JP7059095B2 - コンジュゲート化莢膜糖類抗原を含む免疫原性組成物およびその使用 - Google Patents

コンジュゲート化莢膜糖類抗原を含む免疫原性組成物およびその使用 Download PDF

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Description

本発明は、コンジュゲート化莢膜糖類抗原（グリココンジュゲート）を含む新規免疫原性組成物およびその使用に関する。本発明の免疫原性組成物は、典型的には、糖類がストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型に由来するグリココンジュゲートを含む。本発明はまた、前記新規免疫原性組成物を用いた肺炎球菌感染に対する、ヒト対象、特に、幼児および高齢者のワクチン接種に関する。
肺炎球菌により引き起こされる感染は、全世界における罹患および死亡の主な原因である。肺炎、熱性菌血症および髄膜炎は、侵襲性肺炎球菌疾患の最も一般的な兆候であるが、一方、気道内での細菌拡散は中耳感染、副鼻腔炎または反復性気管支炎をもたらし得る。侵襲性疾患と比較して、非侵襲的兆候は通常、あまり重篤ではないが、さらにより一般的である。
欧州および米国においては、肺炎球菌性肺炎は、最も一般的な市中感染型細菌性肺炎であり、毎年、成人１００，０００人あたり約１００人が罹患すると見積もられている。熱性菌血症および髄膜炎に関する対応する数字は、それぞれ、１０００００人あたり１５～１９人および１００，０００人あたり１～２人である。１つまたは複数のこれらの兆候に関するリスクは、幼児および高齢者、ならびに任意の年齢の免疫力が低下した人々においてははるかにより高い。経済的に発展した地域においても、侵襲性肺炎球菌疾患は死亡率が高い；肺炎球菌性肺炎を有する成人については、死亡率は平均で１０％～２０％であるが、高リスク群においては５０％を超える可能性がある。肺炎は、世界中で肺炎球菌による死亡の圧倒的に最も一般的な原因である。
肺炎球菌疾患の原因菌であるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎球菌）は、多糖莢膜により取り囲まれた、グラム陽性被包性球菌である。この莢膜の組成における差異により、約９１種の莢膜型間の血清学的鑑別が可能になり、そのうちのいくつかは肺炎球菌疾患と関連することが多いが、他のものはそうであることは稀である。侵襲性肺炎球菌感染としては、肺炎、髄膜炎および熱性菌血症が挙げられる；特に、一般的な非侵襲的兆候は、中耳炎、副鼻腔炎および気管支炎である。
肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＰＣＶ）は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（肺炎球菌）により引き起こされる疾患に対して保護するために用いられる肺炎球菌ワクチンである。現在、世界市場で入手可能な３つのＰＣＶワクチンが存在する：ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）（いくつかの国ではＰｒｅｖｅｎａｒと呼ばれる）（７価ワクチン）、ＳＹＮＦＬＯＲＩＸ（登録商標）（１０価ワクチン）およびＰＲＥＶＮＡＲ１３（登録商標）（１３価ワクチン）。
必須の抗生物質に対する幅広い微生物耐性が最近発生しており、免疫力が低下した人々の数が増加していることから、さらにより広い保護を示す肺炎球菌ワクチンの必要性が強調される。
特に、ＰＲＥＶＮＡＲ１３（登録商標）には見出されない血清型があり、またいずれは血清型置換の生じる可能性があることから、肺炎球菌疾患をカバーする医学的必要性は未だ満たされておらず、対処が必要である。ＰＲＥＶＮＡＲ１３（登録商標）における１３を超える疾患を引き起こす特定の血清型は、地域、集団によって変化し、抗生物質耐性の獲得、肺炎球菌ワクチン導入および未知の起源の長期的傾向のため、時間と共に変化し得る。ヒトおよび特に、２歳未満の子供においてさらなるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を誘導するために用いることができる免疫原性組成物が必要とされている。
本発明の新規免疫原性組成物の目的は、ＰＲＥＶＮＡＲ１３（登録商標）には見出されないストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に対する適切な保護を提供することである。一態様において、本発明の免疫原性組成物の目的は、ＰＲＥＶＮＡＲ（登録商標）（７価ワクチン）、ＳＹＮＦＬＯＲＩＸ（登録商標）および／またはＰＲＥＶＮＡＲ１３（登録商標）によって現在包含される血清型に対する免疫応答を維持しながら、前記ワクチンには見出されないストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型に対する適切な保護を提供することである。
本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来するグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来するグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来するグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来するグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来するグリココンジュゲートおよびストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来するグリココンジュゲートからなる群から選択される少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む免疫原性組成物に関する。
一態様において、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。
別の態様において、本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートおよびストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む免疫原性組成物を提供する。
ある態様において、上記の免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来するグリココンジュゲートをさらに含む。
別の態様において、上記の免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、５および７Ｆに由来するグリココンジュゲートをさらに含む。
別の態様において、上記の免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａおよび１９Ａに由来するグリココンジュゲートをさらに含む。
別の態様において、上記の免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３に由来するグリココンジュゲートをさらに含む。
別の態様において、上記の免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２、９Ｎ、１７Ｆ、２０および／または１５Ｃに由来するグリココンジュゲートをさらに含む。
ある態様において、上記の免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎ、９Ａおよび／または９Ｌに由来する莢膜糖類を含まない。
ある態様において、上記の免疫原性組成物は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。ある態様において、上記の免疫原性組成物は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。
ある態様において、グリココンジュゲートは、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風毒素）、ＣＲＭ１９７、他のＤＴ変異体、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ）、またはその免疫学的に機能的な等価物からなる群から選択される担体タンパク質に個別にコンジュゲートされている。
一態様において、本発明は、本文献で定義される任意の免疫原性組成物を充填した容器を提供する。
一態様において、本発明は、薬剤としての使用、特に、ワクチンとしての使用のための本文献で定義される任意の免疫原性組成物を提供する。
一態様において、本発明は、対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連する感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善する方法であって、対象に、免疫学的に有効な量の本文献で定義される任意の免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８（Ｐｎ－８）莢膜多糖の反復多糖構造を示す図である。 ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ（Ｐｎ－１０Ａ）莢膜多糖の反復多糖構造を示す図である。 ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａ（Ｐｎ－１１Ａ）莢膜多糖の反復多糖構造を示す図である。 ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆ（Ｐｎ－１２Ｆ）莢膜多糖の反復多糖構造を示す図である。 ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ（Ｐｎ－１５Ｂ）莢膜多糖の反復多糖構造を示す図である。 ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆ（Ｐｎ－２２Ｆ）莢膜多糖の反復多糖構造を示す図である。 ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆ（Ｐｎ－３３Ｆ）莢膜多糖の反復多糖構造を示す図である。 Ｐｎ－３３Ｆグリココンジュゲートの調製において用いることができる活性化（Ａ）およびコンジュゲーション（Ｂ）プロセスに関する代表的なプロセス流れ図を示す図である。 ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ酸化反応におけるＮＣＳの量の変化によるＤＯに対する効果を示す図である。 Ｐｎ－１２Ｆグリココンジュゲートの安定性の評価を示す図である。 機能横断型ＯＰＡ応答を示す図である。１３価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（ＵＳ Ｓｔｕｄｙ ６１１５Ａ１－００４；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００４２７８９５）をワクチン接種された成人からの５９種の血清のサブセットを、血清型９Ｖ、９Ａ、９Ｌ、および９Ｎに対する機能的抗体の存在についてＯＰＡにおいて評価した。ＯＰＡ陽性力価（すなわち、１：８以上）を有する試料のパーセントを、各群の上に示す。幾何平均力価（ＧＭＴ）を、各群の下のｘ軸に列挙する。 ６６種の対応付けられた前／後血清の機能横断型ＯＰＡ応答を示す図である。１３価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（試験６１１５Ａ１－３００５；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００５４６５７２）をワクチン接種された成人からの６６種の対応付けられたワクチン接種前および接種後の血清パネルのサブセットを、血清型９Ｖ、９Ａ、９Ｌ、および９Ｎに対する機能的抗体の存在についてＯＰＡにおいて評価した。ＯＰＡ陽性力価（すなわち、１：８以上）を有する試料のパーセントを、各群の上に示す。幾何平均力価（ＧＭＴ）を、各群の下のｘ軸に列挙する。 肺炎球菌血清型９Ｖ（Ｐｎ９Ｖ）による免疫化の前および後の逆累積分布曲線（ＲＣＤＣ）を示す図である。１３価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（試験６１１５Ａ１－３００５；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００５４６５７２）をワクチン接種された、対応付けられたワクチン接種前および接種後の血清パネル（Ｎ＝６６）からの血清型９Ｖに対するＯＰＡ力価の逆累積分布曲線である。プロットは、ＯＰＡ陽性力価（すなわち、１：８以上）を有する血清のパーセントを表す。 肺炎球菌血清型９Ａ（Ｐｎ９Ａ）による免疫化の前および後の逆累積分布曲線（ＲＣＤＣ）を示す図である。１３価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（試験６１１５Ａ１－３００５；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００５４６５７２）をワクチン接種された、対応付けられたワクチン接種前および接種後の血清パネル（Ｎ＝６６）からの血清型９Ａに対するＯＰＡ力価の逆累積分布曲線である。プロットは、ＯＰＡ陽性力価（すなわち、１：８以上）を有する血清のパーセントを表す。 肺炎球菌血清型９Ｌ（Ｐｎ９Ｌ）による免疫化の前および後の逆累積分布曲線（ＲＣＤＣ）を示す図である。１３価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（試験６１１５Ａ１－３００５；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００５４６５７２）をワクチン接種された、対応付けられたワクチン接種前および接種後の血清パネル（Ｎ＝６６）からの血清型９Ｌに対するＯＰＡ力価の逆累積分布曲線である。プロットは、ＯＰＡ陽性力価（すなわち、１：８以上）を有する血清のパーセントを表す。 肺炎球菌血清型９Ｎ（Ｐｎ９Ｎ）による免疫化の前および後の逆累積分布曲線（ＲＣＤＣ）を示す図である。１３価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（試験６１１５Ａ１－３００５；ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００５４６５７２）をワクチン接種された、対応付けられたワクチン接種前および接種後の血清パネル（Ｎ＝６６）からの血清型９Ｎに対するＯＰＡ力価の逆累積分布曲線である。プロットは、ＯＰＡ陽性力価（すなわち、１：８以上）を有する血清のパーセントを表す。
１ 本発明の免疫原性組成物
本発明の免疫原性組成物は、典型的には、糖類がストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型に由来するコンジュゲート化莢膜糖類抗原（グリココンジュゲートとも呼ばれる）を含む。
好ましくは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜糖類の数は、８種の異なる血清型（または「ｖ」、価）～２０種の異なる血清型（２０ｖ）の範囲であってもよい。一実施形態においては、８種の異なる血清型が存在する。一実施形態においては、９種の異なる血清型が存在する。一実施形態においては、１０種の異なる血清型が存在する。一実施形態においては、１１種の異なる血清型が存在する。一実施形態においては、１２種の異なる血清型が存在する。一実施形態においては、１３種の異なる血清型が存在する。一実施形態においては、１４種の異なる血清型が存在する。一実施形態においては、１５種の異なる血清型が存在する。一実施形態においては、１６種の異なる血清型が存在する。一実施形態においては、１７種の異なる血清型が存在する。一実施形態においては、１８種の異なる血清型が存在する。一実施形態においては、１９種の異なる血清型が存在する。一実施形態においては、２０種の異なる血清型が存在する。莢膜糖類を担体タンパク質にコンジュゲートさせて、本明細書の以下に記載されるようなグリココンジュゲートを形成させる。
タンパク質担体が組成物中の２つ以上の糖類について同じである場合、糖類を、タンパク質担体の同じ分子（それにコンジュゲートされた２つ以上の異なる糖類を有する担体分子）にコンジュゲートさせることができる[例えば、ＷＯ２００４／０８３２５１を参照されたい]。
しかし、好ましい実施形態においては、糖類を、タンパク質担体の異なる分子（それにコンジュゲートされた１つの種類の糖類のみを有するタンパク質担体のそれぞれの分子）にそれぞれ個別にコンジュゲートさせる。前記実施形態においては、莢膜糖類は、担体タンパク質に個別にコンジュゲートされていると言われる。
本発明の目的では、用語「グリココンジュゲート」は、担体タンパク質に共有的に連結された莢膜糖類を示す。一実施形態においては、莢膜糖類は、担体タンパク質に直接連結される。第２の実施形態においては、細菌糖類はスペーサー／リンカーを介してタンパク質に連結される。
１．１ 本発明の担体タンパク質
本発明のグリココンジュゲートの成分は、糖類がコンジュゲートされている担体タンパク質である。用語「タンパク質担体」または「担体タンパク質」または「担体」は、本明細書では互換的に用いることができる。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に従うべきである。
好ましい実施形態においては、グリココンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風毒素）またはＴＴの断片Ｃ、ＣＲＭ１９７（ジフテリア毒素の非毒性的であるが、抗原的に同一であるバリアント）、他のＤＴ変異体（ＣＲＭ１７６、ＣＲＭ２２８、ＣＲＭ４５（Ｕｃｈｉｄａら（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１８：３８３８～３８４４）、ＣＲＭ９、ＣＲＭ１０２、ＣＲＭ１０３またはＣＲＭ１０７；ＮｉｃｈｏｌｌｓおよびＹｏｕｌｅ、 Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔｏｘｉｎｓ、Ｆｒａｎｋｅｌ（編）、Ｍａｅｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．（１９９２）により記載された他の突然変異；Ｇｌｕ－１４８からＡｓｐ、ＧｌｎもしくはＳｅｒおよび／またはＡｌａ－１５８からＧｌｙへの欠失または突然変異ならびに米国特許第４，７０９，０１７号および第４，９５０，７４０号に開示された他の突然変異；Ｌｙｓ５１６、Ｌｙｓ５２６、Ｐｈｅ５３０および／またはＬｙｓ５３４のうちの少なくとも１つまたは複数の残基の突然変異ならびに米国特許第５，９１７，０１７号および第６，４５５，６７３号に開示された他の突然変異；または米国特許第５，８４３，７１１号に開示された断片、肺炎球菌ニューモリシン（ｐｌｙ）（Ｋｕｏら（１９９５）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ６３：２７０６～２７１３）、例えば、いくつかの様式で解毒されたｐｌｙ、例えば、ｄＰＬＹ－ＧＭＢＳ（ＷＯ２００４／０８１５１５、ＷＯ２００６／０３２４９９）またはｄＰＬＹ－ｆｏｒｍｏｌ、ＰｈｔＸ、例えば、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ（ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤまたはＰｈｔＥの配列は、ＷＯ００／３７１０５およびＷＯ００／３９２９９に開示されている）およびＰｈｔタンパク質の融合物、例えば、ＰｈｔＤＥ融合物、ＰｈｔＢＥ融合物、Ｐｈｔ Ａ－Ｅ（ＷＯ０１／９８３３４、ＷＯ０３／０５４００７、ＷＯ２００９／０００８２６）、通常、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｂから抽出されるＯＭＰＣ（髄膜炎菌外膜タンパク質）（ＥＰ０３７２５０１）、ＰｏｒＢ（ナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来）、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ；例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）、または免疫学的に機能的なその等価物、合成ペプチド（ＥＰ０３７８８８１、ＥＰ０４２７３４７）、熱ショックタンパク質（ＷＯ９３／１７７１２、ＷＯ９４／０３２０８）、百日咳タンパク質（ＷＯ９８／５８６６８、ＥＰ０４７１１７７）、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子またはホルモン（ＷＯ９１／０１１４６）、様々な病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（Ｆａｌｕｇｉら（２００１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３１：３８１６－３８２４）、例えば、Ｎ１９タンパク質（Ｂａｒａｌｄｏｉら（２００４）Ｉｎｆｅｃｔ ｌｍｍｕｎ ７２：４８８４－４８８７）、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ（ＷＯ０２／０９１９９８）、鉄取込みタンパク質（ＷＯ０１／７２３３７）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢ（ＷＯ００／６１７６１）、トランスフェリン結合タンパク質、肺炎球菌接着タンパク質（ＰｓａＡ）、組換えシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）外毒素Ａ（特に、その非毒性変異体（グルタミン酸５５３に置換を担持する外毒素Ａなど）（Ｄｏｕｇｌａｓら（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９（１１）：４９６７－４９７１））からなる群において選択される。オブアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質を、担体タンパク質として用いることもできる。他の好適な担体タンパク質としては、コレラトキソイド（例えば、ＷＯ２００４／０８３２５１に記載される）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、およびシュードモナス・エルギノーサ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に由来する外毒素Ａなどの不活化細菌毒素が挙げられる。
好ましい実施形態においては、グリココンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ、ＤＴ、ＤＴ変異体（ＣＲＭ１９７など）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、ＰｈｔＸ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＤＥ融合物（特に、ＷＯ０１／９８３３４およびＷＯ０３／０５４００７に記載のもの）、解毒されたニューモリシン、ＰｏｒＢ、Ｎ１９タンパク質、ＰｓｐＡ、ＯＭＰＣ、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素ＡまたはＢおよびＰｓａＡからなる群から独立に選択される。
１つの実施形態においては、本発明のグリココンジュゲートの担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリアトキソイド）である。別の実施形態においては、本発明のグリココンジュゲートの担体タンパク質は、ＴＴ（破傷風毒素）である。
別の実施形態においては、本発明のグリココンジュゲートの担体タンパク質は、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ；例えば、ＥＰ０５９４６１０Ｂを参照されたい）である。
好ましい実施形態においては、本発明の莢膜糖類は、ＣＲＭ１９７タンパク質にコンジュゲートされている。ＣＲＭ１９７タンパク質は、非毒性形態のジフテリア毒素であるが、ジフテリア毒素とは免疫学的に区別がつかない。ＣＲＭ１９７は、毒素原性コリネファージベータ（Ｕｃｈｉｄａら（１９７１）Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２３３：８～１１）のニトロソグアニジン突然変異誘発により作出された非毒素原性ファージβ１９７ｔｏｘ－により感染したコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）により産生される。ＣＲＭ１９７タンパク質は、ジフテリア毒素と同じ分子量を有するが、構造遺伝子中の単一塩基変化（グアニンからアデニンへの）によりそれとは異なる。この単一塩基変化は、成熟タンパク質中のアミノ酸置換（グルタミン酸からグリシンへの）を引き起こし、ジフテリア毒素の毒性を除去する。ＣＲＭ１９７タンパク質は、糖類のための安全かつ有効なＴ細胞依存的担体である。ＣＲＭ１９７およびその産生に関するさらなる詳細を、例えば、米国特許第５，６１４，３８２号に見出すことができる。
１つの実施形態において、本発明の莢膜糖類は、ＣＲＭ１９７タンパク質またはＣＲＭ１９７のＡ鎖にコンジュゲートされている（ＣＮ１０３４９５１６１を参照されたい）。１つの実施形態において、本発明の莢膜糖類は、遺伝子組換え体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）による発現を介して得られたＣＲＭ１９７のＡ鎖にコンジュゲートされている（ＣＮ１０３４９５１６１を参照されたい）。１つの実施形態において、本発明の莢膜糖類は、全てＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。１つの実施形態において、本発明の莢膜糖類は、全てＣＲＭ１９７のＡ鎖にコンジュゲートされている。
したがって、よくある実施形態において、本発明のグリココンジュゲートは、担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を含み、ここで、莢膜多糖はＣＲＭ１９７に共有的に連結される。
１．２ 本発明の莢膜糖類
本明細書を通して、用語「糖類」は、多糖またはオリゴ糖類を含んでもよく、両方を含む。よくある実施形態において、糖類は多糖、特に、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖である。
莢膜多糖は、当業者には公知の標準的な技術により調製される。
本発明において、莢膜多糖を、例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから調製することができる。典型的には、莢膜多糖を、培地（例えば、ダイズ系培地）中でそれぞれのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型を増殖させることにより生産した後、細菌培養物から調製する。本発明のグリココンジュゲートにおいて用いられるそれぞれの多糖を作製するために用いられるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の細菌株を、確立された培養株保存機関または臨床標本から得ることができる。
生物の集団（それぞれのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型）を、種バイアルから種ボトルまでスケールアップし、生産規模の発酵容量に達するまで増大する容量の１つまたは複数の種発酵器により継代することが多い。増殖サイクルの終わりに、細胞を溶解した後、溶解物培養液を、下流の（精製）プロセスのために収穫する（例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１、ＷＯ２００８／１１８７５２、ならびに米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００６／０２２８３８１号、第２００８／０１０２４９８号、および第２００８／０２８６８３８号を参照されたい）。
個々の多糖を、典型的には、遠心分離、沈降、限外濾過、および／またはカラムクロマトグラフィーにより精製する（例えば、ＷＯ２００６／１１０３５２およびＷＯ２００８／１１８７５２を参照されたい）。
精製された多糖を、活性化（例えば、化学的に活性化）して、それらが反応（例えば、ｅＴＥＣスペーサーと）することができるようにした後、本明細書にさらに記載されるように、本発明のグリココンジュゲート中に組み込むことができる。
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖は、最大８個の糖残基を含有してもよい反復オリゴ糖類単位を含む。
１つの実施形態において、本発明の莢膜糖類は、１つのオリゴ糖類単位または反復オリゴ糖類単位の天然の長さの糖類鎖よりも短いものであってもよい。１つの実施形態において、本発明の莢膜糖類は、関連する血清型の１つの反復オリゴ糖類単位である。
１つの実施形態において、本発明の莢膜糖類は、オリゴ糖類であってもよい。オリゴ糖類は、少数の反復単位（典型的には、５～１５の反復単位）を有し、典型的には、合成的に、または多糖の加水分解により誘導される。
しかし、好ましくは、本発明の、および本発明の免疫原性組成物中の莢膜糖類の全部は、多糖である。高分子量の莢膜多糖は、抗原表面上に存在するエピトープのため、ある特定の抗体免疫応答を誘導することができる。高分子量莢膜多糖の単離および精製は、好ましくは、本発明のコンジュゲート、組成物および方法における使用のために企図される。
いくつかの実施形態においては、コンジュゲーション前に精製された多糖は、１０ｋＤａ～４，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態においては、多糖は、５０ｋＤａ～４，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態においては、多糖は、５０ｋＤａ～３，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～２，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～２，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；または２００ｋＤａ～５００ｋＤａの分子量を有する。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減少するようになってもよい。さらに、本明細書に記載のように、多糖を、コンジュゲーションの前にサイジング技術にかけてもよい。機械的または化学的サイジングを用いることができる。化学的加水分解を、酢酸を用いて行うことができる。機械的サイジングを、高圧均一化剪断を用いて行うことができる。上記の分子量範囲は、コンジュゲーション前（例えば、活性化前）の精製された多糖を指す。
好ましい実施形態においては、精製された多糖は、莢膜多糖が本明細書に上記された分子量範囲の１つの中にある分子量を有する、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆまたは３３Ｆに由来する莢膜多糖である。
本明細書で用いられる場合、多糖または担体タンパク質－多糖コンジュゲートの「分子量」という用語は、多角レーザー光散乱検出器（ＭＡＬＬＳ）と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により算出される分子量を指す。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型９Ｖ、１８Ｃ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆおよび／または３３Ｆに由来する肺炎球菌糖類は、Ｏ－アセチル化されている。いくつかの実施形態においては、本発明の血清型９Ｖ、１１Ａ、１５Ｂ、２２Ｆおよび／または３３Ｆに由来する肺炎球菌糖類は、Ｏ－アセチル化されている。
本明細書に記載の精製された多糖を化学的に活性化して、担体タンパク質と反応することができる糖類を作製する。これらの肺炎球菌コンジュゲートを、別々のプロセスによって調製し、以下に記載の単一用量製剤に製剤化する。
１．２．１ ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する肺炎球菌多糖
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する莢膜糖類を、当業者には公知の標準的な技術により調製することができる（例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１を参照されたい）。莢膜多糖を、培地中でそれぞれのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型を増殖させることにより生産することができる；増殖サイクルの終わりに、細胞を溶解した後、溶解物培養液を下流の（精製）プロセスのために収穫する。個々の多糖は、典型的には、遠心分離、沈降、限外濾過、および／またはカラムクロマトグラフィーにより精製される（例えば、ＷＯ２００６／１１０３５２およびＷＯ２００８／１１８７５２を参照されたい）。精製された多糖を、本明細書にさらに記載されるようにさらにプロセシングして、本発明のグリココンジュゲートを調製することができる。
いくつかの実施形態においては、コンジュゲーション前のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび／または２３Ｆに由来する精製された多糖は、１０ｋＤａ～４，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態においては、多糖は、５０ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～３，０００ｋＤａまたは５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態においては、多糖は、５０ｋＤａ～３，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～２，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～２，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；または２００ｋＤａ～５００ｋＤａの分子量を有する。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減少するようになってもよい。さらに、本明細書に記載のように、多糖を、コンジュゲーションの前にサイジング技術にかけてもよい。上記の分子量範囲は、最終的なサイジングステップの後、コンジュゲーションの前（例えば、活性化の前）の精製された多糖を指す。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型９Ｖおよび／または１８Ｃに由来する肺炎球菌糖類は、Ｏ－アセチル化されている。いくつかの実施形態においては、本発明の血清型９Ｖに由来する肺炎球菌糖類は、Ｏ－アセチル化されており、本発明の血清型１８Ｃに由来する肺炎球菌糖類は、脱－Ｏ－アセチル化されている。
１．２．２ 肺炎球菌多糖血清型８
血清型８の多糖反復単位は、１つのグルクロン酸（ＧｌｃｐＡ）、２つのグルコピラノース（Ｇｌｃｐ）および１つのガラクトピラノース（Ｇａｌｐ）を有する直鎖状四糖類からなる（Ｊｏｎｅｓら（１９５７） Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．７９（１１）：２７８７～２７９３）。４つ全ての単糖類は、図１に示されるように１，４－結合により連結される。
血清型８の糖類を、当業者には公知の単離手順を用いて細菌から直接得ることができる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００６／０２２８３８１号、第２００７／０１８４０７１号、第２００７／０１８４０７２号、第２００７／０２３１３４０号、および第２００８／０１０２４９８号、ならびにＷＯ２００８／１１８７５２に開示された方法を参照されたい）。さらに、それらを、合成プロトコールを用いて生産することができる。
血清型８のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株を、確立された培養株保存機関（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）など）または臨床標本から得ることができる。
いくつかの実施形態においては、コンジュゲーション前のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来する精製された多糖は、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態においては、莢膜多糖は、５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態においては、莢膜多糖は、７０ｋＤａ～９００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態においては、莢膜多糖は、１００ｋＤａ～８００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、莢膜多糖は、１００ｋＤａ～６００ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；２００ｋＤａ～６００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～６００；２５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～３５０ｋＤａ；３００ｋＤａ～６００ｋＤａ；３００ｋＤａ～５００ｋＤａ；３００ｋＤａ～４００ｋＤａ；４００ｋＤａ～６００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量；および同様の所望の分子量範囲を有する。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減少するようになってもよい。さらに、本明細書に記載のように、多糖を、コンジュゲーションの前にサイジング技術にかけてもよい。上記の分子量範囲は、最終的なサイジングステップの後、コンジュゲーションの前（例えば、活性化の前）の精製された多糖を指す。
１．２．３ 肺炎球菌多糖血清型１０Ａ
血清型１０Ａの多糖反復単位は、２つのガラクトフラノース（Ｇａｌｆ）、３つのガラクトピラノース（Ｇａｌｐ）、１つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌｐＮＡｃ）およびホスホリビトール骨格を有する分枝状六糖類反復単位からなる（Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．（２００５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６９（１）：１７５～１８１）。図２に示されるように、β－ＧａｌｐＮＡｃ部分（β－３－Ｇａｌｐおよびβ－６－Ｇａｌｆ）に２つの分枝単糖類が存在する。
血清型１０Ａの糖類を、当業者には公知の単離手順を用いて細菌から直接得ることができる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００６／０２２８３８１号、第２００７／０１８４０７１号、第２００７／０１８４０７２号、第２００７／０２３１３４０号、および第２００８／０１０２４９８号、ならびにＷＯ２００８／１１８７５２に開示された方法を参照されたい）。さらに、それらを、合成プロトコールを用いて生産することができる。
血清型１０Ａのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株を、確立された培養株保存機関（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）など）または臨床標本から得ることができる。
いくつかの実施形態においては、コンジュゲーション前のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来する精製された多糖は、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態においては、莢膜多糖は、５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態においては、莢膜多糖は、７０ｋＤａ～９００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態においては、莢膜多糖は、１００ｋＤａ～８００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、莢膜多糖は、１００ｋＤａ～６００ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；２００ｋＤａ～６００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～３５０ｋＤａ；３００ｋＤａ～６００ｋＤａ；３００ｋＤａ～５００ｋＤａ；３００ｋＤａ～４００ｋＤａ；４００ｋＤａ～６００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量；および同様の所望の分子量範囲を有する。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減少するようになってもよい。さらに、本明細書に記載のように、多糖を、コンジュゲーションの前にサイジング技術にかけてもよい。上記の分子量範囲は、最終的なサイジングステップの後、コンジュゲーションの前（例えば、活性化の前）の精製された多糖を指す。
１．２．４ 肺炎球菌多糖血清型１１Ａ
血清型１１Ａの多糖反復単位は、図３に示されるように、直鎖状四糖類骨格（２つのガラクトピラノース（Ｇａｌｐ）および２つのグルコピラノース（Ｇｌｃｐ））およびペンダントホスホグリセロールからなる（Ｒｉｃｈａｒｄｓら（１９８８）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２２８：５９５～５９７）。多糖は、複数の位置でＯ－アセチル化されており、文献（Ｃａｌｉｘら（２０１１）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９３（１９）：５２７１～５２７８）中の報告されたデータに基づくと、１１Ａ多糖中のＯ－アセチル化の総量は、多糖反復単位あたり約２．６個のＯ－アセチル基である。
血清型１１Ａの糖類を、当業者には公知の単離手順を用いて細菌から直接得ることができる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００６／０２２８３８１号、第２００７／０１８４０７１号、第２００７／０１８４０７２号、第２００７／０２３１３４０号、および第２００８／０１０２４９８号、ならびにＷＯ２００８／１１８７５２に開示された方法を参照されたい）。さらに、それらを、合成プロトコールを用いて生産することができる。
血清型１１Ａのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株を、確立された培養株保存機関（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）など）または臨床標本から得ることができる。
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）溶解物に由来する血清型１１Ａ多糖の精製により得られた単離された血清型１１Ａ莢膜多糖および場合により、精製された多糖のサイジングを、例えば、分子量（ＭＷ）および前記血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭを含む、様々な属性により特徴付けることができる。
いくつかの実施形態においては、コンジュゲーション前のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来する精製された多糖は、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態においては、莢膜多糖は、５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態においては、莢膜多糖は、７０ｋＤａ～９００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態においては、莢膜多糖は、１００ｋＤａ～８００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、莢膜多糖は、１００ｋＤａ～６００ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～３００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～２００ｋＤａ；２００ｋＤａ～６００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～３５０ｋＤａ；３００ｋＤａ～６００ｋＤａ；３００ｋＤａ～５００ｋＤａ；３００ｋＤａ～４００ｋＤａ；４００ｋＤａ～６００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量；および同様の所望の分子量範囲を有する。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減少するようになってもよい。さらに、本明細書に記載のように、多糖を、コンジュゲーションの前にサイジング技術にかけてもよい。上記の分子量範囲は、最終的なサイジングステップの後、コンジュゲーションの前（例えば、活性化の前）の精製された多糖を指す。
１つの実施形態においては、精製された血清型１１Ａ多糖のサイズを、高圧均一化により減少させる。高圧均一化は、十分に小さい寸法を有する流路を通してプロセス流をポンプすることにより高い剪断速度を達成する。剪断速度は、より大きい印加される均一化圧力を用いることにより増大し、ホモジェナイザーにより供給流を再循環させることにより曝露時間を増大させることができる。
高圧均一化プロセスは、Ｏ－アセチル基の存在などの、多糖の構造的特徴を保持しながら、精製された血清型１１Ａ多糖のサイズを減少させるのに特に好適である。
精製された、単離された、もしくは活性化された血清型１１Ａ莢膜多糖中または血清型１１Ａ多糖－担体タンパク質コンジュゲート中のＯ－アセチルの存在は、前記多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭ数として、または多糖反復単位あたりのＯ－アセチル基の数として表される。
好ましい実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来する精製された多糖は、前記血清型１１Ａ莢膜多糖１μｍｏｌあたり、少なくとも０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４または１．６μｍｏｌのアセテートを有する。
１．２．５ 肺炎球菌多糖血清型１２Ｆ
血清型１２Ｆの多糖反復単位は、図４に示されるように、２つの分枝：ＦｕｃｐＮＡｃのＣ３で連結されたペンダントα－ガラクトピラノース（Ｇａｌｐ）およびＭａｎｐＮＡｃＡのＣ３で連結されたα－Ｇｌｃｐ－（１→２）－α－Ｇｌｃｐ二糖類分枝を有する、直鎖状三糖類骨格（１つのＮ－アセチルフコサミン（ＦｕｃｐＮＡｃ）、１つのＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌｐＮＡｃ）および１つのＮ－アセチルマヌロン酸（ＭａｎｐＮＡｃＡ））からなる（Ｌｅｏｎｔｅｉｎら（１９８３）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１４（２）：２５７～２６６））。
血清型１２Ｆのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株を、確立された培養株保存機関（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）など）または臨床標本から得ることができる。
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来する莢膜糖類は、当業者には公知の標準的な技術により調製される。典型的には、莢膜多糖を、培地（例えば、ダイズ系培地）中でそれぞれのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型を増殖させることにより生産した後、多糖を細菌培養物から調製する。生物の集団（ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆ）を、種バイアルから種ボトルまでスケールアップし、生産規模の発酵容量に達するまで増大する容量の１つまたは複数の種発酵器により継代することが多い。増殖サイクルの終わりに、細胞を溶解した後、溶解物培養液を、下流の（精製）プロセスのために収穫する（例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１およびＷＯ２００８／１１８７５２、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００６／０２２８３８１号、第２００８／０１０２４９８号、および第２００８／０２８６８３８号を参照されたい）。多糖を、典型的には、遠心分離、沈降、限外濾過、および／またはカラムクロマトグラフィーにより精製する（例えば、ＷＯ２００６／１１０３５２およびＷＯ２００８／１１８７５２を参照されたい）。
本明細書にさらに記載されるように、血清型１２Ｆに由来する精製された多糖を、活性化（例えば、化学的に活性化）して、それらを反応することができるようにした後、本発明のグリココンジュゲート中に組み込むことができる。
いくつかの実施形態においては、コンジュゲーション前のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来する精製された多糖は、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態においては、莢膜多糖は、５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態においては、莢膜多糖は、５０ｋＤａ～３００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態においては、莢膜多糖は、７０ｋＤａ～３００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態においては、莢膜多糖は、９０ｋＤａ～２５０ｋＤａ；９０ｋＤａ～１５０ｋＤａ；９０ｋＤａ～１２０ｋＤａ；８０ｋＤａ～１２０ｋＤａ；７０ｋＤａ～１００ｋＤａ；７０ｋＤａ～１１０ｋＤａ；７０ｋＤａ～１２０ｋＤａ；７０ｋＤａ～１３０ｋＤａ；７０ｋＤａ～１４０ｋＤａ；７０ｋＤａ～１５０ｋＤａ；７０ｋＤａ～１６０ｋＤａ；８０ｋＤａ～１１０ｋＤａ；８０ｋＤａ～１２０ｋＤａ；８０ｋＤａ～１３０ｋＤａ；８０ｋＤａ～１４０ｋＤａ；８０ｋＤａ～１５０ｋＤａ；８０ｋＤａ～１６０ｋＤａ；９０ｋＤａ～１１０ｋＤａ；９０ｋＤａ～１２０ｋＤａ；９０ｋＤａ～１３０ｋＤａ；９０ｋＤａ～１４０ｋＤａ；９０ｋＤａ～１５０ｋＤａ；９０ｋＤａ～１６０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１２０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１３０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１４０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１６０ｋＤａの分子量；および同様の所望の分子量範囲を有する。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減少するようになってもよい。さらに、本明細書に記載のように、多糖を、コンジュゲーションの前にサイジング技術にかけてもよい。上記の分子量範囲は、最終的なサイジングステップの後、コンジュゲーションの前（例えば、活性化の前）の精製された多糖を指す。
１．２．６ 肺炎球菌多糖血清型１５Ｂ
図５に示されるように、血清型１５Ｂの多糖反復単位は、ＧｌｃｐＮＡｃのＣ４ヒドロキシル基に連結されたαＧａｌｐ－βＧａｌｐ二糖類を有する、分枝状三糖類骨格（１つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃｐＮＡｃ）、１つのガラクトピラノース（Ｇａｌｐ）および１つのグルコピラノース（Ｇｌｃｐ））からなる。ホスホグリセロールを、二糖類分枝中のβＧａｌｐ残基のＣ３ヒドロキシル基に連結する（Ｊｏｎｅｓら（２００５）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４０（３）：４０３～４０９）。血清型１５Ｃに由来する莢膜多糖は、血清型１５Ｂと同一の骨格構造を有するが、Ｏ－アセチル化を欠く。
血清型１５Ｂ多糖を、当業者には公知の単離手順を用いて細菌から直接得ることができる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００６／０２２８３８１号、第２００７／０１８４０７１号、第２００７／０１８４０７２号、第２００７／０２３１３４０号、および第２００８／０１０２４９８号、ならびにＷＯ２００８／１１８７５２に開示された方法を参照されたい）。また、それらを、当業者には公知の合成プロトコールを用いて生産することができる。
血清型１５Ｂのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株を、確立された培養株保存機関（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ＵＳＡ）など（例えば、寄託株ＡＴＣＣ１０３５４）もしくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ ＵＳＡ））または臨床標本から得ることができる。
細菌細胞を、培地、好ましくはダイズ系培地中で増殖させる。ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖を生産する細菌細胞の発酵後、細菌細胞を溶解して、細胞溶解物を得る。次いで、血清型１５Ｂの多糖を、遠心分離、深層濾過、沈降、限外濾過、活性炭を用いる処理、透析濾過および／またはカラムクロマトグラフィーの使用を含む、当技術分野で公知の精製技術を用いて細胞溶解物から単離することができる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００６／０２２８３８１号、第２００７／０１８４０７１号、第２００７／０１８４０７２号、第２００７／０２３１３４０号、および第２００８／０１０２４９８号、ならびにＷＯ２００８／１１８７５２を参照されたい）。次いで、精製された血清型１５Ｂの莢膜多糖を、免疫原性コンジュゲートの調製のために用いることができる。
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）溶解物からの血清型１５Ｂ多糖の精製により得られる単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖および場合により、精製された多糖のサイジングを、例えば、分子量（ＭＷ）、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭ、および前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのグリセロールのｍＭを含む、様々なパラメータにより特徴付けることができる。
好ましくは、有利な濾過特徴および／または収率を有する１５Ｂコンジュゲートを生成するために、標的分子量範囲への多糖のサイジングを、担体タンパク質へのコンジュゲーションの前に実施する。有利には、精製された血清型１５Ｂ多糖のサイズを、例えば、Ｏ－アセチル基の存在などの多糖の構造の重要な特徴を保持しながら減少させる。好ましくは、精製された血清型１５Ｂ多糖のサイズを、機械的均一化により減少させる。
好ましい実施形態においては、精製された血清型１５Ｂ多糖のサイズを、高圧均一化により減少させる。高圧均一化は、十分に小さい寸法を有する流路を通してプロセス流をポンプすることにより高い剪断速度を達成する。剪断速度は、より大きい印加される均一化圧力を用いることにより増大し、ホモジェナイザーにより供給流を再循環させることにより曝露時間を増大させることができる。
高圧均一化プロセスは、Ｏ－アセチル基の存在などの、多糖の構造的特徴を保持しながら、精製された血清型１５Ｂ多糖のサイズを減少させるのに特に好適である。
好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、５ｋＤａ～５００ｋＤａ、５０ｋＤａ～５００ｋＤａ、５０ｋＤａ～４５０ｋＤａ、１００ｋＤａ～４００ｋＤａ、および１００ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有する。好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１００ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有する。好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１００ｋＤａ～３００ｋＤａの分子量を有する。好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１５０ｋＤａ～３００ｋＤａの分子量を有する。好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１５０ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態においては、莢膜多糖は、１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～３００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～２００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～３５０ｋＤａ；３００ｋＤａ～５００ｋＤａ；３００ｋＤａ～４００ｋＤａの分子量；および同様の所望の分子量範囲を有する。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
血清型１５Ｂの多糖は、Ｏ－アセチル化されており、Ｏ－アセチル化の総量は、多糖反復単位あたり約０．８～０．９個のＯ－アセチル基である。多糖のＯ－アセチル化の程度を、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば、プロトンＮＭＲ（例えば、Ｌｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒら（１９９６）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９６：８３～９６；Ｊｏｎｅｓら（２００２）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３０：１２３３～１２４７；ＷＯ２００５／０３３１４８およびＷＯ００／５６３５７を参照されたい）により決定することができる。別の一般的に用いられる方法は、Ｈｅｓｔｒｉｎ，Ｓ．（１９４９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０：２４９～２６１に記載されている。好ましくは、Ｏ－アセチル基の存在は、イオン－ＨＰＬＣ分析により決定される。
精製された、単離された、もしくは活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖中、または血清型１５Ｂ多糖－担体タンパク質コンジュゲート中のＯ－アセチルの存在は、前記多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭ数として、または多糖反復単位あたりのＯ－アセチル基の数として表される。
本明細書において、「多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭ数」は、「多糖反復単位あたりのＯ－アセチル基の数」と同義である。
好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．５、０．６または０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。
グリセロールリン酸側鎖の存在は、多糖をフッ化水素酸（ＨＦ）で処理することによって遊離させた後にパルスアンペロメトリック検出（ＨＰＡＥＣ－ＰＡＤ）を用いた高速陰イオン交換クロマトグラフィーを使用してグリセロールを測定することにより決定される。精製された、単離された、もしくは活性化された血清型１５Ｂ多糖における、または血清型１５Ｂ多糖－担体タンパク質コンジュゲートにおけるグリセロールの存在は、血清型１５Ｂ多糖１ｍＭあたりのグリセロールのｍＭ数として表される。
好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．５、０．６または０．７ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのグリセロールを含む。
好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１００ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。
好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１００ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。
好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１５０ｋＤａ～３００ｋＤａの分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。
好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１５０ｋＤａ～３００ｋＤａの分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。
好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１５０ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。
好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１５０ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。
好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートおよび前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。
好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１００ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートおよび前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。
好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１５０ｋＤａ～３００ｋＤａの分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートおよび前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。
好ましい実施形態においては、単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１５０ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートおよび前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。
１．２．７ 肺炎球菌多糖血清型２２Ｆ
図６に示されるように、血清型２２Ｆの多糖反復単位は、βＲｈａｐのＣ３ヒドロキシル基に連結されたαＧｌｃｐ分枝を有する分枝状五糖類骨格（１つのグルクロン酸（ＧｌｃｐＡ）、１つのグルコピラノース（Ｇｌｃｐ）、１つのガラクトフラノース（Ｇａｌｆ）および２つのラムノピラノース（Ｒｈａｐ））からなる（Ｒｉｃｈａｒｄｓら（１９８９）、Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６７（６）：１０３８～１０５０）。多糖反復単位中のβＲｈａｐ残基の約８０％のＣ２ヒドロキシル基がＯ－アセチル化されている。
血清型２２Ｆ多糖を、当業者には公知の単離手順を用いて細菌から直接得ることができる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００６／０２２８３８１号、第２００７／０１８４０７１号、第２００７／０１８４０７２号、第２００７／０２３１３４０号、および第２００８／０１０２４９８号、ならびにＷＯ２００８／１１８７５２に開示された方法を参照されたい）。さらに、それらを、合成プロトコールを用いて生産することができる。
血清型２２Ｆのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株を、確立された培養株保存機関（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）など）または臨床標本から得ることができる。
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）溶解物からの血清型２２Ｆ多糖の精製により得られる単離された血清型２２Ｆ莢膜多糖および場合により、精製された多糖のサイジングを、例えば、分子量（ＭＷ）および前記血清型２２Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭを含む、様々なパラメータにより特徴付けることができる。
好ましくは、有利な濾過特徴および／または収率を有する血清型２２Ｆコンジュゲートを生成するために、標的分子量範囲への多糖のサイジングを、担体タンパク質へのコンジュゲーションの前に実施する。有利には、精製された血清型２２Ｆ多糖のサイズを、例えば、Ｏ－アセチル基の存在などの多糖の構造の重要な特徴を保持しながら減少させる。好ましくは、精製された血清型２２Ｆ多糖のサイズを、機械的均一化により減少させる。
好ましい実施形態においては、精製された多糖のサイズを、高圧均一化により減少させる。高圧均一化は、十分に小さい寸法を有する流路を通してプロセス流をポンプすることにより高い剪断速度を達成する。剪断速度は、より大きい印加される均一化圧力を用いることにより増大し、ホモジェナイザーにより供給流を再循環させることにより曝露時間を増大させることができる。
高圧均一化プロセスは、Ｏ－アセチル基の存在などの、多糖の構造的特徴を保持しながら、精製された血清型２２Ｆ多糖のサイズを減少させるのに特に好適である。
いくつかの実施形態においては、コンジュゲーション前のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆからの精製された多糖は、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態においては、莢膜多糖は、５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態においては、莢膜多糖は、７０ｋＤａ～９００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態においては、莢膜多糖は、１００ｋＤａ～８００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態においては、莢膜多糖は、２００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態においては、莢膜多糖は、４００ｋＤａ～７００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、莢膜多糖は、１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～９００ｋＤａ；１００ｋＤａ～８００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７００ｋＤａ；１００ｋＤａ～６００ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～９００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～８００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～３００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～９００ｋＤａ；２００ｋＤａ～８００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７００ｋＤａ；２００ｋＤａ～６００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～９００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～８００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～３５０ｋＤａ；３００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；３００ｋＤａ～９００ｋＤａ；３００ｋＤａ～８００ｋＤａ；３００ｋＤａ～７００ｋＤａ；３００ｋＤａ～６００ｋＤａ；３００ｋＤａ～５００ｋＤａ；３００ｋＤａ～４００ｋＤａ；４００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；４００ｋＤａ～９００ｋＤａ；４００ｋＤａ～８００ｋＤａ；４００ｋＤａ～７００ｋＤａ；４００ｋＤａ～６００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量；および同様の所望の分子量範囲を有する。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減少するようになってもよい。さらに、本明細書の上記に記載のように、２２Ｆ多糖を、コンジュゲーションの前にサイジング技術にかけてもよい。上記の分子量範囲は、最終的なサイジングステップの後、コンジュゲーションの前（例えば、活性化の前）の精製された多糖を指す。
多糖のＯ－アセチル化の程度を、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば、プロトンＮＭＲ（Ｌｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒら（１９９６）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９６：８３～９６；Ｊｏｎｅｓら（２００２）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３０：１２３３～１２４７；ＷＯ２００５／０３３１４８およびＷＯ００／５６３５７を参照されたい）により決定することができる。別の一般的に用いられる方法は、Ｈｅｓｔｒｉｎ，Ｓ．（１９４９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０：２４９～２６１に記載されている。好ましくは、Ｏ－アセチル基の存在は、イオン－ＨＰＬＣ分析により決定される。
精製された、単離された、もしくは活性化された血清型２２Ｆ莢膜多糖中、または血清型２２Ｆ多糖－担体タンパク質コンジュゲート中のＯ－アセチルの存在は、前記多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭ数として、または多糖反復単位あたりのＯ－アセチル基の数として表される。
好ましい実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆからの精製された多糖は、前記血清型２２Ｆ莢膜多糖１μｍｏｌあたり少なくとも０．２、０．４、０．６、０．８、１、１．２、１．４または１．６μｍｏｌのアセテートを有する。
１．２．８ 肺炎球菌多糖血清型３３Ｆ
図７に示されるように、血清型３３Ｆの多糖反復単位は、骨格内のαＧａｌｐ残基のＣ２ヒドロキシル基に連結された末端αＧａｌｐを有する分枝状五糖類骨格（２つのガラクトピラノース（Ｇａｌｐ）、２つのガラクトフラノース（Ｇａｌｆ）および１つのグルコピラノース（Ｇｌｃｐ））からなる（Ｌｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒら（２００６）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４１（１）：６８～７４）。骨格３－β－Ｇａｌｆ残基のＣ２ヒドロキシル基がＯ－アセチル化されていることが文献中で報告されている。
血清型３３Ｆ多糖を、当業者には公知の単離手順を用いて細菌から直接得ることができる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００６／０２２８３８１号、第２００７／０１８４０７１号、第２００７／０１８４０７２号、第２００７／０２３１３４０号、および第２００８／０１０２４９８号、ならびにＷＯ２００８／１１８７５２に開示された方法を参照されたい）。さらに、それらを、合成プロトコールを用いて生産することができる。
血清型３３Ｆのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）株を、確立された培養株保存機関（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）など）または臨床標本から得ることができる。
血清型３３Ｆからの精製された多糖を活性化（例えば、化学的に活性化）して、それらが反応できるようにした後、本明細書にさらに記載されるように、本発明のグリココンジュゲート中に組み込むことができる。
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）溶解物からの血清型３３Ｆ多糖の精製により得られる単離された血清型３３Ｆ莢膜多糖および場合により、精製された多糖のサイジングを、例えば、分子量および前記血清型３３Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭを含む、様々なパラメータにより特徴付けることができる。
いくつかの実施形態においては、コンジュゲーション前のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆからの精製された多糖は、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態においては、糖類は、５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態においては、糖類は、５０ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１５，００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～７５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；または２００ｋＤａ～５００ｋＤａの分子量を有する。上記の範囲のいずれかの中の全ての整数は本開示の実施形態と企図される。
多糖は、通常の精製手順の間にサイズがわずかに減少するようになってもよい。さらに、本明細書に記載のように、多糖を、コンジュゲーションの前にサイジング技術にかけてもよい。上記の分子量範囲は、最終的なサイジングステップの後、コンジュゲーションの前（例えば、活性化の前）の精製された多糖を指す。
精製された、単離された、もしくは活性化された血清型３３Ｆ莢膜多糖中、または血清型３３Ｆ多糖－担体タンパク質コンジュゲート中のＯ－アセチルの存在は、前記多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭ数として、または多糖反復単位あたりのＯ－アセチル基の数として表される。
好ましい実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆからの精製された多糖は、前記血清型３３Ｆ莢膜多糖１μｍｏｌあたり少なくとも０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４または１．６μｍｏｌのアセテートを有する。
１．３ 本発明のグリココンジュゲート
精製された糖類は、担体タンパク質と反応することができる糖類（すなわち、活性化された糖類）を作製するために化学的に活性化される。一度活性化されたら、それぞれの莢膜糖類は、担体タンパク質に別々にコンジュゲートされて、グリココンジュゲートを形成する。一実施形態においては、それぞれの莢膜糖類は、同じ担体タンパク質にコンジュゲートされている。糖類の化学的活性化およびその後の担体タンパク質へのコンジュゲーションは、本明細書に開示される活性化およびコンジュゲーションの方法によって達成することができる。
１．３．１ ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来するグリココンジュゲート
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する莢膜多糖は、当業者には公知の標準的な技術により調製される（例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１、ＷＯ２００８／１１８７５２、ＷＯ２００６／１１０３５２、ならびに米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００６／０２２８３８１号、第２００８／０１０２４９８号、および第２００８／０２８６８３８号を参照されたい）。
