜多醣包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣，且具有介於50 kDa與500 kDa之間、較佳150 kDa至350 kDa之間之分子量。 經活化肺炎鏈球菌血清型15B莢膜多醣與CRM197 之結合 結合方法係由以下步驟組成： a) 與蔗糖賦形劑複合並凍乾； b) 凍乾的經活化多醣與CRM197 之再組成； c) 經活化多醣與CRM197 之結合及封端；及 d) 結合物之純化 a) 與蔗糖賦形劑複合並凍乾 將經活化多醣與蔗糖複合至25克蔗糖/克經活化多醣之比率。然後將複合混合物之瓶凍乾。凍乾後，將含有凍乾的經活化多醣之瓶儲存在-20℃下。將所計算量之CRM197 蛋白單獨套管冷凍及凍乾。將凍乾的CRM197 儲存在-20℃下。 b) 凍乾的經活化多醣與CRM197 蛋白之再組成 將凍乾的經活化多醣於無水二甲基亞碸(DMSO)中再組成。在多醣完全溶解後，將等量無水DMSO添加至凍乾的CRM197 中用於再組成。 c) 結合及封端 在反應器皿中合併再組成的經活化多醣與再組成的CRM197 (輸入比：0.8:1)，然後充分混合以獲得澄清溶液，隨後使用氰基硼氫化鈉起始結合。反應溶液中之最終多醣濃度為約1 g/L。藉由將1.0 - 1.5 MEq之氰基硼氫化鈉添加至反應混合物中來起始結合且在23℃下培育40-48 hr。藉由添加2 MEq硼氫化鈉(NaBH4 )來終止結合反應以對未反應之醛進行封端。使此封端反應在23℃下持續3 hr。 d) 結合物之純化 在製備中使用經冷卻之5 mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)以1:10稀釋結合物溶液，使用100-300K MWCO膜藉由切向流過濾來純化。使經稀釋之結合物溶液通過5 µm過濾器，且使用5 mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)作為介質實施滲濾。完成滲濾後，經由0.22 μm過濾器轉移結合物滲餘物。 使用5 mM琥珀酸鹽/ 0.9%鹽水(pH 6)將結合物進一步稀釋至約0.5 mg/mL之目標醣濃度。完成最終0.22 μm過濾步驟以獲得糖結合物。 較佳地，藉由上述製程獲得之結合物包含至少0.6 mM乙酸鹽/mM血清型15B莢膜多醣，具有介於3,000 kDa與20,000 kDa之間之分子量，且具有介於2與6之間之結合度。實例 11. 包含共價連接至 CRM197 之肺炎鏈球菌血清型 15B 莢膜多醣之糖結合物的表徵 藉由實例10之製程來製備結合物1。使用不同量之氧化劑藉由類似製程製備結合物2及3。藉由類似製程來製備結合物4，只是經純化之血清型15B莢膜多醣未經分篩且活化至較低DO (較高氧化程度)，並在水性介質中實施結合。藉由類似製程來製備結合物5，只是藉由化學水解分篩經純化之血清型15B莢膜多醣且在水性介質中實施結合。藉由類似製程製備結合物6及7，只是經純化之血清型15B莢膜多醣未經分篩。 對所獲得結合物進行表徵且結果概述於表14中。表 14. 肺炎鏈球菌血清型 15B 莢膜多醣 -CRM197 結合物
結合物 1 2 3 4 5 6 7
多醣 分篩 分篩 分篩 天然 水解 天然 天然
O- 乙醯基；經活化多醣 (µmol 乙酸鹽 /µmol 多醣 ) 0.69 0.69 0.69 1.01 0.66 0.76 N/A
溶劑介質 DMSO DMSO DMSO 水性 水性 DMSO DMSO
經活化之多醣 DO 11.4 5.8 9.7 4.8 8.8 5 12
經活化之多醣 MW 196 KDa 218 KDa 235 KDa 435 KDa 270 KDa 431 KDa 460 KDa
產率 (%) 87.2 64 63.7 96.2 78.8 24.2 26.2
醣 蛋白質比率 0.68 0.65 0.71 1.22 1.29 0.9 1.5
游離醣 (%) ＜ 5 ＜ 5 6.1 18.1 14.2 8.8 18
結合物 MW, SEC-MALLS (kDa) 6190 7090 7937 1766 1029 6293 4466
O- 乙醯化結合物 (µmol 乙酸鹽 /µmol 多醣 ) 0.68 0.7 0.68 0.61 0.44 0.85 N/A
＜ 0.3 Kd (%), SEC N/A 73 N/A N/A 62 N/A N/A
結合度 (AAA) ；經修飾 Lys 3.7 3.9 4.1 N/A 3.4 N/A N/A
保留在結合物中之 O- 乙醯基 % 99% 100% 99.5% 60% 67% 100% N/A
N/A= 未獲得 藉由利用氫氧化鋁凝膠之程序量測游離多醣之百分比以連結蛋白質及共價連結之醣用於藉由離心去除。將樣品與磷酸鹽緩衝氫氧化鋁凝膠混合且離心。用凝膠沈澱所連結之醣且游離醣保留在上清液中。藉由適宜比色分析量化所得上清液及對照樣品以確定游離醣之百分比且確認蛋白質之充分去除及醣之回收。 對於胺基酸分析，首先在真空及加熱(160℃保持15分鐘)下使用6N鹽酸(HCl)水解使多醣-蛋白質樣品水解成其呈游離胺基酸形式之個別組份。水解後，使用胺基酸分析儀來分析樣品。使用檸檬酸鈉緩衝液之分級梯度藉由改變溫度及流速經由離子交換層析來分離個別胺基酸。分離後，使用管柱後茚三酮偶合檢測系統以定量方式確定每一胺基酸殘餘物之量。在此系統中，將茚三酮與管柱後反應器系統中之管柱溶析物混合且使該混合物通過光度計。茚三酮與所溶析胺基酸之反應產生最大吸收在570 nm處之紫色化合物。此吸光度係所存在α-胺基之量之線性反應(函數)，且此反應為具有α-胺基之所有有機化合物提供定量比色分析。在與不具游離胺基之亞胺基酸(例如脯胺酸及羥基脯胺酸)之反應中，產生亮黃色化合物且在440 nm下監測。使用570 nm及440 nm波長輸出二者計算每一胺基酸之峰面積。 如下計算產率：(結合物中多醣之量×100) / 經活化多醣之量。 使用水性介質產生之結合物(4及5)展示O-乙醯基含量之顯著損失。在DMSO溶劑中使用天然多醣且不使用MW分篩產生之結合物(6及7)並不展示O-乙醯基含量之損失。然而，結合物產率極低且濾過特徵較差。在DMSO中使用藉由高壓均質化分篩之多醣產生之結合物(1、2及3)具有高產率及較佳濾過特徵以及O-乙醯基含量之顯著保持。該等結合物亦具有極低的游離多醣含量。實例 12. 使用 Pn- 血清型 15B-CRM197 結合物之 調理吞噬活性 (OPA) 分析 本發明肺炎鏈球菌血清型15B結合物之免疫原性可使用下文所闡述之OPA分析來評價。 在第0週時，使用0.001 µg、0.01 µg或0.1 µg之測試結合物經由皮下途徑對36-37週齡之雌性瑞士韋伯斯特小鼠之群實施免疫。在第3週時使用相同劑量之結合物對小鼠實施加強免疫且然後在第4週時采血。對第4週血清樣品實施血清型特異性OPA。 使用OPA來量測鼠類血清中特異性針對肺炎鏈球菌血清型15B之功能性抗體。在分析反應中設定測試血清，該等分析反應量測莢膜多醣特異性免疫球蛋白調理細菌、觸發補體沈積、由此促進吞噬作用及吞噬細胞殺死細菌的能力。OPA效價定義為使細菌計數比不含測試血清之對照孔減少50%的倒數稀釋。OPA效價係自兩種涵蓋此50%殺死截止值之稀釋物內插。 OPA程序係基於具有以下修改之Hu等人(2005) Clin Diagn Lab Immunol 12 (2):287-295中所闡述之方法。將測試血清連續稀釋2.5倍且添加至微量滴定分析板中。將活血清型15B目標細菌添加至孔中，且在37℃下將板振盪30分鐘。將分化的HL-60細胞(吞噬細胞)及幼兔血清(3至4週齡，PEL-FREEZ®, 6.25%最終濃度)添加至孔中，且在37℃下將板振盪45分鐘。