CN101522906B - 肺炎链球菌3型多糖的纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明提供减少或去除含血清3型多糖的复杂细胞肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)溶胞产物或分离物中的蛋白质杂质的改进方法，所述方法涉及与溶胞后加热或pH调节有关的步骤。在某些方法中，将所述溶胞产物在一定温度下加热一定时间，所述温度和时间足以使所述溶胞产物中存在的蛋白质变性并使其聚集和沉淀。在一个实施例中，将所述溶胞产物加热到至少60℃并保持至少30分钟以使蛋白质聚集和沉淀，更具体地加热到约60℃至约70℃并保持约30分钟至约50分钟，且甚至更具体地加热到约65℃并保持约40分钟。在其它方法中，使所述溶胞产物或分离物的pH值增加到至少8.0、更具体地约8.0至8.4且甚至更具体地约8.2以提高过滤性。在其它方法中，将加热和pH调节步骤组合以使蛋白质聚集和沉淀，以及提高溶胞产物或分离物的过滤性。在其它方法中，使所述溶胞产物或分离物的pH值降低到约3.0至约5.0以使蛋白质聚集和沉淀。所述方法允许制造实质上纯的含血清3型多糖的溶胞产物或分离物。

Description

肺炎链球菌3型多糖的纯化
技术领域
本发明关于减少或去除含血清3型多糖的复杂细胞肺炎链球菌溶胞产物或分离物中的蛋白质杂质的改进方法，所述方法涉及加热或pH调节步骤。
背景技术
在制备用于预防由有机体的肺炎链球菌(也称为肺炎球菌)造成的侵入性疾病的多价肺炎球菌结合疫苗中，使选定肺炎链球菌血清型生长以供应制备疫苗所需的多糖。细胞是在大发酵罐中生长，同时在发酵结束时通过添加脱氧胆酸钠(DOC)或替代溶胞剂来引发溶胞。然后收集溶胞产物培养液用于下游纯化并回收围绕着细菌细胞的荚膜多糖。与载体蛋白结合后，多糖包含在最终疫苗产物中并赋予疫苗的目标种群对选定肺炎链球菌血清型的免疫性。
尽管以此工艺产生的细胞溶胞产物包含目标多糖，但其还包含大量细胞碎片，其包括DNA、RNA、蛋白质和残余培养基组份。传统的处理涉及通过添加乙酸来使溶胞产物的最低限度pH值降低到6.6以帮助溶胞剂和一些杂质沉淀出。将此物质进行离心，随后过滤以去除标称尺寸大于0.45μm的大部分固体。然而，所述传统的处理方法展示最低程度的杂质去除，同时随后难以去除可溶蛋白以符合纯化多糖规定。
在针对某些血清型的试验中，高含量的污染可溶蛋白尤其成问题。一些血清型、尤其肺炎链球菌3型产生大且粘的多糖链(例如，对于3型而言，2-3百万道尔顿(Dalton)的葡萄糖/葡萄糖醛酸的链)，当细胞溶胞时这些多糖链释放于生长培养基中。其粘性使其在离心后难以过滤，且在所述情况中，通过纯化工艺已不足以去除蛋白质且导致试验失败。
因此，需要用于自复杂细胞肺炎链球菌溶胞产物、尤其含肺炎链球菌3型多糖的溶胞产物去除蛋白质杂质的改良方法。
发明内容
提供减少或去除含血清3型多糖的复杂细胞肺炎链球菌溶胞产物或分离物中的蛋白质杂质的改进方法。在一种方法中，将含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物在一定温度下加热一定时间以足以使溶胞产物中存在的蛋白质变性并使其聚集和沉淀。因此，在本发明的一个实施例中，所述方法包含以下步骤：1)将溶胞产物加热到至少60℃并保持至少30分钟以使蛋白质聚集和沉淀；及2)从溶胞产物中分离出沉淀物；其中产生实质上纯的含血清3型多糖的溶胞产物。在特定实施例中，将溶胞产物加热到约60℃至约70℃并保持约30分钟至约50分钟。在另一特定实施例中，将溶胞产物加热到约65℃并保持约40分钟。在其它实施例中，分离步骤包含使用膜过滤器、尤其0.45μm孔径膜过滤器过滤溶胞产物以去除沉淀物。在另一实施例中，分离步骤包含使用深度过滤器来过滤溶胞产物以去除沉淀物。在另一特定实施例中，从溶胞产物中分离出沉淀物的步骤包含使溶胞产物离心以去除沉淀物。