１つの実施形態において、多糖を、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）を用いて活性化して、シアン酸エステルを形成させる。次いで、活性化された多糖を、担体タンパク質（好ましくは、ＣＲＭ１９７）上のアミノ基に、直接、またはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングさせる。例えば、スペーサーをシスタミンまたはシステアミンとして、チオール化された多糖を得てもよく、このチオール化された多糖は、マレイミド活性化担体タンパク質（例えば、Ｎ－［γ－マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）を用いる）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、Ｎ－スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ；ＳＩＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノ安息香酸（ＳＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノ安息香酸（スルホ－ＳＩＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）もしくはスクシンイミジル３－[ブロモアセトアミド]プロピオネート（ＳＢＡＰ））との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体にカップリングすることができる。好ましくは、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学反応により作製されていてもよい）を、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングし、アミノ誘導体化糖類を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応を用いて担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）にコンジュゲートする。そのようなコンジュゲートは、例えば、ＷＯ９３／１５７６０、ＷＯ９５／０８３４８およびＷＯ９６／１２９０９４に記載されている。
コンジュゲーションのための他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いる。多くは、国際特許出願公開第ＷＯ９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションはカルボニルリンカーを伴ってもよく、これは、糖類の遊離ヒドロキシル基と１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）との反応（Ｂｅｔｈｅｌｌら（１９７９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２５４：２５７２～２５７４；Ｈｅａｒｎら（１９８１）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９～５１８を参照されたい）、およびそれに続く、カルバメート結合を形成させるためのタンパク質との反応により形成され得る。これは、アノマー末端の一次ヒドロキシル基への還元、場合により、一次ヒドロキシル基の保護／脱保護、ＣＤＩカルバメート中間体を形成させるための一次ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含んでもよい。
好ましい実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する少なくとも１つの莢膜多糖を、還元的アミノ化（米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００７／０２３１３４０号、第２００７／０１８４０７１号、および第２００７／０１８４０７２号、ＷＯ２００６／１１０３８１、ＷＯ２００８／０７９６５３、およびＷＯ２００８／１４３７０９に記載のような）により担体タンパク質にコンジュゲートさせる。好ましい実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する莢膜多糖を、還元的アミノ化により担体タンパク質に全てコンジュゲートさせる。
還元的アミノ化は、２つのステップ、（１）多糖の酸化、（２）コンジュゲートを形成させるための活性化された多糖および担体タンパク質の還元を含む。酸化の前に、多糖を加水分解してもよい。機械的または化学的加水分解を用いることができる。化学的加水分解を、酢酸を用いて行うことができる。酸化ステップは、過ヨウ素酸塩との反応を含んでもよい。本発明の目的では、用語「過ヨウ素酸塩」は、過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を含む；この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４ －）とオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６ ５－）の両方および過ヨウ素酸塩の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）も含む。
１つの実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆまたは２３Ｆに由来する莢膜多糖を、メタ過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）の存在下で酸化させる。別の実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する莢膜多糖を、オルト過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは、過ヨウ素酸の存在下で酸化させる。
多糖の酸化ステップの後、多糖は活性化されると言われ、本明細書の以下では「活性化された多糖」と呼ばれる。活性化された多糖および担体タンパク質を、独立に（個別凍結乾燥）または一緒に（同時凍結乾燥）、凍結乾燥（凍結－乾燥）することができる。一実施形態においては、活性化された多糖および担体タンパク質は同時に凍結乾燥される。別の実施形態においては、活性化された多糖および担体タンパク質は独立に凍結乾燥される。
一実施形態においては、凍結乾燥は、非還元糖の存在下で行われ、可能な非還元糖としては、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットが挙げられる。
コンジュゲーションプロセスの第２のステップは、還元剤を用いた、コンジュゲートを形成させるための活性化された多糖および担体タンパク質の還元（いわゆる、還元的アミノ化）である。好適である還元剤としては、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどのシアノ水素化ホウ素、ボラン－ピリジン、または水素化ホウ素交換樹脂が挙げられる。一実施形態においては、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
１つの実施形態において、還元反応は、水性溶媒中で実行され、別の実施形態においては、反応は非プロトン性溶媒中で実行される。１つの実施形態において、還元反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で実行される。ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒を用いて、凍結乾燥された活性化された多糖および担体タンパク質を復元させることができる。
還元反応の終わりに、コンジュゲート中に残存する未反応のアルデヒド基があってもよく、これらのものを好適なキャッピング剤を用いてキャップすることができる。一実施形態においては、このキャッピング剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である。コンジュゲーション（還元反応および場合により、キャッピング）の後、グリココンジュゲートを精製することができる。グリココンジュゲートを、透析濾過および／またはイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーにより精製することができる。１つの実施形態において、グリココンジュゲートは透析濾過またはイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーにより精製される。一実施形態においては、グリココンジュゲートは滅菌濾過される。
いくつかの実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｖおよび／または１８Ｃに由来するグリココンジュゲートは、１０％～１００％、２０％～１００％、３０％～１００％、４０％～１００％、５０％～１００％、６０％～１００％、７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～１００％、９０％～１００％、５０％～９０％、６０％～９０％、７０％～９０％または８０％～９０％のＯ－アセチル化度を有する糖類を含む。他の実施形態においては、Ｏ－アセチル化度は、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、もしくは９０％以上、または約１００％である。
いくつかの実施形態においては、本発明のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｖおよび／または１８Ｃに由来するグリココンジュゲートは、Ｏ－アセチル化されている。いくつかの実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｖに由来するグリココンジュゲートはＯ－アセチル化されており、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１８Ｃに由来するグリココンジュゲートは、脱－Ｏ－アセチル化されている。
１．３．２ ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来するグリココンジュゲート
１つの実施形態において、血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）を用いて多糖を活性化して、シアン酸エステルを形成させることにより得られる。活性化された多糖を、担体タンパク質上のアミノ基に直接、またはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングさせることができる。例えば、スペーサーをシスタミンまたはシステアミンとして、チオール化された多糖を得てもよく、このチオール化された多糖は、マレイミド－活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを用いる）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、ＳＩＢ、ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＩＡＢ、ＳＩＡ、もしくはＳＢＡＰを用いる）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体にカップリングすることができる。好ましくは、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学反応により作製されていてもよい）を、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングし、アミノ誘導体化された糖類を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応を用いて担体タンパク質にコンジュゲートさせる。そのようなコンジュゲートは、例えば、ＷＯ９３／１５７６０、ＷＯ９５／０８３４８およびＷＯ９６／１２９０９４に記載されている。
他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いる。多くは、国際特許出願公開第ＷＯ９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションはカルボニルリンカーを伴ってもよく、これは、糖類の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌら（１９７９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２５４：２５７２～２５７４；Ｈｅａｒｎら（１９８１）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９～５１８を参照されたい）、およびそれに続く、カルバメート結合を形成させるためのタンパク質との反応により形成され得る。これは、アノマー末端の一次ヒドロキシル基への還元、場合により、一次ヒドロキシル基の保護／脱保護、ＣＤＩカルバメート中間体を形成させるための一次ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含んでもよい。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、還元的アミノ化を用いて調製される。還元的アミノ化は、２つのステップ、（１）個々の六糖類単位中の隣接ジオールからアルデヒド官能基を生成するための多糖の酸化、（２）コンジュゲートを形成させるための活性化された多糖および担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）の還元を含む。
好ましくは、酸化の前に、標的分子量（ＭＷ）範囲への血清型２２Ｆ多糖のサイジングを実施する。有利には、精製された血清型２２Ｆ多糖のサイズを、例えば、Ｏ－アセチル基の存在などの多糖の構造の重要な特徴を保持しながら減少させる。好ましくは、精製された血清型２２Ｆ多糖のサイズを、機械的均一化により減少させる（上記のセクション１．２．７を参照されたい）。
１つの実施形態において、血清型多糖は、
（ａ）単離された血清型２２Ｆ多糖を、酸化剤と反応させるステップ；
（ｂ）クエンチング剤の添加により酸化反応をクエンチして、活性化された血清型２２Ｆ多糖を得るステップ
を含むプロセスにより活性化（酸化）する。
好ましい実施形態においては、酸化剤は、過ヨウ素酸塩である。本発明の目的では、用語「過ヨウ素酸塩」は、過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を含む；この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４ －）とオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６ ５－）の両方および過ヨウ素酸塩の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）も含む。好ましい実施形態においては、酸化剤は、過ヨウ素酸ナトリウムである。好ましい実施形態においては、血清型２２Ｆ多糖の酸化に用いられる過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸塩である。好ましい実施形態においては、血清型２２Ｆ多糖の酸化に用いられる過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムである。
一実施形態においては、クエンチング剤は、隣接ジオール、１，２－アミノアルコール、アミノ酸、グルタチオン、亜硫酸塩、重硫酸塩、亜ジチオン酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩、次亜リン酸塩または亜リン酸から選択される。
一実施形態においては、クエンチング剤は、式（Ｉ）：
Figure 0007059095000001
 （式中、Ｒ１は、Ｈ、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルから選択される）の１，２－アミノアルコールである。
一実施形態においては、クエンチング剤は、亜硫酸塩、重硫酸塩、亜ジチオン酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩、次亜リン酸塩または亜リン酸のナトリウムおよびカリウム塩から選択される。
一実施形態においては、クエンチング剤は、アミノ酸である。そのような実施形態においては、前記アミノ酸を、セリン、トレオニン、システイン、シスチン、メチオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、トリプトファン、チロシン、およびヒスチジンから選択することができる。
一実施形態においては、クエンチング剤は、重硫酸塩、亜ジチオン酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩などの亜硫酸塩である。
一実施形態においては、クエンチング剤は、２つの隣接ヒドロキシル基（隣接ジオール）、すなわち、２つの隣接する炭素原子に共有的に連結された２つのヒドロキシル基を含む化合物である。
好ましくは、クエンチング剤は、式（ＩＩ）：
Figure 0007059095000002
 （式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルから選択される）の化合物である。
好ましい実施形態においては、クエンチング剤は、グリセロール、エチレングリコール、プロパン－１，２－ジオール、ブタン－１，２－ジオールもしくはブタン－２，３－ジオール、またはアスコルビン酸である。好ましい実施形態においては、クエンチング剤は、ブタン－２，３－ジオールである。
好ましい実施形態においては、単離された血清型２２Ｆ多糖は、
（ａ）単離された血清型２２Ｆ多糖を過ヨウ素酸塩と反応させるステップ；
（ｂ）ブタン－２，３－ジオールの添加により酸化反応をクエンチングして、活性化された血清型２２Ｆ多糖を得るステップ
を含むプロセスにより活性化する。
多糖の酸化ステップの後、多糖は活性化されると言われ、本明細書の以下では「活性化された多糖」と呼ばれる。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型２２Ｆ多糖は精製される。活性化された血清型２２Ｆ多糖は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、透析または限外濾過／透析濾過などの当業者には公知の方法に従って精製される。例えば、活性化された２２Ｆ多糖は、限外濾過装置を用いる濃縮および透析濾過により精製される。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型２２Ｆ多糖の酸化度は、２～３０、２～２５、２～２０、２～１５、２～１０、２～５、５～３０、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、１５～３０、１５～２５、１５～２０、２０～３０、または２０～２５である。好ましい実施形態においては、活性化された血清型２２Ｆ多糖の酸化度は、２～１０、４～８、４～６、６～８、６～１２、８～１４、９～１１、１０～１６、１２～１６、１４～１８、１６～２０、１６～１８、１８～２２、または１８～２０である。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型２２Ｆ多糖は、２５ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、３００ｋＤａ～８００ｋＤａ、３００ｋＤａ～７００ｋＤａ、３００ｋＤａ～６００ｋＤａ、４００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ、４００ｋＤａ～８００ｋＤａ、４００ｋＤａ～７００ｋＤａまたは４００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。１つの実施形態において、活性化された血清型２２Ｆ多糖は、３００ｋＤａ～８００ｋＤａの分子量を有する。１つの実施形態において、活性化された血清型２２Ｆ多糖は、４００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。好ましい実施形態において、活性化された血清型２２Ｆ多糖は、４００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量および１０～２５、１０～２０、１２～２０または１４～１８の酸化度を有する。好ましい実施形態において、活性化された血清型２２Ｆ多糖は、４００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量および１０～２０の酸化度を有する。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型２２Ｆ多糖は、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６もしくは０．７または約０．８ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、活性化された血清型２２Ｆ多糖は、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．５、０．６もしくは０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、活性化された血清型２２Ｆ多糖は、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、活性化された血清型２２Ｆ多糖は、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型２２Ｆ多糖は、４００ｋＤａ～８００ｋＤａの分子量を有し、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型２２Ｆ多糖は、４００ｋＤａ～８００ｋＤａの分子量、１２～２０の酸化度を有し、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。
活性化された多糖および／または担体タンパク質を、独立に（個別凍結乾燥）または一緒に（同時凍結乾燥）凍結乾燥（凍結－乾燥）することができる。
１つの実施形態において、活性化された血清型２２Ｆ多糖を、場合により、糖類の存在下で凍結乾燥する。好ましい実施形態においては、糖類は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットから選択される。好ましい実施形態においては、糖類はスクロースである。一実施形態においては、次いで、凍結乾燥された活性化された多糖を、担体タンパク質を含む溶液と混合する。
別の実施形態においては、活性化された多糖および担体タンパク質を同時に凍結乾燥する。そのような実施形態においては、活性化された血清型２２Ｆ多糖を、担体タンパク質と混合し、場合により、糖類の存在下で凍結乾燥する。好ましい実施形態においては、糖類は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットから選択される。好ましい実施形態においては、糖類はスクロースである。次いで、同時に凍結乾燥された多糖および担体タンパク質を、溶液中に再懸濁し、還元剤と反応させることができる。
コンジュゲーションプロセスの第２のステップは、還元剤を用いて、コンジュゲートを形成させるための活性化された多糖および担体タンパク質の還元（還元的アミノ化）である。
活性化された血清型２２Ｆ多糖は、
（ｃ）活性化された血清型２２Ｆ多糖を担体タンパク質と混合するステップ；ならびに
（ｄ）混合された活性化された血清型２２Ｆ多糖および担体タンパク質を、還元剤と反応させて、血清型２２Ｆ多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成させるステップ
を含むプロセスによって担体タンパク質にコンジュゲートさせることができる。
１つの実施形態において、還元反応を水性溶媒中で実行し、別の実施形態においては、反応を非プロトン性溶媒中で実行する。１つの実施形態において、還元反応を、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で実行する。ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒を用いて、凍結乾燥された活性化された多糖および担体タンパク質を復元させることができる。
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化による活性化された血清型２２Ｆ多糖とタンパク質担体とのコンジュゲーションは、例えば、多糖のＯ－アセチル化のレベルを有意に低下させ得る水性相における還元的アミノ化と比較して、多糖のＯ－アセチル含量を保持するのに好適である。したがって、好ましい実施形態においては、ステップ（ｃ）およびステップ（ｄ）を、ＤＭＳＯ中で実行する。
１つの実施形態において、還元剤は、ＢｒｏｎｓｔｅｄまたはＬｅｗｉｓ酸の存在下のシアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素亜鉛、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅｉＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）などのアミンボランである。好ましい実施形態においては、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
還元反応の終わりに、コンジュゲート中に残存する未反応のアルデヒド基が存在してもよく、これらのものを、好適なキャッピング剤を用いてキャップすることができる。一実施形態においては、このキャッピング剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である。
担体タンパク質への血清型２２Ｆ多糖のコンジュゲーション後、グリココンジュゲートを、当業者には公知の様々な技術により精製する（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化する）ことができる。これらの技術としては、透析、濃縮／透析濾過操作、接線流濾過沈降／溶出、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）、および深層濾過が挙げられる。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する糖類を含む。他のそのような実施形態においては、糖類は、５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態においては、糖類は、７０ｋＤａ～９００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態においては、糖類は、１００ｋＤａ～８００ｋＤａの分子量を有する。他のそのような実施形態においては、糖類は、２００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態においては、糖類は、１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～９００ｋＤａ；１００ｋＤａ～８００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７００ｋＤａ；１００ｋＤａ～６００ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～９００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～８００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；１５０ｋＤａ～３００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～９００ｋＤａ；２００ｋＤａ～８００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７００ｋＤａ；２００ｋＤａ～６００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～９００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～８００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～７００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～６００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；２５０ｋＤａ～３５０ｋＤａ；３００ｋＤａ～１０００ｋＤａ；３００ｋＤａ～９００ｋＤａ；３００ｋＤａ～８００ｋＤａ；３００ｋＤａ～７００ｋＤａ；３００ｋＤａ～６００ｋＤａ；３００ｋＤａ～５００ｋＤａ；３００ｋＤａ～４００ｋＤａ；４００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；４００ｋＤａ～９００ｋＤａ；４００ｋＤａ～８００ｋＤａ；４００ｋＤａ～７００ｋＤａ；４００ｋＤａ～６００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６００ｋＤａの分子量を有する。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。いくつかのそのような実施形態においては、血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、還元的アミノ化を用いて調製される。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、４００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａ；または３，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａの分子量を有する。さらに他の実施形態においては、血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、２，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａまたは３，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態においては、本発明の血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、２００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；または２，０００ｋＤａ～３，０００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、本発明の血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、３，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；または４，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、本発明の血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、５，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５，０００～１５，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；または６，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａの分子量を有する。
グリココンジュゲートの分子量は、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳにより測定される。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６もしくは０．７または約０．８ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．５、０．６または０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。
好ましい実施形態においては、グリココンジュゲート中の血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５である。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲート中の血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．７である。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲート中の血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．９である。
好ましい実施形態においては、グリココンジュゲート中の血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５である。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲート中の血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．７である。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲート中の血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型２２Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．９である。
本発明の血清型２２Ｆグリココンジュゲートを特徴付けるための別の方法は、コンジュゲートされたリシンの範囲（コンジュゲーション度）として特徴付けることができる、糖類にコンジュゲートされる担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）中のリシン残基の数によるものである。多糖への共有結合に起因する、担体タンパク質のリシン改変の証拠を、当業者には公知の日常的な方法を用いるアミノ酸分析により得ることができる。コンジュゲーションは、コンジュゲート材料を生成するために用いられるＣＲＭ１９７タンパク質出発材料と比較して、回収されるリシン残基の数の減少をもたらす。好ましい実施形態においては、本発明の血清型２２Ｆグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、２～１５、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、３～１５、３～１３、３～１０、３～８、３～６、３～５、３～４、５～１５、５～１０、８～１５、８～１２、１０～１５または１０～１２である。１つの実施形態において、本発明の血清型２２Ｆグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。好ましい実施形態においては、本発明の血清型２２Ｆグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、４～７である。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
本発明の血清型２２Ｆグリココンジュゲートを、糖類の担体タンパク質に対する比（重量／重量）により特徴付けることもできる。いくつかの実施形態においては、グリココンジュゲート中の血清型２２Ｆ多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．５～３．０（例えば、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、または約３．０）である。他の実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．５～２．０、０．５～１．５、０．８～１．２、０．５～１．０、１．０～１．５または１．０～２．０である。さらなる実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．８～１．２である。好ましい実施形態においては、コンジュゲート中の血清型２２Ｆ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比は、０．９～１．１である。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
本発明の血清型２２Ｆグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされないが、それにも拘わらず、グリココンジュゲート組成物中に存在する遊離糖類を含有してもよい。遊離糖類を、グリココンジュゲートと非共有的に会合させる（すなわち、非共有的に結合させる、吸着させる、またはその中に、もしくはそれと共に捕捉させる）ことができる。
好ましい実施形態においては、血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖の総量と比較して約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％または１５％未満の遊離血清型２２Ｆ多糖を含む。好ましい実施形態においては、血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖の総量と比較して約４０％未満の遊離血清型２２Ｆ多糖を含む。好ましい実施形態においては、血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖の総量と比較して約２５％未満の遊離血清型２２Ｆ多糖を含む。好ましい実施形態においては、血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖の総量と比較して約２０％未満の遊離血清型２２Ｆ多糖を含む。好ましい実施形態においては、血清型２２Ｆグリココンジュゲートは、血清型２２Ｆ多糖の総量と比較して約１５％未満の遊離血清型２２Ｆ多糖を含む。
血清型２２Ｆグリココンジュゲートを、その分子サイズ分布（Ｋｄ）により特徴付けることもできる。サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ－４Ｂ）を用いて、コンジュゲートの相対分子サイズ分布を決定することができる。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、コンジュゲートの分子サイズ分布をプロファイルするための重力送りカラム中で用いられる。媒体中の小孔から排除される高分子は低分子よりも迅速に溶出する。画分収集装置を用いて、カラム溶出液を収集する。画分を、糖類アッセイにより比色的に試験する。Ｋｄの決定のために、カラムを較正して、分子が完全に排除される画分（Ｖ０）、（Ｋｄ＝０）、最大保持を表す画分（Ｖｉ）、（Ｋｄ＝１）を確立する。特定の試料属性に達する画分（Ｖｅ）は、Ｋｄ＝（Ｖｅ－Ｖ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）の式によりＫｄと関連する。
好ましい実施形態においては、少なくとも３０％の血清型２２Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも４０％のグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％の血清型２２Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも６０％の血清型２２Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、５０％～８０％の血清型２２Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、６５％～８０％の血清型２２Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。
１．３．３ ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来するグリココンジュゲート
１つの実施形態において、血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）を用いて多糖を活性化して、シアン酸エステルを形成させることにより得られる。活性化された多糖を、担体タンパク質上のアミノ基に直接、またはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングさせることができる。例えば、スペーサーをシスタミンまたはシステアミンとして、チオール化された多糖を得てもよく、このチオール化された多糖は、マレイミド－活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを用いる）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、ＳＩＢ、ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＩＡＢ、ＳＩＡ、もしくはＳＢＡＰを用いる）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体にカップリングすることができる。好ましくは、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学反応により作製されていてもよい）を、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングし、アミノ誘導体化された糖類を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応を用いて担体タンパク質にコンジュゲートさせる。そのようなコンジュゲートは、例えば、ＷＯ９３／１５７６０、ＷＯ９５／０８３４８およびＷＯ９６／１２９０９４に記載されている。
他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いる。多くは、国際特許出願公開第ＷＯ９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションはカルボニルリンカーを伴ってもよく、これは、糖類の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌら（１９７９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２５４：２５７２～２５７４；Ｈｅａｒｎら（１９８１）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９～５１８を参照されたい）、およびそれに続く、カルバメート結合を形成させるためのタンパク質との反応により形成され得る。これは、アノマー末端の一次ヒドロキシル基への還元、場合により、一次ヒドロキシル基の保護／脱保護、ＣＤＩカルバメート中間体を形成させるための一次ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含んでもよい。
ある特定の実施形態においては、本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、還元的アミノ化を用いて調製される。そのような実施形態においては、本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートを、水性相中での還元的アミノ化（ＲＡＣ／水性）を用いて調製することができる。水性相中での還元的アミノ化は、肺炎球菌コンジュゲートワクチンを生産するために適用され、成功を収めてきた（例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１を参照されたい）。しかし、好ましくは、還元的アミノ化を用いる場合、血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化（ＲＡＣ／ＤＭＳＯ）により調製される。ＲＡＣ／水性プロセスを用いてＯ－アセチル官能基を保持することに関連する課題を考慮すれば、ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化が好ましい。ＲＡＣ／ＤＭＳＯは、肺炎球菌コンジュゲートワクチンを生産するために適用され、成功を収めてきた（例えば、ＷＯ２００６／１１０３８１を参照されたい）。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、実施例１、２および３ならびにＷＯ２０１４／０２７３０２に記載のような、ｅＴＥＣコンジュゲーション（以後、「血清型３３Ｆ ｅＴＥＣ結合されたグリココンジュゲート」）を用いて調製される。前記３３Ｆグリココンジュゲートは、１つまたは複数のｅＴＥＣスペーサーを介して担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされた糖類を含み、糖類はカルバメート結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有的にコンジュゲートされ、担体タンパク質はアミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有的にコンジュゲートされている。本発明のｅＴＥＣ結合されたグリココンジュゲートを、一般式（ＩＩＩ）：
Figure 0007059095000003
 （式中、ｅＴＥＣスペーサーを構成する原子は、中央の箱に含まれる）により表すことができる。
ｅＴＥＣスペーサーは、７つの直鎖状原子（すなわち、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）２ＳＣＨ２Ｃ（Ｏ）－）を含み、糖類と担体タンパク質との安定なチオエーテルおよびアミド結合を提供する。ｅＴＥＣ結合されたグリココンジュゲートの合成は、糖類の活性化ヒドロキシル基と、チオアルキルアミン試薬、例えば、シスタミンもしくはシステインアミンまたはその塩のアミノ基との反応を含み、糖類とのカルバメート結合を形成して、チオール化された糖類を生ずる。１つまたは複数の遊離スルフヒドリル基の生成は、活性化されたチオール化された糖類を得るための還元剤との反応により達成される。活性化されたチオール化された糖類の遊離スルフヒドリル基と、アミン含有残基上に１つまたは複数のα－ハロアセトアミド基を有する活性化された担体タンパク質との反応は、チオエーテル結合を生成してコンジュゲートを形成し、ここで、担体タンパク質はアミド結合によりｅＴＥＣスペーサーに結合される。
本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートにおいて、糖類は、多糖またはオリゴ糖類であってもよい。担体タンパク質を、本明細書に記載の、または当業者には公知の任意の好適な担体から選択することができる。よくある実施形態においては、糖類は多糖である。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。いくつかのそのような実施形態においては、ｅＴＥＣ結合されたグリココンジュゲートは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆ莢膜多糖を含む。
特に好ましい実施形態においては、ｅＴＥＣ結合されたグリココンジュゲートは、ｅＴＥＣスペーサーを介してＣＲＭ１９７に共有的にコンジュゲートされているＰｎ－３３Ｆ莢膜多糖を含む（血清型３３Ｆ ｅＴＥＣ結合されたグリココンジュゲート）。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する糖類を含む。他のそのような実施形態においては、糖類は、５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態においては、糖類は、５０ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；または２００ｋＤａ～５００ｋＤａの分子量を有する。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、２００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する。さらに他の実施形態においては、血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～３，０００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、２００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～９，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；または３，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａの分子量を有する。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートを特徴付けるための別の方法は、コンジュゲートされたリシンの範囲（コンジュゲーション度）として特徴付けることができる、糖類にコンジュゲートされる担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）中のリシン残基の数によるものである。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、２～２０、４～１６、２～１５、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、３～１５、３～１３、３～１０、３～８、３～６、３～５、３～４、５～１５、５～１０、８～１５、８～１２、１０～１５または１０～１２である。１つの実施形態において、本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０である。好ましい実施形態においては、本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、４～１６である。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
好ましい実施形態においては、担体タンパク質は、３９個のリシン残基を含むＣＲＭ１９７を含む。いくつかのそのような実施形態においては、ＣＲＭ１９７は、糖類に共有的に連結された３９個のうちの４～１６個のリシン残基を含んでもよい。このパラメータを表現するための別の方法は、約１０％～約４１％のＣＲＭ１９７リシンが糖類に共有的に連結されることである。別のそのような実施形態においては、ＣＲＭ１９７は、糖類に共有的に連結された３９個のうちの２～２０個のリシン残基を含んでもよい。このパラメータを表現するための別の方法は、約５％～約５０％のＣＲＭ１９７リシンが糖類に共有的に連結されることである。いくつかの実施形態においては、ＣＲＭ１９７は、糖類に共有的に連結された３９個のうちの約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、または約１６個のリシン残基を含んでもよい。
よくある実施形態においては、担体タンパク質は、担体タンパク質上のリシン残基の１つまたは複数のε－アミノ基へのアミド結合を介してｅＴＥＣスペーサーに共有的にコンジュゲートされている。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質は、糖類に共有的にコンジュゲートされた２～２０個のリシン残基を含む。他のそのような実施形態においては、担体タンパク質は、糖類に共有的にコンジュゲートされた４～１６個のリシン残基を含む。
本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートを、糖類の担体タンパク質に対する比（重量／重量）により特徴付けることもできる。いくつかの実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は０．２～４．０（例えば、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、または約４．０）である。他の実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は１．０～２．５である。さらなる実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は０．４～１．７である。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
担体タンパク質上のリシンへの糖類鎖の結合の頻度は、本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートを特徴付けるための別のパラメータである。例えば、いくつかの実施形態においては、担体タンパク質と多糖との間の少なくとも１つの共有結合は、多糖の４個の糖類反復単位ごとに存在する。別の実施形態においては、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１０個の糖類反復単位ごとに少なくとも１回存在する。別の実施形態においては、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１５個の糖類反復単位ごとに少なくとも１回存在する。さらなる実施形態においては、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の２５個の糖類反復単位ごとに少なくとも１回存在する。
よくある実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、ＣＲＭ１９７と多糖との間のｅＴＥＣスペーサーを介する共有結合は、多糖の４、１０、１５または２５個の糖類反復単位ごとに少なくとも１回存在する。
他の実施形態においては、コンジュゲートは、５～１０個の糖類反復単位ごと；２～７個の糖類反復単位ごと；３～８個の糖類反復単位ごと；４～９個の糖類反復単位ごと；６～１１個の糖類反復単位ごと；７～１２個の糖類反復単位ごと；８～１３個の糖類反復単位ごと；９～１４個の糖類反復単位ごと；１０～１５個の糖類反復単位ごと；２～６個の糖類反復単位ごと；３～７個の糖類反復単位ごと；４～８個の糖類反復単位ごと；６～１０個の糖類反復単位ごと；７～１１個の糖類反復単位ごと；８～１２個の糖類反復単位ごと；９～１３個の糖類反復単位ごと；１０～１４個の糖類反復単位ごと；１０～２０個の糖類反復単位ごと；４～２５個の糖類反復単位ごとまたは２～２５個の糖類反復単位ごとに担体タンパク質と糖類との間に少なくとも１つの共有結合を含む。よくある実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
別の実施形態においては、担体タンパク質と糖類との間の少なくとも１つの結合は、多糖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の糖類反復単位ごとに存在する。１つの実施形態において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
コンジュゲーション中に考慮する重要な点は、糖類エピトープの一部を形成し得るＯ－アシル、リン酸またはグリセロールリン酸側鎖などの個々の成分の潜在的に感受性の非糖類置換官能基の保持を可能にする条件の開発である。
一実施形態においては、本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、１０％～１００％のＯ－アセチル化度を有する糖類を含む。いくつかのそのような実施形態においては、糖類は、５０％～１００％のＯ－アセチル化度を有する。
他のそのような実施形態においては、糖類は、７５％～１００％のＯ－アセチル化度を有する。さらなる実施形態においては、糖類は、７０％より高いか、またはそれと等しい（７０％以上）のＯ－アセチル化度を有する。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、血清型３３Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲートは、血清型３３Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．５、０．６または０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲートは、血清型３３Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲートは、血清型３３Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、Ｏ－アセチル基の存在は、イオン－ＨＰＬＣ分析により決定される。
好ましい実施形態においては、グリココンジュゲート中の血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５である。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲート中の血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．７である。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲート中の血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．９である。
好ましい実施形態においては、グリココンジュゲート中の血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５である。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲート中の血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．７である。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲート中の血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型３３Ｆ多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．９である。
本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされないが、それにも拘わらず、グリココンジュゲート組成物中に存在する遊離糖類を含有してもよい。遊離糖類を、グリココンジュゲートと非共有的に会合させる（すなわち、非共有的に結合させる、吸着させる、またはその中に、もしくはそれと共に捕捉させる）ことができる。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、血清型３３Ｆ多糖の総量と比較して約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満の遊離血清型３３Ｆ多糖を含む。好ましくは、血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、１５％未満の遊離糖類、より好ましくは、１０％未満の遊離糖類、さらにより好ましくは、５％未満の遊離糖類を含む。好ましい実施形態においては、血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、血清型３３Ｆ多糖の総量と比較して約２５％未満の遊離血清型３３Ｆ多糖を含む。好ましい実施形態においては、血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、血清型３３Ｆ多糖の総量と比較して約２０％未満の遊離血清型３３Ｆ多糖を含む。好ましい実施形態においては、血清型３３Ｆグリココンジュゲートは、血清型３３Ｆ多糖の総量と比較して約１５％未満の遊離血清型３３Ｆ多糖を含む。
ある特定の好ましい実施形態においては、本発明は、１つまたは複数の以下の特徴を、単独で、または組み合わせて有する血清型３３Ｆグリココンジュゲートを提供する：多糖が５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する；グリココンジュゲートが５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する；担体タンパク質が糖類に共有的に連結された２～２０個のリシン残基を含む；糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．２～４．０である；グリココンジュゲートが多糖の４、１０、１５または２５個の糖類反復単位ごとに少なくとも１個の担体タンパク質と多糖との間の共有結合を含む；糖類が７５％～１００％のＯ－アセチル化度を有する；コンジュゲートが全多糖に対して約１５％未満の遊離多糖を含む；担体タンパク質がＣＲＭ１９７である。
血清型３３Ｆグリココンジュゲートを、その分子サイズ分布（Ｋｄ）により特徴付けることもできる。サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ－４Ｂ）を用いて、上記のように、コンジュゲートの相対分子サイズ分布を決定することができる。１つの実施形態において、少なくとも１５％の本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。１つの実施形態において、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。
好ましい実施形態においては、少なくとも３５％の本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％の本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも６０％の本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも７０％の本発明の血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。
好ましい実施形態においては、４０％～９０％の血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、５０％～９０％の血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、６５％～８０％の血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。
１．３．４ ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来するグリココンジュゲート
１つの実施形態において、血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）を用いて多糖を活性化して、シアン酸エステルを形成させることにより得られる。活性化された多糖を、担体タンパク質上のアミノ基に直接、またはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングさせることができる。例えば、スペーサーをシスタミンまたはシステアミンとして、チオール化された多糖を得てもよく、このチオール化された多糖は、マレイミド－活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを用いる）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、ＳＩＢ、ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＩＡＢ、ＳＩＡ、もしくはＳＢＡＰを用いる）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体にカップリングすることができる。好ましくは、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学反応により作製されていてもよい）を、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングし、アミノ誘導体化された糖類を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応を用いて担体タンパク質にコンジュゲートさせる。そのようなコンジュゲートは、例えば、ＷＯ９３／１５７６０、ＷＯ９５／０８３４８およびＷＯ９６／１２９０９４に記載されている。
他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いる。多くは、国際特許出願公開第ＷＯ９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションはカルボニルリンカーを伴ってもよく、これは、糖類の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌら（１９７９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２５４：２５７２～２５７４；Ｈｅａｒｎら（１９８１）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９～５１８を参照されたい）、およびそれに続く、カルバメート結合を形成させるためのタンパク質との反応により形成され得る。これは、アノマー末端の一次ヒドロキシル基への還元、場合により、一次ヒドロキシル基の保護／脱保護、ＣＤＩカルバメート中間体を形成させるための一次ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含んでもよい。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、還元的アミノ化を用いて調製される。還元的アミノ化は、２つのステップ、（１）個々の六糖類単位中の隣接ジオールからアルデヒド官能基を生成するための多糖の酸化、（２）コンジュゲートを形成させるための活性化された多糖および担体タンパク質の還元を含む。
好ましくは、酸化の前に、標的分子量（ＭＷ）範囲への血清型１５Ｂ多糖のサイジングを実施する。有利には、精製された血清型１５Ｂ多糖のサイズを、例えば、Ｏ－アセチル基の存在などの多糖の構造の重要な特徴を保持しながら減少させる。好ましくは、精製された血清型１５Ｂ多糖のサイズを、機械的均一化により減少させる（上記のセクション１．２．６を参照されたい）。
酸化ステップは、過ヨウ素酸塩との反応を含んでもよい。本発明の目的では、用語「過ヨウ素酸塩」は、過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を含む；この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４ －）とオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６ ５－）の両方および過ヨウ素酸塩の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）も含む。好ましい実施形態においては、血清型１５Ｂ莢膜多糖の酸化に用いられる過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸塩である。好ましい実施形態においては、血清型１５Ｂ莢膜多糖の酸化に用いられる過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムである。
好ましい実施形態においては、多糖を、０．０１～１０．０、０．０５～５．０、０．１～１．０、０．５～１．０、０．７～０．８、０．０５～０．５、０．１～０．３モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態においては、多糖を、約０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態においては、多糖を、約０．１５モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態においては、多糖を、約０．２５モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態においては、多糖を、約０．５モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態においては、多糖を、約０．６モル当量の酸化剤と反応させる。好ましい実施形態においては、多糖を、約０．７モル当量の酸化剤と反応させる。
好ましい実施形態においては、反応の持続時間は、１時間～５０時間、１０時間～３０時間、１５時間～２０時間、１５時間～１７時間または約１６時間である。
好ましい実施形態においては、反応の温度を、１５℃～４５℃、１５℃～３０℃、２０℃～２５℃に維持する。好ましい実施形態においては、反応の温度を、約２３℃に維持する。
好ましい実施形態においては、酸化反応を、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）またはＢｉｓ－Ｔｒｉｓから選択される緩衝液中で実行する。好ましい実施形態においては、緩衝液はリン酸カリウムである。
好ましい実施形態においては、緩衝液は１ｍＭ～５００ｍＭ、１ｍＭ～３００ｍＭ、または５０ｍＭ～２００ｍＭの濃度を有する。好ましい実施形態においては、緩衝液は約１００ｍＭの濃度を有する。
好ましい実施形態においては、酸化反応を、４．０～８．０、５．０～７．０、または５．５～６．５のｐＨで実行する。好ましい実施形態においては、ｐＨは約６．０である。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、０．５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬの単離された血清型１５Ｂ莢膜多糖を、０．２～０．３モル当量の過ヨウ素酸塩と、２０℃～２５℃の温度で反応させることにより得る。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖を精製する。活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖を、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、透析または限外濾過／透析濾過などの、当業者には公知の方法に従って精製する。例えば、活性化された莢膜多糖を、限外濾過装置を用いる濃縮および透析濾過により精製する。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖の酸化度は、２～２０、２～１５、２～１０、２～５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～２０、１０～１５、または１５～２０である。好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖の酸化度は、２～１０、４～８、４～６、６～８、６～１２、８～１２、９～１１、１０～１６、１２～１６、１４～１８、１６～２０、１６～１８、または１８～２０である。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、５ｋＤａ～５００ｋＤａ、５０ｋＤａ～５００ｋＤａ、５０ｋＤａ～４５０ｋＤａ、１００ｋＤａ～４００ｋＤａ、１００ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有する。好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１００ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有する。好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１００ｋＤａ～３００ｋＤａの分子量を有する。好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１００ｋＤａ～２５０ｋＤａの分子量を有する。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．５、０．６または０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．５、０．６または０．７ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのグリセロールを含む。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１００ｋＤａ～２５０ｋＤａの分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１００ｋＤａ～２５０ｋＤａの分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートおよび前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、１００ｋＤａ～２５０ｋＤａの分子量を有し、前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートおよび前記血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。
１つの実施形態において、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、場合により、糖類の存在下で凍結乾燥される。好ましい実施形態においては、糖類は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットから選択される。好ましい実施形態においては、糖類はスクロースである。次いで、凍結乾燥された活性化された莢膜多糖を、担体タンパク質を含む溶液と混合することができる。
別の実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖を、担体タンパク質と混合し、場合により、糖類の存在下で凍結乾燥する。好ましい実施形態においては、糖類は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットから選択される。好ましい実施形態においては、糖類はスクロースである。次いで、同時に凍結乾燥された多糖および担体タンパク質を、溶液中に再懸濁し、還元剤と反応させることができる。
活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖は、
（ａ）活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖を担体タンパク質と混合するステップ、ならびに
（ｂ）混合された活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖および担体タンパク質を還元剤と反応させて、血清型１５Ｂ莢膜多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成させるステップ
を含むプロセスにより担体タンパク質にコンジュゲートさせることができる。
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中での還元的アミノ化による活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖と、タンパク質担体とのコンジュゲーションは、例えば、多糖のＯ－アセチル化のレベルが有意に低い水性溶液中での還元的アミノ化と比較して、多糖のＯ－アセチル含量を保持するのに好適である。好ましい実施形態においては、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）を、ＤＭＳＯ中で実行する。
好ましい実施形態においては、ステップ（ａ）は、担体タンパク質とＤＭＳＯとを含む溶液中に凍結乾燥された血清型１５Ｂ莢膜多糖を溶解させることを含む。好ましい実施形態においては、ステップ（ａ）は、ＤＭＳＯ中に同時に凍結乾燥された血清型１５Ｂ莢膜多糖および担体タンパク質を溶解させることを含む。
ステップ（ａ）および（ｂ）を水性溶液中で実行する場合、ステップ（ａ）および（ｂ）は、好ましくは、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｂｉｓ－ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ、ビシンまたはＨＥＰＢから選択される緩衝液中、６．０～８．５、７．０～８．０または７．０～７．５のｐＨで実行される。好ましい実施形態においては、緩衝液はＰＢＳである。好ましい実施形態においては、ｐＨは約７．３である。好ましい実施形態においては、ステップ（ｂ）における活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖の濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬ、または０．５ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬである。好ましい実施形態においては、ステップ（ｂ）における活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖の濃度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９または３．０ｍｇ／ｍＬである。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖の担体タンパク質に対する初期入力比（重量／重量）は、５：１～０．１：１、２：１～０．１：１、２：１～１：１、１．５：１～１：１、０．１：１～１：１、０．３：１～１：１、または０．６：１～１：１である。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖の担体タンパク質に対する初期入力比は、約０．６：１～１：１である。別の好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖と担体タンパク質との初期入力比は、約０．６：１～１．５：１である。そのような初期入力比は、グリココンジュゲート中の低レベルの遊離多糖を得るのに特に好適である。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１５Ｂ莢膜多糖の担体タンパク質に対する初期入力比は、約０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１または２：１である。