為終止反應，將80 µL 0.9% NaCl添加至所有孔中，混合，且將10 µL等份轉移至含有200 µL水之MULTISCREEN® HTS HV過濾板(MILLIPORE®)之孔中。在真空下經由板過濾液體，且將150 µL HYSOY®培養基添加至每孔中並過濾。然後在37℃、5% CO2 下將過濾板培育過夜，且然後使用脫色溶液(Bio-Rad Laboratories公司, Hercules, CA)固定。然後用考馬斯藍對板進行染色且脫色一次。使菌落成像且列舉於Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, OH) IMMUNOSPOT®分析儀上。使用生菌落計數來繪製殺死曲線並計算OPA效價。 已根據上文所提及之分析來測試結合物1及2之免疫原性。亦在相同分析中測試一種其他結合物及未經結合之天然肺炎鏈球菌血清型15B莢膜多醣(未經結合之PS)： 藉由水溶液中之還原性胺化使天然(即，未經分篩)血清型15B莢膜多醣結合至CRM197 來製備結合物9。 結果展示於表15中。表 15. 使用血清型 15B-CRM197 結合物之動物 OPA 效價測試
   OPA GMT (95% CI)
0.001 µg 0.01 µg 0.1 µg
結合物 1 485 (413, 569) 804 (565, 1145) 1563 (1048, 2330)
結合物 2 556 (438, 707) 871 (609, 1247) 1672 (1054, 2651)
結合物 9 395 (329, 475) 856 (627, 1168) 1802 (1108, 2930)
未經結合之 PS - - 698 (466, 1045)
  
如上表15中所展示，在投與小鼠時，結合物1及2產生能夠調理肺炎鏈球菌血清型15B、觸發補體沈積、由此促進吞噬作用及吞噬細胞殺死細菌的抗體。另外，儘管其分子量較低，但其亦展現與未經分篩之結合物9相比類似之免疫原性程度。實例 13. 血清型 22F 多醣 -CRM197 結 合物之 製備 經分離之肺炎鏈球菌血清型22F多醣之製備 使肺炎鏈球菌血清型22F於種子瓶中生長，且然後轉移至種子發酵罐。達到目標光學密度後，立即將細胞轉移至生產發酵罐。藉由添加N-月桂醯肌胺酸使發酵培養液失活且藉由超濾及滲濾來純化。 使用PANDA 2K®均質機(GEA Niro Soavi, Parma, Italy)藉由高壓均質化分篩經純化之肺炎鏈球菌血清型22F多醣以產生經分離之肺炎鏈球菌血清型22F多醣 經分離之肺炎鏈球菌血清型22F莢膜多醣之氧化 在藉由相繼添加所計算量之500 mM磷酸鉀緩衝液(pH 5.8)及WFI獲得之100 mM磷酸鉀緩衝液(pH 5.8)中實施多醣之氧化，以獲得2.0 g/L之最終多醣濃度。若需要，將反應pH調節至約5.8。調節pH後，將反應溫度降低至5℃。藉由添加0.10莫耳當量(MEq)之過碘酸鈉來起始氧化。在5℃下之目標氧化反應時間為16 hr。 在5℃下持續攪拌1-2 hr用2 MEq之2,3-丁二醇淬滅氧化反應。 使用100K MWCO超濾箱來實施經活化多醣之濃縮及滲濾。針對35倍滲濾體積之WFI實施滲濾。將經純化經活化之多醣儲存在5℃下。尤其藉由以下各項來表徵經純化經活化之醣：(i) 藉由SEC-MALLS獲得之分子量，(ii) O-乙醯基之存在，及(iii) 氧化程度。 使用SEC-MALLS來測定多醣及多醣-蛋白質結合物之分子量。根據流體力學體積使用SEC來分離多醣。使用折射率(RI)及多角雷射光散射(MALLS)檢測器來確定分子量。當光與物質相互作用時會散射，且散射光之量與濃度、dn/dc之平方(比折射率增量)及物質之莫耳質量相關。該分子量量度係基於來自MALLS檢測器之散射光信號及來自RI檢測器之濃度信號的讀數來計算。 如下確定經活化多醣之氧化程度(DO=醣重複單元之莫耳數/醛之莫耳數)： 藉由不同比色方法、例如藉由使用蒽酮方法來測定醣重複單元之莫耳數。首先藉由硫酸及加熱之作用使多醣分解成單醣。使蒽酮試劑與己糖反應以形成黃綠色複合物，在625nm下以分光光度計法讀取其吸光度。在分析之範圍內，吸光度與所存在己糖之量成正比。 亦同時使用MBTH比色方法來測定醛之莫耳數。MBTH分析涉及藉由使醛基團(來自給定樣品)與3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH分析試劑)反應形成吖嗪化合物。使過量3-甲基-2-苯并噻唑酮腙氧化形成反應性陽離子。使反應性陽離子與吖嗪反應形成藍色發色團。然後在650 nm下以光譜方式讀取所形成之發色團。 經活化肺炎鏈球菌血清型22F多醣與CRM197 之結合 結合方法係由以下步驟組成： a. 與蔗糖賦形劑複合並凍乾； b. 經凍乾多醣與CRM197 之再組成； c. 經活化多醣與CRM197 之結合及封端；及 d. 結合物之純化 a. 與蔗糖複合並凍乾 使經活化之多醣與蔗糖(50% w/v於WFI中)複合至25克蔗糖/克經活化多醣之比率。然後將複合混合物之瓶凍乾。凍乾後，將含有凍乾的經活化多醣之瓶儲存在-20℃下。將所計算量之CRM197 蛋白(目標S/P輸入比 = 1)單獨套管冷凍及凍乾。將凍乾的CRM197 儲存在-20℃下。 b. 凍乾的經活化多醣與CRM197 蛋白之再組成 將凍乾的經活化多醣於無水二甲基亞碸(DMSO)中再組成。在多醣完全溶解後，將等量無水DMSO添加至凍乾的CRM197 中用於再組成。 c. 經活化多醣與CRM197 之結合及封端 於結合反應器皿中合併再組成的CRM197 (於DMSO中)與再組成的經活化多醣。反應溶液中之最終多醣濃度為1 g/L。藉由將1.5 MEq之氰基硼氫化鈉添加至反應混合物中來起始結合，且在23℃下將反應物培育20 hr。藉由添加2 MEq硼氫化鈉來終止結合反應。在23℃下將封端反應物培育3 hr。 d. 結合物之純化 在製備中用經冷卻之5 mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)以1:5稀釋結合物溶液，使用100K MWCO膜藉由切向流過濾來純化，且使用5 mM琥珀酸鹽-0.9%鹽水(pH 6.0)作為介質實施20×滲濾。完成滲濾後，進一步稀釋結合物滲餘物，經由0.22 μm過濾器過濾且儲存在2-8℃下。 使用上述方法藉由改變不同參數(例如，醣-蛋白質輸入比、反應濃度及氰基硼氫化鈉之MEq)來獲得若干結合物。CRM197 之代表性Pn-22F糖結合物之表徵提供於表16中。表 16. 肺炎球菌血清型 22F-CRM197 結合物
批次 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
氧化程度 (D.O) 12.6 19.5 17.2 14.0 12.4 14.9 11.1 14.6 14.4 13.7
藉由 MALLS 獲得之經活化醣 MW (kDa) 540 697 864 92 866 631 614 639 709 416
結合結果                              
醣 / 蛋白質比率 0.75 0.87 2 0.8 0.8 0.4 1.9 0.8 0.65 1.0
O-Ac (%) 105 100 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
游離醣 % ＜5 2 15.5 35 ＜5 ＜5 33 ＜5 ＜5 8
藉由 SEC-MALLS 獲得之 MW (kDa) 2787 1668 2194 1419 5039 10450 1577 3911 3734 4453