在本发明另一实施例中，提供一种用于减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物或分离物中的蛋白质杂质的方法，所述方法包含涉及溶胞产物或分离物的pH调节的步骤。在此实施例中，pH调节步骤提高过滤性。在特定实施例中，使溶胞产物或分离物的pH值在过滤之前增加到至少8.0、特定而言在过滤之前增加到约8.0至约8.4之间、且更具体地在过滤之前增加到约8.2。在其它实施例中，过滤步骤包含使用膜过滤器、尤其0.45μm孔径膜过滤器过滤溶胞产物或分离物。在另一实施例中，过滤步骤包含使用深度过滤器过滤溶胞产物或分离物。
在本发明另一实施例中，提供减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物中的蛋白质杂质的方法，所述方法包含将溶胞产物加热步骤与涉溶胞产物或通过溶胞产物离心所产生的分离物的pH调节的步骤组合。在此实施例中，pH调节步骤提高过滤性。因此，在一个实施例中，所述方法包含以下步骤：1)将溶胞产物加热到至少60℃并保持至少30分钟以使蛋白质聚集和沉淀；2)使溶胞产物离心并从溶胞产物中分离出沉淀的蛋白质以产生分离物；3)使分离物的pH值增加到至少8.0；并4)过滤分离物；其中产生实质上纯的含血清3型多糖的分离物。在特定实施例中，在离心之前将溶胞产物加热到约60℃至约70℃并保持约30分钟至约50分钟、更具体地加热到约60℃并保持约40分钟。在另一实施例中，在过滤之前使分离物的pH值增加到介于约8.0至约8.4之间、具体地约8.2。在其它实施例中，过滤步骤包含使用膜过滤器、更具体地0.45μm孔径膜过滤器过滤溶胞产物以去除沉淀物。在另一实施例中，过滤步骤包含使用深度过滤器过滤溶胞产物以去除沉淀物。
在本发明另一实施例中，提供减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物或分离物中的蛋白质杂质的方法，所述方法包含pH调节步骤以使蛋白质聚集和沉淀。在此实施例中，所述方法包含以下步骤：1)使所述溶胞产物的pH值降低到约3.0至约5.0以使蛋白质聚集和沉淀；2)使所述溶胞产物离心并从所述溶胞产物中分离出沉淀的蛋白质以产生分离物；3)使分离物的pH值增加到至少8.0；及4)过滤分离物；其中产生实质上纯的含血清3型多糖的分离物。在特定实施例中，在离心之前使溶胞产物的pH值降低到约3.0。在另一特定实施例中，在过滤之前使分离物的pH值增加到介于约8.0至约8.4之间、更具体地约8.2。在其它实施例中，pH调节步骤以使蛋白质聚集和沉淀进一步包含将溶胞产物加热到至少60℃并保持至少30分钟，更具体地加热到约60℃至约70℃并保持约30分钟至约50分钟，且甚至更具体地加热到约60℃并保持约40分钟。在其它实施例中，过滤步骤包含使用膜过滤器、更具体地0.45μm孔径膜过滤器过滤溶胞产物以去除沉淀物。在另一实施例中，过滤步骤包含使用深度过滤器过滤溶胞产物以去除沉淀物。
附图说明
图1展示来自血清3型溶胞产物在各种加热条件和保持时间的实验室研究的多糖产率。数据展示为未加热处理样品值的百分数以展示经处理样品的蛋白质损失相对百分比(100％相当于无损失)。
图2展示对于血清3型溶胞产物在各种加热条件和保持时间下的实验室研究的蛋白质产率。数据展示为未加热处理样品值的百分数以展示经处理样品的蛋白质损失相对百分比(100％相当于无损失)。
图3展示时间(左边)和温度(右边)对血清3型溶胞产物中蛋白质(顶部)和多糖(PS，底部)浓度的作用的经调节响应曲线图。“经调节PS％”和“经调节蛋白质％”值分别代表多糖和蛋白质浓度在不同时间点和温度点下相对于时间＝0分钟和室温(其代表蛋白质和多糖浓度的100％值)的百分数。
图4展示由温度和时间条件绘制的来自血清3型溶胞产物的总蛋白质百分比的等高线图。剩余可溶蛋白的百分数展示于曲线图上的弯曲线条中。在60℃-70℃下保持30-50分钟的范围由方框突出显示。