１つの実施形態においては、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、ＢｒｏｎｓｔｅｄまたはＬｅｗｉｓ酸の存在下での水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素亜鉛、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅｉＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）などのアミンボランである。好ましい実施形態においては、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。好ましい実施形態においては、還元剤は、２－ピコリンボランナトリウムである。
好ましい実施形態においては、ステップ（ｂ）において用いられる還元剤の量は、約０．１～１０．０モル当量、０．５～５．０モル当量、または１．０～２．０モル当量である。好ましい実施形態においては、ステップ（ｂ）において用いられる還元剤の量は、約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０モル当量である。
好ましい実施形態においては、ステップ（ｂ）の持続時間は、１時間～６０時間、１０時間～５０時間、４０時間～５０時間、または４２時間～４６時間である。好ましい実施形態においては、ステップ（ｂ）の持続時間は、約４４時間である。
好ましい実施形態においては、ステップ（ｂ）における反応温度は、１０℃～４０℃、１５℃～３０℃または２０℃～２６℃に維持される。好ましい実施形態においては、ステップ（ｂ）における反応温度は、約２３℃に維持される。
好ましい実施形態においては、担体タンパク質に共有的に連結されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖を含むグリココンジュゲートの調製のためのプロセスは、ＮａＢＨ４の添加により未反応のアルデヒドをキャップする（クエンチする）ステップ（ステップ（ｃ））をさらに含む。
好ましい実施形態においては、ステップ（ｃ）で用いられるＮａＢＨ４の量は、０．１～１０モル当量、０．５～５．０モル当量または１．０～３．０モル当量である。好ましい実施形態においては、ステップ（ｃ）で用いられるＮａＢＨ４の量は、約２モル当量である。
好ましい実施形態においては、ステップ（ｃ）の持続時間は、０．１時間～１０時間、０．５時間～５時間、または２時間～４時間である。好ましい実施形態においては、ステップ（ｃ）の持続時間は、約３時間である。
好ましい実施形態においては、ステップ（ｃ）における反応温度は、１５℃～４５℃、１５℃～３０℃または２０℃～２６℃に維持される。好ましい実施形態においては、ステップ（ｃ）における反応温度は、約２３℃に維持される。
好ましい実施形態においては、コンジュゲーションステップの収率は、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％より高い。好ましい実施形態においては、コンジュゲーションステップ（ステップｂ）の収率は、６０％より高い。好ましい実施形態においては、コンジュゲーションステップ（ステップｂ）の収率は、７０％より高い。収率は、コンジュゲート中の血清型１５Ｂ多糖の量ｘ１００／コンジュゲーションステップにおいて用いられる活性化された多糖の量である。
好ましい実施形態においては、担体タンパク質に共有的に連結されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖を含むグリココンジュゲートの調製のためのプロセスは、
（ａ）高圧均一化により精製された血清型１５Ｂ多糖をサイジングするステップ；
（ｂ）サイジングされた血清型１５Ｂ多糖を酸化剤と反応させるステップ；
（ｃ）活性化された血清型１５Ｂ多糖を担体タンパク質と混合するステップ；
（ｄ）混合された活性化された血清型１５Ｂ多糖および担体タンパク質を、還元剤と反応させて、血清型１５Ｂ多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成させるステップ；ならびに
（ｅ）ＮａＢＨ４の添加により未反応のアルデヒドをキャップする（クエンチする）ステップ
を含む。
好ましい実施形態においては、上記のプロセスのコンジュゲーションステップ（ステップｄ）の収率は、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％より高い。好ましい実施形態においては、コンジュゲーションステップ（ステップｄ）の収率は、６０％より高い。好ましい実施形態においては、コンジュゲーションステップ（ステップｄ）の収率は、７０％より高い。収率は、コンジュゲート中の血清型１５Ｂ多糖の量ｘ１００／コンジュゲーションステップにおいて用いられる活性化された多糖の量である。
担体タンパク質への血清型１５Ｂ莢膜多糖のコンジュゲーション後、多糖－タンパク質コンジュゲートを、当業者には公知の様々な技術により精製する（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化する）ことができる。これらの技術としては、透析、濃縮／透析濾過操作、接線流濾過、沈降／溶出、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）、および深層濾過が挙げられる。
１つの実施形態において、担体タンパク質は、セクション１．１で定義されている。１つの実施形態において、担体タンパク質は、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風毒素）、ＣＲＭ１９７、他のＤＴ変異体、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ）、またはその免疫学的に機能的な等価物からなる群において選択される。１つの実施形態において、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）にコンジュゲートされ、５ｋＤａ～１，５００ｋＤａの分子量を有する糖類を含む。他のそのような実施形態においては、糖類は、１０ｋＤａ～１，５００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態においては、糖類は、５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～２５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；または２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；または２００ｋＤａ～４００ｋＤａの分子量を有する。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。いくつかの実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有する。好ましい実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、３，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ、５，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ、５，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ、８，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ、８，０００ｋＤａ～１６，０００ｋＤａまたは１０，０００ｋＤａ～１６，０００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、約１，０００ｋＤａ、約１，５００ｋＤａ、約２，０００ｋＤａ、約２，５００ｋＤａ、約３，０００ｋＤａ、約３，５００ｋＤａ、約４，０００ｋＤａ、約４，５００ｋＤａ、約５，０００ｋＤａ、約５，５００ｋＤａ、約６，０００ｋＤａ、約６，５００ｋＤａ、約７，０００ｋＤａ、約７，５００ｋＤａ、約８，０００ｋＤａ、約８，５００ｋＤａ、約９，０００ｋＤａ、約９，５００ｋＤａ、約１０，０００ｋＤａ、約１０，５００ｋＤａ、約１１，０００ｋＤａ、約１１，５００ｋＤａ、約１２，０００ｋＤａ、約１２，５００ｋＤａ、約１３，０００ｋＤａ、約１３，５００ｋＤａ、約１４，０００ｋＤａ、約１４，５００ｋＤａ、約１５，０００ｋＤａ、約１５，５００ｋＤａ、約１６，０００ｋＤａ、約１６，５００ｋＤａ、約１７，０００ｋＤａ、約１７，５００ｋＤａ、約１８，０００ｋＤａ、約１８，５００ｋＤａ、約１９，０００ｋＤａ、約１９，５００ｋＤａ、または約２０，０００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；または２，０００ｋＤａ～３，０００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、３，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；または４，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、５，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；または６，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａの分子量を有する。
グリココンジュゲートの分子量は、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳにより測定される。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。１つの実施形態において、前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、還元的アミノ化を用いて調製される。
本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートを、糖類の担体タンパク質に対する比（重量／重量）により特徴付けることもできる。好ましい実施形態においては、コンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（重量／重量）は、０．５～３．０（例えば、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、または約３．０）である。好ましい実施形態においては、コンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比は、０．４～２である。好ましい実施形態においては、コンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比は、０．５～２．０、０．５～１．５、０．５～１．０、１．０～１．５、１．０～２．０である。好ましい実施形態においては、コンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比は、０．７～０．９である。
本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされていないが、それにも拘わらずグリココンジュゲート組成物中に存在する遊離糖類を含有してもよい。遊離糖類を、グリココンジュゲートと非共有的に会合させる（すなわち、非共有的に結合させる、吸着させる、またはその中に、もしくはそれと共に捕捉させる）ことができる。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖の総量と比較して約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％または１５％未満の遊離血清型１５Ｂ莢膜多糖を含む。好ましい実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖の総量と比較して約２５％未満の遊離血清型１５Ｂ莢膜多糖を含む。好ましい実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖の総量と比較して約２０％未満の遊離血清型１５Ｂ莢膜多糖を含む。好ましい実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖の総量と比較して約１５％未満の遊離血清型１５Ｂ莢膜多糖を含む。
血清型１５Ｂグリココンジュゲートを、その分子サイズ分布（Ｋｄ）によって特徴付けることもできる。サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ－４Ｂ）を用いて、上記のように、コンジュゲートの相対分子サイズ分布を決定することができる。好ましい実施形態においては、少なくとも２０％の本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも３０％の免疫原性コンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも４０％の本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％の本発明の血清型１５グリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも６０％の本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも７０％の本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。
好ましい実施形態においては、４０％～９０％の血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、５０％～９０％の血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、６５％～８０％の血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．５、０．６または０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、グリココンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、Ｏ－アセチル基の存在を、イオン－ＨＰＬＣ分析により決定する。
好ましい実施形態においては、血清型１５Ｂグリココンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５である。好ましい実施形態においては、血清型１５Ｂグリココンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．７である。好ましい実施形態においては、血清型１５Ｂグリココンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．９である。好ましい実施形態においては、Ｏ－アセチル基の存在を、イオン－ＨＰＬＣ分析により決定する。
好ましい実施形態においては、血清型１５Ｂグリココンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５である。好ましい実施形態においては、血清型１５Ｂグリココンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．７である。好ましい実施形態においては、血清型１５Ｂグリココンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．９である。好ましい実施形態においては、Ｏ－アセチル基の存在を、イオン－ＨＰＬＣ分析により決定する。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７または０．８ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．５、０．６、または０．７ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのグリセロールを含む。
本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートを特徴付けるための別の方法は、コンジュゲートされたリシンの範囲（コンジュゲーション度）として特徴付けることができる、糖類にコンジュゲートされる担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）中のリシン残基の数によるものである。多糖への共有結合に起因する、担体タンパク質のリシン改変に関する証拠を、当業者には公知の日常的な方法を用いるアミノ酸分析により得ることができる。コンジュゲーションは、コンジュゲート材料を生成するために用いられるＣＲＭ１９７タンパク質出発材料と比較して、回収されるリシン残基の数の減少をもたらす。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、２～１５、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、３～１５、３～１３、３～１０、３～８、３～６、３～５、３～４、５～１５、５～１０、８～１５、８～１２、１０～１５または１０～１２である。１つの実施形態において、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。好ましい実施形態においては、本発明の血清型１５Ｂグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、２～５である。
１．３．５ ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲート
本発明のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートにおいて、糖類は、多糖およびオリゴ糖類からなる群から選択され、担体タンパク質は、本明細書に記載の、または当業者には公知の任意の好適な担体から選択される。いくつかの好ましい実施形態においては、糖類は、血清型１２Ｆのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する多糖である。
１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＣＤＡＰを用いて調製される。多糖を、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）を用いて活性化して、シアン酸エステルを形成させる。次いで、活性化された多糖を、直接的に、またはスペーサー（リンカー）基を介して、担体タンパク質（好ましくは、ＣＲＭ１９７）上のアミノ基にカップリングさせる。例えば、スペーサーをシスタミンまたはシステアミンとして、チオール化された多糖を得てもよく、このチオール化された多糖は、マレイミド活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを用いる）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、ＳＩＢ、ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＩＡＢ、ＳＩＡ、もしくはＳＢＡＰ）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体にカップリングすることができる。好ましくは、シアン酸エステル（場合により、ＣＤＡＰ化学反応により作製される）を、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングさせ、アミノ誘導体化された糖類を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応を用いて担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）にコンジュゲートさせる。
コンジュゲーションのための他の技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いる。多くは、国際特許出願公開第ＷＯ９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションはカルボニルリンカーを伴ってもよく、これは、糖類の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌら（１９７９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２５４：２５７２～２５７４；Ｈｅａｒｎら（１９８１）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９～５１８を参照されたい）、およびそれに続く、カルバメート結合を形成させるためのタンパク質との反応により形成され得る。これは、アノマー末端の一次ヒドロキシル基への還元、場合により、一次ヒドロキシル基の保護／脱保護、ＣＤＩカルバメート中間体を形成させるための一次ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含んでもよい。
１つの実施形態において、血清型１２Ｆのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来する莢膜多糖を、還元的アミノ化により担体タンパク質にコンジュゲートさせる。還元的アミノ化は、２つのステップ、（１）個々の六糖類単位中の隣接ジオールからアルデヒド官能基を生成するための多糖の酸化、（２）コンジュゲートを形成させるための活性化された糖類および担体タンパク質の還元を含む。
酸化の前に、血清型１２Ｆ多糖を、場合により、加水分解（サイジング）する。機械的または化学的加水分解を用いることができる。化学的加水分解を、酢酸を用いて行うことができる。
１つの実施形態において、酸化剤は過ヨウ素酸塩である。用語「過ヨウ素酸塩」は、過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を含む（以下を参照されたい）。
好ましい実施形態においては、酸化剤は、２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）フリーラジカルおよび共酸化剤としてのＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）である。そのような実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートを、実施例７およびＷＯ２０１４／０９７０９９に記載のように、２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）フリーラジカルを用いて調製し、共酸化剤としてＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）を用いて糖類の第１級アルコールをアルデヒドに酸化する（以後、「ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ酸化」とする）。したがって、一態様においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ａ）１２Ｆ糖類を、水性溶媒中で２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と反応させて、活性化された糖類を生産するステップ；ならびにｂ）活性化された糖類を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップ（以後、「ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ－還元的アミノ化」とする）を含む方法により得ることができる。一態様においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートは、前記方法により得られる。１つの実施形態において、活性化された１２Ｆ糖類の酸化度は、１～５０、１～４０、１～３０、１～２０、１～１０、１～５、３～４０、３～３０、３～２０、３～１０、４～４０、４～３０、４～２０、４～１０、５～３０、５～２５、５～２０、５～１０、６～５０、６～４０、６～３０、６～２０、６～１５、６～１４、６～１３、６～１２、６～１１、６～１０、７～４０、７～３０、７～２０、７～１５、７～１４、７～１３、７～１２、７～１１、７～１０、８～４０、８～３０、８～２０、８～１５、８～１４、８～１３、８～１２、８～１１、８～１０、９～４０、９～３０、９～２０、９～１５、１０～４０、１０～３０、１０～２０、または１０～１５の範囲である。さらなる態様において、活性化された糖類の酸化度は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である。好ましくは、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
１つの実施形態において、ステップａ）の前に、１２Ｆ糖類を、１００ｋＤａ～４００ｋＤａの範囲の分子量まで加水分解する。例えば、一態様において、分子量は、１００ｋＤａ～３５０ｋＤａ、１００ｋＤａ～３００ｋＤａ、１００ｋＤａ～２５０ｋＤａ、１００ｋＤａ～２００ｋＤａ、１００ｋＤａ～１５０ｋＤａ、２００ｋＤａ～４００ｋＤａ、２００ｋＤａ～３５０ｋＤａ、２００ｋＤａ～３００ｋＤａ、２００ｋＤａ～２５０ｋＤａ、３００ｋＤａ～４００ｋＤａ、または３００ｋＤａ～３５０ｋＤａの範囲である。
さらなる態様において、本方法は、ステップｂ）の前に活性化された多糖を精製するステップをさらに含む。さらなる態様において、本方法は、ステップｂ）の後に還元剤を添加するステップをさらに含む。一態様において、還元剤はＮａＣＮＢＨ３である。さらなる態様において、本方法は、ＮａＣＮＢＨ３の添加後にＮａＢＨ４を添加するステップをさらに含む。さらなる態様において、本方法は、ＮａＢＨ４の添加後に精製ステップを含む。
別の態様において、本開示は、上記に開示された方法のいずれかにより生産されるまたは得ることができる、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートを提供する。例えば、一態様において、本開示は、ａ）糖類を、水性溶媒中で２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシ（ＴＥＭＰＯ）およびＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）と反応させて、活性化された糖類を生産するステップ；ならびにｂ）活性化された糖類を、１つまたは複数のアミン基を含む担体タンパク質と反応させるステップを含む方法により生産されるまたは得ることができる、担体タンパク質にコンジュゲートされている糖類を含むストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートを提供する。
一実施形態においては、本発明のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートは、約５０ｋＤａ～約２０，０００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態においては、グリココンジュゲートは、約２００ｋＤａ～約１０，０００ｋＤａの分子量を有する。別の実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートは、約５００ｋＤａ～約５，０００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートは、約１，０００ｋＤａ～約３，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートは、約６００ｋＤａ～約２，８００ｋＤａ；約７００ｋＤａ～約２，７００ｋＤａ；約１，０００ｋＤａ～約２，０００ｋＤａ；約１，８００ｋＤａ～約２，５００ｋＤａ；約１，１００ｋＤａ～約２，２００ｋＤａ；約１，９００ｋＤａ～約２，７００ｋＤａ；約１，２００ｋＤａ～約２，４００ｋＤａ；約１，７００ｋＤａ～約２，６００ｋＤａ；約１，３００ｋＤａ～約２，６００ｋＤａ；約１，６００ｋＤａ～約３，０００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、本発明の血清型１２Ｆグリココンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；または２，０００ｋＤａ～３，０００ｋＤａの分子量を有する。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。いくつかのそのような実施形態においては、血清型１２Ｆグリココンジュゲートは、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ－還元的アミノ化により担体タンパク質にコンジュゲートされている。
本発明の血清型１２Ｆグリココンジュゲートを特徴付けるための別の方法は、コンジュゲートされたリシンの範囲（コンジュゲーション度）として特徴付けることができる、糖類にコンジュゲートされる担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）中のリシン残基の数によるものである。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型１２Ｆグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、２～２０、４～１６、４～１５、２～１５、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、３～１５、３～１３、３～１０、３～８、３～６、３～５、３～４、５～１５、５～１０、８～１５、８～１２、１０～１５または１０～１２である。１つの実施形態において、本発明の血清型１２Ｆグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９または約２０である。
糖類にコンジュゲートされている担体タンパク質中のリシン残基の数を、モル比として表すこともできる。例えば、ＣＲＭ１９７の４～１５個のリシン残基が糖類に共有的に連結されるグリココンジュゲートにおいては、グリココンジュゲート中のコンジュゲートしたリシン残基のＣＲＭ１９７に対するモル比は、約１０：１～約４０：１である。ＣＲＭ１９７の２～２０個のリシン残基が糖類に共有的に連結される免疫原性組成物において、グリココンジュゲート中のコンジュゲートしたリシンのＣＲＭ１９７に対するモル比は、約５：１～約５０：１である。一実施形態においては、本発明のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲート中、コンジュゲートしたリシンの担体タンパク質に対するモル比は、約１０：１～約２５：１である。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。いくつかの実施形態においては、ＣＲＭ１９７は、糖類に共有的に連結される３９個のうちの約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６リシン残基を含んでもよい。いくつかのそのような実施形態においては、血清型１２Ｆグリココンジュゲートは、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ－還元的アミノ化により担体タンパク質にコンジュゲートされている。
一実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲート中で０．２～４（例えば、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、または約４．０）である。別の実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲート中で１．１～１．７である。他の実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．８～１．８（例えば、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７または約１．８）である。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。いくつかのそのような実施形態においては、血清型１２Ｆグリココンジュゲートは、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ－還元的アミノ化により担体タンパク質にコンジュゲートされている。
担体タンパク質上のリシンへの糖類鎖の結合の頻度は、本開示の血清型１２Ｆグリココンジュゲートを特徴付けるための別のパラメータである。例えば、一実施形態においては、多糖の１００個の糖類反復単位ごとに担体タンパク質と多糖との間の少なくとも１つの共有結合が存在する。一実施形態においては、多糖の５０個の糖類反復単位ごとに担体タンパク質と多糖との間の少なくとも１つの共有結合が存在する。一実施形態においては、多糖の２５個の糖類反復単位ごとに担体タンパク質と多糖との間の少なくとも１つの共有結合が存在する。別の実施形態においては、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の４個の糖類反復単位ごとに少なくとも１回存在する。別の実施形態においては、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１０個の糖類反復単位ごとに少なくとも１回存在する。さらなる実施形態においては、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１５個の糖類反復単位ごとに少なくとも１回存在する。よくある実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、ＣＲＭ１９７と多糖との間の共有結合は、多糖の４、１０、１５または２５個の糖類反復単位ごとに少なくとも１回存在する。
他の実施形態においては、コンジュゲートは、５～１０個の糖類反復単位ごと；２～７個の糖類反復単位ごと；３～８個の糖類反復単位ごと；４～９個の糖類反復単位ごと；６～１１個の糖類反復単位ごと；７～１２個の糖類反復単位ごと；８～１３個の糖類反復単位ごと；９～１４個の糖類反復単位ごと；１０～１５個の糖類反復単位ごと；２～６個の糖類反復単位ごと；３～７個の糖類反復単位ごと；４～８個の糖類反復単位ごと；６～１０個の糖類反復単位ごと；７～１１個の糖類反復単位ごと；８～１２個の糖類反復単位ごと；９～１３個の糖類反復単位ごと；１０～１４個の糖類反復単位ごと；１０～２０個の糖類反復単位ごと；４～２５個の糖類反復単位ごと、または２～２５個の糖類反復単位ごとに担体タンパク質と糖類との間の少なくとも１個の共有結合を含む。よくある実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
別の実施形態においては、ＣＲＭ１９７と糖類との間の少なくとも１個の結合は、多糖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の糖類反復単位ごとに存在する。いくつかのそのような実施形態においては、血清型１２Ｆグリココンジュゲートは、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ－還元的アミノ化により担体タンパク質にコンジュゲートされている。
一実施形態においては、本発明のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートは、多糖の２５個の糖類反復単位ごとに担体タンパク質と多糖との間に少なくとも１個の共有結合を含む。別の実施形態においては、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の４個の糖類反復単位ごとに少なくとも１回存在する。別の実施形態においては、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１０個の糖類反復単位ごとに少なくとも１回存在する。さらなる実施形態においては、担体タンパク質と多糖との間の共有結合は、多糖の１５個の糖類反復単位ごとに少なくとも１回存在する。いくつかのそのような実施形態においては、血清型１２Ｆグリココンジュゲートは、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ－還元的アミノ化により担体タンパク質にコンジュゲートされている。
本発明の血清型１２Ｆグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされていないが、それにも拘わらず、グリココンジュゲート組成物中に存在する遊離糖類を含有してもよい。遊離糖類を、グリココンジュゲートと非共有的に会合させる（すなわち、非共有的に結合させる、吸着させる、またはその中に、もしくはそれと共に捕捉させる）ことができる。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型１２Ｆグリココンジュゲートは、血清型１２Ｆ多糖の総量と比較して約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満の遊離血清型１２Ｆ多糖を含む。一実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートは、血清型１２Ｆ多糖の総量と比較して約５０％未満の遊離血清型１２Ｆ多糖を含む。一実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートは、血清型１２Ｆ多糖の総量と比較して約４５％未満の遊離血清型１２Ｆ多糖を含む。別の実施形態においては、グリココンジュゲートは、血清型１２Ｆ多糖の総量と比較して約３０％未満の遊離血清型１２Ｆ多糖を含む。別の実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートは、血清型１２Ｆ多糖の総量と比較して約２０％未満の遊離血清型１２Ｆ多糖を含む。さらなる実施形態においては、グリココンジュゲートは、血清型１２Ｆ多糖の総量と比較して約１０％未満の遊離血清型１２Ｆ多糖を含む。別の実施形態においては、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートは、血清型１２Ｆ多糖の総量と比較して約５％未満の遊離血清型１２Ｆ多糖を含む。いくつかのそのような実施形態においては、血清型１２Ｆグリココンジュゲートは、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ－還元的アミノ化により担体タンパク質にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型１２Ｆグリココンジュゲートは、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する糖類を含む。他のそのような実施形態においては、糖類は、５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態においては、糖類は、５０ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；または２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；または２００ｋＤａ～４００ｋＤａの分子量を有する。いくつかのそのような実施形態においては、血清型１２Ｆグリココンジュゲートは、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ－還元的アミノ化により担体タンパク質にコンジュゲートされている。
血清型１２Ｆグリココンジュゲートを、その分子サイズ分布（Ｋｄ）により特徴付けることもできる。サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ－４Ｂ）を用いて、上記のように、コンジュゲートの相対分子サイズ分布を決定することができる。好ましい実施形態においては、少なくとも３５％の本発明の血清型１２Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％の本発明の血清型１２Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも６０％の本発明の血清型１２Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも７０％の本発明の血清型１２Ｆグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。
好ましい実施形態においては、４０％～９０％の血清型１２ＦグリココンジュゲートがＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、５０％～９０％の血清型１２ＦグリココンジュゲートがＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、６５％～８０％の血清型１２ＦグリココンジュゲートがＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。
１．３．６ ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来するグリココンジュゲート
１つの実施形態において、血清型１０Ａグリココンジュゲートは、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）を用いて多糖を活性化して、シアン酸エステルを形成させることにより得られる。活性化された多糖を、担体タンパク質上のアミノ基に直接、またはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングさせることができる。例えば、スペーサーをシスタミンまたはシステアミンとして、チオール化された多糖を得てもよく、このチオール化された多糖は、マレイミド－活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを用いる）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、ＳＩＢ、ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＩＡＢ、ＳＩＡ、もしくはＳＢＡＰを用いる）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体にカップリングすることができる。好ましくは、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学反応により作製されていてもよい）を、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングし、アミノ誘導体化された糖類を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応を用いて担体タンパク質にコンジュゲートさせる。そのようなコンジュゲートは、例えば、ＷＯ９３／１５７６０、ＷＯ９５／０８３４８およびＷＯ９６／１２９０９４に記載されている。
他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いる。多くは、国際特許出願公開第ＷＯ９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションはカルボニルリンカーを伴ってもよく、これは、糖類の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌら（１９７９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２５４：２５７２～２５７４；Ｈｅａｒｎら（１９８１）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９～５１８を参照されたい）、およびそれに続く、カルバメート結合を形成させるためのタンパク質との反応により形成され得る。これは、アノマー末端の一次ヒドロキシル基への還元、場合により、一次ヒドロキシル基の保護／脱保護、ＣＤＩカルバメート中間体を形成させるための一次ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含んでもよい。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートは、還元的アミノ化を用いて調製される。還元的アミノ化は、２つのステップ、（１）個々の六糖類単位中の隣接ジオールからアルデヒド官能基を生成するための多糖の酸化、（２）コンジュゲートを形成させるための活性化された多糖および担体タンパク質の還元を含む。
酸化の前に、血清型１０Ａ多糖を、場合により、加水分解（サイジング）する。機械的または化学的加水分解を用いることができる。化学的加水分解を、酢酸を用いて行うことができる。
１つの実施形態において、血清型多糖は、
（ａ）単離された血清型１０Ａ多糖を、酸化剤と反応させるステップ；
（ｂ）クエンチング剤の添加により酸化反応をクエンチして、活性化された血清型１０Ａ多糖を得るステップ
を含むプロセスにより活性化（酸化）する。
好ましい実施形態においては、酸化剤は、過ヨウ素酸塩である。本発明の目的のために、用語「過ヨウ素酸塩」は、過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を含む；この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４ －）とオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６ ５－）の両方および過ヨウ素酸塩の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）も含む。好ましい実施形態においては、酸化剤は、過ヨウ素酸ナトリウムである。好ましい実施形態においては、血清型１０Ａ多糖の酸化に用いられる過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸塩である。好ましい実施形態においては、血清型１０Ａ多糖の酸化に用いられる過ヨウ素酸塩は、メタ過ヨウ素酸ナトリウムである。
一実施形態においては、クエンチング剤は、隣接ジオール、１，２－アミノアルコール、アミノ酸、グルタチオン、亜硫酸塩、重硫酸塩、亜ジチオン酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩、次亜リン酸塩または亜リン酸から選択される。
一実施形態においては、クエンチング剤は、式（Ｉ）：
Figure 0007059095000004
 （式中、Ｒ１は、Ｈ、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルから選択される）
の１，２－アミノアルコールである。
一実施形態においては、クエンチング剤は、亜硫酸塩、重硫酸塩、亜ジチオン酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩、亜リン酸塩、次亜リン酸塩または亜リン酸のナトリウムおよびカリウム塩から選択される。
一実施形態においては、クエンチング剤は、アミノ酸である。そのような実施形態においては、前記アミノ酸を、セリン、トレオニン、システイン、シスチン、メチオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、トリプトファン、チロシン、およびヒスチジンから選択することができる。
一実施形態においては、クエンチング剤は、重硫酸塩、亜ジチオン酸塩、メタ重亜硫酸塩、チオ硫酸塩などの亜硫酸塩である。
一実施形態においては、クエンチング剤は、２つの隣接ヒドロキシル基（隣接ジオール）、すなわち、２つの隣接する炭素原子に共有的に連結された２つのヒドロキシル基を含む化合物である。
好ましくは、クエンチング剤は、式（ＩＩ）：
Figure 0007059095000005
 （式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｈ、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルから選択される）
の化合物である。
好ましい実施形態においては、クエンチング剤は、グリセロール、エチレングリコール、プロパン－１，２－ジオール、ブタン－１，２－ジオールもしくはブタン－２，３－ジオール、アスコルビン酸である。好ましい実施形態においては、クエンチング剤は、ブタン－２，３－ジオールである。
好ましい実施形態においては、単離された血清型１０Ａ多糖は、（ａ）単離された血清型１０Ａ多糖を過ヨウ素酸塩と反応させるステップ；
（ｂ）ブタン－２，３－ジオールの添加により酸化反応をクエンチングして、活性化された血清型１０Ａ多糖を得るステップ
を含むプロセスにより活性化する。
多糖の酸化ステップの後、多糖は活性化されると言われ、本明細書の以下では「活性化された多糖」と呼ばれる。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１０Ａ多糖は精製される。活性化された血清型１０Ａ多糖は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、透析または限外濾過／透析濾過などの当業者には公知の方法に従って精製される。例えば、活性化された１０Ａ多糖は、限外濾過装置を用いる濃縮および透析濾過により精製される。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１０Ａ多糖の酸化度は、２～３０、２～２５、２～２０、２～１５、２～１０、２～５、５～３０、５～２５、５～２０、５～１５、５～１０、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１５、１５～３０、１５～２５、１５～２０、２０～３０、または２０～２５である。好ましい実施形態においては、活性化された血清型１０Ａ多糖の酸化度は、２～１０、４～８、４～６、６～８、６～１２、８～１４、９～１１、１０～１６、１２～１６、１４～１８、１６～２０、１６～１８、１８～２２、または１８～２０である。
好ましい実施形態においては、活性化された血清型１０Ａ多糖は、５０ｋＤａ～４００ｋＤａ、５０ｋＤａ～３５０ｋＤａ、５０ｋＤａ～３００ｋＤａ、５０ｋＤａ～２５０ｋＤａ、５０ｋＤａ～２００ｋＤａ、１００ｋＤａ～３００ｋＤａ、１００ｋＤａ～２５０ｋＤａ、または１００ｋＤａ～２００ｋＤａの分子量を有する。好ましい実施形態において、活性化された血清型１０Ａ多糖は、５０ｋＤａ～３００ｋＤａの分子量を有する。好ましい実施形態において、活性化された血清型１０Ａ多糖は、１００ｋＤａ～２００ｋＤａの分子量を有する。好ましい実施形態において、活性化された血清型１０Ａ多糖は、１００ｋＤａ～２００ｋＤａの分子量および５～２０、５～１５、８～１４、８～１２、または９～１１の酸化度を有する。好ましい実施形態において、活性化された血清型１０Ａ多糖は、１００ｋＤａ～２００ｋＤａの分子量および９～１１の酸化度を有する。
活性化された多糖および／または担体タンパク質を、独立に（個別凍結乾燥）または一緒に（同時凍結乾燥）凍結乾燥（凍結－乾燥）することができる。
１つの実施形態において、活性化された血清型１０Ａ多糖を、場合により、糖類の存在下で凍結乾燥する。好ましい実施形態においては、糖類は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットから選択される。好ましい実施形態においては、糖類はスクロースである。一実施形態においては、次いで、凍結乾燥された活性化された多糖を、担体タンパク質を含む溶液と混合する。
別の実施形態においては、活性化された多糖および担体タンパク質を同時に凍結乾燥する。そのような実施形態においては、活性化された血清型１０Ａ多糖を、担体タンパク質と混合し、場合により、糖類の存在下で凍結乾燥する。好ましい実施形態においては、糖類は、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットから選択される。好ましい実施形態においては、糖類はスクロースである。次いで、同時に凍結乾燥された多糖および担体タンパク質を、溶液中に再懸濁し、還元剤と反応させることができる。
コンジュゲーションプロセスの第２のステップは、還元剤を用いて、コンジュゲートを形成させるための活性化された多糖および担体タンパク質の還元（還元的アミノ化）である。
活性化された血清型１０Ａ多糖は、
（ｃ）活性化された血清型１０Ａ多糖を担体タンパク質と混合するステップ；ならびに
（ｄ）混合された活性化された血清型１０Ａ多糖および担体タンパク質を、還元剤と反応させて、血清型１０Ａ多糖－担体タンパク質コンジュゲートを形成させるステップ
を含むプロセスによって担体タンパク質にコンジュゲートさせることができる。
１つの実施形態において、還元反応を水性溶媒中で実行し、別の実施形態においては、反応を非プロトン性溶媒中で実行する。１つの実施形態において、還元反応を、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で実行する。ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒を用いて、凍結乾燥された活性化された多糖および担体タンパク質を再構成させることができる。
１つの実施形態において、還元剤は、ＢｒｏｎｓｔｅｄまたはＬｅｗｉｓ酸の存在下のシアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化ホウ素亜鉛、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン、２，６－ジボラン－メタノール、ジメチルアミン－ボラン、ｔ－ＢｕＭｅｉＰｒＮ－ＢＨ３、ベンジルアミン－ＢＨ３または５－エチル－２－メチルピリジンボラン（ＰＥＭＢ）などのアミンボランである。好ましい実施形態においては、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
還元反応の終わりに、コンジュゲート中に残存する未反応のアルデヒド基が存在してもよく、これらのものを、好適なキャッピング剤を用いてキャップすることができる。一実施形態においては、このキャッピング剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である。
担体タンパク質への血清型１０Ａ多糖のコンジュゲーション後、グリココンジュゲートを、当業者には公知の様々な技術により精製する（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化する）ことができる。これらの技術としては、透析、濃縮／透析濾過操作、接線流濾過沈降／溶出、カラムクロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたは疎水性相互作用クロマトグラフィー）、および深層濾過が挙げられる。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートは、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する糖類を含む。他のそのような実施形態においては、糖類は、５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態においては、糖類は、５０ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；または２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；または２００ｋＤａ～４００ｋＤａの分子量を有する。いくつかのそのような実施形態においては、血清型１０Ａグリココンジュゲートは、還元的アミノ化を用いて調製される。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートは、５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、血清型１０Ａグリココンジュゲートは、５０ｋＤａ～１５，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、血清型１０Ａグリココンジュゲートは、５００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ、５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；または３，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、血清型１０Ａグリココンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、血清型１０Ａグリココンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａの分子量を有する。さらに他の実施形態においては、血清型１０Ａグリココンジュゲートは、２，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａまたは３，０００ｋＤａ～７，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態においては、本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートは、２００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；または２，０００ｋＤａ～３，０００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートは、３，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；または４，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態においては、本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートは、５，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａまたは５，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態においては、本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートは、６，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａまたは６，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態においては、本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートは、７，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；７，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；７，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａまたは７，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態においては、本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートは、８，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；８，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；または８，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する。
上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。グリココンジュゲートの分子量は、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳにより測定される。
本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートを特徴付けるための別の方法は、コンジュゲートされたリシンの範囲（コンジュゲーション度）として特徴付けることができる、糖類にコンジュゲートされる担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）中のリシン残基の数によるものである。多糖への共有結合に起因する、担体タンパク質のリシン改変の証拠を、当業者には公知の日常的な方法を用いるアミノ酸分析により得ることができる。コンジュゲーションは、コンジュゲート材料を生成するために用いられるＣＲＭ１９７タンパク質出発材料と比較して、回収されるリシン残基の数の減少をもたらす。
好ましい実施形態においては、血清型１０Ａグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、２～１５、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、３～１５、３～１３、３～１０、３～８、３～６、３～５、３～４、５～１５、５～１０、８～１５、８～１２、１０～１５または１０～１２である。好ましい実施形態においては、血清型１０Ａグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、６～８である。好ましい実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートを、糖類の担体タンパク質に対する比（重量／重量）により特徴付けることもできる。いくつかの実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．５～３．０（例えば、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、または約３．０）である。好ましい実施形態においては、コンジュゲート中の血清型１０Ａ糖類の担体タンパク質に対する比は、０．５～２．０、０．５～１．５、０．５～１．０、１．０～１．５または１．０～２．０である。好ましい実施形態においては、コンジュゲート中の血清型１０Ａ多糖の担体タンパク質に対する比は、０．８～１．４である。好ましい実施形態においては、コンジュゲート中の血清型１０Ａ多糖の担体タンパク質に対する比は、０．８～１．２（例えば、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１または約１．２）である。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされないが、それにも拘わらず、グリココンジュゲート組成物中に存在する遊離糖類を含有してもよい。遊離糖類を、グリココンジュゲートと非共有的に会合させる（すなわち、非共有的に結合させる、吸着させる、またはその中に、もしくはそれと共に捕捉させる）ことができる。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートは、１０Ａ糖類の総量に対して、約５０％未満の遊離糖類、約４５％未満の遊離糖類、約４０％未満の遊離糖類、約３５％未満の遊離糖類、約３０％未満の遊離糖類、約２５％未満の遊離糖類、約２０％未満の遊離糖類、約１５％未満の遊離糖類、約１０％未満の遊離糖類、または約５％未満の遊離糖類を含む。好ましくは、血清型１０Ａグリココンジュゲートは、１５％未満の遊離糖類、より好ましくは、１０％未満の遊離糖類、さらにより好ましくは、５％未満の遊離糖類を含む。
血清型１０Ａグリココンジュゲートを、その分子サイズ分布（Ｋｄ）により特徴付けることもできる。サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ－４Ｂ）を用いて、上記のように、コンジュゲートの相対分子サイズ分布を決定することができる。好ましい実施形態においては、少なくとも３０％の本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも４０％の本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％の本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも６０％の血清型１０Ａグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、５０％～８０％の本発明の血清型１０Ａグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。
１．３．７ ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来するグリココンジュゲート
１つの実施形態において、血清型１１Ａグリココンジュゲートは、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）を用いて多糖を活性化して、シアン酸エステルを形成させることにより得られる。活性化された多糖を、担体タンパク質上のアミノ基に直接、またはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングさせることができる。例えば、スペーサーをシスタミンまたはシステアミンとして、チオール化された多糖を得てもよく、このチオール化された多糖は、マレイミド－活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを用いる）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、ＳＩＢ、ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＩＡＢ、ＳＩＡ、もしくはＳＢＡＰを用いる）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体にカップリングすることができる。好ましくは、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学反応により作製されていてもよい）を、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングし、アミノ誘導体化された糖類を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応を用いて担体タンパク質にコンジュゲートさせる。そのようなコンジュゲートは、例えば、ＷＯ９３／１５７６０、ＷＯ９５／０８３４８およびＷＯ９６／１２９０９４に記載されている。
他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いる。多くは、国際特許出願公開第ＷＯ９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションはカルボニルリンカーを伴ってもよく、これは、糖類の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌら（１９７９）、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２５４：２５７２～２５７４；Ｈｅａｒｎら（１９８１）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９～５１８を参照されたい）、およびそれに続く、カルバメート結合を形成させるためのタンパク質との反応により形成され得る。これは、アノマー末端の一次ヒドロキシル基への還元、場合により、一次ヒドロキシル基の保護／脱保護、ＣＤＩカルバメート中間体を形成させるための一次ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含んでもよい。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートは、還元的アミノ化を用いて調製される。還元的アミノ化は、２つのステップ、（１）個々の六糖類単位中の隣接ジオールからアルデヒド官能基を生成するための多糖の酸化、（２）コンジュゲートを形成させるための活性化された多糖および担体タンパク質の還元を含む。
酸化の前に、血清型１１Ａ多糖を、場合により、加水分解して、その粘度を低下させる。機械的または化学的加水分解を用いることができる。化学的加水分解を、酢酸を用いて行うことができる。機械的サイジングを、高圧均一化剪断を用いて行うことができる。
酸化ステップは、過ヨウ素酸塩との反応を含んでもよい。本発明の目的では、用語「過ヨウ素酸塩」は、過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を含む；この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４ －）とオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６ ５－）の両方および過ヨウ素酸塩の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）も含む。１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の莢膜多糖血清型１１Ａを、メタ過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）の存在下で酸化する。別の実施形態においては、血清型１１Ａに由来する莢膜多糖を、オルト過ヨウ素酸塩、好ましくは、過ヨウ素酸の存在下で酸化する。
多糖の酸化ステップの後、多糖は活性化されると言われ、本明細書の以下では「活性化された多糖」と呼ばれる。活性化された多糖を、精製し、凍結乾燥（凍結－乾燥）することができる。
活性化された多糖および担体タンパク質を、独立に（個別凍結乾燥）または一緒に（同時凍結乾燥）、凍結乾燥（凍結－乾燥）することができる。一実施形態においては、活性化された多糖および担体タンパク質は同時に凍結乾燥される。別の実施形態においては、活性化された多糖および担体タンパク質は独立に凍結乾燥される。
一実施形態においては、凍結乾燥は、非還元糖の存在下で行われ、可能な非還元糖としては、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットが挙げられる。
コンジュゲーションプロセスの第２のステップは、還元剤を用いた、コンジュゲートを形成させるための活性化された多糖および担体タンパク質の還元（還元的アミノ化）である。好適である還元剤としては、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどのシアノ水素化ホウ素、ボラン－ピリジン、または水素化ホウ素交換樹脂が挙げられる。一実施形態においては、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
１つの実施形態において、還元反応は、水性溶媒中で実行され、別の実施形態においては、反応は非プロトン性溶媒中で実行される。１つの実施形態において、還元反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で実行される。ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒を用いて、凍結乾燥された活性化された多糖および担体タンパク質を復元させることができる。
一実施形態においては、０．１～３．０、０．１５～２．０、０．２～２．０、または０．５～１．５モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムが還元反応において用いられる。一実施形態においては、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．９または３．０モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムが還元反応において用いられる。
一実施形態においては、還元剤はトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムであり、さらなる実施形態においては、１．０～６．０モル当量、２．０～５．０モル当量または約３．０モル当量のトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムが還元反応において用いられる。
還元反応の終わりに、コンジュゲート中に残存する未反応のアルデヒド基が存在してもよく、これらのものを好適なキャッピング剤を用いてキャップすることができる。一実施形態においては、このキャッピング剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である。１つの実施形態において、キャッピングは、還元反応物を、０．５～５．０モル当量のＮａＢＨ４、例えば、約１、１．５、２、２．５または３モル当量のＮａＢＨ４と混合することにより達成される。
コンジュゲーション（還元反応および場合により、キャッピング）の後、グリココンジュゲートを精製することができる。グリココンジュゲートを、透析濾過および／またはイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーにより精製することができる。１つの実施形態において、グリココンジュゲートは、透析濾過またはイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーにより精製される。
一実施形態においては、グリココンジュゲートは滅菌濾過される。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートは担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）にコンジュゲートされ、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する多糖を含む。他のそのような実施形態においては、糖類は、５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態においては、糖類は、５０ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～４００ｋＤａ；５０ｋＤａ～３００ｋＤａ；５０ｋＤａ～２００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～４００ｋＤａ；１００ｋＤａ～３００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２００ｋＤａ；２００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；または２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～４００ｋＤａまたは２００ｋＤａ～３００ｋＤａの分子量を有する。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートは、５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、血清型１１Ａグリココンジュゲートは、５０ｋＤａ～１５，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、血清型１１Ａグリココンジュゲートは、５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、血清型１１Ａグリココンジュゲートは、２００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する。さらに他の実施形態においては、血清型１１Ａグリココンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａまたは２，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートは、２００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１７，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１７，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；７００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；７００ｋＤａ～１７，５００ｋＤａ；７００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；７００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；７００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；７００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；７００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；７００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；７００ｋＤａ～４，５００ｋＤａ；７００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；７００ｋＤａ～３，５００ｋＤａ；７００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；７００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；７００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１７，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１７，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；または２，０００ｋＤａ～３，０００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートは、３，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１７，５００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１７，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；または４，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態においては、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートは、５，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１７，５００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａまたは５，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａの分子量を有する。