N/A= 未獲得 根據結合物之O-乙醯基含量(µmol O-乙醯基/µmol血清型22F醣重複單元)與多醣之O-乙醯基含量(µmol O-乙醯基/µmol血清型22F醣重複單元)的比率來計算最終結合物中之O-乙醯基含量% (所保持)。 上文所獲得結合物之免疫原性已使用下文所闡述之調理吞噬分析(OPA)來評價。 在第0週時，使用0.001 µg、0.005 µg或0.01 µg之測試結合物經由皮下途徑對36-37週齡之雌性瑞士韋伯斯特小鼠之群實施免疫。在第3週時使用相同劑量之結合物對小鼠實施加強免疫且然後在第4週時採血。對第4週血清樣品實施血清型特異性OPA。 使用調理吞噬活性(OPA)分析來量測鼠類血清中特異性針對肺炎鏈球菌血清型22F之功能性抗體。在分析反應中設定測試血清，該等分析反應量測莢膜多醣特異性免疫球蛋白調理細菌、觸發補體沈積、由此促進吞噬作用及吞噬細胞殺死細菌的能力。OPA效價定義為使細菌計數比不含測試血清之對照孔減少50%的倒數稀釋。OPA效價係自兩種涵蓋此50%殺死截止值之稀釋物內插。 OPA程序係基於具有以下修改之Hu等人(2005) Clin Diagn Lab Immunol12(2):287-295中所闡述之方法。將測試血清連續稀釋2.5倍且添加至微量滴定分析板中。將活血清型22F目標細菌菌株添加至孔中，且在25℃下將板振盪30分鐘。將分化的HL-60細胞(吞噬細胞)及幼兔血清(3至4週齡，PEL-FREEZ®, 12.5%最終濃度)添加至孔中，且在37℃下將板振盪45分鐘。為終止反應，將80 µL 0.9% NaCl添加至所有孔中，混合，且將10 µL等份轉移至含有200 µL水之MULTISCREEN® HTS HV過濾板(MILLIPORE®)之孔中。在真空下經由板過濾液體，且將150 µL HYSOY®培養基添加至每孔中並過濾。然後在37℃、5% CO2 下將過濾板培育過夜，且然後使用脫色溶液(Bio-Rad Laboratories公司, Hercules, CA)固定。然後用考馬斯藍對板進行染色且脫色一次。使菌落成像且列舉於Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, OH) IMMUNOSPOT®分析儀上。使用生菌落計數來繪製殺死曲線並計算OPA效價。 如上文所提及確定血清型22F-CRM197 結合物之調理吞噬活性(OPA)效價。在四週時在不同劑量下之OPA效價(具有95%信賴區間(CI)之幾何平均效價(GMT))展示於表17及18中(兩個單獨實驗)，此展示在鼠類免疫原性模型中血清型22F結合(批次1-7；亦參見關於該等結合物之表徵數據之表16)激發OPA效價。表 17. 血清型 22F-CRM197 結合物之免疫原性
   OPA GMT (95% CI)
樣品編號 0.001 µg 0.005 µg 0.01 µg
1 86 (45, 165) 597 (285, 1252) 2519 (1409, 4504)
2 98 (51, 191) 782 (410,1492) 2236 (1319, 3790)
3 35 (18, 69) 250 (122, 512) 509 (273, 950)
表 18. 血清型 22F-CRM197 結合物之免疫原性
   OPA GMT (95% CI)
樣品編號 0.001 µg 0.01 µg
4 37 (18, 76) 3383 (1911, 5987)
5 45 (20, 103) 1773 (1072, 2931)
6 235 (108, 513) 4335 (3018, 6226)
7 10 (7, 13) 252 (138, 457)
實例 14. CRM197 之 Pn-11A 結合物之製備 Pn-11A RAC 糖結合物之製備 將儲存在去離子水或25 mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)中之冷凍經分篩多醣在5℃下解凍。 多醣之氧化 在藉由添加500 mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)及WFI獲得之100 mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)中實施多醣氧化，以獲得2.0 g/L之最終多醣濃度。在23℃下實施氧化反應。藉由添加過碘酸鈉來起始氧化。攪動速率介於100 - 140 rpm範圍內。 經活化11A多醣之純化 使用超濾箱實施經活化多醣之濃縮及滲濾。針對20倍滲濾體積之WFI實施滲濾。0.22 μm過濾後，將經純化經活化之多醣儲存在5℃下。 結合方法描述 結合方法係由以下步驟組成： a.   CRM197 蛋白之套管冷凍及凍乾； b.   經活化多醣與CRM197 之再組成； c.   經活化多醣與CRM197 之結合；及 d.   結合物之純化及稀釋 a. CRM197 蛋白之套管冷凍及凍乾 對CRM197 蛋白實施套管冷凍且凍乾。 b. 經活化多醣與CRM197 蛋白之再組成 將經活化多醣溶液(約10 g/L)裝填至反應器中，然後添加所計算量之0.5 N磷酸鈉緩衝液(pH 7.2)。在攪拌下，添加凍乾的CRM197 ，且將反應混合物攪拌2 - 4小時以達到CRM197 之完全溶解。 c. 結合及封端 藉由添加氰基硼氫化物來起始結合。在23℃下將反應混合物培育72 - 96 hr。藉由添加0.5 × WFI、然後添加2 MEq硼氫化鈉來終止結合反應。使此封端反應在23℃下保持3 - 4 hr。 d. 結合物之稀釋及初始純化 在製備中使用0.15 N磷酸鈉緩衝液(pH 8.0)以1:5 (反應體積)稀釋結合物溶液，藉由切向流過濾(TFF)來純化。於稀釋器皿混合經稀釋之結合物且然後通過5 µm過濾器。然後將經過濾之結合物溶液濃縮至1 - 2 g/L。實施兩步滲濾製程。在步驟1中，使用30× (滲濾體積) 0.15 N磷酸鈉緩衝液(pH 8.0)、然後使用20× 5 mM琥珀酸鹽-0.9% NaCl (pH 6.0)實施TFF。完成初始滲濾後，經由0.45 μm過濾器將結合物滲餘物轉移至收集罐中。 結合物之最終滲濾 最終純化步驟係使用5 mM琥珀酸鹽-0.9% NaCl (pH 6.0)介質使用再生纖維素膜之20×滲濾。 單價本體結合物(MBC)之稀釋 使用5 mM琥珀酸鹽/ 0.9% NaCl (pH 6)將結合物進一步稀釋至0.5 mg/mL之目標醣濃度。完成最終0.22 μm過濾步驟以製備單價本體結合物(MBC)產物用於調配。 使用上述方法藉由改變不同參數(例如，醣-蛋白質輸入比、反應濃度及氰基硼氫化鈉之Meq)來獲得若干結合物。CRM197 之代表性Pn-11A糖結合物之表徵提供於表19 (批次1至5)中。使用 RAC/DMSO 製備 Pn-11A 糖結合物 如上文所闡述製備並純化氧化多醣(參見Pn-11A RAC糖結合物之製備)。 經由DMSO中之還原性胺化(RAC/DMSO)之結合 經由RAC/DMSO之11A之結合係由以下步驟組成： a. 與蔗糖複合、套管冷凍並凍乾； b. 經凍乾多醣與CRM197 之再組成； c. 經活化多醣與CRM197 之結合；及 d. 結合物之純化及稀釋。 a. 與蔗糖複合、套管冷凍並凍乾 將自經分篩多醣製備之經活化多醣與蔗糖(50% w/v於WFI中)複合至25克蔗糖/克經活化多醣之比率。混合該等組份，且然後將複合混合物之經套管冷凍之瓶凍乾。將CRM197 蛋白單獨套管冷凍及凍乾。 b. 凍乾的經活化多醣與CRM197 蛋白之再組成 將凍乾的經活化多醣以2 mg/mL之濃度再組成於DMSO中。多醣完全溶解後，將DMSO添加至凍乾的CRM197 中用於再組成。 c. 結合及封端 於結合反應器皿中合併再組成的CRM197 (於DMSO中)與再組成的經活化多醣。反應溶液中之最終多醣濃度為1 g/L。藉由將氰基硼氫化物添加至反應混合物中來起始結合，且在23℃下培育22小時。藉由添加2 MEq硼氫化鈉來終止結合反應。使此封端反應在23℃下保持3 - 4 hr。 d. 結合物之純化及稀釋 使用與上文所闡述類似之製程純化並稀釋結合物溶液。 使用上述方法藉由改變不同參數(例如，醣-蛋白質輸入比、反應濃度及氰基硼氫化鈉之MEq)來獲得若干結合物。藉由上述製程獲得的CRM197 之代表性Pn-11A糖結合物之表徵提供於表19 (批次6至8)中。表 19. 肺炎球菌血清型 11A-CRM197 結合物