图5展示SDS-PAGE凝胶，其展示可溶蛋白自经热处理细胞的溶胞产物的去除。未经热处理的泳道在左边(IPPPN3-007)且经热处理的泳道在右边(IPPPN3-011)。
图6展示经过相同的沉淀物沉降时间之后比较经热处理(右边)和未经热处理(左边)血清3型溶胞产物的照片。
图7展示血清3型分离物的多糖(PS)浓度、蛋白质浓度、和相对过滤性随分离物pH值变化的曲线图。展示对应于5次试验的5组条形图。多糖浓度(mg/mL)和蛋白质浓度(g/10L)提供于左边y轴上。相对过滤性值提供于右边y轴上，其对应于使约3mL的血清3型分离物通过0.45μm针头过滤器所需的相对力，其等级为1到5(1＝容易，5＝困难)。
图8展示依据分离物pH值比较血清3型分离物样品通过深度过滤器随时间的流率的曲线图。流率(y轴)是通过计算每分钟的过滤比率来测量，其中将时间(以分钟表示)除以在这一分钟内通过过滤器的分离物的总重量(以克表示)(比率越低，流率越高)。将分离物样品调节至不同pH值(5.0至8.5)并使其在不同恒定压力条件(5-20磅/平方英寸(psi))下通过过滤器。
具体实施方式
本发明提供用于减少或去除含血清3型多糖的复杂细胞肺炎链球菌溶胞产物或分离物中的蛋白质杂质的改进方法，所述方法涉及与溶胞后加热或pH调节有关的步骤。在某些方法中，将溶胞产物在一定温度下加热一定时间以足以使溶胞产物中存在的蛋白质变性并使其聚集和沉淀。在其它方法中，对溶胞产物、或通过使所述溶胞产物离心所产生的分离物进行pH调节以提高过滤性或使蛋白质聚集和沉淀。在其它方法中，将加热和pH调节步骤合并以使蛋白质聚集和沉淀以及提高溶胞产物或分离物的过滤性。所述方法允许产生实质上纯的含血清3型多糖的溶胞产物或分离物。
本文所用术语“实质上纯的含血清3型多糖的溶胞产物”或“实质上纯的含血清3型多糖的分离物”是指已去除蛋白质而使得与去除蛋白质之前溶胞产物或分离物的蛋白质浓度相比溶胞产物或分离物的相对蛋白质浓度小于约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％或约1％蛋白质的细胞肺炎链球菌血清3型溶胞产物或分离物。用于量化细胞溶胞产物或分离物中的蛋白质浓度的方法已为此项技术习知且包括(例如)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析、色谱和电泳(参见，例如道池(Deutscher，M.P.)(编辑)的蛋白质纯化手册(Guide toProtein Purification)，圣地亚哥(San Diego)：美国学术出版社(Academic Press，Inc.)(1990))。
在一个实施例中，本发明提供包含加热步骤用于减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物中的蛋白质杂质的方法。通过暴露于热破坏蛋白质的天然结构且使其变性而不会影响多糖。随后，变性蛋白聚集并沉淀，此改良溶胞产物的分离且能够通过离心或过滤容易地去除固体。此加热步骤将有效用于自含大量可溶蛋白质杂质的生物混合物回收或纯化任何热稳定多糖且因此可用于其中可溶蛋白含量尚成问题的任何液相(例如，含DNA、RNA、多糖、寡糖、糖、脂肪酸和脂质的生物混合物)。
因此，在一个实施例中，本发明提供用于减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物中的蛋白质杂质的方法，所述方法包含以下步骤：1)将所述溶胞产物加热到至少50℃、至少55℃、或至少60℃并保持至少15或至少30分钟以使蛋白质聚集和沉淀；及2)从溶胞产物中分离出沉淀物；其中产生实质上纯的含血清3型多糖的溶胞产物。在特定实施例中，将溶胞产物加热到约50℃至约80℃并保持约15-约60分钟。在另一特定实施例中，将溶胞产物加热到约60℃至约70℃之间并保持约30分钟至约50分钟。在另一特定实施例中，将溶胞产物加热到约65℃并保持约40分钟。如下文在试验章节中更详细的阐述，对于热稳定血清3型多糖，通过在65℃下加热40分钟去除了超过80％的蛋白质，同时多糖的损失最少。在其它实施例中，分离步骤包含离心或过滤以去除或减少溶胞产物中的蛋白质。特别地，在一个实施例中，分离步骤包含使用膜过滤器、尤其0.45μm孔径膜过滤器过滤溶胞产物以去除沉淀物。在另一实施例中，分离步骤包含使用深度过滤器过滤溶胞产物以去除沉淀物。