１つの実施形態において、前記血清型１１Ａグリココンジュゲートは、還元的アミノ化を用いて調製される。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートは、血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．３、０．５、０．６、１．０、１．４、１．８、２．２、２．６、３．０、３．４、３．８、４．２、４．６または５ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、血清型１１Ａグリココンジュゲートは、血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり少なくとも１．８、２．２または２．６ｍＭのアセテートを含む。１つの実施形態において、グリココンジュゲートは、血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含む。好ましい実施形態においては、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートは、血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６、１、１．４、１．８、２．２、２．６、３、３．４、３．８、４．２または４．６ｍＭのアセテートおよび血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり約５ｍＭ未満のアセテートを含む。１つの実施形態において、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートは、血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６、１．０、１．４、１．８、２．２、２．６、または３．０ｍＭのアセテートおよび血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり約３．４ｍＭ未満のアセテートを含む。１つの実施形態において、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートは、血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６、１、１．４、１．８、２．２、２．６、または約３．０ｍＭのアセテートおよび血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり約３．３ｍＭ未満のアセテートを含む。任意の上記数が本開示の実施形態として企図される。
好ましい実施形態においては、血清型１１Ａグリココンジュゲート中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５である。好ましい実施形態においては、血清型１１Ａグリココンジュゲート中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．７である。好ましい実施形態においては、血清型１１Ａグリココンジュゲート中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．９である。好ましい実施形態においては、Ｏ－アセチル基の存在は、イオン－ＨＰＬＣ分析により決定される。
好ましい実施形態においては、血清型１１Ａグリココンジュゲート中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５である。好ましい実施形態においては、血清型１１Ａグリココンジュゲート中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．７である。好ましい実施形態においては、血清型１１Ａグリココンジュゲート中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比は、少なくとも０．９である。好ましい実施形態においては、Ｏ－アセチル基の存在は、イオン－ＨＰＬＣ分析により決定される。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートは、血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１．０ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態においては、血清型１１Ａグリココンジュゲートは、血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．２、０．３または０．４ｍＭのグリセロールを含む。好ましい実施形態においては、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートは、血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９ｍＭのグリセロールおよび血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり約１．０ｍＭ未満のグリセロールを含む。好ましい実施形態においては、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートは、血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり少なくとも０．３、０．４、０．５、０．６、または０．７ｍＭのグリセロールおよび血清型１１Ａ多糖１ｍＭあたり約０．８ｍＭ未満のグリセロールを含む。任意の上記数が本開示の実施形態として企図される。
本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートを特徴付けるための別の方法は、コンジュゲートされたリシンの範囲（コンジュゲーション度）として特徴付けることができる、糖類にコンジュゲートされる担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）中のリシン残基の数によるものである。
多糖への共有結合に起因する、担体タンパク質のリシン改変に関する証拠を、当業者には公知の日常的な方法を用いるアミノ酸分析により得ることができる。コンジュゲーションは、コンジュゲート材料を生成するために用いられるＣＲＭ１９７タンパク質出発材料と比較して、回収されるリシン残基の数の減少をもたらす。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、１～１５、１～１３、１～１０、１～８、１～６、１～５、１～４、２～１５、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、５～１５、５～１０、８～１５、８～１２、１０～１５または１０～１２である。１つの実施形態において、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。好ましい実施形態においては、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、１～６または２～５である。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートを、糖類の担体タンパク質に対する比（重量／重量）により特徴付けることもできる。いくつかの実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．２～４（例えば、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９または約４．０）である。他の実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．７～２．５、０．８～２．０、０．７～２．０、０．８～１．５、０．７～１．５、０．７～１．４、０．８～１．４、０．７～１．４５または０．８～１．４５である。さらなる実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．８～１．６（例えば、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５または約１．６）である。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。１つの実施形態において、前記血清型１１Ａグリココンジュゲートは、還元的アミノ化を用いて調製される。
本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされないが、それにも拘わらず、グリココンジュゲート組成物中に存在する遊離糖類を含有してもよい。遊離糖類を、グリココンジュゲートと非共有的に会合させる（すなわち、非共有的に結合させる、吸着させる、またはその中に、もしくはそれと共に捕捉させる）ことができる。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートは、血清型１１Ａ莢膜多糖の総量と比較して約５０％未満の遊離血清型１１Ａ莢膜多糖、血清型１１Ａ莢膜多糖の総量と比較して約４５％未満の遊離糖類、約４０％未満の遊離糖類、約３５％未満の遊離糖類、約３０％未満の遊離糖類、約２５％未満の遊離糖類、約２０％未満の遊離糖類、約１５％未満の遊離糖類、約１０％未満の遊離糖類、または約５％未満の遊離血清型１１Ａ莢膜多糖を含む。好ましくは、血清型１１Ａグリココンジュゲートは、１５％未満の遊離糖類、より好ましくは、１０％未満の遊離糖類、さらにより好ましくは、５％未満の遊離糖類を含む。
血清型１１Ａグリココンジュゲートを、その分子サイズ分布（Ｋｄ）により特徴付けることもできる。サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ－４Ｂ）を用いて、上記のように、コンジュゲートの相対分子サイズ分布を決定することができる。好ましい実施形態においては、少なくとも３０％の本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％の本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも６０％の本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも６５％の本発明の血清型１１Ａグリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。
１．３．８ ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来するグリココンジュゲート
１つの実施形態において、血清型８グリココンジュゲートは、１－シアノ－４－ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ）を用いて多糖を活性化して、シアン酸エステルを形成させることにより得られる。活性化された多糖を、担体タンパク質上のアミノ基に直接、またはスペーサー（リンカー）基を介してカップリングさせることができる。例えば、スペーサーをシスタミンまたはシステアミンとして、チオール化された多糖を得てもよく、このチオール化された多糖は、マレイミド－活性化担体タンパク質（例えば、ＧＭＢＳを用いる）またはハロアセチル化担体タンパク質（例えば、ヨードアセトイミド、ＳＩＢ、ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＩＡＢ、ＳＩＡ、もしくはＳＢＡＰを用いる）との反応後に得られるチオエーテル結合を介して担体にカップリングすることができる。好ましくは、シアン酸エステル（ＣＤＡＰ化学反応により作製されていてもよい）を、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とカップリングし、アミノ誘導体化された糖類を、タンパク質担体上のカルボキシル基を介してカルボジイミド（例えば、ＥＤＡＣまたはＥＤＣ）化学反応を用いて担体タンパク質にコンジュゲートさせる。そのようなコンジュゲートは、例えば、ＷＯ９３／１５７６０、ＷＯ９５／０８３４８およびＷＯ９６／１２９０９４に記載されている。
他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ－ニトロ安息香酸、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ－－ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いる。多くは、国際特許出願公開第ＷＯ９８／４２７２１号に記載されている。コンジュゲーションはカルボニルリンカーを伴ってもよく、これは、糖類の遊離ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌら（１９７９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２５４：２５７２～２５７４；Ｈｅａｒｎら（１９８１）、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．２１８：５０９～５１８を参照されたい）、およびそれに続く、カルバメート結合を形成させるためのタンパク質との反応により形成され得る。これは、アノマー末端の一次ヒドロキシル基への還元、場合により、一次ヒドロキシル基の保護／脱保護、ＣＤＩカルバメート中間体を形成させるための一次ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基とのカップリングを含んでもよい。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型８グリココンジュゲートは、還元的アミノ化を用いて調製される。還元的アミノ化は、２つのステップ、（１）個々の六糖類単位中の隣接ジオールからアルデヒド官能基を生成するための多糖の酸化、（２）コンジュゲートを形成させるための活性化された多糖および担体タンパク質の還元を含む。
酸化の前に、血清型８多糖を、場合により、加水分解して、その粘度を低下させる。機械的または化学的加水分解を用いることができる。化学的加水分解を、酢酸を用いて行うことができる。
酸化ステップは、過ヨウ素酸塩との反応を含んでもよい。本発明の目的のために、用語「過ヨウ素酸塩」は、過ヨウ素酸塩と過ヨウ素酸の両方を含む；この用語はまた、メタ過ヨウ素酸塩（ＩＯ４ －）とオルト過ヨウ素酸塩（ＩＯ６ ５－）の両方および過ヨウ素酸塩の様々な塩（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムおよび過ヨウ素酸カリウム）も含む。１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の莢膜多糖血清型８を、メタ過ヨウ素酸塩の存在下、好ましくは、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）の存在下で酸化する。別の実施形態においては、血清型８に由来する莢膜多糖を、オルト過ヨウ素酸塩、好ましくは、過ヨウ素酸の存在下で酸化する。
多糖の酸化ステップの後、多糖は活性化されると言われ、本明細書の以下では「活性化された多糖」と呼ばれる。活性化された多糖を、精製し、凍結乾燥（凍結－乾燥）することができる。
活性化された多糖および担体タンパク質を、独立に（個別凍結乾燥）または一緒に（同時凍結乾燥）、凍結乾燥（凍結－乾燥）することができる。一実施形態においては、活性化された多糖および担体タンパク質は同時に凍結乾燥される。別の実施形態においては、活性化された多糖および担体タンパク質は独立に凍結乾燥される。
一実施形態においては、凍結乾燥は、非還元糖の存在下で行われ、可能な非還元糖としては、スクロース、トレハロース、ラフィノース、スタキオース、メレジトース、デキストラン、マンニトール、ラクチトールおよびパラチニットが挙げられる。
コンジュゲーションプロセスの第２のステップは、還元剤を用いた、コンジュゲートを形成させるための活性化された多糖および担体タンパク質の還元（還元的アミノ化）である。好適である還元剤としては、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどのシアノ水素化ホウ素、ボラン－ピリジン、または水素化ホウ素交換樹脂が挙げられる。一実施形態においては、還元剤は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムである。
１つの実施形態において、還元反応は、水性溶媒中で実行され、別の実施形態においては、反応は非プロトン性溶媒中で実行される。１つの実施形態において、還元反応は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶媒中で実行される。ＤＭＳＯまたはＤＭＦ溶媒を用いて、凍結乾燥された活性化された多糖および担体タンパク質を再構成させることができる。
一実施形態においては、０．１～３．０、０．１５～２．０、０．２～１．０、または０．２５～０．５モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムが還元反応において用いられる。一実施形態においては、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．９または３．０モル当量のシアノ水素化ホウ素ナトリウムが還元反応において用いられる。
一実施形態においては、還元剤はトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムである。さらなる実施形態においては、１．０～６．０モル当量、２．０～５．０モル当量または約３．０モル当量のトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムが還元反応において用いられる。
還元反応の終わりに、コンジュゲート中に残存する未反応のアルデヒド基が存在してもよく、これらのものを好適なキャッピング剤を用いてキャップすることができる。一実施形態においては、このキャッピング剤は、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）である。１つの実施形態において、キャッピングは、還元反応物を、０．５～５．０モル当量のＮａＢＨ４、例えば、約１．０、１．５、２．０、２．５または３．０モル当量のＮａＢＨ４と混合することにより達成される。
コンジュゲーション（還元反応および場合により、キャッピング）の後、グリココンジュゲートを精製することができる。グリココンジュゲートを、透析濾過および／またはイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィーにより精製することができる。１つの実施形態において、グリココンジュゲートは、透析濾過またはイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーにより精製される。
一実施形態においては、グリココンジュゲートは滅菌濾過される。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型８グリココンジュゲートは担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）にコンジュゲートされ、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する多糖を含む。他のそのような実施形態においては、糖類は、５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなるそのような実施形態においては、糖類は、５０ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５０ｋＤａ～７５０ｋＤａ；５０ｋＤａ～５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；１００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；１００ｋＤａ～５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，７５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，２５０ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７５０ｋＤａ；または２００ｋＤａ～５００ｋＤａ；または２００ｋＤａ～４００ｋＤａの分子量を有する。１つの実施形態において、前記血清型８グリココンジュゲートは、還元的アミノ化を用いて調製される。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型８グリココンジュゲートは、５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、血清型８グリココンジュゲートは、５０ｋＤａ～１５，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、血清型８グリココンジュゲートは、５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する。他の実施形態においては、血清型８グリココンジュゲートは、２００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する。さらに他の実施形態においては、血清型８グリココンジュゲートは、１，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａまたは２，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、本発明の血清型８グリココンジュゲートは、２００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；２００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；５００ｋＤａ～１，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～３，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～２，０００ｋＤａ；７５０ｋＤａ～１，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；１，０００ｋＤａ～２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；２，０００ｋＤａ～４，０００ｋＤａ；または２，０００ｋＤａ～３，０００ｋＤａの分子量を有する。
さらなる実施形態においては、本発明の血清型８グリココンジュゲートは、３，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；３，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａ；４，０００ｋＤａ～６，０００ｋＤａ；または４，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態においては、本発明の血清型８グリココンジュゲートは、５，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；５，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａまたは５，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態においては、本発明の血清型８グリココンジュゲートは、６，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；６，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａまたは６，０００ｋＤａ～７，５００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態においては、本発明の血清型８グリココンジュゲートは、７，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；７，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；７，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａまたは７，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａの分子量を有する。さらなる実施形態においては、本発明の血清型８グリココンジュゲートは、８，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａ；８，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａ；または８，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する。
１つの実施形態において、前記血清型８グリココンジュゲートは、還元的アミノ化を用いて調製される。
本発明の血清型８グリココンジュゲートを特徴付けるための別の方法は、コンジュゲートされたリシンの範囲（コンジュゲーション度）として特徴付けることができる、糖類にコンジュゲートされる担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７）中のリシン残基の数によるものである。
多糖への共有結合に起因する、担体タンパク質のリシン改変に関する証拠を、当業者には公知の日常的な方法を用いるアミノ酸分析により得ることができる。よくある実施形態においては、担体タンパク質は、担体タンパク質上のリシン残基の１つまたは複数のε－アミノ基へのアミン結合を介して活性化された多糖に共有的にコンジュゲートされている。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質は、糖類に共有的にコンジュゲートされた２～２０個のリシン残基を含む。他のそのような実施形態においては、担体タンパク質は、糖類に共有的にコンジュゲートされた４～１６個または６～１４個のリシン残基を含む。
好ましい実施形態においては、本発明の血清型８グリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、２～２０、２～１５、２～１３、２～１０、２～８、２～６、２～５、２～４、３～１５、３～１３、３～１０、３～８、３～６、３～５、３～４、５～１５、５～１０、８～１５、８～１２、１０～１５または１０～１２である。１つの実施形態において、本発明の血清型８グリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４または約１５である。好ましい実施形態においては、本発明の血清型８グリココンジュゲートのコンジュゲーション度は、４～１６または６～１４である。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
好ましい実施形態においては、担体タンパク質は、３９個のリシン残基を含有するＣＲＭ１９７を含む。いくつかのそのような実施形態においては、ＣＲＭ１９７は、糖類に共有的に連結された３９個のうちの４～１６個または６～１４個のリシン残基を含んでもよい。このパラメータを表現する別の方法は、約１０％～約４１％または約１５％～約３６％のＣＲＭ１９７リシンが糖類に共有的に連結されるということである。別のそのような実施形態においては、ＣＲＭ１９７は、糖類に共有的に連結された３９個のうちの２～２０個のリシン残基を含んでもよい。このパラメータを表現する別の方法は、約５％～約５０％のＣＲＭ１９７リシンが糖類に共有的に連結されるということである。いくつかのそのような実施形態においては、ＣＲＭ１９７は、糖類に共有的に連結された３９個のうちの約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個のリシン残基を含んでもよい。
本発明の血清型８グリココンジュゲートを、糖類の担体タンパク質に対する比（重量／重量）により特徴付けることもできる。いくつかの実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．２～４．０（例えば、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９または約４．０）である。他の実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．７～２．５である。さらなる実施形態においては、糖類の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）は、０．８～１．５（例えば、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４または約１．５）である。いくつかのそのような実施形態においては、担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。１つの実施形態において、前記血清型８グリココンジュゲートは、還元的アミノ化を用いて調製される。
本発明の血清型８グリココンジュゲートおよび免疫原性組成物は、担体タンパク質に共有的にコンジュゲートされないが、それにも拘わらず、グリココンジュゲート組成物中に存在する遊離糖類を含有してもよい。遊離糖類を、グリココンジュゲートと非共有的に会合させる（すなわち、非共有的に結合させる、吸着させる、またはその中に、もしくはそれと共に捕捉させる）ことができる。
いくつかの実施形態においては、本発明の血清型８グリココンジュゲートは、血清型８糖類の総量に対して約５０％未満の遊離糖類、約４５％未満の遊離糖類、約４０％未満の遊離糖類、約３５％未満の遊離糖類、約３０％未満の遊離糖類、約２５％未満の遊離糖類、約２０％未満の遊離糖類、約１５％未満の遊離糖類、約１０％未満の遊離糖類、または約５％未満の遊離糖類を含む。好ましくは、血清型８グリココンジュゲートは、１５％未満の遊離糖類、より好ましくは１０％未満の遊離糖類、さらにより好ましくは、５％未満の遊離糖類を含む。
血清型８グリココンジュゲートを、その分子サイズ分布（Ｋｄ）により特徴付けることもできる。サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ－４Ｂ）を用いて、コンジュゲートの相対分子サイズ分布を決定することができる。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、コンジュゲートの分子サイズ分布をプロファイルするための重力送りカラム中で用いられる。媒体中の小孔から排除される高分子は低分子よりも迅速に溶出する。画分収集装置を用いて、カラム溶出液を収集する。画分を、糖類アッセイにより比色的に試験する。Ｋｄの決定のために、カラムを較正して、分子が完全に排除される画分（Ｖ０）、（Ｋｄ＝０）、最大保持を表す画分（Ｖｉ）、（Ｋｄ＝１）を確立する。特定の試料属性に達する画分（Ｖｅ）は、Ｋｄ＝（Ｖｅ－Ｖ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）の式によりＫｄと関連する。
好ましい実施形態においては、少なくとも４０％の本発明の血清型８グリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％の本発明の血清型８グリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも６０％の本発明の血清型８グリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、少なくとも７０％の本発明の血清型８グリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。
好ましい実施形態においては、４０％～９０％の血清型８グリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、５０％～９０％の血清型８グリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。好ましい実施形態においては、６５％～８０％の血清型８グリココンジュゲートが、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する。
１．４ 本発明のグリココンジュゲートの組合せ
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、本明細書に開示されるグリココンジュゲートのいずれかを含む。
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来するグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４に記載のグリココンジュゲートなど）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来するグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．２に記載のグリココンジュゲートなど）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来するグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．３に記載のグリココンジュゲートなど）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．５に記載のグリココンジュゲートなど）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来するグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．６に記載のグリココンジュゲートなど）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来するグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．７に記載のグリココンジュゲートなど）およびストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来するグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．８に記載のグリココンジュゲートなど）からなる群から選択される少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、上記のセクション１．３．４に記載のグリココンジュゲートなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、上記のセクション１．３．２に開示されたものなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、上記のセクション１．３．３に開示されたものなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、上記のセクション１．３．５に開示されたものなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、上記のセクション１．３．６に開示されたものなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、上記のセクション１．３．７に開示されたものなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、上記のセクション１．３．８に開示されたものなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、１５Ｂおよび２２Ｆ、１５Ｂおよび３３Ｆ、１５Ｂおよび１２Ｆ、１５Ｂおよび１０Ａ、１５Ｂおよび１１Ａ、１５Ｂおよび８、２２Ｆおよび３３Ｆ、２２Ｆおよび１２Ｆ、２２Ｆおよび１０Ａ、２２Ｆおよび１１Ａ、２２Ｆおよび８、３３Ｆおよび１２Ｆ、３３Ｆおよび１０Ａ、３３Ｆおよび１１Ａ、３３Ｆおよび８、１２Ｆおよび１０Ａ、１２Ｆおよび１１Ａ、１２Ｆおよび８、１０Ａおよび１１Ａ、１０Ａおよび８、ならびに１１Ａおよび８からなる群から選択されるそれぞれ２種のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型のうちの少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、それぞれ３種の下記のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型：
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆ、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび１２Ｆ、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび１０Ａ、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび１１Ａ、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび８、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび１２Ｆ、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび１０Ａ、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび１１Ａ、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび８、
１５Ｂおよび１２Ｆおよび１０Ａ、
１５Ｂおよび１２Ｆおよび１１Ａ、
１５Ｂおよび１２Ｆおよび８、
１５Ｂおよび１０Ａおよび１１Ａ、
１５Ｂおよび１０Ａおよび８、
１５Ｂおよび１１Ａおよび８、
２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆ、
２２Ｆおよび３３Ｆおよび１０Ａ、
２２Ｆおよび３３Ｆおよび１１Ａ、
２２Ｆおよび３３Ｆおよび８、
２２Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａ、
２２Ｆおよび１２Ｆおよび１１Ａ、
２２Ｆおよび１２Ｆおよび８、
２２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａ、
２２Ｆおよび１０Ａおよび８、
２２Ｆおよび１１Ａおよび８、
３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａ、
３３Ｆおよび１２Ｆおよび１１Ａ、
３３Ｆおよび１２Ｆおよび８、
３３Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａ、
３３Ｆおよび１０Ａおよび８、
３３Ｆおよび１１Ａおよび８、
１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａ、
１２Ｆおよび１０Ａおよび８、
１２Ｆおよび１１Ａおよび８または
１０Ａおよび１１Ａおよび８のうちの少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、それぞれ４種の下記のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型：
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆ、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび１０Ａ、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび１１Ａ、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび８、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａ、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび１２Ｆおよび１１Ａ、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび１２Ｆおよび８、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａ、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび１０Ａおよび８、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび１１Ａおよび８、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａ、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１１Ａ、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび８、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａ、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび１０Ａおよび８、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび１１Ａおよび８、
１５Ｂおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａ、
１５Ｂおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび８、
１５Ｂおよび１２Ｆおよび１１Ａおよび８、
１５Ｂおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８、
２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａ、
２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１１Ａ、
２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび８、
２２Ｆおよび３３Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａ、
２２Ｆおよび３３Ｆおよび１０Ａおよび８、
２２Ｆおよび３３Ｆおよび１１Ａおよび８、
２２Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａ、
２２Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび８、
２２Ｆおよび１２Ｆおよび１１Ａおよび８、
２２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８、
３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａ、
３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび８、
３３Ｆおよび１２Ｆおよび１１Ａおよび８、
３３Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８または
１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８
のうちの少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、それぞれ５種の下記のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型：
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａ、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１１Ａ、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび８、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａ、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび１０Ａおよび８、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび１１Ａおよび８、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａ、１５Ｂおよび２２Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび８、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび１２Ｆおよび１１Ａおよび８、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａ、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび８、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１１Ａおよび８、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８、
１５Ｂおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８、
２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａ、
２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび８、
２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１１Ａおよび８、
２２Ｆおよび３３Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８、
２２Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８または
３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８
のうちの少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、それぞれ６種の下記のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型：
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａ、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび８、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１１Ａおよび８、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８、
１５Ｂおよび２２Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８、
１５Ｂおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８または
２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８
のうちの少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、それぞれ７種の下記のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型：１５Ｂおよび２２Ｆおよび３３Ｆおよび１２Ｆおよび１０Ａおよび１１Ａおよび８のうちの少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
１つの実施形態において、このセクションで定義された免疫原性組成物のいずれかのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ、２２Ｆ、３３Ｆ、１２Ｆ、１０Ａ、１１Ａおよび／または８に由来するグリココンジュゲートは、上記のセクション１．３．２～１．３．８に開示されたものである。
１つの実施形態において、上記の免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来するグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．１に記載のグリココンジュゲートなど）をさらに含む。
１つの実施形態において、上記の免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、５および７Ｆに由来するグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．１に記載のグリココンジュゲートなど）をさらに含む。
１つの実施形態において、上記の免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａおよび１９Ａに由来するグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．１に記載のグリココンジュゲートなど）をさらに含む。
１つの実施形態において、上記の免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３に由来するグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．１に記載のグリココンジュゲートなど）をさらに含む。
好ましくは、上記の免疫原性組成物の全てのグリココンジュゲートは、担体タンパク質に個別にコンジュゲートされている。
上記の免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記の免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記の免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記の免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記の免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記の免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記の免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記の免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記の免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、５および７Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記の免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａおよび１９Ａに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記の免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３に由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、上記免疫原性組成物のいずれかのグリココンジュゲートは、全てＣＲＭ１９７に個別にコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、上記免疫原性組成物のいずれかのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および／または２３Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＰＤに個別にコンジュゲートされている。
１つの実施形態においては、上記免疫原性組成物のいずれかのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１８Ｃに由来するグリココンジュゲートは、ＴＴにコンジュゲートされている。
１つの実施形態においては、上記免疫原性組成物のいずれかのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＤＴにコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、上記免疫原性組成物のいずれかのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および／または２３Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＰＤに個別にコンジュゲートされ、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１８Ｃに由来するグリココンジュゲートは、ＴＴにコンジュゲートされ、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＤＴにコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、上記免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の８～２０種の異なる血清型を含む。一実施形態においては、上記免疫原性組成物は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０種の異なる血清型に由来するグリココンジュゲートを含む。
一実施形態においては、上記免疫原性組成物は、１６または２０種の異なる血清型に由来するグリココンジュゲートを含む。
１つの実施形態においては、上記免疫原性組成物は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。１つの実施形態においては、上記免疫原性組成物は、１４、１５、１６、１７、１８、または１９価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。１つの実施形態においては、上記免疫原性組成物は、１６価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。１つの実施形態においては、上記免疫原性組成物は、１９価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。
１．１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、上記のセクション１．３．４に記載のグリココンジュゲートなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
２．別の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、上記のポイント１に加えて、上記のセクション１．３．２に開示されたものなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
３．別の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、上記のポイント１または２に加えて、上記のセクション１．３．３に開示されたものなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
４．別の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、上記のポイント１、２または３に加えて、上記のセクション１．３．５に開示されたものなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
５．別の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、上記のポイント１、２、３または４に加えて、上記のセクション１．３．６に開示されたものなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
６．別の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、上記のポイント１、２、３、４または５に加えて、上記のセクション１．３．７に開示されたものなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
７．別の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、上記のポイント１、２、３、４、５または６に加えて、上記のセクション１．３．８に開示されたものなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む。
８．別の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、上記のポイント１、２、３、４、５、６または７に加えて、上記のセクション１．３．１に記載のグリココンジュゲートなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来するグリココンジュゲートを含む。
９．別の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、上記のポイント１、２、３、４、５、６、７または８に加えて、上記のセクション１．３．１に記載のグリココンジュゲートなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、５および７Ｆに由来するグリココンジュゲートを含む。
１０．別の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、上記のポイント１、２、３、４、５、６、７、８または９に加えて、上記のセクション１．３．１に記載のグリココンジュゲートなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａおよび１９Ａに由来するグリココンジュゲートを含む。
１１．別の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、上記のポイント１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０に加えて、上記のセクション１．３．１に記載のグリココンジュゲートなどの、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３に由来するグリココンジュゲートを含む。
１つの実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するグリココンジュゲートを含む。
１つの実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するグリココンジュゲートを含む。
１つの実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するコンジュゲートされたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）糖類を含む。
１つの実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するコンジュゲートされたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）糖類を含む。
１つの実施形態においては、本発明の免疫原性組成物のグリココンジュゲートは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するグリココンジュゲートからなる。１つの実施形態においては、本発明の免疫原性組成物のグリココンジュゲートは、血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するグリココンジュゲートからなる。１つの実施形態においては、本発明の免疫原性組成物のグリココンジュゲートは、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するグリココンジュゲートからなる。１つの実施形態においては、本発明の免疫原性組成物のグリココンジュゲートは、１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するグリココンジュゲートからなる。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物のグリココンジュゲートは全て（例えば、上記のポイント１～１１のいずれかの）、担体タンパク質に個別にコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、上記のポイント８～１１のいずれかのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および／または２３Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＰＤに個別にコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、上記のポイント８～１１のいずれかのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１８Ｃに由来するグリココンジュゲートは、ＴＴにコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、上記のポイント８～１１のいずれかのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＤＴにコンジュゲートされている。
上記のポイント８～１１のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および／または２３Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＰＤに個別にコンジュゲートされ、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１８Ｃに由来するグリココンジュゲートは、ＴＴにコンジュゲートされ、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＤＴにコンジュゲートされている。
上記のポイント１～１１のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来するグリココンジュゲートはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記のポイント２～１１のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来するグリココンジュゲートはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記のポイント３～１１のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来するグリココンジュゲートはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記のポイント４～１１のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲートはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記のポイント５～１１のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来するグリココンジュゲートはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記のポイント６～１１のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来するグリココンジュゲートはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記のポイント７～１１のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来するグリココンジュゲートはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記のポイント８～１１のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来するグリココンジュゲートはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記のポイント９～１１のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、５および７Ｆに由来するグリココンジュゲートはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記のポイント１０～１１のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａおよび１９Ａに由来するグリココンジュゲートはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記のポイント１１の１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３に由来するグリココンジュゲートはＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、上記のポイント１～１１の免疫原性組成物のグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７に個別にコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１２～２０種の異なる血清型を含む。一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０種の異なる血清型に由来するグリココンジュゲートを含む。一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、１６または２０種の異なる血清型に由来するグリココンジュゲートを含む。
１つの実施形態において、上記のポイント１～１１の免疫原性組成物は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。１つの実施形態において、上記のポイント１～１１の免疫原性組成物は、１５、１６、１７、１８または１９価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。１つの実施形態において、上記のポイント１～１１の免疫原性組成物は、１６価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。１つの実施形態において、上記のポイント１～１１の免疫原性組成物は、１９価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。
担体タンパク質への莢膜多糖のコンジュゲーション後、グリココンジュゲートを、様々な技術により精製する（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化する）。これらの技術としては、濃縮／透析濾過操作、沈降／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過が挙げられる（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１８４０７２号またはＷＯ２００８／０７９６５３を参照されたい）。個々のグリココンジュゲートを精製した後、それらを混合して、本発明の免疫原性組成物を製剤化する。
１．５ 本発明のグリココンジュゲートのさらなる組合せ
１つの実施形態において、上記のセクション１．４で定義された免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｖに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４で定義された免疫原性組成物のいずれかは、９Ｖおよび４、９Ｖおよび６Ｂ、９Ｖおよび１４、９Ｖおよび１８Ｃ、９Ｖおよび１９Ｆ、９Ｖおよび２３Ｆからなる群から選択されるそれぞれ２種のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型のうちの少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４で定義された免疫原性組成物のいずれかは、それぞれ７種の下記のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型：９Ｖ、４、６Ｂ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆのうちの少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４で定義された免疫原性組成物のいずれかは、それぞれ８種の下記のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型：
９Ｖおよび１および４および６Ｂおよび１４および１８Ｃおよび１９Ｆおよび２３Ｆ、
９Ｖおよび４および５および６Ｂおよび１４および１８Ｃおよび１９Ｆおよび２３Ｆ、または
９Ｖおよび４および６Ｂおよび７Ｆおよび１４および１８Ｃおよび１９Ｆおよび２３Ｆ
のうちの少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４で定義された免疫原性組成物のいずれかは、それぞれ１０種の下記のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型：９Ｖ、１、５、４、６Ｂ、７Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆのうちの少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４で定義された免疫原性組成物のいずれかは、それぞれ１１種の下記のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型：
９Ｖおよび１および４および５および６Ａおよび６Ｂおよび７Ｆおよび１４および１８Ｃおよび１９Ｆおよび２３Ｆまたは
９Ｖおよび１および４および５および６Ｂおよび７Ｆおよび１４および１８Ｃおよび１９Ａおよび１９Ｆおよび２３Ｆ
のうちの少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４で定義された免疫原性組成物のいずれかは、それぞれ１２種の下記のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型：９Ｖ、１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆのうちの少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４で定義された免疫原性組成物のいずれかは、それぞれ１３種の下記のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型：９Ｖ、１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆのうちの少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４で定義された免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４で定義された免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１７Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４で定義された免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２０に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４で定義された免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４で定義された免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む。
好ましくは、上記免疫原性組成物のグリココンジュゲートは全て、担体タンパク質に個別にコンジュゲートされている。
上記免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｖに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、５および７Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａおよび１９Ａに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３に由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２に由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１７Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２０に由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。上記免疫原性組成物のいずれかの１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎに由来するグリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７にコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、上記免疫原性組成物のグリココンジュゲートは全て、ＣＲＭ１９７に個別にコンジュゲートされている。
別の実施形態においては、上記免疫原性組成物のいずれかのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｖに由来するグリココンジュゲートは、ＰＤに個別にコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、上記免疫原性組成物のいずれかのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および／または２３Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＰＤに個別にコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、上記免疫原性組成物のいずれかのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１８Ｃに由来するグリココンジュゲートは、ＴＴにコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、上記免疫原性組成物のいずれかのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＤＴにコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、上記免疫原性組成物のいずれかのストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および／または２３Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＰＤに個別にコンジュゲートされ、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１８Ｃに由来するグリココンジュゲートは、ＴＴにコンジュゲートされ、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆに由来するグリココンジュゲートは、ＤＴにコンジュゲートされている。