批次 1 2 3 4 5 6 7 8
藉由 MALLS 獲得之經活化醣 MW (kDa) 207 129 103 199 183 232 113 113
結合結果                        
醣 / 蛋白質比率 1.24 1.09 1.32 1.47 1.31 1 0.78 0.68
乙酸鹽 (mol/mol PS) 2.72 2.89 2.72 3.2 3.13 N/A N/A N/A
甘油 (mol/mol PS)* 0.62 0.68 0.75 0.51 0.41 N/A N/A N/A
藉由 SEC-MALLS 獲得之 MW (kDa) 3224 837 623 827 994 12200 6543 15730
N/A= 未獲得* 甘油係在其自多醣藉由氫氟酸(HF)釋放後藉由高效陰離子交換層析與脈衝安培檢測(HPAEC-PAD)進行量化。 自藉由上述還原性胺化製程製備之結合物產生之總體數據展示允許製備具有良好結合產率、低游離醣%及良好穩定性之結合物。 上文所獲得結合物之免疫原性已使用下文所闡述之調理吞噬分析(OPA)來評價。 在第0週時，使用0.001 µg、0.005 µg、0.01 µg或0.1 µg測試結合物經由皮下途徑對36-37週齡之雌性瑞士韋伯斯特小鼠之群實施免疫。在第3週時使用相同劑量之結合物對小鼠實施加強免疫且然後在第4週時採血。對第4週血清樣品實施血清型特異性OPA。 使用調理吞噬活性(OPA)分析來量測鼠類血清中特異性針對肺炎鏈球菌血清型11A之功能性抗體。在分析反應中設定測試血清，該等分析反應量測莢膜多醣特異性免疫球蛋白調理細菌、觸發補體沈積、由此促進吞噬作用及吞噬細胞殺死細菌的能力。OPA效價定義為使細菌計數比不含測試血清之對照孔減少50%的倒數稀釋。OPA效價係自兩種涵蓋此50%殺死截止值之稀釋物內插。 OPA程序係基於具有以下修改之Hu等人(2005) Clin Diagn Lab Immunol 12 (2):287-295中所闡述之方法。將測試血清連續稀釋2.5倍且添加至微量滴定分析板中。將活血清型22F目標細菌菌株添加至孔中，且在25℃下將板振盪30分鐘。將分化的HL-60細胞(吞噬細胞)及幼兔血清(3至4週齡，PEL-FREEZ®, 12.5%最終濃度)添加至孔中，且在37℃下將板振盪60分鐘。為終止反應，將80 µL 0.9% NaCl添加至所有孔中，混合，且將10 µL等份轉移至含有200 µL水之MULTISCREEN® HTS HV過濾板(MILLIPORE®)之孔中。在真空下經由板過濾液體，且將150 µL HYSOY®培養基添加至每孔中並過濾。然後在37℃、5% CO2 下將過濾板培育過夜，且然後使用脫色溶液(Bio-Rad Laboratories公司, Hercules, CA)固定。然後用考馬斯藍對板進行染色且脫色一次。使菌落成像且列舉於Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, OH) IMMUNOSPOT®分析儀上。使用生菌落計數來繪製殺死曲線並計算OPA效價。 如上文所提及測定小鼠中血清型11A-CRM197 結合物之調理吞噬活性(OPA)效價。在四週時在不同劑量下之OPA效價(具有95%信賴區間(CI)之幾何平均效價(GMT))展示於表20中，此展示在鼠類免疫原性模型中血清型11A結合物(批次2-4及8；亦參見關於該等結合物之表徵數據之表19)激發OPA效價。表 20. 血清型 11A-CRM197 結合物之免疫原性
   OPA GMT (95% CI)
批次編號 0.001 µg 0.01 µg 0.1 µg
2 326 (260, 408) 1391 (794, 2437) 4366 (3063, 6223)
3 389 (316, 478) 1113 (690, 1795) 5527 (3698, 8260)
4 192 (149, 248) 926 (661, 1298) 2800 (1975, 3970)
8 303 (224, 411) 1099 (624, 1935) 3861 (2629, 5669)
實例 15 . 16 價肺炎球菌結合物疫苗之調配 調配包含皆個別地結合至CRM197 之來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖結合物的16價結合物組合物(16vPnC)。 如上文所揭示產生來自血清型15B、22F及33F之肺炎鏈球菌糖結合物，且如WO2006/110381中所揭示產生來自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F之肺炎鏈球菌糖結合物。 基於批料體積及本體醣濃度來計算所需本體濃縮物之體積。經調配之本體疫苗係藉由以下方式來製備：添加所需體積之NaCl /琥珀酸鹽緩衝液(pH 5.8)，以獲得5.0 mM琥珀酸鹽及150 mM NaCl之最終目標緩衝液濃度。添加聚山梨醇酯80以達到0.02%之最終濃度，且添加16價肺炎球菌結合物。經由0.2 µm Millipore PES膜、然後添加AlPO4 來過濾製劑。將調配物混合以允許連結並達成均一性。 然後將調配物填充至玻璃注射器中以遞送0.5 mL之劑量體積。 最終劑型包括2.2 µg個別地結合至CRM197 之來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖結合物中的每一者、4.4 µg來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物、5 mM琥珀酸鹽緩衝液(pH 5.8，對於0.5 mL之劑量為0.02 PS80、150 mM NaCl及0.25 mg/mL呈AlPO4 形式之鋁)。對於0.5 mL之劑量，CRM197 含量為約38 µg。實例 16. 20 價肺炎球菌結合物疫苗之調配 調配包含皆個別地結合至CRM197 之來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖結合物的20價結合物組合物(20vPnC)。 如上文所揭示產生來自血清型8、10A、11A、12F、15B、22F及33F之肺炎鏈球菌糖結合物，且如WO2006/110381中所揭示產生來自血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F之肺炎鏈球菌糖結合物。 基於批料體積及本體醣濃度來計算所需本體濃縮物之體積。經調配本體疫苗係藉由以下方式來製備：添加所需體積之NaCl /琥珀酸鹽緩衝液(pH 5.8)，以獲得5.0 mM琥珀酸鹽及150 mM NaCl之最終目標緩衝液濃度。添加聚山梨醇酯80以達到0.02%之最終濃度，且添加20價肺炎球菌結合物。經由0.2 µm Millipore PES膜、然後添加AlPO4 來過濾製劑。將調配物充分混合以獲得結合物與鋁之最大連結。 然後將調配物填充至玻璃注射器中以遞送0.5 mL之劑量體積。 