通常用于高体积过滤工艺(例如血清3型多糖的纯化)的过滤器包括膜(或表面)过滤器和深度过滤器。膜过滤器主要通过尺寸排除起作用，其中欲过滤溶液中大于膜过滤器设定孔径的所有杂质将截留在过滤器表面上。相反，深度过滤器包含具有使欲过滤溶液通过的随意多孔结构的纤维或粒状基质，且主要通过在整个基质深度上对杂质的随意吸附和机械夹带起作用。在本发明方法中，膜过滤器和深度过滤器二者可组合使用，其中深度过滤器收集较大杂质而表面过滤器捕获较小杂质。
在本发明另一实施例中，还提供用于减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物或通过使所述溶胞产物离心所产生的分离物中的蛋白质杂质的方法，所述方法包含涉及溶胞产物或分离物的pH调节的步骤。在此实施例中，pH调节步骤提高过滤性。如本文所用，含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物或分离物的“过滤性”是指溶胞产物或分离物通过过滤器(例如膜过滤器或深度过滤器)的能力。因此，溶胞产物或分离物的经改良过滤性与(例如)以下有关：溶胞产物或分离物通过过滤器的流率增加，使溶胞产物或分离物对过滤器的堵塞减少，或使给定体积的溶胞产物或分离物通过过滤器所需的压力降低。
从含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物或分离物中去除杂质的传统方法涉及通过添加乙酸使溶胞产物的最低pH值降低到6.6，随后连续离心并滤除大于0.45μm的物质。此处理方法展示了最低程度的杂质去除，并且随后在将产物送至纯化处理之前很难通过膜过滤器或深度过滤器去除可溶蛋白。然而，本发明方法涉及以下发现：此高分子量多糖的过滤性可直接随pH值的改变而改变，且增加溶胞产物或分离物的pH值可提高过滤性而多糖血清3型的分子量大小或功能性无明显损失。
因此，在本发明的一个实施例中，提供用于减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物或通过使溶胞产物离心所产生的分离物中的蛋白质杂质的方法，所述方法包含在过滤之前使分离物或溶胞产物的pH值增加到至少8.0的步骤。在另一实施例中，使分离物或溶胞产物的pH值在过滤之前增加到约8.0至约8.4、更具体地约8.2。溶胞产物或分离物的pH调节之后的过滤可涉及使用膜过滤器、尤其0.45μm孔径膜过滤器过滤溶胞产物或分离物。在另一实施例中，过滤溶胞产物或分离物可涉及使用深度过滤器。
在其它实施例中，提供用于减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物中的蛋白质杂质的方法，所述方法包含将溶胞产物加热步骤与涉及溶胞产物pH调节的步骤组合。在一个实施例中，所述方法包含以下步骤：1)将溶胞产物加热到至少50℃、至少55℃、或至少60℃并保持至少15或至少30分钟以使蛋白质聚集和沉淀；2)使所述溶胞产物离心并从所述溶胞产物中分离出沉淀的蛋白质以产生分离物；3)使分离物的pH值增加到至少8.0；和4)过滤分离物；其中产生实质上纯的含血清3型多糖的分离物。在特定实施例中，在离心之前将溶胞产物加热到约50℃至约80℃并保持约15-约60分钟。在另一特定实施例中，在离心之前将溶胞产物加热到约60℃至约70℃并保持约30分钟至约50分钟。在其它实施例中，在离心之前将溶胞产物加热到约65℃并保持约40分钟。在另一特定实施例中，在过滤之前使分离物的pH值增加到约8.0至约8.4、更具体地约8.2。在其它实施例中，过滤步骤涉及使用膜过滤器、尤其0.45μm孔径膜过滤器过滤分离物。在另一实施例中，过滤步骤包含使用深度过滤器过滤溶胞产物以去除沉淀物。