１つの実施形態において、上記免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の７～２５種の異なる血清型を含む。一実施形態においては、上記免疫原性組成物は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５種の異なる血清型に由来するグリココンジュゲートを含む。一実施形態においては、上記免疫原性組成物は、１６または２０種の異なる血清型に由来するグリココンジュゲートを含む。１つの実施形態において、上記免疫原性組成物は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。１つの実施形態において、上記免疫原性組成物は、１４、１５、１６、１７、１８または１９価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。１つの実施形態において、上記免疫原性組成物は、１６価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。１つの実施形態において、上記免疫原性組成物は、１９価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。１つの実施形態において、上記免疫原性組成物は、２０価の肺炎球菌コンジュゲート組成物である。
担体タンパク質への莢膜多糖のコンジュゲーション後、グリココンジュゲートを、様々な技術により精製する（多糖－タンパク質コンジュゲートの量に関して富化する）。これらの技術としては、濃縮／透析濾過操作、沈降／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過が挙げられる（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１８４０７２号またはＷＯ２００８／０７９６５３を参照されたい）。個々のグリココンジュゲートを精製した後、それらを混合して、本発明の免疫原性組成物を製剤化する。
１．６ 本発明のグリココンジュゲートの特定の組合せ
１つの実施形態において、上記のセクション１．４または１．５で定義された免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎに由来する莢膜糖類を含まない。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４または１．５で定義された免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ａに由来する莢膜糖類を含まない。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４または１．５で定義された免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｌに由来する莢膜糖類を含まない。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４または１．５で定義された免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎおよび９Ａに由来する莢膜糖類を含まない。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４または１．５で定義された免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎおよび９Ｌに由来する莢膜糖類を含まない。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４または１．５で定義された免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ａおよび９Ｌに由来する莢膜糖類を含まない。
１つの実施形態において、上記のセクション１．４または１．５で定義された免疫原性組成物のいずれかは、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎ、９Ａおよび９Ｌに由来する莢膜糖類を含まない。
２ 免疫原性組成物の用量
各用量中のグリココンジュゲートの量は、典型的なワクチン被接種者において有意な有害副作用なしに免疫保護応答を誘導する量として選択される。そのような量は、用いられる特定の免疫原およびそれが提示される方法に応じて変化する。
２．１ グリココンジュゲートの量
免疫原性組成物中の特定のグリココンジュゲートの量を、そのコンジュゲートの総多糖（コンジュゲート化および非コンジュゲート化）に基づいて算出することができる。例えば、２０％の遊離多糖を含むグリココンジュゲートは、１００μｇの多糖用量中、約８０μｇのコンジュゲート化多糖および約２０μｇの非コンジュゲート化多糖を有する。グリココンジュゲートの量は、肺炎球菌血清型に応じて変化してもよい。糖類の濃度を、ウロン酸アッセイによって決定することができる。
免疫原性組成物中の様々な多糖成分の「免疫原性量」は、異なっていてもよく、それぞれ、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇ、約７０μｇ、約８０μｇ、約９０μｇ、または約１００μｇの任意の特定の多糖抗原を含んでもよい。
一般に、各用量は、所与の血清型について０．１μｇ～１００μｇの多糖、特に、０．５μｇ～２０μｇ、より特には、１．０μｇ～１０μｇ、さらにより特に好ましくは、２．０μｇ～５．０μｇを含む。上記範囲のいずれかの中の任意の全整数が、本開示の実施形態として企図される。
１つの実施形態において、各用量は、それぞれの特定のグリココンジュゲートについて約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．４μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．２μｇ、約５．４μｇ、約５．６μｇ、約５．８μｇまたは約６．０μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび／または３３Ｆに由来するグリココンジュゲートについて、約１．１μｇ、約１．２μｇ、約１．３μｇ、約１．４μｇ、約１．５μｇ、約１．６μｇ、約１．７μｇ、約１．８μｇ、約１．９μｇ、約２．０μｇ、約２．１μｇ、約２．２μｇ、約２．３μｇ、約２．４μｇ、約２．５μｇ、約２．６μｇ、約２．７μｇ、約２．８μｇ、約２．９μｇ、または約３．０μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび／または３３Ｆに由来するグリココンジュゲートについて、約１．１μｇ、約１．２μｇ、約１．３μｇ、約１．４μｇ、約１．５μｇ、約１．６μｇ、約１．７μｇ、約１．８μｇ、約１．９μｇ、約２．０μｇ、約２．１μｇ、約２．２μｇ、約２．３μｇ、約２．４μｇ、約２．５μｇ、約２．６μｇ、約２．７μｇ、約２．８μｇ、約２．９μｇ、または約３．０μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．４μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０、約５．２μｇ、約５．４μｇ、約５．６μｇ、約５．８μｇ、または約６．０μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するそれぞれのグリココンジュゲートについて、約１．５μｇ～約３．０μｇの多糖、ならびにストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて、約３．０μｇ～約６．０μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するそれぞれのグリココンジュゲートについて、約２．０μｇ～約２．５μｇの多糖、ならびにストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて、約４．０μｇ～約４．８μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するそれぞれのグリココンジュゲートに由来する、約２．２μｇの多糖、ならびにストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて、約４．４μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するそれぞれのグリココンジュゲートについて、約１．５μｇ～約３．０μｇの多糖、ならびにストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて、約３μｇ～約６μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するそれぞれのグリココンジュゲートについて、約２．０μｇ～約２．５μｇの多糖、ならびにストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて、約４．０μｇ～約４．８μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するそれぞれのグリココンジュゲートに由来する約２．２μｇの多糖、ならびにストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて、約４．４μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するそれぞれのグリココンジュゲートについて、約１．５μｇ～約３．０μｇの多糖、ならびにストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて、約３．０μｇ～約６．０μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するそれぞれのグリココンジュゲートについて、約２．０μｇ～約２．５μｇの多糖、ならびにストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて、約４．０μｇ～約４．８μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するそれぞれのグリココンジュゲートに由来する、約２．２μｇの多糖、ならびにストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて、約４．４μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するそれぞれのグリココンジュゲートについて、約１．５μｇ～約３．０μｇの多糖、ならびにストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて、約３．０μｇ～約６．０μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するそれぞれのグリココンジュゲートについて、約２．０μｇ～約２．５μｇの多糖、ならびにストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて、約４．０μｇ～約４．８μｇの多糖を含む。
１つの実施形態において、各用量は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するそれぞれのグリココンジュゲートに由来する約２．２μｇの多糖、ならびにストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて、約４．４μｇの多糖を含む。
２．２ 担体の量
一般に、各用量は、１０μｇ～１５０μｇの担体タンパク質、特に、１５μｇ～１００μｇの担体タンパク質、より特には、２５μｇ～７５μｇの担体タンパク質、さらにより特には、４０μｇ～６０μｇの担体タンパク質を含む。１つの実施形態において、前記担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
１つの実施形態において、各用量は、約２５μｇ、約２６μｇ、約２７μｇ、約２８μｇ、約２９μｇ、約３０μｇ、約３１μｇ、約３２μｇ、約３３μｇ、約３４μｇ、約３５μｇ、約３６μｇ、約３７μｇ、約３８μｇ、約３９μｇ、約４０μｇ、約４１μｇ、約４２μｇ、約４３μｇ、約４４μｇ、約４５μｇ、約４６μｇ、約４７μｇ、約４８μｇ、約４９μｇ、約５０μｇ、約５１μｇ、約５２μｇ、約５３μｇ、約５４μｇ、約５５μｇ、約５６μｇ、約５７μｇ、約５８μｇ、約５９μｇ、約６０μｇ、約６１μｇ、約６２μｇ、約６３μｇ、約６４μｇ、約６５μｇ、約６６μｇ、約６７μｇ、約６８μｇ、約６９μｇ、約７０μｇ、約７１μｇ、約７２μｇ、約７３μｇ、約７４μｇまたは約７５μｇの担体タンパク質を含む。１つの実施形態において、前記担体タンパク質はＣＲＭ１９７である。
３ さらなる抗原
本発明の免疫原性組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）糖類抗原（グリココンジュゲート）を含む。それらはまた、他の病原体、特に、細菌および／またはウイルスに由来する抗原をさらに含んでもよい。好ましいさらなる抗原は、ジフテリアトキソイド（Ｄ）、破傷風トキソイド（Ｔ）、典型的には無細胞性（Ｐａ）である百日咳抗原（Ｐ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原、コンジュゲート化ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖類（Ｈｉｂ）、不活化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）から選択される。
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、Ｄ－Ｔ－Ｐａを含む。１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、Ｄ－Ｔ－Ｐａ－Ｈｉｂ、Ｄ－Ｔ－Ｐａ－ＩＰＶまたはＤ－Ｔ－Ｐａ－ＨＢｓＡｇを含む。１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、Ｄ－Ｔ－Ｐａ－ＨＢｓＡｇ－ＩＰＶまたはＤ－Ｔ－Ｐａ－ＨＢｓＡｇ－Ｈｉｂを含む。１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、Ｄ－Ｔ－Ｐａ－ＨＢｓＡｇ－ＩＰＶ－Ｈｉｂを含む。
百日咳抗原：ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は、百日咳を引き起こす。ワクチン中の百日咳抗原は細胞性（全細胞、不活化ボルデテラ・ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）細胞の形態）または無細胞性である。細胞性百日咳抗原の調製は、文書で十分に立証されている（例えば、それをボルデテラ・ペルツシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のフェーズＩ培養物の熱不活化により得ることができる）。しかしながら、好ましくは、本発明は無細胞性抗原を用いる。無細胞性抗原を用いる場合、１つ、２つまたは（好ましくは）３つの以下の抗原：（１）解毒された百日咳毒素（百日咳トキソイド、またはＰＴ）；（２）線維性ヘマグルチニン（ＦＨＡ）；（３）ペルタクチン（６９キロダルトン外膜タンパク質としても知られる）を用いることが好ましい。ＦＨＡおよびペルタクチンを、本発明による使用の前にホルムアルデヒドで処理することができる。ＰＴを、好ましくは、ホルムアルデヒドおよび／またはグルタルアルデヒドを用いる処理により解毒する。無細胞性百日咳抗原を、好ましくは、１つまたは複数のアルミニウム塩アジュバント上に吸着させる。代替手段として、それらを非吸着状態で添加してもよい。ペルタクチンを添加する場合、それは水酸化アルミニウムアジュバント上に既に吸着されていることが好ましい。ＰＴおよびＦＨＡを、水酸化アルミニウムアジュバントまたはリン酸アルミニウム上に吸着させることができる。ＰＴ、ＦＨＡおよびペルタクチンの全部の水酸化アルミニウムへの吸着が最も好ましい。
不活化ポリオウイルスワクチン：ポリオウイルスは急性灰白髄炎を引き起こす。経口ポリオウイルスワクチンを用いるよりもむしろ、本発明の好ましい実施形態はＩＰＶを用いる。患者に投与する前に、ポリオウイルスを不活化する必要があり、これを、ホルムアルデヒドを用いる処理により達成することができる。急性灰白髄炎は、３つの型のポリオウイルスのうちの１つにより引き起こされ得る。３つの型は類似しており、同一の症状を引き起こすが、それらは抗原的に異なり、１つの型による感染は他の型による感染に対して保護しない。したがって、本発明においては３つのポリオウイルス抗原を用いることが好ましい：ポリオウイルス１型（例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ株）、ポリオウイルス２型（例えば、ＭＥＦ－１株）、およびポリオウイルス３型（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ株）。このウイルスを、好ましくは個別に増殖させ、精製し、不活化した後、混合して、本発明と共に使用するためのバルク三価混合物を得る。
ジフテリアトキソイド：コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）はジフテリアを引き起こす。ジフテリア毒素を（例えば、ホルマリンまたはホルムアルデヒドを用いて）処理して、注射後、特定の抗毒素抗体を誘導する能力を保持しながら毒性を除去することができる。これらのジフテリアトキソイドは、ジフテリアワクチン中で用いられる。好ましいジフテリアトキソイドは、ホルムアルデヒド処理により調製されるものである。ジフテリアトキソイドを、増殖培地中でコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）を増殖させた後、ホルムアルデヒドで処理し、限外濾過し、沈降させることにより得ることができる。次いで、トキソイド化された材料を、滅菌濾過および／または透析を含むプロセスにより処理することができる。ジフテリアトキソイドを、好ましくは、水酸化アルミニウムアジュバント上に吸着させる。
破傷風トキソイド：クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）は破傷風を引き起こす。破傷風毒素を処理して、保護トキソイドを得ることができる。トキソイドは破傷風ワクチン中で用いられる。好ましい破傷風トキソイドは、ホルムアルデヒド処理により調製されるものである。破傷風トキソイドを、増殖培地中でクロストリジウム・テタニ（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）を増殖させた後、ホルムアルデヒドで処理し、限外濾過し、沈降させることにより得ることができる。次いで、材料を、滅菌濾過および／または透析を含むプロセスにより処理することができる。
Ａ型肝炎ウイルス抗原：Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は、ウイルス性肝炎を引き起こす公知の因子の１つである。好ましいＨＡＶ成分は不活化ウイルスに基づくものであり、不活化はホルマリン処置により達成することができる。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ウイルス性肝炎を引き起こす公知の因子の１つである。キャプシドの主成分は、ＨＢＶ表面抗原として知られるタンパク質であり、またはより一般的には、典型的には約２４ｋＤａの分子量を有する２２６アミノ酸のポリペプチドであるＨＢｓＡｇである。全ての存在するＢ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇを含有し、この抗原を正常なワクチン被接種者に投与する場合、それはＨＢＶ感染に対して保護する抗ＨＢｓＡｇ抗体の産生を刺激する。
ワクチン製造のために、ＨＢｓＡｇは２つの方法で作製されてきた：慢性Ｂ型肝炎キャリアの血漿からの粒子状形態の抗原の精製または組換えＤＮＡ法によるタンパク質の発現（例えば、酵母細胞中での組換え発現）。天然のＨＢｓＡｇ（すなわち、血漿精製産物中として）と違って、酵母により発現されるＨＢｓＡｇは一般的にはグリコシル化されておらず、これは本発明と共に使用するためのＨＢｓＡｇの最も好ましい形態である。
コンジュゲート化ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型抗原：ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型（Ｈｉｂ）は、細菌性髄膜炎を引き起こす。Ｈｉｂワクチンは、典型的には莢膜糖類抗原に基づくものであり、その調製は文書で十分に立証されている。Ｈｉｂ糖類を担体タンパク質にコンジュゲートさせて、特に、子供におけるその免疫原性を増強することができる。典型的な担体タンパク質は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ＣＲＭ１９７、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、およびＢ血清群髄膜炎菌に由来する外膜タンパク質複合体である。コンジュゲートの糖類部分は、Ｈｉｂ細菌から調製される完全長ポリリボシルリビトールリン酸（ＰＲＰ）および／または完全長ＰＲＰの断片を含んでもよい。Ｈｉｂコンジュゲートを、アルミニウム塩アジュバントに吸着させても、またはさせなくてもよい。
１つの実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、コンジュゲート化ナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ莢膜糖類（ＭｅｎＹ）、および／またはコンジュゲート化ナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ莢膜糖類（ＭｅｎＣ）をさらに含む。
１つの実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、コンジュゲート化ナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ莢膜糖類（ＭｅｎＡ）、コンジュゲート化ナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５莢膜糖類（ＭｅｎＷ１３５）、コンジュゲート化ナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ莢膜糖類（ＭｅｎＹ）、および／またはコンジュゲート化ナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ莢膜糖類（ＭｅｎＣ）をさらに含む。
１つの実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、コンジュゲート化ナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５莢膜糖類（ＭｅｎＷ１３５）、コンジュゲート化ナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ莢膜糖類（ＭｅｎＹ）、および／またはコンジュゲート化ナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ莢膜糖類（ＭｅｎＣ）をさらに含む。
４ アジュバント
いくつかの実施形態においては、本明細書に開示される免疫原性組成物は、少なくとも１つ、２つまたは３つのアジュバントをさらに含んでもよい。用語「アジュバント」とは、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を指す。抗原は、主に送達系として、主に免疫モジュレータとして作用するか、またはその両方の強力な特徴を有してもよい。好適なアジュバントとしては、ヒトを含む哺乳動物における使用にとって好適なものが挙げられる。
ヒトにおいて用いることができる公知の好適な送達系型アジュバントの例としては、限定されるものではないが、ミョウバン（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、リン酸カルシウム、リポソーム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖ三オレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５））などの水中油乳濁液、モンタニドなどの油中水乳濁液、およびポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧ）マイクロ粒子またはナノ粒子が挙げられる。
１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバントとしてアルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）を含む。好ましい実施形態においては、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバントとしてリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムを含む。１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、０．１ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬまたは０．２ｍｇ／ｍＬ～０．３ｍｇ／ｍＬの、リン酸アルミニウムの形態のアルミニウム元素を含む。１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、約０．２５ｍｇ／ｍＬの、リン酸アルミニウムの形態のアルミニウム元素を含む。
ヒトにおいて用いることができる公知の好適な免疫調節型アジュバントの例としては、限定されるものではないが、アクイラ（Ａｑｕｉｌｌａ）の木の樹皮に由来するサポニン抽出物（ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡ）、ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ）、３ＤＭＰＬ（３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ）またはＧＬＡ－ＡＱなどのＴＬＲ４アゴニスト、ＬＴ／ＣＴ変異体、様々なインターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２）またはＧＭ－ＣＳＦなどのサイトカインその他が挙げられる。
ヒトにおいて用いることができる送達および免疫調節の両方を特徴とする公知の好適な免疫調節型アジュバントの例としては、限定されるものではないが、ＩＳＣＯＭＳ（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．６４：７１３；ＷＯ９０／０３１８４、ＷＯ９６／１１７１１、ＷＯ００／４８６３０、ＷＯ９８／３６７７２、ＷＯ００／４１７２０、ＷＯ２００６／１３４４２３およびＷＯ２００７／０２６１９０を参照されたい）またはＴＬＲ４アゴニストと水中油乳濁液との組合せであるＧＬＡ－ＥＭが挙げられる。
限定されるものではないが、動物実験などの獣医学的適用のためには、当業者であれば、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバント（ＩＦＡ）、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル－ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ－ＰＥと呼ばれる）、ならびに２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０乳濁液中に細菌から抽出される３つの成分、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコール酸および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有するＲＩＢＩを用いることができる。
本明細書に開示される肺炎球菌ワクチンの有効性を増強するためのさらなる例示的アジュバントとしては、限定されるものではないが、（１）例えば、（ａ）より大きい粒径の乳濁液を生成するためにサブミクロン乳濁液中にマイクロ流体化された、またはボルテックスされた１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ－ＭＤＰを含有するＳＡＦ、および（ｂ）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤＥＴＯＸ（商標））などの１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）などの、水中油乳濁液製剤（ムラミルペプチド（下記参照）または細菌細胞壁成分などの他の特異的免疫刺激剤を含む、または含まない）；（２）ＱＳ２１、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）、ＡＢＩＳＣＯ（登録商標）（Ｉｓｃｏｎｏｖａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、または用いることができるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）またはさらなる界面活性剤を含まなくてもよいＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）などのそれから生成される粒子（例えば、ＷＯ００／０７６２１）などのサポニンアジュバント；（３）完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ）および不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１２（例えば、ＷＯ９９／４４６３６））、インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン；（５）場合により、肺炎球菌糖類と共に用いられる場合（例えば、ＷＯ００／５６３５８を参照されたい）、ミョウバンの実質的な非存在下にあるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、ＧＢ－２２２０２２１、ＥＰ０６８９４５４を参照されたい）；（６）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油乳濁液との組合せ（例えば、ＥＰ０８３５３１８、ＥＰ０７３５８９８、ＥＰ０７６１２３１を参照されたい）；（７）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（例えば、ＷＯ９９／５２５４９を参照されたい）；（８）オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１２０７）またはオクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤（例えば、ＷＯ０１／２１１５２）；（９）サポニンおよび免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（例えば、ＷＯ００／６２８００）；（１０）免疫刺激剤および金属塩の粒子（例えば、ＷＯ００／２３１０５を参照されたい）；（１１）サポニンおよび水中油乳濁液（例えば、ＷＯ９９／１１２４１）；（１２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（場合により、＋ステロール）（例えば、ＷＯ９８／５７６５９）；（１３）組成物の効能を増強するための免疫刺激剤として作用する他の物質が挙げられる。ムラミルペプチドとしては、Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－トレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－２５アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ノル－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミニル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミンＭＴＰ－ＰＥ）などが挙げられる。
本発明の１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、アジュバントとしてＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で用いられるＣｐＧオリゴヌクレオチドとは、免疫刺激ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）を指し、したがって、これらの用語は、別途指摘しない限り互換的に用いられる。免疫刺激ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、場合により、ある特定の好ましい塩基の文脈内で、非メチル化シトシン－グアニンジヌクレオチドである、１つまたは複数の免疫刺激ＣｐＧモチーフを含有する。ＣｐＧ免疫刺激モチーフのメチル化状態は、一般に、ジヌクレオチド中のシトシン残基を指す。少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する免疫刺激オリゴヌクレオチドは、３’グアニンにリン酸結合により連結された５’非メチル化シトシンを含有し、トール様受容体９（ＴＬＲ－９）への結合により免疫系を活性化するオリゴヌクレオチドである。別の実施形態においては、免疫刺激オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有してもよく、これらはＣｐＧモチーフがメチル化されていない場合ほど強くないが、ＴＬＲ９により免疫系を活性化する。ＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドは、順に、ＣｐＧジヌクレオチドを包含してもよい１つまたは複数のパリンドロームを含んでもよい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、いくつかの発行された特許、公開された特許出願、および他の刊行物、例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；および第６，３３９，０６８号に記載されている。
本発明の１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ＷＯ２０１０／１２５４８０の３頁、２２行目～１２頁、３６行目に記載された任意のＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。
異なるクラスのＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドが同定されている。これらのものは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＰクラスと呼ばれ、ＷＯ２０１０／１２５４８０の３頁、２２行目～１２頁、３６行目により詳細に記載されている。本発明の方法は、これらの異なるクラスのＣｐＧ免疫刺激オリゴヌクレオチドの使用を包含する。
本発明の１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ＡクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明の「Ａクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、以下の核酸配列：５’ＧＧＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧ３’（配列番号１）を有する。Ａクラスのオリゴヌクレオチドのいくつかの非限定例としては、５’Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＿Ｇ＿Ａ＿Ｃ＿Ｇ＿Ａ＿Ｃ＿Ｇ＿Ｔ＿Ｃ＿Ｇ＿Ｔ＿Ｇ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ３’（配列番号２）（式中、「＊」はホスホロチオエート結合を指し、「＿」はホスホジエステル結合を指す）が挙げられる。
本発明の１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態においては、本発明における使用のためのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも式：５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４３’（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はヌクレオチドである）により表されるＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドである。一実施形態においては、Ｘ２はアデニン、グアニン、またはチミンである。別の実施形態においては、Ｘ３はシトシン、アデニン、またはチミンである。
本発明のＢクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列は、上記に広く記載されたもの、ならびにＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１８８１０ならびに米国特許第６，１９４，３８８号；第６，２０７，６４６号；第６，２１４，８０６号；第６，２１８，３７１号；第６，２３９，１１６号；および第６，３３９，０６８号に開示されたものである。例示的な配列としては、限定されるものではないが、これらの後者の出願および特許に開示されたものが挙げられる。
１つの実施形態において、本発明の「Ｂクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、以下の核酸配列：
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＣＴＴＴＴ３’（配列番号３）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＴＴＴＴ３’（配列番号４）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’（配列番号５）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ３’（配列番号６）、または５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＣＧＡ３’（配列番号７）
を有する。
これらの配列のいずれかにおいて、全ての結合は全てホスホロチオエート結合であってもよい。別の実施形態においては、これらの配列のいずれかにおいて、１つまたは複数の結合は、好ましくは、セミソフトＣｐＧオリゴヌクレオチドを作るＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」の間のホスホジエステルであってもよい。これらの配列のいずれかにおいて、エチル－ウリジンまたはハロゲンは、５’Ｔに置き換わってもよい；ハロゲン置換の例としては、限定されるものではないが、ブロモ－ウリジンまたはヨード－ウリジン置換が挙げられる。
Ｂクラスのオリゴヌクレオチドのいくつかの非限定例としては、
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号８）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号９）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号１０）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ３’（配列番号１１）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ａ３’（配列番号１２）
（式中、「＊」はホスホロチオエート結合を指す）が挙げられる。
本発明の１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ＣクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、本発明の「Ｃクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、以下の核酸配列：
５’ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１３）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１４）、または
５’ＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１５）、または
５’ＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１６）、または
５’ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１７）、または
５’ＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１８）、または
５’ＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号１９）、または
５’ＴＣＧＣＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号２０）、または
５’ＴＣＧＣＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号２１）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号２２）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧ３’（配列番号２３）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧ３’（配列番号２４）、または
５’ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＴ３’（配列番号２５）
を有する。
これらの配列のいずれかにおいて、全ての結合は全てホスホロチオエート結合であってもよい。別の実施形態においては、これらの配列のいずれかにおいて、１つまたは複数の結合は、好ましくは、セミソフトＣｐＧオリゴヌクレオチドを作るＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」の間のホスホジエステルであってもよい。
Ｃクラスのオリゴヌクレオチドのいくつかの非限定例としては、
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号２６）、または５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号２７）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号２８）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号２９）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３０）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３１）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３２）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３３）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３４）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３５）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３６）、または
５’Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号３７）、または
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ３’（配列番号３８）
（式中、「＊」はホスホロチオエート結合を指し、「＿」はホスホジエステル結合を指す）が挙げられる。これらの配列のいずれかにおいて、エチル－ウリジンまたはハロゲンは５’Ｔに置き換わってもよい；ハロゲン置換の例としては、限定されるものではないが、ブロモ－ウリジンまたはヨード－ウリジン置換が挙げられる。
本発明の１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ＰクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、本発明における使用のためのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’ＴＬＲ活性化ドメインと、少なくとも２つのパリンドローム領域とを含有するＰクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドであって、一方のパリンドローム領域が、少なくとも６ヌクレオチド長の５’パリンドローム領域であり、直接的に、またはスペーサーを介して少なくとも８ヌクレオチド長の３’パリンドローム領域に接続されいる、少なくとも１つのＹｐＲジヌクレオチドを含むＣｐＧオリゴヌクレオチドである。１つの実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ（配列番号２７）ではない。一実施形態においては、ＰクラスのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、ＴＬＲ活性化ドメインは、ＴＣＧ、ＴＴＣＧ、ＴＴＴＣＧ、ＴＹｐＲ、ＴＴＹｐＲ、ＴＴＴＹｐＲ、ＵＣＧ、ＵＵＣＧ、ＵＵＵＣＧ、ＴＴＴ、またはＴＴＴＴである。さらに別の実施形態においては、ＴＬＲ活性化ドメインは、５’パリンドローム領域内にある。別の実施形態においては、ＴＬＲ活性化ドメインは、５’パリンドローム領域のすぐ５’側にある。
１つの実施形態において、本発明の「Ｐクラス」のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、以下の核酸配列：５’ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ３’（配列番号３９）を有する。
前記配列において、全ての結合は、全てホスホロチオエート結合であってもよい。別の実施形態において、１つまたは複数の結合は、好ましくは、セミソフトＣｐＧオリゴヌクレオチドを作るＣｐＧモチーフの「Ｃ」と「Ｇ」との間のホスホジエステルであってもよい。これらの配列のいずれかにおいて、エチル－ウリジンまたはハロゲンは５’Ｔに置き換わってもよい；ハロゲン置換の例としては、限定されるものではないが、ブロモ－ウリジンまたはヨード－ウリジン置換が挙げられる。
Ｐクラスのオリゴヌクレオチドの非限定例としては、
５’Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｃ＿Ｇ＊Ａ＊Ｔ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＿Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ３’（配列番号４０）
（式中、「＊」はホスホロチオエート結合を指し、「＿」はホスホジエステル結合を指す）を含む。
一実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合である。別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホジエステル様結合を含む。別の実施形態においては、ホスホジエステル様結合は、ホスホジエステル結合である。別の実施形態においては、親油性基をオリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせる。一実施形態においては、親油性基はコレステロールである。
１つの実施形態において、本明細書に開示されるＣｐＧオリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル結合（ＷＯ２００７／０２６１９０に記載された「ソフト」オリゴヌクレオチド）である。別の実施形態においては、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、分解に耐性にされる（例えば、安定化される）。「安定化されたオリゴヌクレオチド」とは、ｉｎ ｖｉｖｏでの分解（例えば、エキソまたはエンドヌクレアーゼによる）に比較的耐性であるオリゴヌクレオチドを指す。核酸安定化を、骨格改変により達成することができる。ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、最大活性を生じ、細胞内エキソおよびエンドヌクレアーゼによる分解からオリゴヌクレオチドを保護する。
免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合とホスホロチオエート結合との組合せを有するキメラ骨格を有してもよい。本発明の目的では、キメラ骨格とは、部分的に安定化された骨格であって、少なくとも１つのヌクレオチド間結合がホスホジエステルまたはホスホジエステル様であり、少なくとも１つの他のヌクレオチド間結合が安定化されたヌクレオチド間結合であり、少なくとも１つのホスホジエステルまたはホスホジエステル様結合と、少なくとも１つの安定化された結合とが異なるものである、骨格を指す。ホスホジエステル結合がＣｐＧモチーフ内に優先的に配置される場合、そのような分子は、ＷＯ２００７／０２６１９０に記載されたような「セミソフト」と呼ばれる。
他の改変オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および／またはｐ－エトキシ結合の組合せを含む。
混合骨格改変ＯＤＮを、ＷＯ２００７／０２６１９０に記載のように合成することができる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのサイズ（すなわち、オリゴヌクレオチドの長さに沿ったヌクレオチド残基の数）は、オリゴヌクレオチドの刺激活性にも寄与し得る。細胞中への取込みを容易にするために、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、好ましくは、６ヌクレオチドの残基の最小の長さを有する。より大きいオリゴヌクレオチドは細胞内で分解されるため、十分な免疫刺激モチーフが存在する場合、６ヌクレオチドを超える任意のサイズのオリゴヌクレオチド（多くのｋｂ長であっても）は、免疫応答を誘導することができる。ある特定の実施形態においては、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、６～１００ヌクレオチド長、好ましくは、８～３０ヌクレオチド長である。重要な実施形態においては、本発明の核酸およびオリゴヌクレオチドは、プラスミドまたは発現ベクターではない。
１つの実施形態において、本明細書に開示されるＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＷＯ２００７／０２６１９０の段落１３４～１４７に記載されたような塩基および／または糖などにおける、置換または改変を含む。
１つの実施形態において、本発明のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、化学的に改変される。化学的改変の例は、当業者には公知であり、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎら（１９９０）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３；Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＵＳＡ １９９３；Ｃｒｏｏｋｅら（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３６：１０７～１２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒら（１９９５）Ｍｏｄ．Ｓｙｎｔｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ７：３３１～４１７に記載されている。本発明によるオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の改変を有してもよく、ここで、各改変は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡから構成される同じ配列のオリゴヌクレオチドと比較して、特定のホスホジエステルヌクレオシド間架橋および／または特定のβ－Ｄ－リボース単位および／または特定の天然ヌクレオシド塩基位置に位置する。
本発明のいくつかの実施形態においては、ＣｐＧ含有核酸を、当業者には公知の方法（例えば、ＷＯ０３／０２４４８０を参照されたい）に従って免疫原性担体と単純に混合することができる。
本発明の特定の実施形態においては、本明細書に開示される任意の免疫原性組成物は、２μｇ～１００ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは、０．１ｍｇ～５０ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは、０．２ｍｇ～１０ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは、０．３ｍｇ～５ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは、０．３ｍｇ～５ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは、０．５～２ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは、０．７５～１．５ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施形態においては、本明細書に開示される任意の免疫原性組成物は、約１ｍｇのＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む。
５ 製剤
本発明の免疫原性組成物を、液体形態（すなわち、溶液もしくは懸濁液）または凍結乾燥形態で製剤化することができる。液体製剤は、有利には、その包装された形態から直接的に投与することができ、したがって、本発明の凍結乾燥組成物について別途必要とされるような水性媒体中での復元を必要とせず、注射にとって理想的である。
本発明の免疫原性組成物の製剤を、当技術分野で認識される方法を用いて達成することができる。例えば、個々の肺炎球菌コンジュゲートを、生理的に許容できるビヒクルと共に製剤化して、組成物を調製することができる。そのようなビヒクルの例としては、限定されるものではないが、水、緩衝塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびデキストロース溶液が挙げられる。
本開示は、本明細書に開示されるグリココンジュゲートの任意の組合せと、薬学的に許容できる賦形剤、担体、または希釈剤とを含む免疫原性組成物を提供する。
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、液体形態、好ましくは、水性液体形態にある。
本開示の免疫原性組成物は、緩衝液、塩、二価陽イオン、非イオン性界面活性剤、糖などの凍結防止剤、フリーラジカルスカベンジャーもしくはキレート剤などの酸化防止剤のうちの１つもしくは複数、またはその任意の複数の組合せを含んでもよい。
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、緩衝液を含む。１つの実施形態において、前記緩衝液は、約３．５～約７．５のｐＫａを有する。いくつかの実施形態においては、緩衝液は、リン酸、コハク酸、ヒスチジンまたはクエン酸である。ある特定の実施形態においては、緩衝液は最終濃度１ｍＭ～１０ｍＭのコハク酸である。１つの特定の実施形態においては、コハク酸緩衝液の最終濃度は約５ｍＭである。
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、塩を含む。いくつかの実施形態においては、塩は塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムおよびその組合せからなる群から選択される。１つの特定の実施形態においては、塩は塩化ナトリウムである。１つの特定の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
１つの実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、界面活性剤を含む。１つの実施形態において、界面活性剤は、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（商標）２０）、ポリソルベート４０（ＴＷＥＥＮ（商標）４０）、ポリソルベート６０（ＴＷＥＥＮ（商標）６０）、ポリソルベート６５（ＴＷＥＥＮ（商標）６５）、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（商標）８０）、ポリソルベート８５（ＴＷＥＥＮ（商標）８５）、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｎ－１０１、ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ－１００、オキシトキシノール（ｏｘｔｏｘｙｎｏｌ）４０、ノノキシノール－９、トリエタノールアミン、トリエタノールアミンポリペプチドオレエート、ポリオキシエチレン－６６０ヒドロキシステアレート（ＰＥＧ－１５、Ｓｏｌｕｔｏｌ Ｈ１５）、ポリオキシエチレン－３５－リシノレエート（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）ＥＬ）、大豆レシチンおよびポロキサマーからなる群から選択される。１つの特定の実施形態においては、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。いくつかの前記実施形態においては、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、少なくとも０．０００１％～１０％重量／重量（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０である。いくつかの前記実施形態においては、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、少なくとも０．００１％～１％重量／重量（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０である。いくつかの前記実施形態においては、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、少なくとも０．０１％～１％重量／重量（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０である。他の実施形態においては、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％または０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０である。別の実施形態においては、製剤中のポリソルベート８０の最終濃度は、１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０である。
ある特定の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、５．５～７．５のｐＨ、より好ましくは、５．６～７．０のｐＨ、さらにより好ましくは、５．８～６．０のｐＨを有する。
一実施形態においては、本発明は、本明細書に開示される免疫原性組成物のいずれかを充填された容器を提供する。一実施形態においては、容器は、バイアル、シリンジ、フラスコ、発酵器、バイオリアクター、バッグ、ジャー、アンプル、カートリッジおよび使い捨て型ペンからなる群から選択される。ある特定の実施形態においては、容器はシリコン処理されている。
１つの実施形態において、本発明の容器は、ガラス、金属（例えば、スチール、ステンレススチール、アルミニウムなど）および／またはポリマー（例えば、熱可塑性物質、エラストマー、熱可塑性エラストマー）から作られている。１つの実施形態において、本発明の容器は、ガラスから作られている。
一実施形態においては、本発明は、本明細書に開示される免疫原性組成物のいずれかを充填されたシリンジを提供する。ある特定の実施形態においては、シリンジはシリコン処理されている、および／またはガラスから作られている。
注射のための本発明の免疫原性組成物の典型的な用量は、０．１ｍＬ～２ｍＬ、より好ましくは、０．２ｍＬ～１ｍＬ、さらにより好ましくは、約０．５ｍＬの容量を有する。
したがって、上記で定義された容器またはシリンジは、０．１ｍＬ～２ｍＬ、より好ましくは、０．２ｍＬ～１ｍＬ、さらにより好ましくは、約０．５ｍＬの容量の本明細書で定義される任意の免疫原性組成物を充填される。
６ 本発明の免疫原性組成物の使用
１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、薬剤としての使用のためのものである。
本明細書に記載の免疫原性組成物を、対象における細菌感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善するための様々な治療的または予防的方法において用いることができる。特に、本明細書に記載の免疫原性組成物を用いて、対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善することができる。
かくして、一態様において、本発明は、対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連する感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善する方法であって、対象に、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。
いくつかのそのような実施形態において、感染、疾患または状態は、肺炎、副鼻腔炎、中耳炎、急性中耳炎、髄膜炎、菌血症、敗血症、膿胸、結膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、乳様突起炎、蜂巣炎、軟組織感染および脳膿瘍からなる群から選択される。
１つの実施形態において、本発明は、対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。
１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ワクチンとしての使用のためのものである。そのような実施形態においては、本明細書に記載の免疫原性組成物を用いて、対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染を防止することができる。かくして、一態様において、本発明は、対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を防止する方法であって、対象に、免疫学的に有効な量の本発明の免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。いくつかのそのような実施形態においては、感染は、肺炎、副鼻腔炎、中耳炎、急性中耳炎、髄膜炎、菌血症、敗血症、膿胸、結膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、乳様突起炎、蜂巣炎、軟組織感染および脳膿瘍からなる群から選択される。一態様において、ワクチン接種される対象は、ヒト、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシまたはイヌなどの哺乳動物である。
一態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連する感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善する方法における使用のためのものである。いくつかのそのような実施形態においては、感染、疾患または状態は、肺炎、副鼻腔炎、中耳炎、急性中耳炎、髄膜炎、菌血症、敗血症、膿胸、結膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、乳様突起炎、蜂巣炎、軟組織感染および脳膿瘍からなる群から選択される。
１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ワクチンとしての使用のためのものである。そのような実施形態においては、本明細書に記載の免疫原性組成物を用いて、対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染を防止することができる。かくして、一態様において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を防止する方法における使用のためのものである。いくつかのそのような実施形態においては、感染は、肺炎、副鼻腔炎、中耳炎、急性中耳炎、髄膜炎、菌血症、敗血症、膿胸、結膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、心内膜炎、腹膜炎、心膜炎、乳様突起炎、蜂巣炎、軟組織感染および脳膿瘍からなる群から選択される。一態様において、ワクチン接種される対象は、ヒト、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシまたはイヌなどの哺乳動物である。
本発明の免疫原性組成物を用いて、全身経路または粘膜経路を介して免疫原性組成物を投与することにより、肺炎球菌感染に感受性であるヒトを防止する、または処置することができる。１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、筋肉内、腹腔内、皮内、または皮下経路により投与される。１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下注射により投与される。１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、筋肉内または皮下注射により投与される。
１つの実施形態において、対象に投与された場合、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにより測定された場合、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ、１５Ａおよび／または１５Ｃに結合することができる抗体の形成を誘導することができる。１つの実施形態において、対象に投与された場合、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにより測定された場合、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂおよび１５Ｃに結合することができる抗体の形成を誘導することができる。
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）法においては、ワクチン接種された対象の血清に由来する抗体を、固相支持体に吸着させた多糖と共にインキュベートする。結合した抗体を、酵素コンジュゲート化二次検出抗体を用いて検出する。
１つの実施形態において、前記標準的なＥＬＩＳＡアッセイは、「Ｔｒａｉｎｉｎｇ ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ（Ｐｎ ＰＳ ＥＬＩＳＡ）」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅ．ｕａｂ．ｅｄｕ／ＥＬＩＳＡ％２０ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｐｄｆでアクセス可能；２０１４年３月３１日にアクセスされた）においてＷＨＯにより定義された標準化された（ＷＨＯ）ＥＬＩＳＡアッセイである。
ＥＬＩＳＡによって、ヒト血清中に存在する、型特異的ＩｇＧ抗ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）莢膜多糖（ＰＳ）抗体を測定する。ヒト血清の希釈液を型特異的莢膜ＰＳ被覆マイクロタイタープレートに添加する場合、その莢膜ＰＳに特異的な抗体がマイクロタイタープレートに結合する。プレートに結合した抗体を、ヤギ抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼ標識抗体、次いで、ｐ－ニトロフェニルリン酸基質を用いて検出する。着色された最終産物の光密度は、血清中に存在する抗莢膜ＰＳ抗体の量に比例する。
１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定された場合、少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３、０．３５、０．４または０．５μｇ／ｍｌの濃度でストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ多糖に結合することができる、ヒトにおけるＩｇＧ抗体を惹起することができる。
１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定された場合、少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３、０．３５、０．４または０．５μｇ／ｍｌの濃度でストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃ多糖に結合することができる、ヒトにおけるＩｇＧ抗体を惹起することができる。
１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、ＥＬＩＳＡアッセイにより決定された場合、少なくとも０．０５、０．１、０．２、０．３、０．３５、０．４または０．５μｇ／ｍｌの濃度でストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂおよび１５Ｃ多糖に結合することができる、ヒトにおけるＩｇＧ抗体を惹起することができる。
１つの実施形態において、対象に投与された場合、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、本明細書に開示されるオプソニン貪食作用アッセイにおいてストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂを殺傷することができる抗体の形成を誘導することができる。
１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、本明細書に開示されるＯＰＡアッセイ（実施例１２のＯＰＡアッセイなど）において試験した場合、コンジュゲートされていない天然のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖を用いて得られるＯＰＡ力価よりも高いＯＰＡ力価を有する。
１つの実施形態において、対象に投与された場合、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、本明細書に開示されるオプソニン貪食作用アッセイ（実施例１２のＯＰＡアッセイなど）においてストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃを殺傷することができる抗体の形成を誘導することができる。１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、本明細書に開示されるＯＰＡアッセイ（実施例１２のＯＰＡアッセイなど）において試験した場合、コンジュゲートされていない天然のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖を用いて得られるＯＰＡ力価よりも高いＯＰＡ力価を有する。
機能的抗体および補体の存在下での食作用エフェクター細胞によるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細胞の殺傷を測定する、肺炎球菌オプソニン貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）は、肺炎球菌ワクチンの有効性を評価するための重要な代理物であると考えられる。
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細胞、試験される熱不活化ヒト血清、分化したＨＬ－６０細胞（食細胞）および外来補体源（例えば、子ウサギ補体）の混合物と一緒にインキュベートすることにより、オプソニン貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）を行うことができる。オプソニン貪食作用は、インキュベーションの間に進行し、抗体および補体で被覆された細菌細胞は、オプソニン貪食作用の際に殺傷される。オプソニン貪食作用を逃れる生存細菌のコロニー形成単位（ｃｆｕ）は、アッセイ混合物を塗布することにより決定される。ＯＰＡ力価は、試験血清を含まない対照ウェルに対して細菌計数の５０％の減少をもたらす希釈率の逆数と定義される。ＯＰＡ力価は、この５０％の殺傷のカットオフを挟む２つの希釈率から内挿される。
１：８またはそれ以上の終点力価は、これらの殺傷型ＯＰＡにおける陽性の結果と考えられる。
１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、オプソニン貪食作用殺傷アッセイ（ＯＰＡ）により決定される場合、少なくとも５０％の対象においてストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに対する少なくとも１：８の力価を惹起することができる。１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、オプソニン貪食作用殺傷アッセイ（ＯＰＡ）により決定される場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９３％の対象においてストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに対する少なくとも１：８の力価を惹起することができる。
１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、オプソニン貪食作用殺傷アッセイ（ＯＰＡ）により決定される場合、少なくとも５０％の対象においてストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃに対する少なくとも１：８の力価を惹起することができる。１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、オプソニン貪食作用殺傷アッセイ（ＯＰＡ）により決定される場合、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％の対象においてストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃに対する少なくとも１：８の力価を惹起することができる。
さらなる態様において、本開示は、対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／または１５Ｃと関連するストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、疾患または状態を処置する、または防止する方法であって、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む、本開示の任意の免疫原性組成物の治療的または予防的に有効な量を投与するステップを含む方法を提供する。１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、対象に投与された場合、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ、１５Ａおよび／または１５Ｃに結合することができる抗体の形成を誘導する。１つの実施形態において、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の免疫原性組成物は、対象に投与された場合、本明細書に開示されるオプソニン貪食作用アッセイ（実施例１２のＯＰＡアッセイなど）においてストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ、１５Ｃおよび／または１５Ａを殺傷することができる抗体の形成を誘導する。