最終劑型包括2.2 µg個別地結合至CRM197 之來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖結合物中的每一者、4.4 µg來自肺炎鏈球菌血清型6B之糖結合物、5 mM琥珀酸鹽緩衝液(pH 5.8，對於0.5 mL之劑量為0.02 PS80、150 mM NaCl及0.25 mg/mL呈AlPO4 形式之鋁)。對於0.5 mL之劑量，CRM197 含量為約46 µg。實例 17. 16 價免疫原組合物之免疫原性 在兔中使用多倍體直接Luminex免疫分析(dLIA)評價16價免疫原組合物(參見實例15)之免疫原性，以量測血清中之血清型特異性IgG濃度及血清型特異性OPA。 在第0週時，使用所建議的人類臨床劑量(2.2 µg結合物，只是血清型6B為4.4 µg；加0.1 mg呈AlPO4 形式之鋁)經由肌內途徑對10隻2.5 kg至3.5 kg之雌性新西蘭(New Zealand)白兔實施免疫。在第2週時使用相同劑量之結合物疫苗對兔實施加強免疫且然後在第4週時採血。對第0週及第4週血清樣品實施血清型特異性dLIA及OPA。 為量化特異性針對每一肺炎球菌多醣(PnPS)之總多醣連結抗體(IgG)，在兩種直接Luminex免疫分析(dLIA; 13-plex dLIA, PREVNAR 13® 血清型及7-plex dLIA，其他血清型)中評估兔血清。13-plex分析量測特異性針對13價肺炎球菌結合物(PnC)疫苗中所包括之13種血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F)之抗PnPS抗體，且7-plex分析量測針對其他血清型(15B、22F、33F)之抗PnPS抗體。每一分析含有偶合至PnPS結合物(PnPS-PLL結合物：結合至聚-L-離胺酸之PnPS)的13個或7個光譜不同之磁性微球之組合。 簡言之，首先使用兩種Pn吸收劑CWPS1 (來自含有PnA之C-多醣之細胞壁多醣)及CWPS2 (來自莢膜肺炎鏈球菌血清型2之CWP)預吸附參考標準品、對照及測試血清，以阻斷非特異性抗體與PnPS塗覆抗原之連結。預吸附後，將PnPS偶合之微球與經適當稀釋之參考標準血清、對照或兔測試血清一起培育。培育後，洗滌每一混合物，且添加R-藻紅素結合之山羊抗兔IgG二級抗體。使用Bio-Plex讀數器量測螢光信號(表示為中值螢光強度(MFI))且與所連結PnPS特異性IgG之量相關聯。測試血清之值報告為(單位/mL, U/mL)。 如上文所闡述實施血清型特異性OPA。OPA效價係與不含血清之對照(定義為背景CFU)相比時使細菌菌落形成單位(CFU)之數量減少50%之最高血清稀釋的倒數。該效價係自兩種涵蓋此50%殺死截止值之稀釋物內側。
表 21.    16vPnC 總 IgG 濃度及 OPA 效價
總 IgG (Pn dLIA) 調理吞噬抗體 (OPA)
血清型 Wk0 GMC (μg/ml) Wk4 GMC (μg/ml) Wk4 95% CI (LCI - UCI) IgG GMC 比率 Wk4:Wk0 Wk0GMT Wk4GMT Wk4 95% CI (LCI - UCI) OPA GMT 比率 Wk4:Wk0
1 0.08 28 17 - 44 369 4 87 55 - 139 22
3 0.08 88 60 - 128 1062 4 214 151 - 304 54
4 0.08 30 14 - 67 402 4 934 551 - 1583 233
5 0.08 34 18 - 64 449 4 368 232 - 584 87
6A 0.03 46 15 - 142 1835 4 3026 1607 - 5696 756
6B 0.08 89 33 - 241 1182 4 6156 3043 - 12453 1539
7F 0.01 50 31 - 78 3969 6 2917 2013 - 4227 528
9V 0.03 24 15 - 38 881 5 613 426 - 883 112
14 0.08 28 20 - 39 368 19 449 331 - 610 24
18C 0.05 79 45 - 139 1587 4 1847 1003 - 3401 462
19A 0.08 120 71 - 205 1605 4 1410 851 - 2336 352
19F 0.08 156 96 - 255 2083 4 3207 1783 - 5771 802
23F 0.05 33 13 - 84 668 4 997 487 - 2042 249
15B 0.05 54 40 - 71 1073 6 741 514 - 1069 116
22F 0.08 158 95 - 262 2103 5 1078 661 - 1756 211
33F 0.10 11 6 - 20 115 49 1337 829 - 2154 27
縮寫：GMC，幾何平均濃度；CI，信賴區間；LCI，下信賴區間；UCI，上信賴區間。
結果展示使用16vPnC兩次免疫後血清型特異性IgG及功能性OPA抗體反應顯著增加(表21)。血清IgG含量在基線上方增加超過2-log。類似地，使用在基線上方增加最小22倍之OPA GMT激發穩健的功能性OPA抗體反應。免疫前血清(Wk 0)展示無法檢測到之PnPS特異性IgG含量及無法檢測到之針對除血清型14及33F外之大部分16v Pn血清型的功能性OPA抗體含量。該等血清型存在低值OPA效價，但該等基線反應並不對疫苗接種後之抗體反應造成不利影響。實例 18. 20 價免疫原組合物之免疫原性 在兔中使用多倍體直接Luminex免疫分析(dLIA)評價20價免疫原組合物(如實例16所製備)之免疫原性，以量測血清中之血清型特異性IgG濃度及血清型特異性OPA。 在第0週時，使用所建議的人類臨床劑量(2.2 µg結合物，只是血清型6B為4.4 µg；加0.1 mg呈AlPO4 形式之鋁)經由肌內途徑對10隻2.5 kg至3.5 kg雌性新西蘭白兔之群實施免疫。在第2週時使用相同劑量之結合物疫苗對兔實施加強免疫且然後在第4週時採血。對第0週及第4週血清樣品實施血清型特異性dLIA及OPA。 為量化特異性針對每一肺炎球菌多醣(PnPS)之總多醣連結抗體(IgG)，在兩種直接Luminex免疫分析(dLIA; 13-plex dLIA, PREVNAR 13® 血清型及7-plex dLIA, 其他血清型)中評估兔血清。13-plex分析量測特異性針對13價肺炎球菌結合(PnC)疫苗中所包括之13種血清型(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F)之抗PnPS抗體，且7-plex分析量測針對其他血清型(15B、22F、33F)之抗PnPS抗體。每一分析含有偶合至PnPS結合物(PnPS-PLL結合物：結合至聚-L-離胺酸之PnPS)的13個或7個光譜不同之磁性微球之組合。 簡言之，首先使用兩種Pn吸收劑CWPS1 (來自含有PnA之C-多醣之細胞壁多醣)及CWPS2 (來自莢膜肺炎鏈球菌血清型2之CWP)預吸附參考標準品、對照及測試血清，以阻斷非特異性抗體與PnPS塗覆抗原之連結。預吸附後，將PnPS偶合之微球與經適當稀釋之參考標準血清、對照或兔測試血清一起培育。培育後，洗滌每一混合物，且添加R-藻紅素結合之山羊抗兔IgG二級抗體。使用Bio-Plex讀數器量測螢光信號(表示為中值螢光強度(MFI))且與所連結PnPS特異性IgG之量相關聯。測試血清之值報告為(單位/mL, U/mL)。 如上文所闡述實施血清型特異性OPA。OPA效價係與不含血清之對照(定義為背景CFU)相比時使細菌菌落形成單位(CFU)之數量減少50%之最高血清稀釋的倒數。該效價係自兩種涵蓋此50%殺死截止值之稀釋物內側。 經20vPnC免疫之兔亦展示總IgG及針對為16v及20v調配物所常見之血清型以及針對其他四種血清型(8、10A、11A及12F)之功能性OPA抗體效價顯著增加(表22)。在兩次免疫後誘導20種血清型之血清IgG含量之2-log增加。使用該疫苗激發之OPA GMT在基線上方至少27倍。在20vPnC疫苗接種後對血清型14與33F觀察到類似的免疫前血清中之低程度OPA效價，但亦不改變疫苗接種後抗體反應之穩健性。 16vPnC及20vPnC調配物激發特異性針對肺炎球菌多醣且與細菌之功能性殺死相關二者皆有之穩健的體液反應(參見表21及22)。總之，實例17及18中所展示之研究展示16vPnC及20vPnC調配物二者之良好免疫原性。