在其它实施例中，提供用于减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物或分离物中的蛋白质杂质的方法，所述方法包含pH调节步骤以使蛋白质聚集并沉淀。在一个实施例中，所述方法包含以下步骤：1)使所述溶胞产物的pH值降低到小于约5.0、4.5、4.0、3.5、或3.0、或降低到约3.0至约5.0以使蛋白质聚集和沉淀；2)使所述溶胞产物离心并从所述溶胞产物中分离出沉淀的蛋白质以产生分离物；3)使分离物的pH值增加到至少8.0；和4)过滤分离物；其中产生实质上纯的含血清3型多糖的分离物。在特定实施例中，在离心之前使溶胞产物的pH值降低到约3.0。在另一特定实施例中，在过滤之前使分离物的pH值增加到约8.0至约8.4之间、更具体地约8.2。在特定实施例中，过滤步骤包含使用膜过滤器、更具体地0.45μm孔径膜过滤器过滤溶胞产物以去除沉淀物。在另一实施例中，过滤步骤包含使用深度过滤器过滤溶胞产物以去除沉淀物。
在其它实施例中，用于减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物或分离物中的蛋白质杂质的方法包含pH调节步骤以使蛋白质聚集和沉淀，其进一步包含将所述溶胞产物加热到至少50℃、至少55℃或至少60℃并保持至少15或至少30分钟以使蛋白质聚集并沉淀。在特定实施例中，在离心之前将溶胞产物加热到约50℃至约80℃并保持约15-约60分钟。在另一特定实施例中，在离心之前将溶胞产物加热到约60℃至约70℃并保持约30分钟至约50分钟。在其它实施例中，在离心之前将溶胞产物加热到约65℃并保持约40分钟。
提供以下实例以举例说明而非加以限制。
试验
肺炎链球菌3型产生极大且粘的多糖，当细胞溶胞时所述多糖释放于生长培养基中。此溶胞目前是在发酵结束时利用脱氧胆酸钠(DOC)来诱导。3型多糖看起来在宽温度和pH值范围内极其稳定；然而，其粘性使其在离心后难以过滤，此导致无细胞培养液(CFB)的回收率低。以下实例阐述关于溶胞后加热以使蛋白质变性并沉淀出以及pH调节以提高溶胞产物过滤性的研究。
实例1.加热步骤
实施用于肺炎链球菌血清3型回收的加热步骤是受需要在纯化步骤之前降低蛋白质负载的驱使。经纯化多糖的批料易于因残余蛋白质含量高于5％w/w蛋白质/多糖的设定规定含量而使得批料不合格。因此实施以下试验研究以表征在肺炎链球菌血清3型的纯化和回收中使用加热步骤的有效性和范围。包括此加热步骤的目的是使蛋白质含量减少同时维持高多糖含量。
在实验室中，将从中试设备试验获得的发酵细胞溶胞产物物质按等份加入猎鹰(Falcon)TM试管(碧迪生物科学公司(BD Biosciences)，贝德福德(Bedford)，麻萨诸塞州(MA))中并在水浴中加热到不同温度。所研究的温度从50℃至80℃，同时保持时间从15分钟至240分钟。将对照样品置于周围室温(约21℃)下。然后使所有样品在周围条件下过夜，之后将样品离心并使其通过0.45μm针头过滤器(HT
Figure G2007800378009D00071
膜25mm针头过滤器，低蛋白质结合，颇尔生命科学(Pall Life Sciences)，Anne Arbor，MI)以提供用于多糖和蛋白质分析的物质。实验数据是由统计软件包(CornerstoneTM，来自应用系统科技公司(Applied Systems Technologies，Inc.)，Dunnellon，FL)来分析以确定温度和时间对多糖和蛋白质含量的影响。
多糖和蛋白质分析