本開示の一実施形態は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃによる感染に対して対象を保護する方法、またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃによる感染を防止する方法、またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃにより引き起こされる感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減する、もしくはその開始を遅延させる方法であって、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む、本開示の任意の免疫原性組成物の免疫原性量を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示の一実施形態は、対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／または１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／または１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）と関連するストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、疾患または状態を処置する、または防止する方法であって、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む、本開示の任意の免疫原性組成物の治療的または予防的に有効な量を対象に投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態は、対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／または１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／または１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）と関連するストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、疾患または状態を処置する、または防止する方法であって、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む、本開示の任意の免疫原性組成物からポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を生成すること、および対象に対する受動免疫を付与するために前記抗体調製物を使用することを含む方法を提供する。
一実施形態においては、本開示は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染に対して対象を保護する、および／またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を防止する、および／またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減する、もしくはその開始を遅延させる、および／またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）による感染に対して対象を保護する、および／またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）による感染を防止する、および／またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）により引き起こされる感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減する、もしくはその開始を遅延させるための薬剤の製造のための、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の任意の免疫原性組成物の使用に関する。
一実施形態においては、本開示は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染に対して対象を保護する、および／またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を防止する、および／またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減する、もしくはその開始を遅延させる、および／またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）による感染に対して対象を保護する、および／またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）による感染を防止する、および／またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）により引き起こされる感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減する、もしくはその開始を遅延させるための、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート（上記のセクション１．３．４のグリココンジュゲートなど）を含む本開示の任意の免疫原性組成物の使用に関する。
７ 本発明の免疫原性組成物を用いて処置される対象
本明細書に開示されるように、本明細書に記載の免疫原性組成物を、対象における細菌感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善するための様々な治療的または予防的方法において用いることができる。
好ましい実施形態においては、前記対象はヒトである。最も好ましい実施形態においては、前記対象は、新生児（すなわち、３カ月齢より下）、乳児（すなわち、３カ月齢～１歳）または幼児（すなわち、１歳～４歳）である。
１つの実施形態において、本明細書に開示される免疫原性組成物は、ワクチンとしての使用のためのものである。
そのような実施形態においては、ワクチン接種される対象は、１歳未満の年齢であってもよい。例えば、ワクチン接種される対象は、約１カ月齢、約２カ月齢、約３カ月齢、約４カ月齢、約５カ月齢、約６カ月齢、約７カ月齢、約８カ月齢、約９カ月齢、約１０カ月齢、約１１カ月齢または約１２カ月齢であってもよい。１つの実施形態においては、ワクチン接種される対象は、約２、約４または約６カ月齢である。別の実施形態においては、ワクチン接種される対象は、２歳未満の年齢である。例えば、ワクチン接種される対象は、約１２～約１５カ月齢であってもよい。いくつかの場合、わずか１回用量の本発明による免疫原性組成物が必要であるが、いくつかの状況下では、第２、第３または第４の用量を与えてもよい（以下のセクション８を参照されたい）。
本発明の１つの実施形態において、ワクチン接種される対象は、５０歳またはそれ以上の成人、より好ましくは、５５歳またはそれ以上の成人である。１つの実施形態において、ワクチン接種される対象は、６５歳もしくはそれ以上、７０歳もしくはそれ以上、７５歳もしくはそれ以上、または８０歳もしくはそれ以上の成人である。
１つの実施形態において、ワクチン接種される対象は、免疫障害を有する個体、特に、ヒトである。免疫障害を有する個体は、一般に、感染性因子によるチャレンジに対して正常な体液性または細胞性防御を高める能力が減衰または低下した人と定義される。
本発明の１つの実施形態において、ワクチン接種される免疫障害を有する対象は、免疫系を減弱させる疾患または状態に罹患し、肺炎球菌疾患に対して保護する、またはそれを処置するのに不十分である抗体応答をもたらす。
１つの実施形態において、前記疾患は、原発性免疫不全障害である。好ましくは、前記原発性免疫不全障害は、混合ＴおよびＢ細胞免疫不全、抗体欠損、明確に定義された症候群、免疫脱調節疾患、食細胞障害、自然免疫不全、自己炎症障害、および補体欠損からなる群から選択される。１つの実施形態において、前記原発性免疫不全障害は、ＷＯ２０１０／１２５４８０の２４頁、１１行目～２５頁、１９行目に開示されたものから選択される。
本発明の特定の実施形態においては、ワクチン接種される免疫障害を有する対象は、ＨＩＶ感染、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、がん、慢性心臓または肺障害、鬱血性心不全、糖類尿病、慢性肝疾患、アルコール依存症、肝硬変、髄液漏、心筋症、慢性気管支炎、肺気腫、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脾臓機能障害（鎌状赤血球症など）、脾臓機能の欠如（無脾症）、血液悪性腫瘍、白血病、多発性硬化症、ホジキン病、リンパ腫、腎不全、ネフローゼ症候群および喘息からなる群から選択される疾患に罹患する。
本発明の１つの実施形態において、ワクチン接種される免疫障害を有する対象は、栄養不良に罹患する。
本発明の特定の実施形態においては、ワクチン接種される免疫障害を有する対象は、感染に対する身体の耐性を低下させる薬物または処置を受けている。１つの実施形態において、前記薬物は、ＷＯ２０１０／１２５４８０の２６頁、３３行目～２６頁、４行目に開示されたものから選択される。
本発明の特定の実施形態においては、ワクチン接種される免疫障害を有する対象は、喫煙者である。
本発明の特定の実施形態においては、ワクチン接種される免疫障害を有する対象は、５ｘ１０９細胞／リットルより下、または４ｘ１０９細胞／リットルより下、または３ｘ１０９細胞／リットルより下、または２ｘ１０９細胞／リットルより下、または１ｘ１０９細胞／リットルより下、または０．５ｘ１０９細胞／リットルより下、または０．３ｘ１０９細胞／リットルより下、または０．１ｘ１０９細胞／リットルより下の白血球数（白血球算定）を有する。
白血球数（白血球算定）：血液中の白血球（ＷＢＣ）の数。ＷＢＣは通常、ＣＢＣ（完全血球算定）の一部として測定される。白血球は、血液中の感染と戦う細胞であり、赤血球として知られる赤い（酸素運搬）血液細胞と異なる。好中球（多形核白血球；ＰＭＮ）、桿状球（わずかに未熟な好中球）、Ｔ型リンパ球（Ｔ細胞）、Ｂ型リンパ球（Ｂ細胞）、単球、好酸球、好塩基球などの、異なる型の白血球が存在する。全ての型の白血球が白血球数に反映される。白血球数の正常な範囲は通常、血液１立方ミリメートルあたり４，３００～１０，８００個の細胞である。これはまた、白血球算定と言うこともでき、４．３～１０．８ｘ１０９細胞／リットルの国際単位で表すことができる。
本発明の特定の実施形態においては、ワクチン接種される免疫障害を有する対象は、好中球減少症に罹患する。本発明の特定の実施形態においては、ワクチン接種される免疫障害を有する対象は、２ｘ１０９細胞／リットルより下、または１ｘ１０９細胞／リットルより下、または０．５ｘ１０９細胞／リットルより下、または０．１ｘ１０９細胞／リットルより下、または０．０５ｘ１０９細胞／リットルより下の好中球数を有する。
低い白血球数または「好中球減少症」は、循環血液中の異常に低レベルの好中球を特徴とする状態である。好中球は、感染を防止し、それと戦うのを助ける特定の種類の白血球である。がん患者が好中球減少症を経験する最も一般的な理由は、化学療法の副作用としてのものである。化学療法により誘導される好中球減少症は、患者の感染リスクを増大させ、がん処置を中断させる。
本発明の特定の実施形態においては、ワクチン接種される免疫障害を有する対象は、５００／ｍｍ３より下のＣＤ４＋細胞数、または３００／ｍｍ３より下のＣＤ４＋細胞数、または２００／ｍｍ３より下のＣＤ４＋細胞数、または１００／ｍｍ３より下のＣＤ４＋細胞数、または７５／ｍｍ３より下のＣＤ４＋細胞数、または５０／ｍｍ３より下のＣＤ４＋細胞数を有する。
ＣＤ４細胞試験は通常、１ｍｍ３中の細胞数として報告される。正常なＣＤ４計数は５００～１，６００であり、ＣＤ８計数は３７５～１，１００である。ＣＤ４計数はＨＩＶを有する人々においては劇的に低下する。
本発明の１つの実施形態において、本明細書に開示される任意の免疫障害を有する対象は、ヒト男性またはヒト女性である。
８ レジメン
いくつかの場合、わずか１回用量の本発明による免疫原性組成物が必要であるが、より高い免疫不全の状態などの、いくつかの状況下では、第２、第３または第４の用量を与えてもよい。初回ワクチン接種後、対象は、十分に間隔を空けた１回または数回の追加免疫を受けてもよい。
１つの実施形態において、本発明による免疫原性組成物のワクチン接種のスケジュールは、単回用量である。特定の実施形態においては、前記単回用量スケジュールは、少なくとも２歳の年齢である健康な人々のためのものである。
１つの実施形態において、本発明による免疫原性組成物のワクチン接種のスケジュールは、複数回用量スケジュールである。特定の実施形態においては、前記複数回用量スケジュールは、約１カ月～約２カ月の間隔で隔てられた２回用量シリーズからなる。特定の実施形態においては、前記複数回用量スケジュールは、約１カ月の間隔で隔てられた２回用量シリーズ、または約２カ月の間隔で隔てられた２回用量シリーズからなる。
別の実施形態においては、前記複数回用量スケジュールは、約１カ月～約２カ月の間隔で隔てられた３回用量シリーズからなる。別の実施形態においては、前記複数回用量スケジュールは、約１カ月の間隔で隔てられた３回用量シリーズ、または約２カ月の間隔で隔てられた３回用量シリーズからなる。
別の実施形態においては、前記複数回用量スケジュールは、約１カ月～約２カ月の間隔で隔てられた３回用量シリーズ、およびそれに続く、１回目の用量の約１０カ月～約１３カ月後の４回目の用量からなる。別の実施形態においては、前記複数回用量スケジュールは、約１カ月の間隔で隔てられた３回用量シリーズ、およびそれに続く、１回目の用量の約１０カ月～約１３カ月後の４回目の用量、または約２カ月の間隔で隔てられた３回用量シリーズ、およびそれに続く、１回目の用量の約１０カ月～約１３カ月後の４回目の用量からなる。
１つの実施形態において、複数回用量スケジュールは、１歳目に少なくとも１回の用量（例えば、１、２または３回用量）、およびそれに続く、少なくとも１回の幼児用量からなる。
１つの実施形態において、複数回用量スケジュールは、２カ月齢で開始する、約１カ月～約２カ月の間隔で隔てられた２回もしくは３回用量シリーズ（例えば、投与間は２８～５６日）、およびそれに続く、１２～１８カ月齢での幼児用量からなる。１つの実施形態において、前記複数回用量スケジュールは、２カ月齢で開始する、約１カ月～約２カ月の間隔で隔てられた３回用量シリーズ（例えば、用量間は２８～５６日）、およびそれに続く、１２～１５カ月齢での幼児用量からなる。別の実施形態においては、前記複数回用量スケジュールは、２カ月齢で開始する、約２カ月の間隔で隔てられた２回用量シリーズ、およびそれに続く、１２～１８カ月齢での幼児用量からなる。
１つの実施形態において、複数回用量スケジュールは、２、４、６、および１２～１５カ月齢での４回用量シリーズのワクチンからなる。
１つの実施形態において、初回用量は、０日目に与えられ、１回または複数回の追加は、約２～約２４週間の範囲の間隔で、好ましくは４～８週間の投与間隔で与えられる。
１つの実施形態において、初回用量は、０日目に与えられ、追加は約３カ月後に与えられる。
本明細書で用いられる用語「約」は、記述される濃度範囲、時間枠、分子量、温度またはｐＨなどの、ある値の統計的に意味のある範囲内にあることを意味する。そのような範囲は、所与の値または範囲の１桁分以内、典型的には、２０％以内、より典型的には、１０％以内、さらにより典型的には、５％以内、または１％以内にあってもよい。時には、そのような範囲は、所与の値または範囲の測定および／または決定のために用いられる標準的な方法に典型的な実験誤差の範囲内にあってもよい。用語「約」により包含される許容し得る変動は、試験下の特定のシステムに依存し、当業者であれば容易に理解することができる。範囲がこの適用の範囲内で記載される場合はいつでも、範囲内の全ての全整数も本開示の実施形態として企図される。
本明細書における用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、それぞれ、例ごとに、用語「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」と置換可能であってもよいと本発明者らによって意図される。
本特許明細書内で引用される全ての参考文献または特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明を、添付の実施例に例示する。以下の実施例は、別途詳細に記載される場合を除いて、当業者には周知であり、日常的である標準的な技術を用いて実行される。実施例は例示的なものであるが、本発明を限定するものではない。
（実施例１）
ｅＴＥＣ結合されたグリココンジュゲートの調製のための一般的プロセス
シスタミンジヒドロクロリドによる糖類の活性化およびチオール化
糖類を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元させる。溶液の湿度含量を、Ｋａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）分析により決定し、０．１％～０．４％、典型的には、０．２％の湿度含量に達するように調整する。
活性化を開始させるために、１，１’－カルボニル－ジ－１，２，４－トリアゾール（ＣＤＴ）または１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）の溶液を、ＤＭＳＯ中、１００ｍｇ／ｍＬの濃度で新鮮に調製する。糖類を、様々な量のＣＤＴ／ＣＤＩ（１～１０モル当量）で活性化し、２３±２℃で１時間、反応を進行させる。活性化レベルを、ＨＰＬＣにより決定することができる。シスタミンジヒドロクロリドを、５０ｍｇ／ｍＬの濃度に無水ＤＭＳＯ中で新鮮に調製する。活性化された糖類を、１モル当量（ｍｏｌ．ｅｑ．）のシスタミンジヒドロクロリドと反応させる。あるいは、活性化された糖類を、１ｍｏｌ．ｅｑ．のシステアミンヒドロクロリドと反応させる。チオール化反応を、２３±２℃で２１±２時間進行させて、チオール化された糖類を生産する。チオール化レベルを、添加された量のＣＤＴ／ＣＤＩにより決定する。
活性化反応溶液中の残留ＣＤＴ／ＣＤＩを、１００ｍＭ四ホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．０溶液の添加によりクエンチする。計算を実施して、添加される四ホウ酸の量を決定し、最終湿度含量が総水性のうちの１～２％となるように調整する。
活性化されたチオール化された糖類の還元および精製
チオール化された糖類の反応混合物を、０．９％塩水、ｐＨ６．０中の予め冷却した５ｍＭのコハク酸ナトリウムへの添加により１０倍に希釈し、５μｍフィルターを通して濾過する。チオール化された糖類の透析濾過を、４０倍の透析容量のＷＦＩに対して実施する。１０％容量の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０により希釈した後、保持液に、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、１～５ｍｏｌ．ｅｑ．の溶液を添加する。この還元反応を、５±３℃で２０±２時間進行させる。活性化されたチオール化された糖類の精製を、好ましくは、予め冷却した１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、ｐＨ４．３に対して限外濾過／透析濾過により実施する。あるいは、チオール化された糖類を、標準的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）手順またはイオン交換クロマトグラフィー法により精製する。活性化されたチオール化された糖類の保持液のアリコートを取って、糖類濃度を決定し、チオール含量（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを行う。
活性化されたチオール化された糖類の代替的な還元および精製
また、上記の精製手順に対する代替として、活性化されたチオール化された糖類を、以下のように精製した。
チオール化された糖類の反応混合物に、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の溶液、５～１０ｍｏｌ．ｅｑ．を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させた。次いで、反応混合物を、０．９％塩水、ｐＨ６．０中の予め冷却した５ｍＭコハク酸ナトリウムへの添加により５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化された糖類の透析濾過を、予め冷却した１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、ｐＨ４．３の４０倍透析容量を用いて実施した。活性化されたチオール化された糖類の保持液のアリコートを取って、糖類濃度を決定し、チオール含量（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイを行った。
ブロモアセチル化担体タンパク質の活性化および精製
担体タンパク質の遊離アミノ基を、ブロモ酢酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）、ブロモアセチルブロミド、または別の好適な試薬などのブロモアセチル化剤との反応によりブロモアセチル化する。
担体タンパク質（０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０±０．２中）を、活性化の前にまず、約ｐＨ７で、８±３℃で保持する。タンパク質溶液に、ストックジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）の形のブロモ酢酸のＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＡＮＳ）を、０．２５～０．５の比のＢＡＡＮＳ：タンパク質（ｗ／ｗ）で添加する。反応物を、５±３℃で３０～６０分間、穏やかに混合する。得られるブロモアセチル化（活性化）されたタンパク質を、例えば、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）緩衝液を用いた１０ｋＤａのＭＷＣＯ膜を用いる限外濾過／透析濾過により精製する。精製後、ブロモアセチル化された担体タンパク質のタンパク質濃度を、Ｌｏｗｒｙのタンパク質アッセイにより見積もる。
活性化の程度を、抑制電導度検出（イオンクロマトグラフィー）と共役させたイオン交換液体クロマトグラフィーによる総ブロミドアッセイにより決定する。活性化されたブロモアセチル化されたタンパク質上の結合したブロミドを、アッセイ試料調製物中のタンパク質から切断し、存在し得る任意の遊離ブロミドと共に定量する。タンパク質上に残存する共有的に結合した臭素は全て、アルカリ２－メルカプトエタノール中で試料を加熱することにより、イオン性ブロミドへの変換により遊離させる。
ブロモアセチル化されたＣＲＭ１９７の活性化および精製
ＣＲＭ１９７を、１０ｍＭリン酸緩衝化０．９％ＮａＣｌ ｐＨ７（ＰＢＳ）を用いて５ｍｇ／ｍＬに希釈した後、１Ｍストック溶液を用いて、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．０を作製した。ＢＡＡＮＳを、２０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯのＢＡＡＮＳストック溶液を用いてＣＲＭ１９７：ＢＡＡＮＳ比１：０．３５（ｗ：ｗ）で添加した。反応混合物を３℃～１１℃で３０ｍｉｎ～１時間インキュベートした後、１０Ｋ ＭＷＣＯ膜および１０ｍＭリン酸ナトリウム／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を用いる限外濾過／透析濾過により精製した。精製された活性化されたＣＲＭ１９７を、Ｌｏｗｒｙアッセイによりアッセイして、タンパク質濃度を決定した後、ＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに希釈した。スクロースを凍結保護剤として５％ｗｔ／ｖｏｌまで添加し、活性化されたタンパク質を凍結し、コンジュゲーションのために必要となるまで－２５℃で保存した。
ＣＲＭ１９７のリシン残基のブロモアセチル化は非常に一貫しており、利用可能な３９個のリシンから１５～２５個のリシンの活性化が得られた。この反応は、高収率で活性化されたタンパク質を生じた。
ブロモアセチル化された担体タンパク質への活性化されたチオール化された糖類のコンジュゲーション
コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５℃に予め冷却する。続いて、ブロモアセチル化された担体タンパク質および活性化されたチオール化された糖類を添加し、１５０～２００ｒｐｍの撹拌速度で混合する。糖類／タンパク質の入力比は０．９±０．１である。反応のｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨ溶液で８．０±０．１に調整する。コンジュゲーション反応を２０±２時間、５℃で進行させる。
残存する反応性官能基のキャッピング
担体タンパク質上の未反応のブロモアセチル化された残基を、５℃で３時間、キャッピング試薬である２ｍｏｌ．ｅｑ．のＮ－アセチル－Ｌ－システインと反応させることによりクエンチする。残存する遊離スルフヒドリル基を、５℃で２０時間、４ｍｏｌ．ｅｑ．のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）でキャッピングする。
ｅＴＥＣ結合グリココンジュゲートの精製
コンジュゲーション反応（ポストＩＡＡキャップ）混合物を、０．４５μｍフィルターを通して濾過する。グリココンジュゲートの限外濾過／透析濾過を、５ｍＭコハク酸－０．９％塩水、ｐＨ６．０に対して実施する。次いで、グリココンジュゲート保持液を、０．２μｍフィルターを通して濾過する。グリココンジュゲートのアリコートを、アッセイのために取る。残りのグリココンジュゲートを５℃で保存する。
（実施例２）
Ｐｎ－３３Ｆ ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
活性化プロセス
Ｐｎ３３Ｆ多糖の活性化
Ｐｎ－３３Ｆ多糖を、５００ｍＭの１，２，４－トリアゾール（ＷＦＩ中）と混合して、多糖１グラムあたり１０グラムのトリアゾールを得た。混合物をドライアイス－エタノール浴中でシェル凍結した後、乾固まで凍結乾燥した。凍結乾燥された３３Ｆ多糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元させた。凍結乾燥された３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液の湿度含量を、Ｋａｒｌ Ｆｉｓｃｈｅｒ（ＫＦ）分析により決定した。３３Ｆ／ＤＭＳＯ溶液にＷＦＩを添加して、０．２％の湿度含量を達成することにより、湿度含量を調整した。
活性化を開始する前に、１，１’－カルボニル－ジ－１，２，４－トリアゾール（ＣＤＴ）を、ＤＭＳＯ溶液中、１００ｍｇ／ｍＬとして新鮮に調製した。チオール化ステップの前に、Ｐｎ３３Ｆ多糖を、様々な量のＣＤＴで活性化した。ＣＤＴ活性化を２３±２℃で１時間実行した。活性化レベルを、ＨＰＬＣ（Ａ２２０／Ａ２０５）により決定した。四ホウ酸ナトリウム、１００ｍＭ、ｐＨ９．０溶液を添加して、活性化反応溶液中に残存するＣＤＴを完全にクエンチした。計算を行って、四ホウ酸の添加される量を決定し、最終湿度含量が総水性の１．２％となるようにする。反応を２３±２℃で１時間進行させた。
活性化されたＰｎ－３３Ｆ多糖のチオール化
シスタミン－ジヒドロクロリドを、無水ＤＭＳＯ中で新鮮に調製し、１ｍｏｌ．ｅｑ．のシスタミンジヒドロクロリドを活性化された多糖反応溶液に添加した。反応を、２３±２℃で２１±３時間進行させた。チオール化された糖類溶液を、０．９％塩水、ｐＨ６．
０中の予め冷却した５ｍＭコハク酸ナトリウムへの添加により１０倍希釈した。希釈された反応溶液を、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化されたＰｎ－３３Ｆ多糖の透析濾過を、注射用水（ＷＦＩ）を用いて、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットを用いて実行した。
活性化されたチオール化されたＰｎ－３３Ｆ多糖の還元および精製
１０％容量の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０により希釈した後、保持液に、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、５ｍｏｌ．ｅｑ．の溶液を添加した。この還元反応を、２３±２℃で２±１時間進行させた。チオール化された３３Ｆ多糖の透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットを用いて実行した。透析濾過を、予め冷却した１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．３に対して実施した。チオール化された３３Ｆ多糖の保持液を、糖類濃度とチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイの両方のために取った。
活性化されたチオール化されたＰｎ－３３Ｆ多糖の代替的還元および精製
また、上記の精製手順に対する代替として、３３Ｆ活性化されチオール化された糖類を以下のように精製した。
チオール化された糖類の反応混合物に、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、５ｍｏｌ．ｅｑ．の溶液を添加し、２３±２℃で３±１時間進行させた。次いで、反応混合物を、０．９％塩水、ｐＨ６．０中の予め冷却した５ｍＭコハク酸ナトリウムへの添加により５倍希釈し、５μｍフィルターを通して濾過した。チオール化された糖類の透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットを用いて、予め冷却した１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、ｐＨ４．３の４０倍透析容量を用いて実施した。チオール化された３３Ｆ多糖保持液を、糖類濃度とチオール（Ｅｌｌｍａｎ）アッセイとの両方のために取った。活性化プロセスの流れ図を、図８（Ａ）に提供する。
コンジュゲーションプロセス
ブロモアセチル化されたＣＲＭ１９７へのチオール化されたＰｎ３３Ｆ多糖のコンジュゲーション
ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、実施例１に記載のように、ブロモアセチル化により別々に活性化した後、コンジュゲーション反応のために活性化されたＰｎ－３３Ｆ多糖と反応させた。コンジュゲーション反応を開始する前に、反応容器を５℃に予め冷却した。ブロモアセチル化されたＣＲＭ１９７とチオール化された３３Ｆ多糖を、１５０～２００ｒｐｍの撹拌速度で、反応容器中で一緒に混合した。糖類／タンパク質入力比は０．９±０．１であった。反応のｐＨを８．０～９．０に調整した。コンジュゲーション反応を、５℃で２０±２時間進行させた。
ブロモアセチル化されたＣＲＭ１９７とチオール化されたＰｎ３３Ｆ多糖上の反応性基のキャッピング
ＣＲＭ１９７タンパク質上の未反応のブロモアセチル化された残基を、５℃で３時間、２ｍｏｌ．ｅｑ．のＮ－アセチル－Ｌ－システインと反応させた後、５℃で２０時間、４ｍｏｌ．ｅｑ．のヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を用いてチオール化された３３Ｆ多糖に残存する遊離スルフヒドリル基を完全にキャッピングすることによりキャッピングした。
ｅＴＥＣ結合Ｐｎ－３３Ｆグリココンジュゲートの精製
コンジュゲーション溶液を、０．４５μｍまたは５μｍフィルターを通して濾過した。３３Ｆグリココンジュゲートの透析濾過を、３００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜カセットを用いて実行した。透析濾過を、５ｍＭコハク酸－０．９％塩水、ｐＨ６．０に対して実施した。次いで、Ｐｎ－３３Ｆグリココンジュゲート３００Ｋ保持液を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、５℃で保存した。コンジュゲーションプロセスの流れ図を、図８（Ｂ）に提供する。
結果
Ｐｎ－３３Ｆ ｅＴＥＣグリココンジュゲートのいくつかのバッチに関する反応パラメータおよび特徴付けデータを、表１に示す。シスタミンジヒドロクロリドを用いるＣＤＴ活性化－チオール化は、６３％～９０％の糖類収率および１％～１３％未満の遊離糖類を有するグリココンジュゲートを生成した。
Figure 0007059095000006
ＣＲＭ１９７に対するＰｎ－３３Ｆ ｅＴＥＣグリココンジュゲートのＯＰＡ力価
マウスにおけるＰｎ－３３ＦのＯＰＡ力価を、標準的な条件下で決定した（１０Ａおよび２２Ｆコンジュゲートについて以下に記載されるＯＰＡ手順と同様）。４および７週でのＯＰＡ力価（９５％ＣＩを有するＧＭＴ）を表２に示し、これは、血清型３３Ｆ Ｐｎグリココンジュゲートがマウス免疫原性モデルにおいてＯＰＡ力価を惹起したことを示している。
Figure 0007059095000007
（実施例３）
さらなるＰｎ－３３Ｆ ｅＴＥＣコンジュゲートの調製
さらなるＰｎ－３３Ｆ ｅＴＥＣコンジュゲートを、実施例２に記載のプロセスを用いて生成した。Ｐｎ－３３Ｆ ｅＴＥＣグリココンジュゲートのこれらのさらなるバッチに関する反応パラメータおよび特徴付けデータを、表３に示す。
Figure 0007059095000008
上記および表３に示されるように、上記のｅＴＥＣコンジュゲーションを用いて、いくつかのＰｎ－３３Ｆコンジュゲートを得た。ｅＴＥＣ化学反応により、高収率、低い％の遊離糖類および高いコンジュゲーション度（コンジュゲートしたリシン）を示すコンジュゲートの調製が可能になった。さらに、ｅＴＥＣコンジュゲーションプロセスを用いて８０％を超えるアセチル官能基を保持することができた。
（実施例４）
Ｐｎ－３３Ｆ ｅＴＥＣグリココンジュゲートの安定性の評価：遊離糖類の％の傾向
コンジュゲートバッチ３３Ｆ－２Ｂのアリコート（表１を参照されたい）をポリプロピレン管に分注し、それぞれ、４℃、２５℃および３７℃で保存し、遊離糖類％における傾向についてモニタリングした。データ（遊離糖類％）を表４に示す。この表に示されるように、遊離糖類％における有意な変化はなかった。
Figure 0007059095000009
また、別のコンジュゲートロット（バッチ３３Ｆ－３Ｃ）の加速安定性試験も３７℃で１カ月まで行った。表５に示されるように、３７℃で１カ月まで、遊離糖類％に対する有意な変化はなかった。
Figure 0007059095000010
ｅＴＥＣコンジュゲートの安定性をさらに確認するために、４℃で保存されたさらなるコンジュゲートバッチ（３３Ｆ－３Ｃおよび３３Ｆ－５Ｅ（表１を参照されたい））を、遊離糖類％における潜在的な傾向について、約１年までモニタリングした。表６に示されるように、約１年までの長期間にわたって４℃で保存されたコンジュゲートについて遊離糖類レベル（％）における有意な変化はなかった。
Figure 0007059095000011
３３Ｆ ｅＴＥＣ化学反応により生成された血清型３３Ｆコンジュゲートは、様々な温度における遊離糖類の傾向によりモニタリングされる（リアルタイムおよび加速）顕著な分解なしに安定であることが示された。
（実施例５）
ＣＲＭ１９７に対するＰｎ－８コンジュゲートの調製
Ｐｎ－８ ＲＡＣ／ＤＭＳＯグリココンジュゲートの調製
凍結された多糖を解凍し、反応容器に移した。２Ｍ酢酸およびＷＦＩ（注射用水）を多糖溶液に添加して、約２．５ｇ／Ｌの最終多糖濃度および０．２Ｍの最終酢酸濃度を達成した。
多糖の加水分解
天然多糖を、活性化の前に化学的に加水分解した。希釈された多糖溶液を７０℃に加熱した後、この温度を３．５時間保持した。
多糖の酸化
多糖の酸化を、過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により開始し、反応を２３℃で２０ｈ進行させ続けた。
活性化された多糖の精製
活性化された多糖を、限外濾過カセットを用いて濃縮した。透析濾過を、２０倍透析容量のＷＦＩに対して実施した。
凍結乾燥
活性化された多糖を、活性化された多糖１グラムあたり２５グラムのスクロースの比率でスクロースと混合する。活性化された糖類とスクロースとを含有するボトルを、エタノール浴中でシェル凍結し、凍結乾燥する。
ＣＲＭ１９７への活性化された多糖のコンジュゲーションおよびキャッピング
凍結乾燥された活性化された多糖を、ＤＭＳＯ中で２ｍｇ／ｍＬに復元させた。復元のために、凍結乾燥されたＣＲＭ１９７にＤＭＳＯを添加した。復元されたＣＲＭ１９７を、復元された活性化された多糖に添加した。次いで、コンジュゲーションを、反応混合物にシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加することにより開始させ、２３℃で２４ｈインキュベートした。コンジュゲーション反応の終結を、２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウムを添加することにより行う。このキャッピング反応を、２３℃で３ｈ進行させた。
コンジュゲートの精製
次いで、コンジュゲート溶液を、冷却した５ｍＭコハク酸－０．９％塩水（ｐＨ６．０）中で希釈し、濾過し、３００Ｋセルロース膜を用いて２～４ｇ／Ｌに濃縮し、第１段階の透析濾過を、５ｍＭコハク酸－０．９％塩水（ｐＨ６．０）に対して実施した。最終精製ステップを、５ｍＭコハク酸－０．９％塩水、ｐＨ６．０緩衝液を用いる透析濾過により行った。透析濾過が完了した後、精製されたコンジュゲートを、０．２２μｍフィルターを通して収集タンクに移した。
一価バルクコンジュゲートの希釈
コンジュゲートを、５ｍＭコハク酸／０．９％塩水（ｐＨ６）を用いて、０．５ｍｇ／ｍＬの標的糖類濃度にさらに希釈した。最終的な０．２２μｍの濾過ステップを完了させて、製剤のための一価バルクコンジュゲート（ＭＢＣ）産物を調製した。
様々なパラメータ（例えば、糖類－タンパク質入力比、反応物濃度およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムのＭｅｑ）を変化させることにより上記のプロセスを用いて、いくつかのコンジュゲートを得た。ＣＲＭ１９７に対する代表的なＰｎ－８グリココンジュゲートに関する特徴付けを、表７に示す。
Figure 0007059095000012
マウスにおける血清型８－ＣＲＭ１９７コンジュゲートに関するオプソニン貪食活性（ＯＰＡ）力価を、標準的な条件下（１０Ａおよび２２Ｆコンジュゲートについて以下に記載されるＯＰＡ手順と同様）、マウスにおいて決定した。様々な用量で４週でのＯＰＡ力価（９５％信頼区間（ＣＩ）を有する幾何平均力価（ＧＭＴ））を表８および表９（２つの別々の実験）に示し、これは、血清型８コンジュゲート（試料１～９；これらのコンジュゲートの特徴付けデータについては表７も参照されたい）がマウス免疫原性モデルにおいてＯＰＡ力価を惹起したことを示している。
表８に示されるように、血清型８コンジュゲートは、低い抗体力価を有する対照の非コンジュゲート化多糖と比較して、有意により高い抗体力価を有することが示された。
Figure 0007059095000013
Figure 0007059095000014
上記の還元的アミノ化プロセスにより調製されたコンジュゲートから生成された全データにより、良好なコンジュゲーション収率、低い遊離糖類％、および良好な安定性を示すコンジュゲートを調製することができることが示された。さらに、調製されたコンジュゲートは、マウス免疫原性モデルにおいて良好なＯＰＡ力価を惹起した。
（実施例６）
血清型１０Ａ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
単離されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ多糖の調製
血清型１０Ａ莢膜多糖を、当業者には公知の単離手順（例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８３８０号、第２００６／０２２８３８１号、第２００７／０１８４０７１号、第２００７／０１８４０７２号、第２００７／０２３１３４０号、および第２００８／０１０２４９８号ならびにＷＯ２００８／１１８７５２に開示された方法を参照されたい）を用いて、細菌から直接得ることができる。
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａを、種ボトル中で増殖させた後、種発酵器に移した。一度、標的光密度に達したら、細胞を生産発酵器に移した。発酵培地を、Ｎ－ラウロイルサルコシンの添加により不活化し、限外濾過および透析濾過により精製した。
単離されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ莢膜多糖の酸化
計算された容量の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）および注射用水（ＷＦＩ）を多糖溶液に添加して、必要なｐＨを約６．０に調整した場合、２．５ｇ／Ｌの最終多糖濃度および２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液の最終濃度を達成した。次いで、希釈した多糖を５℃に冷却した。０．２５モル当量（ＭＥｑ）の過ヨウ素酸ナトリウム溶液の添加により、酸化を開始させた。酸化反応時間は５℃で約４ｈであった。酸化反応を、５℃で１～２ｈの連続撹拌下で、１ＭＥｑの２，３－ブタンジオールを用いてクエンチした。
標的反応時間に達した後、活性化された多糖を、３０Ｋ ＭＷＣＯ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限外濾過カセットを用いて濃縮した。次いで、透析濾過を、２０倍透析容量のＷＦＩに対して実施した。精製された活性化された多糖を、５℃で保存した。精製された活性化された糖類を、特に、（ｉ）ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによる分子量および（ｉｉ）酸化度により特徴付ける。
活性化されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａ多糖とＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
コンジュゲーションプロセスは、以下のステップからなっていた：
ａ．スクロース賦形剤との混合、および凍結乾燥；
ｂ．凍結乾燥された多糖およびＣＲＭ１９７の復元；
ｃ．ＣＲＭ１９７への活性化された多糖のコンジュゲーションおよびキャッピング；ならびに
ｄ．コンジュゲートの精製
ａ．スクロースとの混合
活性化された多糖を、活性化された多糖１グラムあたり２５ｇのスクロースの比でスクロースと混合する。次いで、混合された混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥後、凍結乾燥された活性化された多糖を含有するボトルを、－２０℃で保存した。
ｂ．凍結乾燥された活性化された多糖とＣＲＭ１９７タンパク質の復元
凍結乾燥された活性化された多糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元させた。多糖が完全に溶解されたら、復元のために、計算されたＣＲＭ１９７に同量のＤＭＳＯを添加した。
ｃ．ＣＲＭ１９７への活性化された多糖のコンジュゲーションおよびキャッピング
復元されたＣＲＭ１９７（ＤＭＳＯ中）を、コンジュゲーション反応器中で復元された活性化された多糖に添加した。最終多糖濃度は１ｇ／Ｌである。１．２ＭＥｑのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加することにより、コンジュゲーションを実施した。反応物を２３℃で２４ｈインキュベートした。２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウムを添加することにより、コンジュゲーション反応の終結を行う。キャッピング反応を、２３℃で３ｈインキュベートした。
２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウムを添加することにより、コンジュゲーション反応の終結を行う。このキャッピング反応を、２３℃で３ｈ進行させた。
ｄ．コンジュゲートの精製
次いで、コンジュゲート溶液を、冷却した５ｍＭコハク酸－０．９％塩水（ｐＨ６．０）で５倍（容量で）に希釈し、２０Ｘ透析濾過を、５ｍＭコハク酸－０．９％塩水（ｐＨ６．０）を用いて実施した。初回の透析濾過が完了した後、コンジュゲート保持液を、０．２２μｍフィルターを通して移した。コンジュゲートを、５ｍＭコハク酸／０．９％塩水（ｐＨ６）でさらに希釈し、最終的な０．２２μｍ濾過ステップの後、それを２～８℃で保存した。
様々なパラメータ（例えば、糖類－タンパク質入力比、反応物濃度およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムのＭＥｑ）を変化させることにより上記のプロセスを用いて、いくつかのコンジュゲートを得た。上記の化学反応により、血清型１０Ａコンジュゲートを生成することが可能になり、様々な温度での遊離糖類の傾向によりモニタリングされるように（リアルタイムおよび加速）、顕著な分解なしに安定であることが示された。ＣＲＭ１９７に対する代表的なＰｎ－１０Ａグリココンジュゲートに関する特徴付けを、表１０に示す。
Figure 0007059095000015
マウスにおける血清型１０Ａ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートに関するオプソニン貪食活性（ＯＰＡ）力価を、標準的な条件下で決定した。３０匹の６～７週齢のメスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの群を、０週目に皮下経路により０．００１μｇ、０．０１μｇ、または０．１μｇの試験コンジュゲートで免疫した。３週目にマウスに同じ用量のコンジュゲートを追加接種した後、４週目に出血させた。血清型特異的ＯＰＡを４週目の血清試料に対して実施した。
オプソニン貪食活性（ＯＰＡ）アッセイを用いて、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに特異的なマウス血清中の機能的抗体を測定する。試験血清を、細菌をオプソニン化し、補体沈着を誘発し、それによって食細胞による細菌の食作用および殺傷を容易にする莢膜多糖特異的免疫グロブリンの能力を測定するアッセイ反応において設定する。ＯＰＡ力価を、試験血清を含まない対照ウェル上での細菌計数の５０％の減少をもたらす希釈率の逆数として定義する。ＯＰＡ力価を、この５０％の殺傷カットオフを挟む２つの希釈率から内挿する。ＯＰＡ手順は、以下の改変を含む、Ｈｕら（２００５）Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２（２）：２８７～２９５に記載の方法に基づくものであった。試験血清を２．５倍に連続希釈し、マイクロタイターアッセイプレートに添加した。生きた血清型１０Ａ標的細菌株をウェルに添加し、プレートを３７℃で３０分間振盪した。
分化したＨＬ－６０細胞（食細胞）および子ウサギ血清（３～４週齢、ＰＥＬ－ＦＲＥＥＺ（登録商標）、１２．５％最終濃度）をウェルに添加し、プレートを３７℃で６０分間振盪した。反応を終結させるために、８０μＬの０．９％ＮａＣｌを全てのウェルに添加し、混合し、１０μＬのアリコートを、２００μＬの水を含有するＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮ（登録商標）ＨＴＳ ＨＶフィルタープレート（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標））
のウェルに移した。液体を減圧下でプレートを通して濾過し、１５０μＬのＨＹＳＯＹ（登録商標）培地を各ウェルに添加し、濾過した。次いで、フィルタープレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、Ｄｅｓｔａｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて固定した。次いで、プレートをクマシーブルーで染色し、一度脱色した。コロニーを画像化し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＣＴＬ）（Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＯＨ）ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ上で数えた。生コロニー計数を用いて、殺傷曲線をプロットし、ＯＰＡ力価を算出した。
様々な用量で４週でのＯＰＡ力価（９５％信頼区間（ＣＩ）を有する幾何平均力価（ＧＭＴ））を表１１に示し、これは血清型１０Ａコンジュゲート（試料１～３；これらのコンジュゲートの特徴付けデータについては表１０も参照されたい）がマウス免疫原性モデルにおいてＯＰＡ力価を惹起したことを示している。表１１に示されるように、血清型１０Ａコンジュゲートは、低いＯＰＡ応答を有する対照の非コンジュゲート化多糖と比較して、有意により高いＯＰＡ力価を有することが示された。
Figure 0007059095000016
（実施例７）
ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳを用いるＰｎ血清型１２Ｆのコンジュゲーション
血清型１２Ｆ－ＣＲＭ１９７グリココンジュゲートの安定性を改善するために、第１級アルコールをアルデヒド基に酸化するための共酸化剤として２，２，６，６－テトラメチル－１－ピペリジニルオキシフリーラジカル（ＴＥＭＰＯ）およびＮ－クロロスクシンイミド（ＮＣＳ）を用いて、代替化学反応を探索した。ＧＣ／ＭＳ分析により、酸化部位が過ヨウ素酸媒介性酸化のものと異なることが示された。ＴＥＭＰＯ－ＮＣＳ酸化の場合、α－Ｄ－Ｇｌｃｐおよび２－Ｇｌｃｐが酸化されたが、過ヨウ素酸塩を用いた場合、α－Ｄ－Ｇａｌｐが主要な酸化部位であった（図４を参照されたい）。本明細書にさらに詳細に記載されるように、ＴＥＭＰＯを触媒量（０．１モル当量以下）で用いて、所望の酸化度（ＤＯ）を、用いたＮＣＳの量を変化させることにより達成した。続いて、いくつかのコンジュゲートを合成し、特徴付けた。一般に、血清型１２Ｆグリココンジュゲートの生産を、以下のように、いくつかのフェーズで実行した：
ａ）分子量５０ｋＤａ～５００ｋＤａへの血清型１２Ｆ多糖の加水分解；
ｂ）ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳによる血清型１２Ｆ多糖の活性化；
ｃ）活性化された多糖の精製；
ｄ）ＣＲＭ１９７タンパク質への活性化された血清型１２Ｆのコンジュゲーション；および
ｅ）血清型１２Ｆ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートの精製。
血清型１２Ｆの加水分解および酸化
多糖の加水分解を、典型的には、加熱しながら酸性条件下で実施して、１００ｋＤａ～３５０ｋＤａの所望の範囲の平均分子量を得た。典型的な実験を、以下に記載する。
加水分解
血清型１２Ｆ多糖溶液を、カバー付き反応容器に添加した。これに、必要な容量の０．３０Ｍ酢酸および注射用水（ＷＦＩ）を添加して、約０．１Ｍの酢酸濃度を維持した。溶液のｐＨを、１Ｎ ＮａＯＨまたは氷酢酸を用いて３．２±０．３に調整した。反応混合物の温度を、７０±５℃まで上昇させた。反応混合物を７０±５℃で９０～１２０分間撹拌した。反応混合物を２３±２℃に冷却し、１Ｍ ＮａＯＨ溶液を添加することにより中和した（ｐＨ７．０）。加水分解された多糖を、３０Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いてＷＦＩに対して限外濾過／透析濾過により精製した。溶液を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、酸化まで２～８℃で保存した。加水分解された多糖の分子量を、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳにより分析して、分子量が１００ｋＤａ～３５０ｋＤａの標的範囲を満たすことを保証した。
部分酸化
１つの実験において、マイクロフルイダイザーを用いる圧力均一化を用い、血清型１２Ｆ多糖を機械的にサイジングして、分子量を約１００ｋＤａ～５００ｋＤａに低下させた。サイジングされた多糖を４．０ｍｇ／ｍＬの濃度で反応容器に添加し、１：１ｖ／ｖの比で重炭酸／炭酸緩衝液（０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３／０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３緩衝液、ｐＨ８．６）と混合した。撹拌した混合物に、０．１モル当量以下のＴＥＭＰＯを添加した。０．６～１．０モル当量のＮＣＳの添加により、反応を開始させた。反応混合物を室温で２時間撹拌した後、３０Ｋ限外濾過膜を用いて、ＷＦＩを用いる透析濾過により活性化された多糖を精製した。精製された多糖を回収し、アルデヒド（３－メチル－２－ベノチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）アッセイを用いる）および多糖（アントロンアッセイを用いる）の定量測定により酸化度（ＤＯ）を決定した。
別の実験において、血清型１２Ｆ多糖を加水分解して、分子量を、約１００ｋＤａ～５００ｋＤａの分子量に低下させた。血清型１２Ｆ多糖を反応容器に添加し、１：１ｖ／ｖの比で０．５Ｍ ＮａＨＣＯ３／０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ８．６）と混合した。撹拌した混合物に、ＷＦＩ中に溶解した０．６～１．０モル当量のＮＣＳを添加した。ＷＦＩ中に溶解した約０．１モル当量のＴＥＭＰＯの添加により、活性化を開始させた。反応混合物を室温で２時間撹拌した後、３０Ｋ限外濾過膜を用いて、ＷＦＩを用いる透析濾過により活性化された多糖を精製した。精製された活性化された多糖を、０．２μｍフィルターを通して濾過し、使用前に４℃で保存した。
また、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ媒介性酸化を、ｐＨ６．５、７．０、７．５および８．０のリン酸ナトリウム緩衝液において実施することに成功した。いくつかの活性化実験において、ｎ－プロパノールなどの第１級アルコールを用いて試薬をクエンチして、糖類の過剰酸化を回避した。別のセットの実験において、化学的に加水分解された多糖を、限外濾過／透析濾過精製ステップを用いずに、直接的に酸化にかけた。
血清型１２Ｆ酸化多糖のコンジュゲーション
１つの実験において、精製された酸化された血清型１２Ｆ多糖を、反応容器に添加した後、０．１Ｍの最終緩衝液濃度となるように０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を添加した。この溶液に、予め凍結乾燥されたＣＲＭ１９７を添加し、完全に混合して、均一な溶液を得た。ｐＨを、希ＨＣｌまたは１Ｎ ＮａＯＨ溶液を用いて６．８に調整した。この後、１．５モル当量のＮａＣＮＢＨ３を添加した。反応混合物を、室温（２３℃）で２４時間および３７℃で２．５日間撹拌した。次いで、反応混合物を１Ｘ０．９％塩水で希釈し、未反応のアルデヒド基を２モル当量の水素化ホウ素ナトリウムで「キャッピング」した。キャッピング反応時間は３時間であった。
別の実験において、精製された活性化された血清型１２Ｆを反応容器に添加した後、０．１Ｍの最終緩衝液濃度となるように０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を添加した。この溶液に、予め凍結乾燥されたＣＲＭ１９７を添加し、完全に混合して、均一な溶液を得た。ｐＨを、希ＨＣｌまたは１Ｎ ＮａＯＨ溶液を用いて６．８に調整した。この後、３モル当量のＮａＣＮＢＨ３を添加した。反応混合物を、２３℃で２４時間および３７℃で４８ｈ撹拌した。次いで、反応混合物を１Ｘ０．９％塩水で希釈し、撹拌しながら、未反応のアルデヒド基を１モル当量の水素化ホウ素ナトリウムＮａＢＨ４で「キャッピング」した。キャッピング反応時間は３時間であった。
別の実験において、精製された活性化された血清型１２Ｆを反応容器に添加し、ＣＲＭ１９７溶液と混合した。混合物を凍結乾燥し、５ｍｇ／ｍＬの最終糖類濃度となるように０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中に粉末を溶解した。必要に応じて、希ＨＣｌまたは１Ｎ ＮａＯＨ溶液を用いて、ｐＨを６．８に調整した。この後、３モル当量のＮａＣＮＢＨ３を添加した。反応混合物を、２３℃で２４時間および３７℃で４８ｈ撹拌した。次いで、反応混合物を１Ｘ０．９％塩水で希釈し、未反応のアルデヒド基を１モル当量の水素化ホウ素ナトリウムＮａＢＨ４で「キャッピング」した。キャッピング反応時間は３時間であった。
コンジュゲーション精製
キャッピングされた反応混合物を、５μｍフィルターを用いて濾過した後、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過膜を用いて精製した。コンジュゲートを、まず、１０ｍＭコハク酸／０．９％塩水、ｐＨ６．０緩衝液を用いて透析濾過した。次いで、精製されたコンジュゲートを、０．４５／０．２２μｍフィルターを通して濾過して、バルクコンジュゲートを得た。
酸化度
血清型１２Ｆ多糖における第１級アルコールの酸化の成功を、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ系を用いて達成した。加水分解された血清型１２Ｆ多糖を、ＮＣＳ共酸化剤の量を調整することにより様々な酸化度（ＤＯ）レベルに酸化した。様々な多糖バッチおよび分子量を用いてＮＣＳの量を変化させることによるＤＯに対する効果を、図９に示す。ＤＯにおける有意な変化は２時間後でも観察されなかったため、典型的には、酸化反応は２時間以内に完了する。
いくつかの血清型１２Ｆコンジュゲートを生成し、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ酸化多糖を用いて特徴付けた。結果を、表１２にまとめる。
Figure 0007059095000017
（実施例８）
ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ酸化法を用いたＰｎ－血清型１２Ｆ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートの免疫原性
マウスにおける血清型１２Ｆ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートに関するオプソニン貪食活性（ＯＰＡ）力価を、標準的な条件下でマウスにおいて決定した。４および７週でのＯＰＡ力価（９５％信頼区間（ＣＩ）を有する幾何平均力価（ＧＭＴ））を表１３に示し、これは、血清型１２Ｆ－ＣＲＭ１９７コンジュゲート（バッチ１２Ｆ－９７Ｂ；このコンジュゲートの特徴付けデータについては、表１２も参照されたい）がマウス免疫原性モデルにおいてＯＰＡ力価を惹起したことを示している。ＴＥＭＰＯ－ＮＣＳにより生成されたコンジュゲートは、過ヨウ素酸酸化から生成された対照コンジュゲート（１７１Ｂ）よりも免疫原性が高かった。
Figure 0007059095000018
（実施例９）
Ｐｎ－１２Ｆグリココンジュゲート安定性の評価
過ヨウ素酸酸化とＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ酸化により生成されたコンジュゲートの安定性（２５℃での）の比較（図１０を参照されたい）により、Ｐｎ－１２Ｆ多糖の酸化により生成されたコンジュゲートが相対的により安定であることが示された。図１０に示されるように、経時的な遊離糖類の増加が、２５℃でのＰｎ－１２Ｆ多糖の過ヨウ素酸酸化により生成されたグリココンジュゲートについて観察された。対照的に、Ｐｎ－１２Ｆ多糖のＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ酸化を用いて調製されたグリココンジュゲートは、同様の条件下で遊離糖類に関する有意な傾向を示さなかった。
（実施例１０）
血清型１５Ｂ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
単離されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ多糖の調製
血清型１５Ｂ莢膜多糖を、当業者には公知の単離手順を用いて、細菌から直接得ることができる。ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂを、種ボトル中で増殖させた後、種発酵器に移した。一度、標的光密度に達したら、細胞を生産発酵器に移した。発酵培地を、Ｎ－ラウロイルサルコシンの添加により不活化し、限外濾過および透析濾過により精製した。
次いで、精製されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ多糖を、ＰＡＮＤＡ ２Ｋ（登録商標）ホモジェナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ、Ｐａｒｍａ、Ｉｔａｌｙ）を用いる高圧均一化によりサイジングして、単離されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ多糖を生産した。
好ましくは、上記プロセスにより得られた単離されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖は、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含み、５０ｋＤａ～５００ｋＤａ、好ましくは、１５０ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有する。
単離されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖の酸化
多糖の酸化を、計算された量の５００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）およびＷＦＩの連続的添加により１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で実行して、２．０ｇ／Ｌの最終多糖濃度を得た。必要に応じて、反応のｐＨを約ｐＨ６．０に調整した。ｐＨ調整の後、反応温度を２３℃に調整した。約０．２５モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムの添加により、酸化を開始させた。酸化反応を、約１６ｈ、２３℃で実施した。
活性化された多糖の濃縮および透析濾過を、１０Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過カセットを用いて実行した。２０倍透析容量のＷＦＩに対して透析濾過を実施した。次いで、精製された活性化された多糖を５℃で保存した。精製された活性化された糖類を、特に、（ｉ）比色アッセイによる糖類濃度；（ｉｉ）比色アッセイによるアルデヒド濃度；（ｉｉｉ）酸化度；（ｉｖ）ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによる分子量ならびに（ｖ）Ｏ－アセチルおよびグリセロールの存在により特徴付けた。
多糖および多糖－タンパク質コンジュゲートの分子量の決定のために、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳを用いる。流体力学的容積により多糖を分離するために、ＳＥＣを用いる。分子量の決定のために、屈折率（ＲＩ）および多角レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器を用いる。光が物質と相互作用する場合、それは散乱し、散乱光の量は物質の濃度、ｄｎ／ｄｃ（特定の屈折率増分）の２乗、および分子量と関連する。分子量測定を、ＭＡＬＬＳ検出器からの散乱光シグナルおよびＲＩ検出器からの濃度シグナルからの読み取り値に基づいて算出する。
活性化された多糖の酸化度（ＤＯ＝糖反復単位のモル数／アルデヒドのモル数）を、以下のように決定した：
糖反復単位のモル数を、様々な比色法により、例えば、Ａｎｔｈｒｏｎｅ法を用いることにより決定する。多糖を、硫酸および熱の作用により最初に単糖類まで破壊する。Ａｎｔｈｒｏｎｅ試薬は、ヘキソースと反応して黄緑色の複合体を形成し、その吸光度は６２５ｎｍで分光光度的に読み取られる。アッセイの範囲内で、吸光度は存在するヘキソースの量に正比例する。
また、アルデヒドのモル数を、ＭＢＴＨ比色法を用いて同時に決定する。ＭＢＴＨアッセイは、アルデヒド基（所与の試料に由来する）を３－メチル－２－ベンゾチアゾロンヒドラゾン（ＭＢＴＨアッセイ試薬）と反応させることによるアジン化合物の形成を含む。過剰の３－メチル－２－ベンゾチアゾロンヒドラゾンは酸化して、反応性陽イオンを形成する。反応性陽イオンとアジンは反応して、青色の発色団を形成する。次いで、形成された発色団を、６５０ｎｍで分光光度的に読み取る。
好ましくは、上記プロセスにより得られた活性化されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖は、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含み、５０ｋＤａ～５００ｋＤａ、好ましくは、１５０ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有する。
活性化されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖とＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
コンジュゲーションプロセスは、以下のステップからなっていた：
ａ）スクロース賦形剤との混合および凍結乾燥；
ｂ）凍結乾燥された活性化された多糖とＣＲＭ１９７の復元；
ｃ）ＣＲＭ１９７への活性化された多糖のコンジュゲーションおよびキャッピング；ならびに
ｄ）コンジュゲートの精製
ａ）スクロース賦形剤との混合および凍結乾燥
活性化された多糖を、活性化された多糖１グラムあたり２５グラムのスクロースの比でスクロースと混合した。次いで、混合された混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥後、凍結乾燥された活性化された多糖を含有するボトルを、－２０℃で保存した。計算された量のＣＲＭ１９７タンパク質をシェル凍結し、別々に凍結乾燥した。凍結乾燥されたＣＲＭ１９７を、－２０℃で保存した。
ｂ）凍結乾燥された活性化された多糖とＣＲＭ１９７タンパク質の復元
凍結乾燥された活性化された多糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元させた。多糖が完全に溶解されたら、復元のために、凍結乾燥されたＣＲＭ１９７に等量の無水ＤＭＳＯを添加した。
ｃ）コンジュゲーションおよびキャッピング
復元された活性化された多糖を、反応容器中で復元されたＣＲＭ１９７と混合（入力比：０．８：１）した後、完全に混合して、シアノ水素化ホウ素ナトリウムとのコンジュゲーションを開始する前に透明な溶液を得た。反応溶液中の最終多糖濃度は、約１ｇ／Ｌである。反応混合物に１．０～１．５ＭＥｑのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加することにより、コンジュゲーションを開始させ、２３℃で４０～４８ｈインキュベートした。２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を添加して未反応のアルデヒドをキャッピングすることにより、コンジュゲーション反応を終結させた。このキャッピング反応を、２３℃で３ｈ継続した。
ｄ）コンジュゲートの精製
コンジュゲート溶液を、１００～３００Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いる接線流濾過による精製のための調製物中、冷却した５ｍＭコハク酸－０．９％塩水（ｐＨ６．０）を用いて１：１０に希釈した。希釈したコンジュゲート溶液を、５μｍフィルターに通過させ、媒体として５ｍＭコハク酸－０．９％塩水（ｐＨ６．０）を用いて透析濾過を実施した。透析濾過が完了した後、コンジュゲート保持液を、０．２２μｍフィルターを通して移した。
コンジュゲートを、約０．５ｍｇ／ｍＬの標的糖類濃度となるように５ｍＭコハク酸／０．９％塩水（ｐＨ６）でさらに希釈した。最終的な０．２２μｍの濾過ステップを完了させて、グリココンジュゲートを得た。
好ましくは、上記プロセスにより得られたコンジュゲートは、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含み、３，０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有し、２～６のコンジュゲーション度を有する。
（実施例１１）
ＣＲＭ１９７に共有的に連結されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖を含むグリココンジュゲートの特徴付け
コンジュゲート１を、実施例１０のプロセスにより調製した。コンジュゲート２および３を、異なる量の酸化剤を用いる同様のプロセスにより調製した。コンジュゲート４を、精製された血清型１５Ｂ莢膜多糖をサイジングせず、より低いＤＯ（より高い酸化レベル）まで活性化し、コンジュゲーションを水性媒体中で実施した以外は同様のプロセスによって調製した。コンジュゲート５を、精製された血清型１５Ｂ莢膜多糖を化学的加水分解によりサイジングし、コンジュゲーションを水性媒体中で実施した以外は同様のプロセスによって調製した。コンジュゲート６および７を、精製された血清型１５Ｂ莢膜多糖をサイジングしなかった以外は同様のプロセスによって調製した。
得られたコンジュゲートを特徴付け、その結果を表１４にまとめる。
Figure 0007059095000019
遊離多糖のパーセンテージは、水酸化アルミニウムゲルを用いて、タンパク質および共有的に結合した糖類を結合させ、遠心分離により除去する手順により測定する。試料をリン酸緩衝水酸化アルミニウムゲルと混合し、遠心分離する。結合した糖類はゲルと共にペレット化し、遊離糖類は上清中に残存する。得られる上清および対照試料を、適切な比色アッセイにより定量して、遊離糖類のパーセンテージを決定し、タンパク質の十分な除去および糖類の回収を確認する。
アミノ酸分析のために、多糖－タンパク質試料を最初に、減圧および加熱下（１６０℃で１５分間）での６Ｎ塩酸（ＨＣｌ）加水分解を用いて、遊離アミノ酸としてその個々の成分に加水分解する。加水分解後、試料を、アミノ酸分析装置を用いて分析する。個々のアミノ酸を、温度および流量を変化させながらクエン酸ナトリウム緩衝液の段階勾配を用いて、イオン交換クロマトグラフィーにより分離する。分離後、それぞれのアミノ酸残留物の量を、ポストカラムニンヒドリンカップリング検出システムを用いて定量的に決定する。このシステムにおいては、ニンヒドリンを、ポストカラムリアクターシステム中でカラム溶出液と混合し、混合物を光度計に通過させる。ニンヒドリンと溶出したアミノ酸との反応は、５７０ｎｍで最大吸収する紫色の化合物をもたらす。この吸光度は、存在するα－アミノ基の量の線形応答（関数）であり、この反応はα－アミノ基を有する全ての有機化合物のための定量比色アッセイとなる。遊離アミノ基を有さない、プロリンおよびヒドロキシルプロリンなどのイミノ酸との反応においては、明黄色の化合物が生成され、４４０ｎｍでモニタリングされる。各アミノ酸に関するピーク面積を、５７０ｎｍと４４０ｎｍの波長の出力の両方を用いて算出する。
収率を以下のように算出する：（コンジュゲート中の多糖の量ｘ１００）／活性化された多糖の量。
水性媒体を用いて生成されたコンジュゲート（４および５）は、Ｏ－アセチルレベルの有意な喪失を示した。ＭＷサイジングを用いずに天然多糖を用いてＤＭＳＯ溶媒中で生成されたコンジュゲート（６および７）は、Ｏ－アセチルレベルの喪失を示さなかった。しかしながら、低い濾過可能性特徴に加えて、コンジュゲート収率も非常に低かった。高圧均一化によりサイジングされた多糖を用いてＤＭＳＯ中で生成されたコンジュゲート（１、２および３）は、Ｏ－アセチルレベルの有意な保持と共に、高い収率およびより良好な濾過可能性特徴を有していた。これらのコンジュゲートもまた、非常に低レベルの遊離多糖を有していた。
（実施例１２）
Ｐｎ－血清型１５Ｂ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートを用いたオプソニン貪食活性（ＯＰＡ）アッセイ
本発明のストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂコンジュゲートの免疫原性を、以下に記載のＯＰＡアッセイを用いて評価することができる。
３０匹の６～７週齢のメスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの群を、０週目に皮下経路により０．００１μｇ、０．０１μｇ、または０．１μｇの試験コンジュゲートで免疫した。３週目にマウスに同じ用量のコンジュゲートを追加接種した後、４週目に出血させた。血清型特異的ＯＰＡを４週目の血清試料に対して実施した。
ＯＰＡを用いて、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに特異的なマウス血清中の機能的抗体を測定する。試験血清を、細菌をオプソニン化し、補体沈着を誘発し、それによって食細胞による細菌の食作用および殺傷を容易にする莢膜多糖特異的免疫グロブリンの能力を測定するアッセイ反応において設定する。ＯＰＡ力価を、試験血清を含まない対照ウェル上に対して、細菌計数の５０％の減少をもたらす希釈率の逆数として定義する。ＯＰＡ力価を、この５０％の殺傷カットオフを挟む２つの希釈率から内挿する。
ＯＰＡ手順は、以下の改変を含む、Ｈｕら（２００５）Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２（２）：２８７～２９５に記載の方法に基づくものであった。試験血清を２．５倍に連続希釈し、マイクロタイターアッセイプレートに添加した。生きた血清型１５Ｂ標的細菌をウェルに添加し、プレートを３７℃で３０分間振盪した。分化したＨＬ－６０細胞（食細胞）および子ウサギ血清（３～４週齢、ＰＥＬ－ＦＲＥＥＺ（登録商標）、６．２５％最終濃度）をウェルに添加し、プレートを３７℃で４５分間振盪した。反応を終結させるために、８０μＬの０．９％ＮａＣｌを全てのウェルに添加し、混合し、１０μＬのアリコートを、２００μＬの水を含有するＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮ（登録商標）ＨＴＳ ＨＶフィルタープレート（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標））のウェルに移した。液体を減圧下でプレートを通して濾過し、１５０μＬのＨＹＳＯＹ（登録商標）培地を各ウェルに添加し、濾過した。次いで、フィルタープレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、Ｄｅｓｔａｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて固定した。次いで、プレートをクマシーブルーで染色し、一度脱色した。コロニーを画像化し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＣＴＬ）（Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＯＨ）ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ上で数えた。生コロニー計数を用いて、殺傷曲線をプロットし、ＯＰＡ力価を算出した。
コンジュゲート１および２の免疫原性を、上記のアッセイに従って試験した。また、同じアッセイにおいて、１つのさらなるコンジュゲートおよび非コンジュゲート化天然ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖（非コンジュゲート化ＰＳ）を試験した。
コンジュゲート９を、水性溶液中での還元的アミノ化によるＣＲＭ１９７への天然（すなわち、サイジングされていない）血清型１５Ｂ莢膜多糖のコンジュゲーションにより調製した。
その結果を、表１５に示す。
Figure 0007059095000020
上記の表１５に示されたように、コンジュゲート１および２は、マウスに投与された場合、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂをオプソニン化し、補体沈着を誘発し、それによって、食細胞による細菌の食作用および殺傷を容易にすることができる抗体を生成した。さらに、その低い分子量にも拘わらず、それらはまたサイジングされていないコンジュゲート９と比較して同様のレベルの免疫原性を示した。
（実施例１３）
血清型２２Ｆ多糖－ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
単離されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆ多糖の調製
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆを、種ボトル中で増殖させた後、種発酵器に移した。一度、標的光密度に達したら、細胞を生産発酵器に移した。発酵培地を、Ｎ－ラウロイルサルコシンの添加により不活化し、限外濾過および透析濾過により精製した。
精製されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆ多糖を、ＰＡＮＤＡ ２Ｋ（登録商標）ホモジェナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ、Ｐａｒｍａ、Ｉｔａｌｙ）を用いる高圧均一化によりサイジングして、単離されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆ多糖を生産した。
単離されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆ莢膜多糖の酸化
多糖の酸化を、計算された量の５００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．８）およびＷＦＩの連続的添加により１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．８）中で実行して、２．０ｇ／Ｌの最終多糖濃度を得た。必要に応じて、反応のｐＨを約ｐＨ５．８に調整した。ｐＨ調整の後、反応温度を５℃に低下させた。０．１０モル当量（ＭＥｑ）の過ヨウ素酸ナトリウムの添加により、酸化を開始させた。標的酸化反応時間は５℃で１６ｈである。
酸化反応を、５℃で１～２ｈ、連続撹拌下で２ＭＥｑの２，３－ブタンジオールを用いてクエンチした。
活性化された多糖の濃縮および透析濾過を、１００Ｋ ＭＷＣＯ限外濾過カセットを用いて実行した。３５倍透析容量のＷＦＩに対して透析濾過を実施した。精製された活性化された多糖を５℃で保存した。精製された活性化された糖類を、特に、（ｉ）ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによる分子量、（ｉｉ）Ｏ－アセチルの存在および（ｉｉｉ）酸化度により特徴付ける。