表 22.    20vPnC 總 IgG 濃度及 OPA 效價
總 IgG (Pn dLIA) 調理吞噬抗體 (OPA)
血清型 Wk0 GMC (μg/ml) Wk4 GMC (μg/ml) Wk4 95% CI (LCI - UCI) IgG GMC 比率 Wk4:Wk0 Wk0 GMT Wk4 GMT Wk4 95% CI (LCI - UCI) OPA GMT 比率 Wk4:Wk0
1 0.08 28 19 - 43 379 4 106 69 - 164 27
3 0.08 116 76 - 176 1542 4 286 193 - 425 72
4 0.08 62 39 - 97 821 4 1477 954 - 2287 369
5 0.08 49 33 - 71 648 4 509 350 - 742 127
6A 0.03 30 14 - 66 1209 4 3682 2743 - 4944 849
6B 0.08 58 36 - 94 775 4 4469 3002 - 6653 1117
7F 0.02 62 39 - 101 3681 6 3226 2226 - 4675 500
9V 0.05 30 19 - 48 644 6 956 634 - 1442 150
14 0.08 34 20 - 60 457 12 506 348 - 736 42
18C 0.05 106 67 - 166 2115 4 1942 1263 - 2986 485
19A 0.08 112 73 - 171 1493 4 1580 1071- 2332 395
19F 0.08 178 119 - 266 2372 4 3392 2085 - 5519 848
23F 0.05 48 23 - 103 960 4 1514 889 - 2577 378
15B 0.05 70 51 - 98 1410 6 1332 949 - 1869 210
22F 0.10 172 118 - 250 1811 5 1304 1000 - 1700 279
33F 0.12 14 10 - 20 120 54 1490 1117 - 1989 28
8 0.13 144 100 - 207 1149 4 1388 988 - 1949 333
10A 0.13 54 31 - 94 433 5 1129 732 - 1741 236
11A 0.13 178 125 - 254 1423 7 10483 6373 - 17241 1434
12F 0.08 31 15 - 63 408 4 828 608 - 1127 191
縮寫：GMC，幾何平均濃度；CI，信賴區間；LCI，下信賴區間；UCI，上信賴區間。
實例 19. 肺炎鏈球菌之血清群 9 內之交叉反應性調理吞噬免疫反應之評估 認為量測在功能性抗體及補體存在下吞噬效應細胞對肺炎鏈球菌細胞之殺死的肺炎球菌調理吞噬分析(OPA)係用於評估肺炎球菌疫苗之有效性的重要替代方式。材料及方法 在針對血清型9V、9A、9L及9N之OPA分析中測試來自經13價肺炎球菌結合物疫苗(13v PnC)疫苗接種之成人的免疫血清之兩個隨機選擇之亞組。分別自美國臨床試驗6115A1-004 (N=59，疫苗接種後)及6115A1-3005 (N=66，匹配的疫苗接種之前及之後)收集血清。 研究6115A1-3005 (ClinicalTrials.gov識別碼：NCT00546572)為第3期隨機化、主動控制、經修改之雙盲試驗，其評估在入選研究前至少5年接受1劑量23vPS之70歲及以上可行動老年人個體中Prevnar 13與23價肺炎球菌多醣疫苗(23vPS)相比之安全性、耐受性及免疫原性(參見：http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00546572；於2014年3月31日獲取)。 研究6115A1-004 (ClinicalTrials.gov識別碼：NCT00427895)為第3期隨機化、主動控制、經修改之雙盲試驗，其評估在首次接種23vPS之60至64歲成人中13價肺炎球菌結合物疫苗(13vPnC)與23價肺炎球菌多醣疫苗(23vPS)相比之安全性、耐受性及免疫原性以及首次接種23vPS之18至59歲成人中13vPnC之安全性、耐受性及免疫原性(參見：http://clinicaltrials.gov/show/NCT00427895；於2014年3月31日獲取)。 在該等研究中測試之13價肺炎球菌結合物疫苗(13vPnC)含有個別地結合至白喉交叉反應材料197 (CRM197 )載體蛋白質之來自肺炎球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F及23F的結合物。 使用OPA來量測人類血清中針對肺炎鏈球菌血清型9V, 9N, 9A及/或9L之功能性抗體。在分析反應中設定測試血清，該等分析反應量測莢膜多醣特異性免疫球蛋白調理細菌、觸發補體沈積、由此促進吞噬作用及吞噬細胞殺死細菌的能力。OPA效價定義為使細菌計數比不含測試血清之對照孔減少50%的倒數稀釋。OPA效價係自兩種涵蓋此50%殺死截止值之稀釋物內插。 OPA程序係基於Hu等人(2005) Clin Diagn Lab Immunol122):287-295中所闡述之方法。將熱失活之測試血清連續稀釋2.5倍且與目標細菌一起添加於分析板中並在振盪的同時培育30分鐘。然後以200:1之適宜效應物對目標比率將分化的HL-60細胞(吞噬細胞)及幼兔血清(3至4週齡，PEL-FREEZ®, Arkansas, 12.5%最終濃度)添加至孔中，且在37℃下在振盪的同時培育。為終止反應，將80 µL 0.9% NaCl添加至所有孔中，混合，且將10 µL等份轉移至含有200 µL水之MULTISCREEN® HTS HV過濾板(MILLIPORE®)之孔中。在真空下經由板過濾液體，且將150 µL HYSOY®培養基添加至每孔中並過濾。然後在37℃、5% CO2 下將過濾板培育過夜，且然後使用脫色溶液(Bio-Rad Laboratories公司, Hercules, CA)固定。然後用考馬斯藍對板進行染色且脫色一次。使菌落成像且列舉於Cellular Technology Limited (CTL) (Shaker Heights, OH) IMMUNOSPOT®分析儀上。 統計學分析：計算個人雙尾關聯。結果 - 9V 、 9A 、 9L 及 9N 中之 OPA 反應 在各別微菌落調理吞噬分析(mcOPA)中評估來自經針對血清型9A、9L及9N之13vPnC免疫之成人的免疫血清之交叉功能性反應以及針對血清型9V之同源功能性反應。測試來自經13vPnC疫苗接種之成人的免疫血清之兩個隨機選擇之亞組。分別自美國臨床試驗6115A1-004 (N=59，疫苗接種後)及6115A1-3005 (N=66，匹配的疫苗接種之前及之後)收集血清。 