多糖分析是通过HPLC-SEC(高效液相色谱-尺寸排除柱)使用此项技术中已知的标准方法来实施(参见例如，艾吉拉(Aquilar，M.)“肽和蛋白质的HPLC：方法和方案(HPLC of Peptides and Proteins：Methods and Protocols)”，Totowa，NJ：Humana Press(2004))。图1展示来自不同加热时间的实验室研究的多糖产率。所报告的数据是对照多糖含量的百分数，其中100％表示无损失。如图1中所示，多糖产率相对于加热时间和温度而言稳定。
还收集了中试规模数据且在图1中以“IPP”缩写标明的数据点展示。所列出的时间反映了加热时期、在所标明状态下的加热保持时期、和冷却时期。与在实验室中进行加热相反，这些样品是在实际发酵罐中热处理之后获得。在以中试规模测试的温度和时间范围内(30-50分钟和60℃至70℃)，多糖损失在0-18％范围内，其中大多数测试的损失为10％或更少。这在此物质下游处理的可接受范围内。
蛋白质分析是通过使用此项技术中已知的标准SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)方法来实施(参见例如，沃可(Walker，J.M.)“蛋白质技术手册(TheProtein Protocols Handbook)”Totowa，NJ：Humana Press(2002))。凝胶的分析是借助凝胶成像系统(具有LabworksTM V.3软件的UVP成像仪，UVP公司，厄普兰德，加利福尼亚州(Upland，CA))以针对蛋白质标准物解释总带(泳道)密度。
如图2中所示，以实验室规模和中试规模(以“IPP”缩写标明的数据点)研究从50℃至80℃的温度。蛋白质数据展示为未经加热处理样品的对照值的百分数以展示经处理样品的蛋白质损失相对百分比。通过在60℃的温度下进行热沉淀，15分钟的加热时间足以去除60％的可溶蛋白(参见图2)。尽管在50℃和55℃下出现明显蛋白质减少，但由于在60℃下蛋白质去除量较高故将此温度设定为中试设备作业的最低温度。
图3展示由时间和温度绘制的蛋白质和多糖浓度的经调节响应曲线图。所展示的数据代表蛋白质和多糖浓度在不同时间点和温度点下相对于时间＝0分钟和室温(其代表蛋白质和多糖的100％值)的百分数。如图3中所示，保持温度对可溶蛋白去除具有重要影响，而保持超过15分钟的持续时间并不重要。对于多糖(PS)产率而言，时间和温度二者皆对PS损失展示有限的影响(＜20％损失，这是下游处理可接受的)。
图4展示由温度和时间条件绘制的来自血清3型溶胞产物的总蛋白质百分比的等高线图。剩余可溶蛋白的百分数展示于曲线图上的弯曲线条中。60℃-70℃下保持30-50分钟的范围由方框突出显示且代表经选定用于实施本文所述的加热步骤的优选范围。然而，如上文所述，还分析了更宽的范围且所述范围也展示有效。
图5展示以中试规模测试加热步骤之后可溶蛋白的SDS-PAGE凝胶。左边的凝胶展示来自无加热步骤的中试规模发酵批料(IPPPN3-007)的结果且展示整个回收过程的完整蛋白质含量(pH调节前、pH调节后、离心后、和pH调节后的罐)。“pH调节后的罐”是指在过滤之前调节至给定pH值之后从分离物贮存罐中取出的样品。使用100千道尔顿(KD)切向流纯化超滤(UF)处理去除小于100KD的溶质，其是通过使用连续循环和过滤而逐渐用缓冲溶液代替初始悬浮介质并随后浓缩溶液来实施。此UF处理步骤之后，据报告批料IPPPN3-007的蛋白质含量为31％蛋白质/多糖(以w/w计)。整个纯化处理之后的最终蛋白质含量为9.9％(相对于多糖的w/w)，这使得所述批料不符合最终批料浓缩物(FBC)中的蛋白质≤5％的规定。对于批料IPPPN3-011，在溶胞产物保持之后且在下游处理之前包括60℃下保持30分钟的加热步骤。100K UF过滤之后的蛋白质含量为6.7％，且FBC蛋白质含量为2.5％，其符合FBC药物中间体规定。如图5中右边的凝胶图像所示，在回收作业期间的加热步骤使得蛋白质含量显著降低。