多糖および多糖－タンパク質コンジュゲートの分子量の決定のために、ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳを用いる。流体力学的容積により多糖を分離するために、ＳＥＣを用いる。分子量の決定のために、屈折率（ＲＩ）および多角レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器を用いる。光が物質と相互作用する場合、それは散乱し、散乱光の量は物質の濃度、ｄｎ／ｄｃ（特定の屈折率増分）の２乗、および分子量と関連する。分子量測定を、ＭＡＬＬＳ検出器からの散乱光シグナルおよびＲＩ検出器からの濃度シグナルからの読み取り値に基づいて算出する。
活性化された多糖の酸化度（ＤＯ＝糖反復単位のモル数／アルデヒドのモル数）を、以下のように決定した：
糖反復単位のモル数を、様々な比色法により、例えば、Ａｎｔｈｒｏｎｅ法を用いることにより決定する。多糖を、硫酸および熱の作用により最初に単糖類まで破壊する。Ａｎｔｈｒｏｎｅ試薬は、ヘキソースと反応して黄緑色の複合体を形成し、その吸光度は６２５ｎｍで分光光度的に読み取られる。アッセイの範囲内で、吸光度は存在するヘキソースの量に正比例する。
また、アルデヒドのモル数を、ＭＢＴＨ比色法を用いて同時に決定する。ＭＢＴＨアッセイは、アルデヒド基（所与の試料に由来する）を３－メチル－２－ベンゾチアゾロンヒドラゾン（ＭＢＴＨアッセイ試薬）と反応させることによるアジン化合物の形成を含む。過剰の３－メチル－２－ベンゾチアゾロンヒドラゾンは酸化して、反応性陽イオンを形成する。反応性陽イオンとアジンは反応して、青色の発色団を形成する。次いで、形成された発色団を、６５０ｎｍで分光光度的に読み取る。
活性化されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆ多糖とＣＲＭ１９７とのコンジュゲーション
コンジュゲーションプロセスは以下のステップからなっていた：
ａ．スクロース賦形剤との混合、および凍結乾燥；
ｂ．凍結乾燥された多糖およびＣＲＭ１９７の復元；
ｃ．ＣＲＭ１９７への活性化された多糖のコンジュゲーションおよびキャッピング；ならびに
ｄ．コンジュゲートの精製
ａ．スクロースとの混合および凍結乾燥
活性化された多糖を、活性化された多糖１グラムあたり２５ｇのスクロースの比でスクロース（ＷＦＩ中の５０％ｗ／ｖ）と混合した。次いで、混合された混合物のボトルを凍結乾燥した。凍結乾燥後、凍結乾燥された活性化された多糖を含有するボトルを、－２０℃で保存した。計算された量のＣＲＭ１９７タンパク質（標的Ｓ／Ｐ入力比＝１）をシェル凍結し、別々に凍結乾燥した。凍結乾燥されたＣＲＭ１９７を－２０℃で保存した。
ｂ．凍結乾燥された活性化された多糖とＣＲＭ１９７タンパク質の復元
凍結乾燥された活性化された多糖を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で復元させた。多糖が完全に溶解されたら、復元のために、凍結乾燥されたＣＲＭ１９７に、等量の無水ＤＭＳＯを添加した。
ｃ．ＣＲＭ１９７への活性化された多糖のコンジュゲーションおよびキャッピング
復元されたＣＲＭ１９７（ＤＭＳＯ中）を、コンジュゲーション反応容器中で復元された活性化された多糖と混合した。反応溶液中の最終多糖濃度は１ｇ／Ｌである。１．５ＭＥｑのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを反応混合物に添加することにより、コンジュゲーションを開始させ、反応物を２３℃で２０ｈインキュベートした。２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウムを添加することにより、コンジュゲーション反応の終結を行う。キャッピング反応を、２３℃で３ｈインキュベートした。
ｄ．コンジュゲートの精製
コンジュゲート溶液を、１００Ｋ ＭＷＣＯ膜を用いる接線流濾過による精製のための調製物中、冷却した５ｍＭコハク酸－０．９％塩水（ｐＨ６．０）で１：５に希釈し、２０Ｘ透析濾過を、媒体として５ｍＭコハク酸－０．９％塩水（ｐＨ６．０）を用いて実施した。透析濾過が完了した後、コンジュゲート保持液を、さらに希釈し、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、２～８℃で保存した。
様々なパラメータ（例えば、糖類－タンパク質入力比、反応物濃度およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムのＭｅｑ）を変化させることにより上記のプロセスを用いて、いくつかのコンジュゲートを得た。ＣＲＭ１９７に対する代表的なＰｎ－２２Ｆグリココンジュゲートに関する特徴付けを、表１６に示す。
Figure 0007059095000021
最終コンジュゲート中のＯ－アセチル（保持された）レベルの％を、多糖のＯ－アセチル含量（血清型２２Ｆ多糖反復単位１μｍｏｌあたりのＯ－アセチルのμｍｏｌ）に対する、コンジュゲートのＯ－アセチル含量（血清型２２Ｆ糖類反復単位１μｍｏｌあたりのＯ－アセチルのμｍｏｌ）の比から算出した。
上記で得られたコンジュゲートの免疫原性を、以下に記載のオプソニン貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）を用いて評価した。
３０匹の６～７週齢のメスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの群を、０週目に皮下経路により０．００１μｇ、０．００５μｇ、または０．０１μｇの試験コンジュゲートで免疫した。３週目にマウスに同じ用量のコンジュゲートを追加接種した後、４週目に出血させた。血清型特異的ＯＰＡを４週目の血清試料に対して実施した。
オプソニン貪食活性（ＯＰＡ）アッセイを用いて、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに特異的なマウス血清中の機能的抗体を測定する。試験血清を、細菌をオプソニン化し、補体沈着を誘発し、それによって食細胞による細菌の食作用および殺傷を容易にする莢膜多糖特異的免疫グロブリンの能力を測定するアッセイ反応において設定する。ＯＰＡ力価を、試験血清を含まない対照ウェル上での細菌計数の５０％の減少をもたらす希釈率の逆数として定義する。ＯＰＡ力価を、この５０％の殺傷カットオフを挟む２つの希釈率から内挿する。
ＯＰＡ手順は、以下の改変を含む、Ｈｕら（２００５）Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２（２）：２８７～２９５に記載の方法に基づくものであった。試験血清を２．５倍に連続希釈し、マイクロタイターアッセイプレートに添加した。生きた血清型２２Ｆ標的細菌株をウェルに添加し、プレートを２５℃で３０分間振盪した。
分化したＨＬ－６０細胞（食細胞）および子ウサギ血清（３～４週齢、ＰＥＬ－ＦＲＥＥＺ（登録商標）、１２．５％最終濃度）をウェルに添加し、プレートを３７℃で４５分間振盪した。反応を終結させるために、８０μＬの０．９％ＮａＣｌを全てのウェルに添加し、混合し、１０μＬのアリコートを、２００μＬの水を含有するＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮ（登録商標）ＨＴＳ ＨＶフィルタープレート（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標））
のウェルに移した。液体を減圧下でプレートを通して濾過し、１５０μＬのＨＹＳＯＹ（登録商標）培地を各ウェルに添加し、濾過した。次いで、フィルタープレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、Ｄｅｓｔａｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて固定した。次いで、プレートをクマシーブルーで染色し、一度脱色した。コロニーを画像化し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＣＴＬ）（Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＯＨ）ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ上で数えた。生コロニー計数を用いて、殺傷曲線をプロットし、ＯＰＡ力価を算出した。
血清型２２Ｆ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートに関するオプソニン貪食活性（ＯＰＡ）力価を、上記のように決定した。様々な用量で４週でのＯＰＡ力価（９５％信頼区間（ＣＩ）を有する幾何平均力価（ＧＭＴ））を表１７および表１８（２つの別々の実験）に示し、これは、血清型２２Ｆコンジュゲート（バッチ１～７；これらのコンジュゲートの特徴付けデータについては、表１６も参照されたい）がマウス免疫原性モデルにおいてＯＰＡ力価を惹起したことを示している。
Figure 0007059095000022
Figure 0007059095000023
（実施例１４）
ＣＲＭ１９７に対するＰｎ－１１Ａコンジュゲートの調製
Ｐｎ－１１Ａ ＲＡＣグリココンジュゲートの調製
脱イオン水または２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で保存された凍結されサイジングされた多糖を、５℃で解凍した。
多糖の酸化
多糖酸化を、５００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）およびＷＦＩの添加により１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で実行して、２．０ｇ／Ｌの最終多糖濃度を得た。酸化反応を、２３℃で実行した。酸化を、過ヨウ素酸ナトリウムの添加により開始させた。撹拌速度は１００～１４０ｒｐｍの範囲である。
活性化された１１Ａ多糖の精製
活性化された多糖の濃縮および透析濾過を、限外濾過カセットを用いて実行した。透析濾過を、２０倍透析容量のＷＦＩに対して実施した。０．２２μｍ濾過後、精製された活性化された多糖を、５℃で保存した。
コンジュゲーションプロセスの説明
コンジュゲーションプロセスは以下のステップからなっていた：
ａ．ＣＲＭ１９７タンパク質のシェル凍結および凍結乾燥；
ｂ．活性化された多糖およびＣＲＭ１９７の復元；
ｃ．ＣＲＭ１９７への活性化された多糖のコンジュゲーション；ならびに
ｄ．コンジュゲートの精製および希釈
ａ．ＣＲＭ１９７タンパク質のシェル凍結および凍結乾燥
ＣＲＭ１９７タンパク質をシェル凍結し、凍結乾燥した。
ｂ．活性化された多糖およびＣＲＭ１９７タンパク質の復元
活性化された多糖溶液（約１０ｇ／Ｌ）をリアクター中に入れた後、計算された量の０．５Ｎリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を添加した。撹拌下で、凍結乾燥されたＣＲＭ１９７を添加し、反応混合物を２～４時間撹拌して、ＣＲＭ１９７の完全な溶解を達成した。
ｃ．コンジュゲーションおよびキャッピング
コンジュゲーションを、シアノ水素化ホウ素を添加することにより開始させた。反応混合物を２３℃で７２～９６ｈインキュベートした。コンジュゲーション反応の終結を、０．５Ｘ ＷＦＩ、次いで、２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウムを添加することにより行った。このキャッピング反応を２３℃で３～４ｈ保持した。
ｄ．コンジュゲートの希釈および初期精製
コンジュゲート溶液を、接線流濾過（ＴＦＦ）による精製のための調製物中で０．１５Ｎリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて１：５（反応容量）に希釈した。希釈されたコンジュゲートを、希釈容器中で混合した後、５μｍフィルターに通過させた。次いで、濾過されたコンジュゲート溶液を、１～２ｇ／Ｌまで濃縮した。２ステップの透析濾過プロセスを実施した。ステップ１においては、３０Ｘ（透析濾過容量）の０．１５Ｎリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、次いで、２０Ｘの５ｍＭコハク酸－０．９％ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）を用いて、ＴＦＦを実行した。初回の透析濾過が完了した後、コンジュゲート保持液を、０．４５μｍフィルターを通して収集タンク中に移した。
コンジュゲートの最終透析濾過
最終精製ステップは、再生セルロース膜を用いた、５ｍＭコハク酸－０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ６．０媒体を用いる２０Ｘ透析濾過であった。
一価バルクコンジュゲート（ＭＢＣ）の希釈 コンジュゲートを、５ｍＭコハク酸／０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ６を用いて、０．５ｍｇ／ｍＬの標的糖類濃度にさらに希釈した。最終的な０．２２μｍの濾過ステップを完了させて、製剤化のための一価バルクコンジュゲート（ＭＢＣ）産物を調製した。
様々なパラメータ（例えば、糖類－タンパク質入力比、反応物濃度およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムのＭｅｑ）を変化させることにより上記のプロセスを用いて、いくつかのコンジュゲートを得た。ＣＲＭ１９７に対する代表的なＰｎ－１１Ａグリココンジュゲートに関する特徴付けを、表１９（バッチ１～５）に提供する。
ＲＡＣ／ＤＭＳＯを用いたＰｎ－１１Ａグリココンジュゲートの調製
酸化された多糖を、上記のように調製および精製した（Ｐｎ－１１Ａ ＲＡＣグリココンジュゲートの調製を参照されたい）。
ＤＭＳＯ中での還元的アミノ化によるコンジュゲーション（ＲＡＣ／ＤＭＳＯ）
ＲＡＣ／ＤＭＳＯによる１１Ａのコンジュゲーションは、以下のステップからなっていた：
ａ．スクロースとの混合、シェル凍結および凍結乾燥；
ｂ．活性化された多糖およびＣＲＭ１９７の復元；
ｃ．ＣＲＭ１９７への活性化された多糖のコンジュゲーション；ならびに
ｄ．コンジュゲートの精製および希釈。
ａ．スクロースとの混合、シェル凍結および凍結乾燥
サイジングされた多糖から調製された活性化された多糖を、活性化された多糖１グラムあたり２５ｇのスクロースの比でスクロース（ＷＦＩ中の５０％ｗ／ｖ）と混合した。成分を混合した後、混合された混合物のシェル凍結されたボトルを凍結乾燥した。ＣＲＭ１９７タンパク質をシェル凍結し、別々に凍結乾燥した。
ｂ．凍結乾燥された活性化された多糖とＣＲＭ１９７タンパク質の復元
凍結乾燥された活性化された多糖を、ＤＭＳＯ中で２ｍｇ／ｍＬ濃度に復元させた。多糖が完全に溶解されたら、復元のために、凍結乾燥されたＣＲＭ１９７にＤＭＳＯを添加した。
ｃ．コンジュゲーションおよびキャッピング
復元されたＣＲＭ１９７（ＤＭＳＯ中）を、コンジュゲーション反応容器中で復元された活性化された多糖と混合した。反応溶液中の最終多糖濃度は１ｇ／Ｌである。シアノ水素化ホウ素を反応混合物に添加することにより、コンジュゲーションを開始させ、２３℃で２２ｈインキュベートした。２ＭＥｑの水素化ホウ素ナトリウムを添加することにより、コンジュゲーション反応の終結を行う。このキャッピング反応を、２３℃で３～４ｈ保持した。
ｄ．コンジュゲートの精製および希釈
コンジュゲート溶液を、上記と同様のプロセスを用いて精製および希釈した。
様々なパラメータ（例えば、糖類－タンパク質入力比、反応物濃度およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムのＭｅｑ）を変化させることにより上記のプロセスを用いて、いくつかのコンジュゲートを得た。上記プロセスにより得られたＣＲＭ１９７に対する代表的なＰｎ－１１Ａグリココンジュゲートに関する特徴付けを、表１９（バッチ６～８）に提供する。
Figure 0007059095000024
上記の還元的アミノ化により調製されたコンジュゲートから生成された全データにより、良好なコンジュゲーション収率、低い遊離糖類％および良好な安定性を示すコンジュゲートを調製することができることが示された。
上記で得られたコンジュゲートの免疫原性を、以下に記載のオプソニン貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）を用いて評価した。
３０匹の６～７週齢のメスのＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの群を、０週目に皮下経路により０．００１μｇ、０．００５μｇ、０．０１μｇ、または０．１μｇの試験コンジュゲートで免疫した。３週目にマウスに同じ用量のコンジュゲートを追加接種した後、４週目に出血させた。血清型特異的ＯＰＡを４週目の血清試料に対して実施した。
オプソニン貪食活性（ＯＰＡ）アッセイを用いて、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに特異的なマウス血清中の機能的抗体を測定する。試験血清を、細菌をオプソニン化し、補体沈着を誘発し、それによって食細胞による細菌の食作用および殺傷を容易にする莢膜多糖特異的免疫グロブリンの能力を測定するアッセイ反応において設定する。ＯＰＡ力価を、試験血清を含まない対照ウェル上での細菌計数の５０％の減少をもたらす希釈率の逆数として定義する。ＯＰＡ力価を、この５０％の殺傷カットオフを挟む２つの希釈率から内挿する。
ＯＰＡ手順は、以下の改変を含む、Ｈｕら（２００５）Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２（２）：２８７～２９５に記載の方法に基づくものであった。試験血清を２．５倍に連続希釈し、マイクロタイターアッセイプレートに添加した。生きた血清型２２Ｆ標的細菌株をウェルに添加し、プレートを２５℃で３０分間振盪した。
分化したＨＬ－６０細胞（食細胞）および子ウサギ血清（３～４週齢、ＰＥＬ－ＦＲＥＥＺ（登録商標）、１２．５％最終濃度）をウェルに添加し、プレートを３７℃で６０分間振盪した。反応を終結させるために、８０μＬの０．９％ＮａＣｌを全てのウェルに添加し、混合し、１０μＬのアリコートを、２００μＬの水を含有するＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮ（登録商標）ＨＴＳ ＨＶフィルタープレート（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標））のウェルに移した。液体を減圧下でプレートを通して濾過し、１５０μＬのＨＹＳＯＹ（登録商標）培地を各ウェルに添加し、濾過した。次いで、フィルタープレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、Ｄｅｓｔａｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて固定した。次いで、プレートをクマシーブルーで染色し、一度脱色した。コロニーを画像化し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＣＴＬ）（Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＯＨ）ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ上で数えた。生コロニー計数を用いて、殺傷曲線をプロットし、ＯＰＡ力価を算出した。
血清型１１Ａ－ＣＲＭ１９７コンジュゲートに関するオプソニン貪食活性（ＯＰＡ）力価を、上記のように決定した。様々な用量で４週でのＯＰＡ力価（９５％信頼区間（ＣＩ）を有する幾何平均力価（ＧＭＴ））を表２０に示し、これは、血清型１１Ａコンジュゲート（バッチ２～４および８；これらのコンジュゲートの特徴付けデータについては、表１９も参照されたい）がマウス免疫原性モデルにおいてＯＰＡ力価を惹起したことを示している。
Figure 0007059095000025
（実施例１５）
１６価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤
ＣＲＭ１９７に全て個別にコンジュゲートされたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ（１６ｖＰｎＣ）に由来するグリココンジュゲートを含む１６価コンジュゲート組成物を製剤化した。
血清型１５Ｂ、２２Ｆおよび３３Ｆに由来するストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するグリココンジュゲートを、上記に開示されたように生産し、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来するストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）グリココンジュゲートを、ＷＯ２００６／１１０３８１に開示されたように生産した。
バルク濃縮物の必要な容量を、バッチ容量およびバルク糖類濃度に基づいて算出した。必要な容量のＮａＣｌ／コハク酸緩衝液（ｐＨ５．８）を添加して、５．０ｍＭコハク酸および１５０ｍＭ ＮａＣｌの最終標的緩衝液濃度を得ることにより、製剤化されたバルクワクチンを調製した。０．０２％の最終濃度となるようにポリソルベート８０および１６価肺炎球菌コンジュゲートを添加した。調製物を０．２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＥＳ膜を通して濾過した後、ＡｌＰＯ４を添加した。製剤を混合して、結合を可能にし、均一性を達成した。
次いで、０．５ｍＬの用量を送達するために、製剤をガラスシリンジ中に充填した。
最終的な剤形は、０．５ｍＬの用量について、ＣＲＭ１９７に個別にコンジュゲートされたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するそれぞれのグリココンジュゲート２．２μｇ、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲート４．４μｇ、５ｍＭコハク酸緩衝液ｐＨ５．８、０．０２ＰＳ８０、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよびＡｌＰＯ４として０．２５ｍｇ／ｍＬのアルミニウムからなっていた。ＣＲＭ１９７含量は、０．５ｍＬの用量について約３８μｇであった。
（実施例１６）
２０価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤
ＣＲＭ１９７に全て個別にコンジュゲートされたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ（２０ｖＰｎＣ）に由来するグリココンジュゲートを含む２０価コンジュゲート組成物を製剤化した。
血清型８、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１５Ｂ、２２Ｆおよび３３Ｆに由来するストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するグリココンジュゲートを、上記に開示されたように生産し、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来するストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）グリココンジュゲートを、ＷＯ２００６／１１０３８１に開示されたように生産した。
バルク濃縮物の必要な容量を、バッチ容量およびバルク糖類濃度に基づいて算出した。必要な容量のＮａＣｌ／コハク酸緩衝液（ｐＨ５．８）を添加して、５．０ｍＭコハク酸および１５０ｍＭ ＮａＣｌの最終標的緩衝液濃度を得ることにより、製剤化されたバルクワクチンを調製した。０．０２％の最終濃度となるようにポリソルベート８０および２０価肺炎球菌コンジュゲートを添加した。調製物を０．２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＥＳ膜を通して濾過した後、ＡｌＰＯ４を添加した。製剤をよく混合して、アルミニウムへのコンジュゲートの最大結合を得た。
次いで、０．５ｍＬの用量を送達するために、製剤をガラスシリンジ中に充填した。
最終的な剤形は、０．５ｍＬの用量について、ＣＲＭ１９７に個別にコンジュゲートされたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆに由来するそれぞれのグリココンジュゲート２．２μｇ、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲート４．４μｇ、５ｍＭコハク酸緩衝液ｐＨ５．８、０．０２ＰＳ８０、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよびＡｌＰＯ４として０．２５ｍｇ／ｍＬのアルミニウムからなっていた。ＣＲＭ１９７含量は、０．５ｍＬの用量について約４６μｇであった。
（実施例１７）
１６価免疫原性組成物の免疫原性
１６価免疫原性組成物の免疫原性（実施例１５を参照されたい）を、多重化直接Ｌｕｍｉｎｅｘイムノアッセイ（ｄＬＩＡ）を用いてウサギにおいて評価して、血清中の血清型特異的ＩｇＧ濃度および血清型特異的ＯＰＡを測定した。
１０匹の２．５ｋｇ～３．５ｋｇのメスのＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギの群を、０週目に筋肉内経路により、提唱されるヒト臨床用量（４．４μｇであった血清型６Ｂ以外は２．２μｇのコンジュゲート、加えてＡｌＰＯ４の形の０．１ｍｇのアルミニウム）で免疫した。ウサギに、２週目に同じ用量のコンジュゲートワクチンを追加接種した後、４週目に出血させた。血清型特異的ｄＬＩＡおよびＯＰＡを、０週目および４週目の血清試料に対して実施した。
それぞれの肺炎球菌多糖（ＰｎＰＳ）に特異的な総多糖結合抗体（ＩｇＧ）を定量するために、ウサギ血清を２つの直接Ｌｕｍｉｎｅｘイムノアッセイ（ｄＬＩＡ；１３プレックスｄＬＩＡ、ＰＲＥＶＮＡＲ１３（登録商標）血清型および７プレックスｄＬＩＡ、さらなる血清型）において評価した。１３プレックスアッセイは、１３価肺炎球菌コンジュゲート（ＰｎＣ）ワクチン（１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆ）中に含まれる１３種の血清型に特異的な抗ＰｎＰＳ抗体を測定し、７プレックスアッセイは、さらなる血清型（１５Ｂ、２２Ｆ、３３Ｆ）に対する抗ＰｎＰＳ抗体を測定する。それぞれのアッセイは、ＰｎＰＳコンジュゲート（ＰｎＰＳ－ＰＬＬコンジュゲート：ポリ－Ｌ－リシンにコンジュゲートされたＰｎＰＳ）に結合した１３または７種のスペクトルが異なる磁気ミクロスフェアの組合せを含有する。
簡単に述べると、参照標準、対照および試験血清を、最初に２つのＰｎ吸収剤；ＣＷＰＳ１（ＰｎＡ含有Ｃ多糖に由来する細胞壁多糖）およびＣＷＰＳ２（無莢膜ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２に由来するＣＷＰ）に予め吸着させて、非特異的抗体がＰｎＰＳ被覆抗原に結合しないようにした。予備吸着後、ＰｎＰＳに結合したミクロスフェアを、適切に希釈された参照標準血清、対照またはウサギ試験血清と共にインキュベートした。インキュベーション後、各混合物を洗浄し、Ｒ－フィコエリトリンコンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体を添加した。蛍光シグナル（中央蛍光強度（ＭＦＩ）として表される）を、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘリーダーを用いて測定し、結合したＰｎＰＳ特異的ＩｇＧの量と相関付けた。試験血清に関する値を、（単位／ｍＬ、Ｕ／ｍＬ）として報告する。
血清型特異的ＯＰＡを、上記のように実施した。ＯＰＡ力価は、血清を含まない対照（バックグラウンドＣＦＵとして定義される）と比較した場合、細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）数の５０％の減少をもたらす最も高い血清希釈率の逆数である。力価を、この５０％の殺傷カットオフを挟む２つの希釈率から内挿する。
Figure 0007059095000026
結果は、１６ｖＰｎＣを用いる２回の免疫化後に血清型特異的ＩｇＧおよび機能的ＯＰＡ抗体応答の有意な増加を示した（表２１）。血清ＩｇＧレベルは、ベースラインよりも２ｌｏｇを超えて増加した。同様に、ベースラインの上のＯＰＡ ＧＭＴにおいて最小で２２倍の増加と共にロバストな機能的ＯＰＡ抗体応答が惹起された。免疫前血清（Ｗｋ０）により、血清型１４および３３Ｆを除いて、１６ｖＰｎ血清型の大部分について検出不可能なレベルのＰｎＰＳ特異的ＩｇＧおよび機能的ＯＰＡ抗体が示された。低レベルのＯＰＡ力価がこれらの血清型について存在していたが、これらのベースライン応答はワクチン接種後の抗体応答に有害に影響しなかった。
（実施例１８）
２０価免疫原性組成物の免疫原性
２０価免疫原性組成物（実施例１６で調製された）の免疫原性を、多重化直接Ｌｕｍｉｎｅｘイムノアッセイ（ｄＬＩＡ）を用いてウサギにおいて評価して、血清中の血清型特異的ＩｇＧ濃度および血清型特異的ＯＰＡを測定した。
１０匹の２．５ｋｇ～３．５ｋｇのメスのＮｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギの群を、０週目に筋肉内経路により、提唱されるヒト臨床用量（４．４μｇであった血清型６Ｂ以外は２．２μｇのコンジュゲート加えてＡｌＰＯ４の形の０．１ｍｇのアルミニウム）で免疫した。ウサギに、２週目に同じ用量のコンジュゲートワクチンを追加接種した後、４週目に出血させた。血清型特異的ｄＬＩＡおよびＯＰＡを、０週目および４週目の血清試料に対して実施した。
それぞれの肺炎球菌多糖（ＰｎＰＳ）に特異的な総多糖結合抗体（ＩｇＧ）を定量するために、ウサギ血清を２つの直接Ｌｕｍｉｎｅｘイムノアッセイ（ｄＬＩＡ；１３プレックスｄＬＩＡ、ＰＲＥＶＮＡＲ１３（登録商標）血清型および７プレックスｄＬＩＡ、さらなる血清型）において評価した。１３プレックスアッセイは、１３価肺炎球菌コンジュゲート（ＰｎＣ）ワクチン（１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆ）中に含まれる１３種の血清型に特異的な抗ＰｎＰＳ抗体を測定し、７プレックスアッセイは、さらなる血清型（１５Ｂ、２２Ｆ、３３Ｆ）に対する抗ＰｎＰＳ抗体を測定する。それぞれのアッセイは、ＰｎＰＳコンジュゲート（ＰｎＰＳ－ＰＬＬコンジュゲート：ポリ－Ｌ－リシンにコンジュゲートされたＰｎＰＳ）に結合した１３または７種のスペクトルが異なる磁気ミクロスフェアの組合せを含有する。
簡単に述べると、参照標準、対照および試験血清を、最初に２つのＰｎ吸収剤；ＣＷＰＳ１（ＰｎＡ含有Ｃ多糖に由来する細胞壁多糖）およびＣＷＰＳ２（無莢膜ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２に由来するＣＷＰ）に予め吸着させて、非特異的抗体がＰｎＰＳ被覆抗原に結合しないようにした。予備吸着後、ＰｎＰＳに結合したミクロスフェアを、適切に希釈された参照標準血清、対照またはウサギ試験血清と共にインキュベートした。インキュベーション後、各混合物を洗浄し、Ｒ－フィコエリトリンコンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体を添加した。蛍光シグナル（中央蛍光強度（ＭＦＩ）として表される）を、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘリーダーを用いて測定し、結合したＰｎＰＳ特異的ＩｇＧの量と相関付けた。試験血清に関する値を、（単位／ｍＬ、Ｕ／ｍＬ）として報告する。
血清型特異的ＯＰＡを、上記のように実施した。ＯＰＡ力価は、血清を含まない対照（バックグラウンドＣＦＵとして定義される）と比較した場合、細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）数の５０％の減少をもたらす最も高い血清希釈率の逆数である。力価を、この５０％の殺傷カットオフを挟む２つの希釈率から内挿する。
２０ｖＰｎＣで免疫されたウサギはまた、１６ｖおよび２０ｖ製剤ならびにさらなる４つの血清型（８、１０Ａ、１１Ａおよび１２Ｆ）に共通の血清型に対する総ＩｇＧおよび機能的ＯＰＡ抗体力価の有意な増加を示した（表２２）。２０種の血清型にわたる血清ＩｇＧレベルの２ｌｏｇの増加が、２回の免疫化後に誘導された。ワクチンを用いて惹起されたＯＰＡ ＧＭＴは、ベースラインの少なくとも２７倍上であった。血清型１４および３３Ｆに関する免疫前血清における低レベルのＯＰＡ力価は２０ｖＰｎＣワクチン接種後に同様に観察されたが、再度、ワクチン接種後の抗体応答のロバスト性を変化させなかった。
１６ｖＰｎＣおよび２０ｖＰｎＣ製剤は、両方とも肺炎球菌多糖に特異的であり、細菌の機能的殺傷と関連するロバストな体液性応答を惹起した（表２１および表２２を参照されたい）。結論として、実施例１７および実施例１８に示された試験は、１６ｃＰｎＣと２０ｖＰｎＣ製剤の両方の良好な免疫原性を示した。
Figure 0007059095000027
（実施例１９）
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の血清型９内の交差反応性オプソニン貪食作用免疫応答の評価
機能的抗体および補体の存在下での食作用エフェクター細胞によるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）細胞の殺傷を測定する、肺炎球菌オプソニン貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）は、肺炎球菌ワクチンの有効性を評価するための重要な代用物であると考えられる。
材料および方法
１３価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（１３ｖＰｎＣ）をワクチン接種された成人からの免疫血清の２つの無作為に選択されたサブセットを、血清型９Ｖ、９Ａ、９Ｌおよび９ＮについてＯＰＡアッセイにおいて試験した。血清を、それぞれ、米国臨床試験６１１５Ａ１－００４（Ｎ＝５９、ワクチン接種後）および６１１５Ａ１－３００５（Ｎ＝６６、対応付けられたワクチン接種前および後）から収集した。
試験６１１５Ａ１－３００５（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００５４６５７２）は、試験登録の少なくとも５年前に１回用量の２３ｖＰＳを受けた７０歳以上の外来高齢者における２３価肺炎球菌多糖ワクチン（２３ｖＰＳ）と比較した、Ｐｒｅｖｎａｒ１３の安全性、忍容性、および免疫原性を評価するフェーズ３、無作為化、実薬対照、改変二重盲検であった（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ００５４６５７２を参照；２０１４年３月３１日にアクセス）。
試験６１１５Ａ１－００４（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００４２７８９５）は、２３ｖＰＳに対してナイーブである６０～６４歳の成人における２３価肺炎球菌多糖ワクチン（２３ｖＰＳ）と比較した１３価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（１３ｖＰｎＣ）の安全性、忍容性、および免疫原性ならびに２３ｖＰＳに対してナイーブである１８～５９歳の成人における１３ｖＰｎＣの安全性、忍容性、および免疫原性を評価するフェーズ３、無作為化、実薬対照、改変二重盲検であった（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ００４２７８９５を参照；２０１４年３月３１日にアクセス）。
これらの試験において試験された１３価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（１３ｖＰｎＣ）は、ジフテリア交差反応物質１９７（ＣＲＭ１９７）担体タンパク質に個別にコンジュゲートされた、肺炎球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆに由来するコンジュゲートを含んでいた。
ＯＰＡを用いて、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｖ、９Ｎ、９Ａおよび／または９Ｌに対するヒト血清中の機能的抗体を測定する。試験血清を、細菌をオプソニン化し、補体沈着を誘発し、それによって食細胞による細菌の食作用および殺傷を容易にする莢膜多糖特異的免疫グロブリンの能力を測定するアッセイ反応において設定する。ＯＰＡ力価を、試験血清を含まない対照ウェル上での細菌計数の５０％の減少をもたらす希釈率の逆数として定義する。ＯＰＡ力価を、この５０％の殺傷カットオフを挟む２つの希釈率から内挿する。
ＯＰＡ手順は、Ｈｕら（２００５）Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２（２）：２８７～２９５に記載の方法に基づくものであった。試験熱不活化血清を２．５倍に連続希釈し、アッセイプレート中に標的細菌と一緒に添加し、振盪しながら３０分間インキュベートした。次いで、分化したＨＬ－６０細胞（食細胞）および子ウサギ血清（３～４週齢、ＰＥＬ－ＦＲＥＥＺ（登録商標）、Ａｒｋａｎｓａｓ、１２．５％最終濃度）を、２００：１の近似エフェクターと標的との比でウェルに添加し、３７℃で振盪しながらインキュベートした。反応を終結させるために、８０μＬの０．９％ＮａＣｌを全てのウェルに添加し、混合し、１０μＬのアリコートを、２００μＬの水を含有するＭＵＬＴＩＳＣＲＥＥＮ（登録商標）ＨＴＳ ＨＶフィルタープレート（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（登録商標））のウェルに移した。液体を減圧下でプレートを通して濾過し、１５０μＬのＨＹＳＯＹ（登録商標）培地を各ウェルに添加し、濾過した。次いで、フィルタープレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした後、Ｄｅｓｔａｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて固定した。次いで、プレートをクマシーブルーで染色し、一度脱色した。コロニーを画像化し、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＣＴＬ）（Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＯＨ）ＩＭＭＵＮＯＳＰＯＴ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ上で数えた。
統計分析：Ｐｅａｒｓｏｎの両側相関を算出した。
結果－９Ｖ、９Ａ、９Ｌおよび９ＮにおけるＯＰＡ応答
血清型９Ａ、９Ｌおよび９Ｎに対する１３ｖＰｎＣで免疫された成人の免疫血清からの機能横断型応答を、血清型９Ｖに対する相同な機能的応答と共に、それぞれのマイクロコロニーオプソニン貪食作用アッセイ（ｍｃＯＰＡ）において評価した。１３ｖＰｎＣをワクチン接種された成人からの免疫血清の２つの無作為に選択されたサブセットを試験した。血清を、それぞれ、米国臨床試験６１１５Ａ１－００４（Ｎ＝５９、ワクチン接種後）および６１１５Ａ１－３００５（Ｎ＝６６、対応付けられたワクチン接種前および後）から収集した。
試験６１１５Ａ１－００４における対象は任意の肺炎球菌ワクチン接種に対して以前はナイーブであり、試験プロトコールの一部として単回用量の１３ｖＰｎＣを受けた。試験６１１５Ａ１－００４からの免疫血清は、それぞれ、９Ｖ、９Ａ、９Ｌおよび９Ｎについて９８．３％、９８．３％、１００％および９３．２％の値を示す全ての血清群に対する類似するパーセンテージの応答者を示し（図１１）、６１１５Ａ１－３００５（図１２）からの結果を支持する。比較的良好なＯＰＡ力価の相関が、９Ｎ（ｐ＝０．１２１７、ｐ＜０．３６２７）ではなく、血清型９Ｖと９Ａ（Ｐｅａｒｓｏｎ相関ｐ＝０．５４５６、ｐ＜０．０００１）または９Ｌ（ｐ＝０．７３５３、ｐ＜０．０００１）との間で観察された。
試験６１１５Ａ１－３００５における対象は、試験登録の少なくとも５年前に１回用量の２３ｖＰＳを以前に受けており、試験プロトコールの一部として単回用量の１３ｖＰｎＣを受けた。１３ｖＰｎＣで免疫された成人からの対応付けられたワクチン接種前および後の血清パネル（Ｎ＝６６）（試験６１１５Ａ１－３００５）を、血清型９Ｖに対する相同な応答について、ならびに血清型９Ａ、９Ｌおよび９Ｎに対する抗９Ｖ抗体の交差反応性についてＯＰＡによって評価した。図１２に示されるように、９Ｖ（８４％）、９Ａ（８２％）、９Ｌ（８２％）および９Ｎ（８６％）に対する比較的高い免疫（応答者のパーセンテージ）が、おそらく血清型９Ｖおよび９Ｎに由来する非コンジュゲート化多糖を含む２３ｖＰＳを用いる、対象に対する以前の免疫化のため、ＯＰＡアッセイにおいて検出された。しかしながら、応答者のパーセンテージは、血清群９に由来する血清型９Ｖコンジュゲートのみを含有する１３ｖＰｎＣを用いるワクチン接種後、４つ全部の血清型について９５％またはそれ以上に増加した。力価の値における倍数の上昇を表２３に示し、これは血清型間で類似し、交差反応性も示唆する。
Figure 0007059095000028
ＯＰＡ力価分布のより包括的な分析を、図１３～図１６中の逆累積分布曲線（ＲＣＤＣ）に示す。ＲＣＤＣは、血清型９Ｖ、９Ａ、９Ｌおよびより低い程度では９Ｎに関するワクチン接種後の血清型特異的免疫応答の増加を示す。個々の対応付けられた試料の力価の上昇倍率の、９Ｖ、９Ａ、９Ｖ／９Ｌ、および９Ｖ／９Ｎ間における相関も、Ｐｅａｒｓｏｎの相関を用いて分析した。９Ｌに関してはより低い程度であるが（ｐ＝０．１８０４、ｐ＜０．１６４０）、血清型９Ｖと９Ａ（Ｐｅａｒｓｏｎの相関ｐ＝０．８７２０、ｐ＜０．０００１）または９Ｎ（ｐ＝０．５８０１、ｐ＜０．０００１）の間で、力価の上昇倍率の比較的良好な相関が観察された。
結論
これらのデータに基づけば、１３ｖＰｎＣワクチンは、血清型９Ａ、９Ｌおよび９Ｎに対するさらなる保護を提供することによって、より広い血清型包含率を実現する可能性がある。
（実施例２０）
血清型１５Ｂと血清型１５Ｃとの間の機能横断型ＯＰＡ応答
肺炎球菌血清群１５は、４つの構造的に関連する血清型：１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃおよび１５Ｆを含む。血清型１５Ｂおよび１５Ｃは、遺伝子タイピング技術によっては識別不可能であり、１５Ｂ－ＰＳが１５Ｃ－ＰＳのＯ－アセチル化変異体であることを除いて、類似する莢膜多糖（ＰＳ）組成を有する。血清型１５Ｂに対する抗莢膜ＰＳ抗体が血清型１５Ｃと機能的に交差反応するかどうかを理解するために、１０匹のウサギを、１６ｖＰｎＣ（実施例１５を参照されたい）および２０ｖＰｎＣ（実施例１６を参照されたい）ワクチンで免疫した。いずれのワクチンも、その製剤の一部として、本明細書に開示されるＣＲＭ１９７に共有的に連結されたストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂ莢膜多糖を含む免疫原性コンジュゲートを含有する。ワクチン接種の前および後に由来する血清を、血清型１５Ｂおよび１５Ｃ標的肺炎球菌株に対するＯＰＡアッセイにおいて試験した。
各群からの１０匹のウサギのうちの１００％が、血清型１５Ｂコンジュゲートを用いる免疫化後に血清型１５Ｂに対するＯＰＡ応答を有していた。これらの同じ試料のうちの１００％が、同様に血清型１５Ｃに対するＯＰＡ応答を有していた（表２４および表２５）。１５Ｃ ＯＰＡにおいては、ワクチン接種前の血清中で低いＯＰＡ力価が観察された。しかしながら、ワクチン接種前と比較したワクチン接種後の血清に関する１０倍を超えるＧＭＴ ＯＰＡ力価の増加により、本発明の免疫原性コンジュゲートがＯＰＡにおいて血清型１５Ｂおよび１５Ｃストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を殺傷することができる抗体の形成を誘導することが示された。
Figure 0007059095000029
Figure 0007059095000030
本明細書に記載された全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する当技術分野における当業者のレベルを示すものである。全ての刊行物および特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれると示されたのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
非限定的に、本発明は以下の態様を含む。
［特許請求の範囲］
［態様１］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来するグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来するグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来するグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来するグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来するグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来するグリココンジュゲートおよびストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来するグリココンジュゲートからなる群から選択される少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む免疫原性組成物。
［態様２］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、態様１に記載の免疫原性組成物。
［態様３］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、態様１から２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様４］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、態様１から３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様５］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、態様１から４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様６］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、態様１から５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様７］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、態様１から６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様８］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、態様１から７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様９］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートおよびストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む免疫原性組成物。
［態様１０］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートおよびストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む免疫原性組成物。
［態様１１］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む免疫原性組成物。
［態様１２］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様１１に記載の免疫原性組成物。
［態様１３］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様１１から１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１４］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様１１から１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１５］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様１１から１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１６］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様１１から１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１７］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様１１から１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１８］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来するグリココンジュゲートをさらに含む、態様１から１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１９］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、５および７Ｆに由来するグリココンジュゲートをさらに含む、態様１から１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２０］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａおよび１９Ａに由来するグリココンジュゲートをさらに含む、態様１から１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２１］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様１から２０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２２］
８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０価肺炎球菌コンジュゲート組成物である、態様１から２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２３］
１４、１５、１６、１７、１８または１９価肺炎球菌コンジュゲート組成物である、態様１から２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２４］
１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物である、態様１から２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２５］
１９価肺炎球菌コンジュゲート組成物である、態様１から２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２６］
２０価肺炎球菌コンジュゲート組成物である、態様１から２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２７］
前記グリココンジュゲートがＣＲＭ１９７に個別にコンジュゲートされている、態様１から２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２８］
全てのグリココンジュゲートがＣＲＭ１９７に個別にコンジュゲートされている、態様１から２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２９］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および／または２３Ｆに由来するグリココンジュゲートがＰＤに個別にコンジュゲートされている、態様１９から２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様３０］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１８Ｃに由来するグリココンジュゲートがＴＴにコンジュゲートされている、態様１８から２６または２９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様３１］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆに由来するグリココンジュゲートがＤＴにコンジュゲートされている、態様１８から２６または２９から３０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様３２］
前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが１０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有する、態様２、９から３１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様３３］
前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが１０，０００ｋＤａ～１６，０００ｋＤａの分子量を有する、態様２、９から３２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様３４］
血清型１５Ｂグリココンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．５～３である、態様２、９から３３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様３５］
血清型１５Ｂグリココンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．７～０．９である、態様２、９から３３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様３６］
前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、血清型１５Ｂ莢膜多糖の総量と比較して約５０％未満の遊離血清型１５Ｂ莢膜多糖を含む、態様２、９から３５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様３７］
血清型１５Ｂグリココンジュゲートの少なくとも４０％が、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する、態様２、９から３６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様３８］
前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１ｍＭのアセテートを含む、態様２、９から３７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様３９］
前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む、態様２、９から３７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様４０］
血清型１５Ｂグリココンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比が、少なくとも０．６である、態様２、９から３９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様４１］
血清型１５Ｂグリココンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比が、少なくとも０．６である、態様２、９から４０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様４２］
前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１ｍＭのグリセロールを含む、態様２、９から４１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様４３］
前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．５ｍＭのグリセロールを含む、態様２、９から４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様４４］
前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのグリセロールを含む、態様２、９から４３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様４５］
前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートのコンジュゲーション度が２～１５である、態様２、９から４４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様４６］
前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、１０ｋＤａ～１，５００ｋＤａの分子量を有する糖類を含む、態様２、９から４５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様４７］
前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートの担体タンパク質が、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風毒素）、ＣＲＭ１９７、他のＤＴ変異体、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ）、またはその免疫学的に機能的な等価物からなる群において選択される、態様２、９から４６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様４８］
前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートの担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、態様２、９から４７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様４９］
前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが還元的アミノ化を用いて調製される、態様２、９から４８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様５０］
前記血清型２２Ｆグリココンジュゲートが４００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａの分子量を有する、態様３、９、１０、１２から４９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様５１］
前記血清型２２Ｆグリココンジュゲートが１，０００ｋＤａ～８，０００ｋＤａの分子量を有する、態様３、９、１０、１２から４９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様５２］
血清型２２Ｆグリココンジュゲート中の血清型２２Ｆ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．５～３である、態様３、９、１０、１２から５１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様５３］
血清型２２Ｆグリココンジュゲート中の血清型２２Ｆ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．９～１．１である、態様３、９、１０、１２から５２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様５４］
前記血清型２２Ｆグリココンジュゲートが、血清型２２Ｆ莢膜多糖の総量と比較して約５０％未満の遊離血清型２２Ｆ莢膜多糖を含む、態様３、９、１０、１２から５３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様５５］
血清型２２Ｆグリココンジュゲートの少なくとも３０％が、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する、態様３、９、１０、１２から５４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様５６］
前記血清型２２Ｆグリココンジュゲートが、血清型２２Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１ｍＭのアセテートを含む、態様３、９、１０、１２から５４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様５７］
前記血清型２２Ｆグリココンジュゲートが、血清型２２Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む、態様３、９、１０、１２から５６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様５８］
血清型２２Ｆグリココンジュゲート中の血清型２２Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型２２Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比が、少なくとも０．６である、態様３、９、１０、１２から５７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様５９］
血清型２２Ｆグリココンジュゲート中の血清型２２Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型２２Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比が、少なくとも０．６である、態様３、９、１０、１２から５８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様６０］
前記血清型２２Ｆグリココンジュゲートのコンジュゲーション度が２～１５である、態様３、９、１０、１２から５９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様６１］
前記血清型２２Ｆグリココンジュゲートが、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する糖類を含む、態様３、９、１０、１２から６０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様６２］
前記血清型２２Ｆグリココンジュゲートの担体タンパク質が、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風毒素）、ＣＲＭ１９７、他のＤＴ変異体、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ）、またはその免疫学的に機能的な等価物からなる群において選択される、態様３、９、１０、１２から６１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様６３］
前記血清型２２Ｆグリココンジュゲートの担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、態様３、９、１０、１２から６２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様６４］
血清型２２Ｆグリココンジュゲートが還元的アミノ化を用いて調製される、態様３、９、１０、１２から６３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
の免疫原性組成物。
［態様６５］
前記血清型３３Ｆグリココンジュゲートが５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有する、態様４、９、１０、１３から６４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様６６］
前記血清型３３Ｆグリココンジュゲートが１，０００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する、態様４、９、１０、１３から６５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様６７］
血清型３３Ｆグリココンジュゲート中の血清型３３Ｆ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．２～４である、態様４、９、１０、１３から６６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様６８］
血清型３３Ｆグリココンジュゲート中の血清型３３Ｆ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．４～１．７である、態様４、９、１０、１３から６７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様６９］
前記血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、血清型３３Ｆ莢膜多糖の総量と比較して約４０％未満の遊離血清型３３Ｆ莢膜多糖を含む、態様４、９、１０、１３から６８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様７０］
血清型３３Ｆグリココンジュゲートの少なくとも３５％が、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する、態様４、９、１０、１３から６９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様７１］
前記血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、血清型３３Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１ｍＭのアセテートを含む、態様４、９、１０、１３から７０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様７２］
前記血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、血清型３３Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む、態様４、９、１０、１３から７１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様７３］
血清型３３Ｆグリココンジュゲート中の血清型３３Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型３３Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比が、少なくとも０．６である、態様４、９、１０、１３から７２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様７４］
血清型３３Ｆグリココンジュゲート中の血清型３３Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型３３Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比が、少なくとも０．６である、態様４、９、１０、１３から７３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様７５］
前記血清型３３Ｆグリココンジュゲートのコンジュゲーション度が２～２０である、態様４、９、１０、１３から７４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様７６］
前記血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する糖類を含む、態様４、９、１０、１３から７５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様７７］
前記血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、２～２５個の糖類反復単位ごとに担体タンパク質と糖類との間に少なくとも１個の共有結合を含む、態様４、９、１０、１３から７６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様７８］
前記血清型３３Ｆグリココンジュゲートの担体タンパク質が、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風毒素）、ＣＲＭ１９７、他のＤＴ変異体、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ）、またはその免疫学的に機能的な等価物からなる群において選択される、態様４、９、１０、１３から７７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様７９］
前記血清型３３Ｆグリココンジュゲートの担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、態様４、９、１０、１３から７８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様８０］
前記血清型３３Ｆグリココンジュゲートが還元的アミノ化を用いて調製される、態様４、９、１０、１３から７９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様８１］
前記血清型３３ＦグリココンジュゲートがｅＴＥＣコンジュゲーションを用いて調製される、態様４、９、１０、１３から７９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様８２］
前記血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、一般式（Ｉ）：
Figure 0007059095000031
 （式中、ｅＴＥＣスペーサーを構成する原子は中央のボックス中に含まれる）により表される、態様８０に記載の免疫原性組成物。
［態様８３］
前記血清型１２Ｆグリココンジュゲートが５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有する、態様５、１０、１４から８２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様８４］
前記血清型１２Ｆグリココンジュゲートが５００ｋＤａ～５，０００ｋＤａの分子量を有する、態様５、１０、１４から８３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様８５］
血清型１２Ｆグリココンジュゲート中の血清型１２Ｆ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．２～４である、態様５、１０、１４から８４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様８６］
血清型１２Ｆグリココンジュゲート中の血清型１２Ｆ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．８～１．８である、態様５、１０、１４から８５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様８７］
前記血清型２２Ｆグリココンジュゲートが、血清型１２Ｆ莢膜多糖の総量と比較して約５０％未満の遊離血清型１２Ｆ莢膜多糖を含む、態様５、１０、１４から８６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様８８］
血清型１２Ｆグリココンジュゲートの少なくとも３５％が、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する、態様５、１０、１４から８７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様８９］
前記血清型１２Ｆグリココンジュゲートのコンジュゲーション度が２～２０である、態様５、１０、１４から８８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様９０］
前記血清型１２Ｆグリココンジュゲートが、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する糖類を含む、態様５、１０、１４から８９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様９１］
前記血清型１２Ｆグリココンジュゲートが、２～２５個の糖類反復単位ごとに担体タンパク質と糖類との間に少なくとも１個の共有結合を含む、態様５、１０、１４から９０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様９２］
前記血清型１２Ｆグリココンジュゲートの担体タンパク質が、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風毒素）、ＣＲＭ１９７、他のＤＴ変異体、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ）、またはその免疫学的に機能的な等価物からなる群において選択される、態様５、１０、１４から９１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様９３］
前記血清型１２Ｆグリココンジュゲートの担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、態様５、１０、１４から９１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様９４］
前記血清型１２Ｆグリココンジュゲートが還元的アミノ化を用いて調製される、態様５、１０、１４から９３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様９５］
前記血清型１２Ｆグリココンジュゲートが、ＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ還元的アミノ化を用いて調製される、態様５、１０、１４から９４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様９６］
前記血清型１０Ａグリココンジュゲートが５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有する、態様６、１０、１５から９５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様９７］
前記血清型１０Ａグリココンジュゲートが１，０００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａの分子量を有する、態様６、１０、１５から９６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様９８］
血清型１０Ａグリココンジュゲート中の血清型１０Ａ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．５～３である、態様６、１０、１５から９７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様９９］
血清型１０Ａグリココンジュゲート中の血清型１０Ａ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．８～１．２である、態様６、１０、１５から９８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１００］
前記血清型１０Ａグリココンジュゲートが、血清型１０Ａ莢膜多糖の総量と比較して約５０％未満の遊離血清型１０Ａ莢膜多糖を含む、態様６、１０、１５から９９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１０１］
血清型１０Ａグリココンジュゲートの少なくとも３０％が、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する、態様６、１０、１５から１００のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１０２］
前記血清型１０Ａグリココンジュゲートのコンジュゲーション度が２～１５である、態様６、１０、１５から１０１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１０３］
前記血清型１０Ａグリココンジュゲートが、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する糖類を含む、態様６、１０、１５から１０２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１０４］
前記血清型１０Ａグリココンジュゲートの担体タンパク質が、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風毒素）、ＣＲＭ１９７、他のＤＴ変異体、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ）、またはその免疫学的に機能的な等価物からなる群において選択される、態様６、１０、１５から１０３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１０５］