研究6115A1-004中之個體先前從未經肺炎球菌疫苗接種且接受單一劑量之13vPnC作為研究方案之一部分。來自研究6115A1-004之免疫血清對於所有血清群展示相似的反應者百分比，且針對9V、9A、9L及9N之值分別為98.3%、98.3%、100%及93.2% (圖11)，此支持6115A1-3005之結果(圖12)。在血清型9V與9A (皮爾森關聯(Pearson correlation) ρ = 0.5456，p ＜ 0.0001)或9L (ρ = 0.7353，p ＜ 0.0001)而非9N (ρ = 0.1217, p ＜ 0.3627)之間觀察到相對良好之OPA效價關聯。 研究6115A1-3005中之個體先前已在入選研究前至少5年接受1劑量23vPS，且使其接受單一劑量之13vPnC作為研究方案之一部分。在OPA中評估來自經13vPnC免疫之成人之匹配的疫苗接種之前及之後血清盤(N = 66) (研究6115A1-3005)對血清型9V的同源反應以及抗9V抗體對血清型9A、9L及9N之交叉反應性。如圖12中所展示，在OPA分析中檢測到對9V (84%)、9A (66%)、9L (82%)及9N (86%)相對較高之免疫性(反應者百分比)，此可能歸因於其先前經包括來自血清型9V及9N之未經結合之多醣的23vPS免疫。然而，經僅含有來自血清群9之血清型9V結合物之13vPnC疫苗接種後，對於所有四種血清型之反應者百分比增加至95%或更大。效價值之增加倍數展示於表23中且在血清型之間類似，此亦表明交叉反應性。表 23. 匹配的疫苗接種 (13vPnC) 之前及之後的 OPA 效價增加倍數
   OPA 效價
9V 9A 9L 9N
前 後 前 後 前 後 前 後
GMT 221 1323 41 308 165 706 322 693
增加倍數 5.9 7.5 4.2 2.1
OPA效價分佈之更全面分析展示於圖13-16中之逆累積分佈曲線(RCDC)中。RCDC展示疫苗接種後針對血清型9V、9A、9L及9N (增加程度較小)之血清型特異性免疫反應增加。亦使用皮爾森氏關聯分析9V/9A之間、9V/9L之間及9V/9N之間的個別匹配的樣品之效價增加倍數之關聯。在血清型9V與9A (皮爾森關聯ρ = 0.8720，p ＜ 0.0001)或9N (ρ = 0.5801，p ＜ 0.0001)、但在減小程度上與9L (ρ = 0.1804，p ＜ 0.1640)之間觀察到效價增加倍數之相對良好之關聯。結論 基於該等數據，13vPnC疫苗可能藉由提供針對血清型9A、9L及9N之其他保護而提供較寬血清型覆蓋率。實例 20 ： 血清型 15B 與血清型 15C 之間之交叉功能性 OPA 反應 肺炎球菌血清群15包括四種結構相關之血清型：15A、15B、15C及15F。血清型15B及15C難以藉由遺傳分型技術來區分，且具有相似的莢膜多醣(PS)組成，只是15B-PS係15C-PS之O-乙醯化變體。為理解針對血清型15B之抗莢膜PS抗體是否在功能上與血清型15C交叉反應，使用16vPnC (參見實例15)及20vPnC (參見實例16)疫苗對10隻兔實施免疫，該等疫苗皆含有包含如本文所揭示共價連接至CRM197 之肺炎鏈球菌血清型15B莢膜多醣的免疫原結合物作為其調配物。在OPA分析中針對血清型15B及15C目標肺炎球菌菌株測試來自疫苗接種之前及之後的血清。 在每組之10隻兔中，在使用血清型15B結合物免疫後，100%對血清型15B具有OPA反應。在該等相同樣品中，100%亦對血清型15C具有OPA反應(表24及表25)。在15C OPA中在疫苗接種前血清中觀察到低OPA效價。然而，與疫苗接種前相比，使用疫苗接種後血清具有10倍以上之GMT OPA效價增加，此展示本發明之免疫原結合物誘導能夠在OPA中殺死血清型15B及15C肺炎鏈球菌之抗體之形成。表 24. 使用 16vPnC 疫苗接種之前及之後的兔血清中針對血清型 15B 及 15C 菌株之 OPA 效價
   動物 15B OPA 15C OPA
wk0 wk4 wk0 wk4
1 4 4129 50 2524
2 4 1645 182 472
3 4 1131 126 818
4 4 3199 50 1189
5 4 2664 36 727
6 4 4589 68 2492
7 11 3601 169 1137
8 4 1838 165 672
9 4 1334 98 528
10 4 1108 204 2425
GMT 4 2222 98 1075
表 25. 使用 20vPnC 疫苗接種之前及之後的兔血清中針對血清型 15B 及 15C 菌株之 OPA 效價
動物 15B OPA 15C OPA
wk0 wk4 wk0 wk4
1 4 3784 無法確定* 2353
2 4 862 480 938
3 4 3056 69 1497
4 4 1948 無法確定* 1316
5 4 2360 4 4665
6 4 1594 無法確定* 1835
7 4 4943 172 4085
8 4 2419 117 1458
9 4 1245 無法確定* 527
10 4 616 無法確定* 545
GMT 4 1917 77 1515
*效價因較差殺死曲線所致而無法確定 本說明書中所提及之所有公開案及專利申請案皆指示彼等熟習本發明所屬領域技術者之技術水準。所有出版物及專利申請案皆以引用方式併入本文中，其程度如同指示每一個別出版物或專利申請案係特定地且個別地以引用方式併入本文中一般。 儘管出於清晰理解之目的已藉助說明及實例相當詳細地闡述了上述發明，但可在隨附申請專利範圍之範疇內實踐某些變化及修改。
圖 1 展示肺炎鏈球菌血清型8 (Pn-8)莢膜多醣之重複多醣結構。圖 2 展示肺炎鏈球菌血清型10A (Pn-10A)莢膜多醣之重複多醣結構。圖 3 展示肺炎鏈球菌血清型11A (Pn-11A)莢膜多醣之重複多醣結構。圖 4 展示肺炎鏈球菌血清型12F (Pn-12F)莢膜多醣之重複多醣結構。圖 5 展示肺炎鏈球菌血清型15B (Pn-15B)莢膜多醣之重複多醣結構。圖 6 展示肺炎鏈球菌血清型22F (Pn-22F)莢膜多醣之重複多醣結構。圖 7 展示肺炎鏈球菌血清型33F (Pn-33F)莢膜多醣之重複多醣結構。圖 8 展示可用於製備Pn-33F糖結合物之活化(A)及結合(B)過程之代表性過程流程圖。圖 9 展示在TEMPO/NCS氧化反應中不同量之NCS對DO之效應。圖 10 展示對Pn-12F糖結合物穩定性之評估。圖 11 交叉功能性OPA反應。在OPA中評價來自成人的59份血清之亞組之針對血清型9V、9A、9L及9N之功能性抗體的存在，該等成人經13價肺炎球菌結合物疫苗(美國研究6115A1-004; ClinicalTrials.gov識別碼：NCT00427895)疫苗接種。各組之具有OPA正效價(即，≥1:8)之樣品之百分數指示於上方。各組之幾何平均效價(GMT)列示於x軸下方。圖 12 66份匹配的前/後血清之交叉功能性OPA反應。在OPA中評價來自成人的66份匹配的疫苗接種之前及之後血清盤之亞組的針對血清型9V、9A、9L及9N之功能性抗體之存在，該等成人經13價肺炎球菌結合物疫苗(研究6115A1-3005; ClinicalTrials.gov識別碼：NCT00546572)疫苗接種。各組之具有OPA正效價(即，≥1:8)之樣品之百分數指示於上方。各組之幾何平均效價(GMT)列示於x軸下方。圖 13 免疫之前及之後的逆累積分佈曲線(RCDC) - 肺炎球菌血清型9V (Pn9V)。 