关于此加热步骤的中试规模数据的汇总还展示在表1中。试验-001、-004、-005、-007和-013未使用加热步骤。在这些试验中，仅-001和-004符合≤5％w/w的目标蛋白质规定，此表明纯化处理依旧难以除去UF处理步骤后的20％至35％的蛋白质负载。如表1中试验-011、-012、-014、-015和-017所示纳入加热保持步骤，UF处理步骤之后蛋白质负载降低到3.1％至6.7％，其中纯化多糖中的最终蛋白质含量为0.6％至2.5％。
表1.在各种加热条件和保持时间下超滤之后和最终批料浓缩物(FBC)中的蛋白质百分比
  处理   批料   UF蛋白质％   FBC蛋白质％
  未加热   IPPPN3-001   32   4.8
  未加热   IPPPN3-004   35   3.5
  未加热   IPPPN3-005   20   7.4
  未加热   IPPPN3-007   31   9.9
  未加热   IPPPN3-013   22   6.1
  加热60℃/30min   IPPPN3-011   6.7   2.5
  加热70℃/50min   IPPPN3-012   4.3   1.7
  加热65℃/40min   IPPPN3-014   3.1   0.9
  加热65℃/40min   IPPPN3-015   3.7   0.6
  加热65℃/40min   IPPPN3-017   3.4   1.7
实施加热步骤还通过增加蛋白质聚集提高了分离效率，此允许更有效的分离。此步骤的作用绘示于图6中，其中照片提供于周围条件下过夜无搅拌保持之后未经加热(左边)和经加热(右边)细胞溶胞产物的比较。热处理之后的介质明显更清澈，此反映出蛋白质的更多聚集和沉淀。
如以上所阐述的数据所示，包括加热步骤对于去除蛋白质杂质来制造多糖来说很重要。最终多糖符合≤5％w/w(蛋白质/多糖)的药物中间体释放标准，此表明产物相对于热处理的稳定性。
实例2.pH调节和过滤步骤
Figure G2007800378009D00091
度苗中所包括的肺炎链球菌多糖的传统过滤涉及使细胞溶胞产物连续离心，随后深度过滤和膜过滤。如上所述，肺炎链球菌3型是大的多糖，其在溶液中有粘性且在传统处理条件下不能充分过滤。由于这些问题，已进行试验来改变此多糖的过滤特性。因此，实施研究来确定提高血清3型多糖溶液过滤性的方法。
使用pH值作为变量，在实验室中实施pH值对血清3型溶胞产物溶液的蛋白质去除和随后其通过25mm直径0.45μm HT
Figure G2007800378009D00092
针头过滤器(颇尔生命科学(PallLife Sciences)，Anne Arbor，MI)的过滤性的影响的初步研究。在离心之前，使用乙酸或硫酸将血清3型的发酵溶胞产物样品的pH值调节至6.6(两次试验)、5.0(两次试验)、或3.0(一次试验)试图去除可溶蛋白。将溶胞产物离心并按等份加入猎鹰(Falcon)TM试管(碧迪生物科学公司(BD Biosciences)，贝德福德(Bedford)，麻萨诸塞州(MA))，所述试管处于如下四种条件中的一种(其中使用3N NaOH(氢氧化钠溶液)调节pH值)：1)对照(无pH调节)；2)pH值调节至7.0；3)pH值调节至8.0；和4)pH值调节至9.0。然后利用过滤约3mL物质所需的相对力使分离物通过0.45μm针头过滤器。
以上所述五次试验的结果展示于图7中，其展示血清3型分离物的多糖(PS)浓度、蛋白质浓度、和相对过滤性随分离物pH值变化的曲线图。多糖浓度(mg/mL)和蛋白质浓度(g/10L)值提供于左边y轴上。相对过滤性值提供于右边y轴上，其对应于使约3mL的血清3型分离物通过0.45μm针头过滤器所需的相对力，其等级为1到5(1＝容易，5＝困难)。如图7中所示，在除一个以外的所有各次试验中较高pH值与提高的分离物过滤性有关。图7中所展示的结果还表明，3.0的极低pH值可成功去除蛋白质，但与过滤难度增加有关。