前記血清型１０Ａグリココンジュゲートの担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、態様６、１０、１５から１０４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１０６］
前記血清型１０Ａグリココンジュゲートが還元的アミノ化を用いて調製される、態様６、１０、１５から１０５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１０７］
前記血清型１１Ａグリココンジュゲートが５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有する、態様７、１０、１６から１０６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１０８］
前記血清型１１Ａグリココンジュゲートが５００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有する、態様７、１０、１６から１０７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１０９］
血清型１１Ａグリココンジュゲート中の血清型１１Ａ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．２～４である、態様７、１０、１６から１０８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１１０］
血清型１１Ａグリココンジュゲート中の血清型１１Ａ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．８～１．６である、態様７、１０、１６から１０９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１１１］
前記血清型１１Ａグリココンジュゲートが、血清型１１Ａ莢膜多糖の総量と比較して約５０％未満の遊離血清型１１Ａ莢膜多糖を含む、態様７、１０、１６から１１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１１２］
血清型１１Ａグリココンジュゲートの少なくとも３０％が、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する、態様７、１０、１６から１１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１１３］
前記血清型１１Ａグリココンジュゲートが、血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．３ｍＭのアセテートを含む、態様７、１０、１６から１１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１１４］
前記血清型１１Ａグリココンジュゲートが、血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも１．８ｍＭのアセテートを含む、態様７、１０、１６から１１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１１５］
血清型１１Ａグリココンジュゲート中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比が、少なくとも０．６である、態様７、１０、１６から１１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１１６］
血清型１１Ａグリココンジュゲート中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比が、少なくとも０．６である、態様７、１０、１６から１１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１１７］
前記血清型１１Ａグリココンジュゲートが、血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１ｍＭのグリセロールを含む、態様７、１０、１６から１１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１１８］
前記血清型１１Ａグリココンジュゲートが、血清型１１Ａ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．４ｍＭのグリセロールを含む、態様７、１０、１６から１１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１１９］
前記血清型１１Ａグリココンジュゲートのコンジュゲーション度が１～１５である、態様７、１０、１６から１１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１２０］
前記血清型１１Ａグリココンジュゲートが、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する糖類を含む、態様７、１０、１６から１１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１２１］
前記血清型１１Ａグリココンジュゲートの担体タンパク質が、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風毒素）、ＣＲＭ１９７、他のＤＴ変異体、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ）、またはその免疫学的に機能的な等価物からなる群において選択される、態様７、１０、１６から１２０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１２２］
前記血清型１１Ａグリココンジュゲートの担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、態様７、１０、１６から１２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１２３］
前記血清型１１Ａグリココンジュゲートが還元的アミノ化を用いて調製される、態様７、１０、１６から１２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１２４］
前記血清型８グリココンジュゲートが５０ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有する、態様８、１０、１７から１２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１２５］
前記血清型８グリココンジュゲートが１，０００ｋＤａ～１５，０００ｋＤａの分子量を有する、態様８、１０、１７から１２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１２６］
血清型８グリココンジュゲート中の血清型８莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．２～４である、態様８、１０、１７から１２５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１２７］
血清型８グリココンジュゲート中の血清型８莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．８～１．５である、態様８、１０、１７から１２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１２８］
前記血清型８グリココンジュゲートが、血清型８莢膜多糖の総量と比較して約５０％未満の遊離血清型８莢膜多糖を含む、態様８、１０、１７から１２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１２９］
血清型８グリココンジュゲートの少なくとも３０％が、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する、態様８、１０、１７から１２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１３０］
前記血清型８グリココンジュゲートのコンジュゲーション度が２～２０である、態様８、１０、１７から１２９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１３１］
前記血清型８グリココンジュゲートが、１０ｋＤａ～２，０００ｋＤａの分子量を有する糖類を含む、態様８、１０、１７から１３０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１３２］
前記血清型８グリココンジュゲートの担体タンパク質が、ＤＴ（ジフテリア毒素）、ＴＴ（破傷風毒素）、ＣＲＭ１９７、他のＤＴ変異体、ＰＤ（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ）、またはその免疫学的に機能的な等価物からなる群において選択される、態様８、１０、１７から１３１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１３３］
前記血清型８グリココンジュゲートの担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、態様８、１０、１７から１３２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１３４］
前記血清型８グリココンジュゲートが還元的アミノ化を用いて調製される、態様８、１０、１７から１３３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１３５］
各用量が０．１～１００μｇの各血清型の多糖を含む、態様１から１３４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１３６］
各用量が１～１０μｇの各血清型の多糖を含む、態様１から１３４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１３７］
各用量が、特定の各グリココンジュゲートについて約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．４μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．２μｇ、約５．４μｇ、約５．６μｇ、約５．８μｇまたは約６．０μｇの多糖を含む、態様１から１３６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１３８］
各用量が、存在する場合、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび／または３３Ｆに由来する各グリココンジュゲートについて約１．５μｇ～約３．０μｇの多糖を含み、存在する場合、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて約３．０μｇ～約６．０μｇの多糖を含む、態様１から１３４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１３９］
各用量が、１０μｇ～１５０μｇの担体タンパク質を含む、態様１から１３８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１４０］
前記担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、態様１から１３９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１４１］
各用量が、約２５μｇ、約２６μｇ、約２７μｇ、約２８μｇ、約２９μｇ、約３０μｇ、約３１μｇ、約３２μｇ、約３３μｇ、約３４μｇ、約３５μｇ、約３６μｇ、約３７μｇ、約３８μｇ、約３９μｇ、約４０μｇ、約４１μｇ、約４２μｇ、約４３μｇ、約４４μｇ、約４５μｇ、約４６μｇ、約４７μｇ、約４８μｇ、約４９μｇ、約５０μｇ、約５１μｇ、約５２μｇ、約５３μｇ、約５４μｇ、約５５μｇ、約５６μｇ、約５７μｇ、約５８μｇ、約５９μｇ、約６０μｇ、約６１μｇ、約６２μｇ、約６３μｇ、約６４μｇ、約６５μｇ、約６６μｇ、約６７μｇ、約６８μｇ、約６９μｇ、約７０μｇ、約７１μｇ、約７２μｇ、約７３μｇ、約７４μｇまたは約７５μｇの担体タンパク質を含む、態様１から１４０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１４２］
他の病原体に由来する抗原をさらに含む、態様１から１４１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１４３］
ジフテリアトキソイド（Ｄ）、破傷風トキソイド（Ｔ）、典型的には無細胞性（Ｐａ）である、百日咳抗原（Ｐ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原、コンジュゲート化ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖類（Ｈｉｂ）、不活化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）から選択される抗原をさらに含む、態様１から１４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１４４］
Ｄ－Ｔ－Ｐａをさらに含む、態様１から１４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１４５］
Ｄ－Ｔ－Ｐａ－Ｈｉｂをさらに含む、態様１から１４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１４６］
Ｄ－Ｔ－Ｐａ－ＩＰＶをさらに含む、態様１から１４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１４７］
Ｄ－Ｔ－Ｐａ－ＨＢｓＡｇをさらに含む、態様１から１４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１４８］
Ｄ－Ｔ－Ｐａ－ＨＢｓＡｇ－ＩＰＶをさらに含む、態様１から１４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１４９］
Ｄ－Ｔ－Ｐａ－ＨＢｓＡｇ－Ｈｉｂをさらに含む、態様１から１４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１５０］
Ｄ－Ｔ－Ｐａ－ＨＢｓＡｇ－ＩＰＶ－Ｈｉｂをさらに含む、態様１から１４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１５１］
コンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ莢膜糖類（ＭｅｎＹ）をさらに含む、態様１から１５０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１５２］
コンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ莢膜糖類（ＭｅｎＣ）をさらに含む、態様１から１５１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１５３］
コンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ莢膜糖類（ＭｅｎＡ）をさらに含む、態様１から１５２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１５４］
コンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５莢膜糖類（ＭｅｎＷ１３５）をさらに含む、態様１から１５３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１５５］
コンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ莢膜糖類（ＭｅｎＹ）、およびコンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ莢膜糖類（ＭｅｎＣ）をさらに含む、態様１から１５０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１５６］
コンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５莢膜糖類（ＭｅｎＷ１３５）、コンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ莢膜糖類（ＭｅｎＹ）、および／またはコンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ莢膜糖類（ＭｅｎＣ）をさらに含む、態様１から１５０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１５７］
コンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ莢膜糖類（ＭｅｎＡ）、コンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５莢膜糖類（ＭｅｎＷ１３５）、コンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ莢膜糖類（ＭｅｎＹ）、および／またはコンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ莢膜糖類（ＭｅｎＣ）をさらに含む、態様１から１５０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１５８］
少なくとも１つのアジュバント、最も好ましくは、本明細書に開示されるアジュバントのいずれかをさらに含む、態様１から１５７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１５９］
ミョウバン（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、リン酸カルシウム、リポソーム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖトリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５））などの水中油乳濁液、モンタニドなどの油中水乳濁液、およびポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧ）マイクロ粒子またはナノ粒子からなる群から選択される少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、態様１から１５７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１６０］
リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、態様１から１５７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１６１］
アジュバントとしてリン酸アルミニウムをさらに含む、態様１から１５７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１６２］
アジュバントとして硫酸アルミニウムをさらに含む、態様１から１５７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１６３］
アジュバントとして水酸化アルミニウムをさらに含む、態様１から１５７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１６４］
アジュバントとしてリン酸アルミニウムの形態の０．１ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬのアルミニウム元素を含む、態様１から１５７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１６５］
アジュバントとしてリン酸アルミニウムの形態の０．２ｍｇ／ｍＬ～０．３ｍｇ／ｍＬのアルミニウム元素を含む、態様１から１５７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１６６］
アジュバントとしてリン酸アルミニウムの形態の約０．２５ｍｇ／ｍＬのアルミニウム元素を含む、態様１から１５７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１６７］
アジュバントとしてＣｐＧオリゴヌクレオチド、好ましくは、本明細書に開示されるＣｐＧオリゴヌクレオチドのいずれかを含む、態様１から１６６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１６８］
液体形態で製剤化された、態様１から１６７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１６９］
凍結乾燥形態で製剤化された、態様１から１６７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１７０］
水性液体形態で製剤化された、態様１から１６７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１７１］
緩衝液、塩、二価陽イオン、非イオン性界面活性剤、糖などの凍結防止剤、およびフリーラジカルスカベンジャーもしくはキレート剤などの酸化防止剤のうちの１つもしくは複数、またはその任意の複数の組合せを含む、態様１から１７０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１７２］
緩衝液を含む、態様１から１７０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１７３］
前記緩衝液が約３．５～約７．５のｐＫａを有する、態様１７１に記載の免疫原性組成物。
［態様１７４］
前記緩衝液が、リン酸、コハク酸、ヒスチジンまたはクエン酸である、態様１７２または１７３に記載の免疫原性組成物。
［態様１７５］
前記緩衝液が１ｍＭ～１０ｍＭの最終濃度のコハク酸緩衝液である、態様１７２に記載の免疫原性組成物。
［態様１７６］
前記緩衝液が約５ｍＭの最終濃度のコハク酸緩衝液である、態様１７２に記載の免疫原性組成物。
［態様１７７］
塩を含む、態様１から１７６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１７８］
前記塩が、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたはその組合せからなる群から選択される、態様１７７に記載の免疫原性組成物。
［態様１７９］
前記塩が塩化ナトリウムである、態様１７７に記載の免疫原性組成物。
［態様１８０］
１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、態様１７７に記載の免疫原性組成物。
［態様１８１］
界面活性剤を含む、態様１から１８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１８２］
前記界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｎ－１ ０１、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、オキシトキシノール４０、ノノキシノール－９、トリエタノールアミン、トリエタノールアミンポリペプチドオレエート、ポリオキシエチレン－６６０、ヒドロキシステアリン酸、ポリオキシエチレン－３５－リシノレエート、大豆レシチンおよびポロキサマーの群から選択される、態様１８１に記載の免疫原性組成物。
［態様１８３］
前記界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８５およびポロキサマーの群から選択される、態様１８１に記載の免疫原性組成物。
［態様１８４］
前記界面活性剤がポリソルベート８０である、態様１８１に記載の免疫原性組成物。
［態様１８５］
製剤中のポリソルベート８０の最終濃度が、少なくとも０．０００１％～１０％重量／重量（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０である、態様１８４に記載の免疫原性組成物。
［態様１８６］
製剤中のポリソルベート８０の最終濃度が、少なくとも０．００１％～１％重量／重量（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０である、態様１８４に記載の免疫原性組成物。
［態様１８７］
製剤中のポリソルベート８０の最終濃度が、少なくとも０．０１％～１％重量／重量（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０である、態様１８４に記載の免疫原性組成物。
［態様１８８］
製剤中のポリソルベート８０の最終濃度が、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％または０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０である、態様１８４に記載の免疫原性組成物。
［態様１８９］
５．５～７．５のｐＨを有する、態様１から１８８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１９０］
５．６～７．０のｐＨを有する、態様１から１８８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１９１］
５．８～６．０のｐＨを有する、態様１から１８８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様１９２］
態様１から１９１または２２８から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物のいずれかを充填した容器。
［態様１９３］
バイアル、シリンジ、フラスコ、発酵器、バイオリアクター、バッグ、ジャー、アンプル、カートリッジおよび使い捨て型ペンからなる群から選択される、態様１９２に記載の容器。
［態様１９４］
シリコン処理されている、態様１９２または１９３に記載の容器。
［態様１９５］
ガラス、金属（例えば、スチール、ステンレススチール、アルミニウムなど）および／またはポリマー（例えば、熱可塑性物質、エラストマー、熱可塑性エラストマー）から作られている、態様１９２から１９４のいずれか一項に記載の容器。
［態様１９６］
ガラスから作られている、態様１９２から１９４のいずれか一項に記載の容器。
［態様１９７］
態様１から１９１または２２８から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物のいずれかを充填したシリンジ。
［態様１９８］
シリコン処理されている、および／またはガラスから作られている、態様１９７に記載のシリンジ。
［態様１９９］
０．１ｍＬ～２ｍＬの容量の前記免疫原性組成物を充填した、態様１９２から１９８のいずれか一項に記載の容器またはシリンジ。
［態様２００］
約０．５ｍｌの容量の前記免疫原性組成物を充填した、態様１９２から１９８のいずれか一項に記載の容器またはシリンジ。
［態様２０１］
薬剤としての使用のための態様１から１９１または２２８から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２０２］
ワクチンとしての使用のための態様１から１９１または２２８から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２０３］
対象における細菌感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善するための方法における使用のための態様１から１９１または２２８から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２０４］
対象における細菌感染、疾患または状態を防止するための方法における使用のための態様１から１９１または２２８から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２０５］
全身経路または粘膜経路により前記免疫原性組成物を投与することにより、肺炎球菌感染に罹りやすいヒトを保護または処置するための方法における使用のための態様１から１９１、２２８から２８０または２０１から２０４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２０６］
筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路により投与される、態様２０５に記載の免疫原性組成物。
［態様２０７］
筋肉内、腹腔内、皮内または皮下注射により投与される、態様２０５に記載の免疫原性組成物。
［態様２０８］
対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連する感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善する方法であって、対象に、免疫学的に有効な量の態様１から１９１または２２８から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む方法。
［態様２０９］
対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を防止する方法であって、対象に、免疫学的に有効な量の態様１から１９１または２２８から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与することを含む方法。
［態様２１０］
ワクチン接種しようとする対象が１歳未満のヒトである、ワクチンとしての使用のための態様１から１９１、２２８から２８０または２０１から２０７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２１１］
ワクチン接種しようとする対象が２歳未満のヒトである、ワクチンとしての使用のための態様１から１９１、２２８から２８０または２０１から２０７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２１２］
ワクチン接種しようとする対象が５０歳以上の成人である、ワクチンとしての使用のための態様１から１９１、２２８から２８０または２０１から２０７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２１３］
ワクチン接種しようとする対象が免疫障害を有するヒトである、ワクチンとしての使用のための態様１から１９１、２２８から２８０、２０１から２０７、または２１０から２１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２１４］
単回用量スケジュールにおける使用のための態様１から１９１、２２８から２８０、２０１から２０７、または２１０から２１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２１５］
複数回用量スケジュールにおける使用のための態様１から１９１、２２８から２８０、２０１から２０７、または２１０から２１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２１６］
前記複数回用量スケジュールが、約１カ月～約２カ月の間隔で隔てられた２回用量シリーズからなる、態様２１５に記載の免疫原性組成物。
［態様２１７］
前記複数回用量スケジュールが、約１カ月～約２カ月の間隔で隔てられた３回用量シリーズからなる、態様２１５に記載の免疫原性組成物。
［態様２１８］
前記複数回用量スケジュールが、約１カ月～約２カ月の間隔で隔てられた３回用量シリーズ、およびそれに続く、１回目の用量の約１０カ月～約１３カ月後の４回目の用量からなる、態様２１５に記載の免疫原性組成物。
［態様２１９］
前記複数回用量スケジュールが、１歳目における少なくとも１回の用量、およびそれに続く、少なくとも１回の幼児用量からなる、態様２１５に記載の免疫原性組成物。
［態様２２０］
前記複数回用量スケジュールが、２カ月齢で開始する、約１カ月～約２カ月の間隔で隔てられた一連の２回または３回用量、およびそれに続く、１２～１８カ月齢での幼児用量からなる、態様２１５に記載の免疫原性組成物。
［態様２２１］
前記複数回用量スケジュールが、２、４、６および１２～１５カ月齢での４回用量シリーズのワクチンからなる、態様２１５に記載の免疫原性組成物。
［態様２２２］
対象に投与された場合、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにより測定される、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂおよび１５Ｃに結合することができる抗体の形成を誘導することができる、態様２から１９１、２０１から２０７、または２１０から２２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２２３］
対象に投与された場合、オプソニン貪食作用アッセイにおいてストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂを殺傷することができる抗体の形成を誘導することができる、態様２から１９１、２０１から２０７、または２１０から２２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２２４］
対象に投与された場合、オプソニン貪食作用アッセイにおいてストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂおよび１５Ｃを殺傷することができる抗体の形成を誘導することができる、態様２から１９１、２０１から２０７、または２１０から２２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２２５］
対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／または１５Ｃと関連するストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、疾患または状態を処置する、または防止する方法であって、治療的または予防的に有効な量の、態様２から１９１、２０１から２０７、または２１０から２２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
［態様２２６］
対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂおよび／または１５Ｃと関連するストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染を防止する方法であって、予防的に有効な量の、態様２から１９１、２０１から２０７、または２１０から２２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
［態様２２７］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染に対して対象を保護する、ならびに／またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を防止する、ならびに／またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減する、もしくはその開始を遅延させる、ならびに／または血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染に対して対象を保護する、ならびに／または血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を防止する、ならびに／または血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ（好ましくは、１５Ｂおよび／もしくは１５Ｃ、より好ましくは、１５Ｂ）ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減する、もしくはその開始を遅延させる方法における使用のための、態様２から１９１、２０１から２０７、または２１０から２２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２２８］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎに由来する莢膜糖類を含まない、態様１から１９１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２２９］
前記組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ａに由来する莢膜糖類を含まない、態様１から１９１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２３０］
前記組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｌに由来する莢膜糖類を含まない、態様１から１９１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２３１］
前記組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎおよび９Ａに由来する莢膜糖類を含まない、態様１から１９１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２３２］
前記組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎおよび９Ｌに由来する莢膜糖類を含まない、態様１から１９１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２３３］
前記組成物が、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ａおよび９Ｌに由来する莢膜糖類を含まない、態様１から１９１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２３４］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎ、９Ａおよび９Ｌに由来する莢膜糖類を含まない、態様１から１９１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２３５］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｖに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様１から１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２３６］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来するグリココンジュゲートをさらに含む、態様２３５に記載の免疫原性組成物。
［態様２３７］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様２３５または２３６に記載の免疫原性組成物。
［態様２３８］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型５に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様２３５から２３７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２３９］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型７Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様２３５から２３８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２４０］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、５および７Ｆに由来するグリココンジュゲートをさらに含む、態様２３５から２３９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２４１］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様２３５から２４０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２４２］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様２３５から２４１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２４３］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａおよび１９Ａに由来するグリココンジュゲートをさらに含む、態様２３５から２４０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２４４］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様２３５から２４３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２４５］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様１から１９１または２３５から２４４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２４６］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１７Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様１から１９１または２３５から２４５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２４７］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２０に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様１から１９１または２３５から２４６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２４８］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２、１７Ｆおよび２０に由来するグリココンジュゲートをさらに含む、態様１から１９１または２３５から２４４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２４９］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｃに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、態様１から１９１または２３５から２４８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２５０］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎに由来する莢膜糖類を含まない、態様２３５から２４９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２５１］
前記組成物が、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ａに由来する莢膜糖類を含まない、態様２３５から２４９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２５２］
前記組成物が、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｌに由来する莢膜糖類を含まない、態様２３５から２４９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２５３］
前記組成物が、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎおよび９Ａに由来する莢膜糖類を含まない、態様２３５から２４９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２５４］
前記組成物が、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎおよび９Ｌに由来する莢膜糖類を含まない、態様２３５から２４９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２５５］
前記組成物が、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ａおよび９Ｌに由来する莢膜糖類を含まない、態様２３５から２４９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２５６］
前記組成物が、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型９Ｎ、９Ａおよび９Ｌに由来する莢膜糖類を含まない、態様２３５から２４９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２５７］
７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４価肺炎球菌コンジュゲート組成物である、態様２３５から２５６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２５８］
１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０価肺炎球菌コンジュゲート組成物である、態様２３５から２５６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２５９］
１６価肺炎球菌コンジュゲート組成物である、態様２３５から２５６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２６０］
２０価肺炎球菌コンジュゲート組成物である、態様２３５から２５６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２６１］
前記グリココンジュゲートがＣＲＭ１９７に個別にコンジュゲートされている、態様２３５から２６０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２６２］
全てのグリココンジュゲートがＣＲＭ１９７に個別にコンジュゲートされている、態様２３５から２６０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２６３］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および／または２３Ｆに由来するグリココンジュゲートがＰＤに個別にコンジュゲートされている、態様２３５から２６０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２６４］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１８Ｃに由来するグリココンジュゲートがＴＴにコンジュゲートされている、態様２３６から２６０または２６３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２６５］
ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆに由来するグリココンジュゲートがＤＴにコンジュゲートされている、態様２３６から２６０または２６４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２６６］
存在する場合、前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、態様３２から４９のいずれか一項に記載の通りである、態様２３５から２６５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２６７］
存在する場合、前記血清型２２Ｆグリココンジュゲートが、態様５０から６４のいずれか一項に記載の通りである、態様２３５から２６６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２６８］
存在する場合、前記血清型３３Ｆグリココンジュゲートが、態様６５から８２のいずれか一項に記載の通りである、態様２３５から２６７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２６９］
存在する場合、前記血清型１２Ｆグリココンジュゲートが、態様８３から９５のいずれか一項に記載の通りである、態様２３５から２６８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２７０］
存在する場合、前記血清型１０Ａグリココンジュゲートが、態様９６から１０６のいずれか一項に記載の通りである、態様２３５から２６９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２７１］
存在する場合、前記血清型１１Ａグリココンジュゲートが、態様１０７から１２３のいずれか一項に記載の通りである、態様２３５から２７０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２７２］
存在する場合、前記血清型８グリココンジュゲートが、態様１２４から１３４のいずれか一項に記載の通りである、態様２３５から２７１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２７３］
各用量が０．１μｇ～１００μｇの各血清型の多糖を含む、態様２２８から２７２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２７４］
各用量が１０μｇ～１５０μｇの担体タンパク質を含む、態様２２８から２７３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２７５］
他の病原体に由来する抗原をさらに含む、態様２２８から２７４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２７６］
態様１４３から１５７のいずれか一項に記載の抗原をさらに含む、態様２２８から２７４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２７７］
少なくとも１つのアジュバント、最も好ましくは、本明細書に開示される任意のアジュバントをさらに含む、態様２２８から２７６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２７８］
リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、態様２２８から２７６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２７９］
アジュバントとしてリン酸アルミニウムをさらに含む、態様２２８から２７６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２８０］
態様１６８から１９１のいずれか一項に記載のように製剤化された、態様２２８から２７６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
［態様２８１］
対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ａ、１５Ｂおよび／または１５Ｃに対する免疫応答を誘導する方法であって、治療的または予防的に有効な量の、態様２から１９１、２２２から２２４または２２７から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
［態様２８２］
対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに対する免疫応答を誘導する方法であって、治療的または予防的に有効な量の、態様３から１９１、２２２から２２４または２２７から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
［態様２８３］
対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに対する免疫応答を誘導する方法であって、治療的または予防的に有効な量の、態様４から１９１、２２２から２２４または２２７から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
［態様２８４］
対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに対する免疫応答を誘導する方法であって、治療的または予防的に有効な量の、態様５から１９１、２２２から２２４または２２７から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
［態様２８５］
対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに対する免疫応答を誘導する方法であって、治療的または予防的に有効な量の、態様６から１９１、２２２から２２４または２２７から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
［態様２８６］
対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに対する免疫応答を誘導する方法であって、治療的または予防的に有効な量の、態様７から１９１、２２２から２２４または２２７から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
［態様２８７］
対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に対する免疫応答を誘導する方法であって、治療的または予防的に有効な量の、態様８から１９１、２２２から２２４または２２７から２８０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与するステップを含む方法。
前記発明を、理解の明確性のために例示および実施例によりいくらか詳細に説明してきたが、ある特定の変化および改変を、添付の特許請求の範囲内で実行することができる。

Claims (64)

  1. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来するグリココンジュゲートを含む免疫原性組成物であって、前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートは還元的アミノ化によって調製され、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．６ｍＭのアセテートを含み、そして、１５０ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有する血清型１５Ｂ多糖を含み、ここにおいて前記グリココンジュゲートは、ＣＲＭ１９７からなる担体タンパク質にコンジュゲートされており、ここにおいて前記組成物は、血清型１５Ｂ莢膜多糖の総量と比較して約１５％未満の遊離血清型１５Ｂ莢膜多糖を含む、前記免疫原性組成物。
  2. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  3. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、請求項１－２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  4. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、請求項１－３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  5. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、請求項１－４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  6. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、請求項１－５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  7. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、請求項１－６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  8. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートおよびストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  9. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３３Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１２Ｆに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１０Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲート、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１１Ａに由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートおよびストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型８に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
  10. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来するグリココンジュゲートをさらに含む、請求項１－９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  11. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、５および７Ｆに由来するグリココンジュゲートをさらに含む、請求項１－１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  12. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ａおよび１９Ａに由来するグリココンジュゲートをさらに含む、請求項１－１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  13. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型３に由来する少なくとも１つのグリココンジュゲートをさらに含む、請求項１－１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  14. ８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０価肺炎球菌コンジュゲート組成物である、請求項１－１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  15. １４、１５、１６、１７、１８または１９価肺炎球菌コンジュゲート組成物である、請求項１－１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  16. １６価肺炎球菌コンジュゲート組成物である、請求項１－１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  17. １９価肺炎球菌コンジュゲート組成物である、請求項１－１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  18. ２０価肺炎球菌コンジュゲート組成物である、請求項１－１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  19. 前記グリココンジュゲートがＣＲＭ１９７に個別にコンジュゲートされている、請求項１－１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  20. 全てのグリココンジュゲートがＣＲＭ１９７に個別にコンジュゲートされている、請求項１－１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  21. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４および／または２３Ｆに由来するグリココンジュゲートがＰＤに個別にコンジュゲートされている、請求項１１－１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  22. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１８Ｃに由来するグリココンジュゲートがＴＴにコンジュゲートされている、請求項１０－１８または２１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  23. ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１９Ｆに由来するグリココンジュゲートがＤＴにコンジュゲートされている、請求項１０－１８または２１－２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  24. 前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが１０００ｋＤａ～２０，０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１－２３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  25. 前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが１０，０００ｋＤａ～１６，０００ｋＤａの分子量を有する、請求項１－２４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  26. 血清型１５Ｂグリココンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．５～３である、請求項１－２５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  27. 血清型１５Ｂグリココンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．７～０．９である、請求項１－２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  28. 血清型１５Ｂグリココンジュゲートの少なくとも４０％が、ＣＬ－４Ｂカラム中で０．３より低いか、またはそれと等しいＫｄを有する、請求項１－２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  29. 前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのアセテートを含む、請求項１－２８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  30. 血清型１５Ｂグリココンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、単離された多糖中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比が、少なくとも０．６である、請求項１－２９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  31. 血清型１５Ｂグリココンジュゲート中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭの、活性化された多糖中の血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたりのアセテートのｍＭに対する比が、少なくとも０．６である、請求項１－３０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  32. 前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１ｍＭのグリセロールを含む、請求項１－３１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  33. 前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．５ｍＭのグリセロールを含む、請求項１－３２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  34. 前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートが、血清型１５Ｂ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．７ｍＭのグリセロールを含む、請求項１－３３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  35. 前記血清型１５Ｂグリココンジュゲートのコンジュゲーション度が２～１５である、請求項１－３４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  36. 前記血清型２２Ｆグリココンジュゲートが１，０００ｋＤａ～１２，５００ｋＤａの分子量を有し、そして、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２２Ｆに由来する単離された莢膜多糖及び担体タンパク質を含み、
    前記莢膜多糖の担体タンパク質に対する比（ｗ／ｗ）が０．４～２であり、そして、
    前記血清型２２Ｆグリココンジュゲートが、血清型２２Ｆ莢膜多糖１ｍＭあたり少なくとも０．１ｍＭのアセテートを含む、
    請求項２－３５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  37. 各用量が０．１～１００μｇの各血清型の多糖を含む、請求項１－３６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  38. 各用量が、特定の各グリココンジュゲートについて約１．０μｇ、約１．２μｇ、約１．４μｇ、約１．６μｇ、約１．８μｇ、約２．０μｇ、約２．２μｇ、約２．４μｇ、約２．６μｇ、約２．８μｇ、約３．０μｇ、約３．２μｇ、約３．４μｇ、約３．６μｇ、約３．８μｇ、約４．０μｇ、約４．２μｇ、約４．４μｇ、約４．６μｇ、約４．８μｇ、約５．０μｇ、約５．２μｇ、約５．４μｇ、約５．６μｇ、約５．８μｇまたは約６．０μｇの多糖を含む、請求項１－３７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  39. 各用量が、存在する場合、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１、３、４、５、６Ａ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆおよび／または３３Ｆに由来する各グリココンジュゲートについて約１．５μｇ～約３．０μｇの多糖を含み、存在する場合、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型６Ｂに由来するグリココンジュゲートについて約３．０μｇ～約６．０μｇの多糖を含む、請求項１－３７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  40. 各用量が、１０μｇ～１５０μｇの担体タンパク質を含む、請求項１－３９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  41. 他の病原体に由来する抗原をさらに含む、請求項１－４０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  42. ジフテリアトキソイド（Ｄ）、破傷風トキソイド（Ｔ）、典型的には無細胞性（Ｐａ）である、百日咳抗原（Ｐ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）抗原、コンジュゲート化ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型莢膜糖類（Ｈｉｂ）、不活化ポリオウイルスワクチン（ＩＰＶ）から選択される抗原をさらに含む、請求項１－４１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  43. コンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ａ莢膜糖類（ＭｅｎＡ）、コンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｗ１３５莢膜糖類（ＭｅｎＷ１３５）、コンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｙ莢膜糖類（ＭｅｎＹ）、および／またはコンジュゲート化されたナイセリア・メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清群Ｃ莢膜糖類（ＭｅｎＣ）をさらに含む、請求項１－４２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  44. 少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、請求項１－４３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  45. ミョウバン（例えば、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）、リン酸カルシウム、リポソーム、ＭＦ５９（４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．５％ｗ／ｖポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、０．５％ｗ／ｖトリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５））などの水中油乳濁液、モンタニドなどの油中水乳濁液、およびポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧ）マイクロ粒子またはナノ粒子からなる群から選択される少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、請求項１－４３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  46. リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される少なくとも１つのアジュバントをさらに含む、請求項１－４３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  47. 緩衝液を含む、請求項１－４６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  48. 前記緩衝液が約５ｍＭの最終濃度のコハク酸緩衝液である、請求項４７に記載の免疫原性組成物。
  49. 塩を含む、請求項１－４８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  50. １５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、請求項４９に記載の免疫原性組成物。
  51. 界面活性剤を含む、請求項１－５０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  52. 前記界面活性剤がポリソルベート８０である、請求項５１に記載の免疫原性組成物。
  53. 製剤中のポリソルベート８０の最終濃度が、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％または０．１％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０である、請求項５２に記載の免疫原性組成物。
  54. ５．８～６．０のｐＨを有する、請求項１－５３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  55. 請求項１－５４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物のいずれかを充填したシリンジ。
  56. ワクチンとしての使用のための請求項１－５４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  57. 対象における細菌感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善するための方法における使用のための請求項１－５４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  58. 全身経路または粘膜経路により前記免疫原性組成物を投与することにより、肺炎球菌感染に罹りやすいヒトを保護または処置するための方法における使用のための請求項１－５４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  59. 対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）と関連する感染、疾患または状態を防止する、処置する、または改善する方法において使用するための、請求項１－５４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  60. 対象に投与された場合、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにより測定される、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂおよび１５Ｃに結合することができる抗体の形成を誘導することができる、請求項１－５４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  61. 対象に投与された場合、オプソニン貪食作用アッセイにおいてストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂおよび１５Ｃを殺傷することができる抗体の形成を誘導することができる、請求項１－５４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  62. 対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂおよび／または１５Ｃと関連するストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染、疾患または状態を処置する、または防止する方法において使用するための、請求項１－５４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  63. 以下の：
    －血清型１５Ｂもしくは１５Ｃストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染に対して対象を保護する方法；
    －血清型１５Ｂもしくは１５Ｃストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）による感染を防止する方法；および
    －血清型１５Ｂもしくは１５Ｃストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）により引き起こされる感染と関連する少なくとも１つの症状の重症度を軽減する、もしくはその開始を遅延させる方法
    からなるグループから選択される方法における使用のための請求項１－５４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
  64. 対象におけるストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型１５Ｂおよび／または１５Ｃに対する免疫応答を誘導する方法において使用するための、請求項１－５４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
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