針對來自匹配的疫苗接種之前及之後血清盤(N = 66)的血清型9V之OPA效價之逆累積分佈曲線，該血清盤經13價肺炎球菌結合物疫苗(研究6115A1-3005; ClinicalTrials.gov識別碼：NCT00546572)疫苗接種。該等曲線表示具有OPA正效價(即，≥1:8)之血清之百分數。圖 14 免疫之前及之後的逆累積分佈曲線(RCDC) - 肺炎球菌血清型9A (Pn9A)。 針對來自匹配的疫苗接種之前及之後血清盤(N = 66)之血清型9A之OPA效價的逆累積分佈曲線，該血清盤經13價肺炎球菌結合物疫苗(研究6115A1-3005; ClinicalTrials.gov識別碼：NCT00546572)疫苗接種。該等曲線表示具有OPA正效價(即，≥1:8)之血清之百分數。圖 15 免疫之前及之後的逆累積分佈曲線(RCDC) - 肺炎球菌血清型9L (Pn9L)。 針對來自匹配的疫苗接種之前及之後血清盤(N = 66)之血清型9L之OPA效價的逆累積分佈曲線，該血清盤經13價肺炎球菌結合物疫苗(研究6115A1-3005; ClinicalTrials.gov識別碼：NCT00546572)疫苗接種。該等曲線表示具有OPA正效價(即，≥1:8)之血清之百分數。圖 16 免疫之前及之後的逆累積分佈曲線(RCDC) - 肺炎球菌血清型9N (Pn9N)。
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Claims (29)

  1. 一種免疫原組合物，其包含來自肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)血清型8之糖結合物，其中該血清型8糖結合物之特徵在於：-分子量介於4,000kDa與15,000kDa之間，-血清型8糖結合物中血清型8莢膜多醣對載體蛋白質之比率(w/w)介於0.4與2之間，-包含具有分子量介於100kDa與500kDa之間之醣，其中該血清型8糖結合物之載體蛋白係CRM197，且其中該糖結合物係使用二甲基亞碸(DMSO)中之還原性胺化法製備。
  2. 如請求項1之免疫原組合物，其中該血清型8糖結合物中血清型8莢膜多醣對載體蛋白質之比率(w/w)介於0.8與1.5之間。
  3. 如請求項1之免疫原組合物，其中該血清型8糖結合物包含具有分子量介於200kDa與400kDa之間之醣。
  4. 如請求項1之免疫原組合物，其中該血清型8糖結合物之結合度介於2與20之間。
  5. 如請求項1之免疫原組合物，其中該血清型8糖結合物之結合度介於6與14之間。
  6. 如請求項1之免疫原組合物，其進一步包含選自以下之一或多者：至少一個來自肺炎鏈球菌血清型22F之糖結合物，至少一個來自肺炎鏈球菌血清型33F之糖結合物，至少一個來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物，至少一個來自肺炎鏈球菌血清型10A之糖結合物，至少一個來自肺炎鏈球菌血清型11A之糖結合物，及至少一個來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物。
  7. 如請求項1之免疫原組合物，其進一步包含至少一個來自肺炎鏈球菌血清型22F之糖結合物及至少一個來自肺炎鏈球菌血清型33F之糖結合物。
  8. 如請求項1之免疫原組合物，其進一步包含至少一個來自肺炎鏈球菌血清型22F之糖結合物、至少一個來自肺炎鏈球菌血清型33F之糖結合物、至少一個來自肺炎鏈球菌血清型12F之糖結合物、至少一個來自肺炎鏈球菌血清型10A之糖結合物、至少一個來自肺炎鏈球菌血清型11A之糖結合物及至少一個來自肺炎鏈球菌血清型15B之糖結合物。
  9. 如請求項1之免疫原組合物，其進一步包含：來自肺炎鏈球菌血清型4、6B、9V、14、18C、19F及23F之糖結合物； 來自肺炎鏈球菌血清型1、3、5、6A、7F及19A之糖結合物；或二者。
  10. 如請求項1之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F及33F之糖結合物。
  11. 如請求項1之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖結合物。
  12. 如請求項1之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖結合物。
  13. 如請求項1之免疫原組合物，其進一步包含來自肺炎鏈球菌血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F及33F之糖結合物。
  14. 如請求項1至13中任一項之免疫原組合物，其進一步包含來自選自肺炎鏈球菌血清型2、15C、17F及20之一或多者之糖結合物。
  15. 如請求項1至13中任一項之免疫原組合物，其中該等糖結合物個 別地結合至CRM197。
  16. 如請求項9至13中任一項之免疫原組合物，其進一步以下列之一或多者為特徵：來自肺炎鏈球菌血清型1、4、5、6B、7F、9V、14及23F之糖結合物個別地結合至流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)蛋白質D，來自肺炎鏈球菌血清型18C之糖結合物結合至破傷風類毒素，及來自肺炎鏈球菌血清型19F之糖結合物結合至白喉毒素。
  17. 如請求項1至9中任一項之免疫原組合物，其係7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24價之肺炎鏈球菌結合物組合物。
  18. 如請求項1至13之免疫原組合物，其係7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24價之肺炎鏈球菌結合物組合物。
  19. 如請求項1至13之免疫原組合物，其係20價之肺炎鏈球菌結合物組合物。
  20. 如請求項6至13中任一項之免疫原組合物，其中血清型33F糖結合物、血清型12F糖結合物、血清型10A糖結合物、血清型11A糖結合物及血清型15B糖結合物中之一或多者之分子量介於50kDa與20,000 kDa之間。
  21. 如請求項1至13中任一項之免疫原組合物，其中該免疫原組合物進一步包含至少一佐劑。
  22. 如請求項21之免疫原組合物，其中該佐劑係磷酸鋁。
  23. 如請求項22之免疫原組合物，其中該磷酸鋁包含0.25mg/mL之元素鋁。
  24. 如請求項1至13中任一項之免疫原組合物，其包含緩衝液。
  25. 如請求項24之免疫原組合物，其中該緩衝液係最終濃度為5mM之琥珀酸鹽。
  26. 如請求項1至13中任一項之免疫原組合物，其包含150mM之氯化鈉。
  27. 如請求項1至13中任一項之免疫原組合物，其包含選自由以下組成之群之表面活性劑：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯85、Triton N-101、Triton X-100、辛苯醇醚(oxtoxynol)40、壬苯醇醚(nonoxynol)-9、三乙醇胺、三乙醇胺多肽油酸酯、聚氧乙烯-660羥基硬脂酸酯、聚氧乙烯 -35-蓖麻油酸酯、大豆卵磷脂及泊洛沙姆(poloxamer)。
  28. 如請求項1至13中任一項之免疫原組合物，其包含聚山梨醇酯80，其最終濃度為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%或0.1%聚山梨醇酯80(w/w/)。
  29. 如請求項1至13中任一項之免疫原組合物，其pH為5.8至6.0。
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