利用已确定的pH值的影响，接着实施受控实验室研究来确定pH值对过滤能力的影响。自中试设备试验获得分离后材料并在实验室中再次离心。将溶胞产物分成数份并在5.0至8.5的范围内进行pH调节。将溶胞产物放置于施加恒定压力的压力容器中。使溶胞产物通过CUNO 60SP深度过滤器(美国坤诺公司(CUNO Inc.)，梅里登(Meriden)，康涅狄格州(CT))的管道并分析过滤器的能力。针对所测试的每一pH值(5.0至8.5)且在不同恒定压力条件(5-20磅/平方英寸(psi))下实施这一过程。结果展示于图8中，图8依据分离物pH值比较了血清3型分离物样品通过深度过滤器随时间的流率。流率(y轴)是通过计算每分钟的过滤比率来测量，其中将时间(以分钟表示)除以在这一分钟内通过过滤器的分离物的总重量(以克表示)(比率越低，流率越高)。如图8所示，与在5.0或6.0的较低pH值下处理相比，在相同恒定压力条件(10psi)下在7.0至8.5的较高pH值下处理获得较快流率。在pH 8.0下，10psi或20psi的恒定压力与5psi相比也与较快流率有关。
然后，实施纳入上述pH调节步骤的中试规模试验(中试规模试验列于下表2中)。使含肺炎链球菌3型接种物的种子罐在发酵罐中生长。使细胞以化学方式溶胞并将溶胞产物离心或在离心之前进行热处理。离心之后，调节pH值(试验IPPPN3-015除外)并通过深度过滤器和0.45μm膜过滤器过滤溶胞产物，然后送至下游用于纯化。将各次试验中处理溶胞产物所需过滤器的数量用作过滤性的量度(过滤性越低，越频繁堵塞过滤器且处理溶胞产物所需过滤器的数量越高)。表2展示，在有或没有热处理的情况下，仅需要一个深度过滤器和一个膜过滤器来处理各次试验中调节至7.5或更高的不同pH值的溶胞产物。利用试验-015，评价pH 6.6对过滤性的影响。如所示，对于试验-015，仅处理37L就需要三个过滤器组。即使在存在加热步骤来去除蛋白质的情况下，试验-015也获得此结果。将来自试验-015的剩余溶胞产物物质调节至pH8.2之后，一组过滤器即可处理剩余的68L。
表2在中试规模下经pH调节的溶胞产物的过滤性
试验 pH 体积   深度过滤器 膜过滤器   加热温度℃   加热斜坡上升/保持/冷却时间(min)
  IPPPN3-001   8.0   82L   1   1   N/A   N/A
  IPPPN3-003   7.5   80L   1   1   N/A   N/A
  IPPPN3-004   9.0   90L   1   1   N/A   N/A
  IPPPN3-006   8.5   85L   1   1   N/A   N/A
  IPPPN3-007   8.5   96L   1   1   N/A   N/A
  IPPPN3-010   8.0   88L   1   1   N/A   N/A
  IPPPN3-011*   8.2   85L   1   1   60   42/30/43
  IPPPN3-012*   8.2   86L   1   1   70   55/50/45
  IPPPN3-013   8.1   90L   1   1   N/A   N/A
  IPPPN3-014*   8.2   103L   1   1   65   52/40/51
  IPPPN3-015*   6.6   37L   3   3   65   57/40/52
  IPPPN3-015*   8.2   68L   1   1   65   57/40/52
  IPPPN3-016*   8.2   87L   1   1   65   53/40/43
*离心之前经热处理的溶胞产物。
根据图7和图8中所呈现的实验室数据和中试设备设施的pH调节能力，确定处理作业的优选pH值范围为8.2±0.2以提高血清3型溶胞产物的过滤性。
本文所用冠词“一”(“a”和“an”)是指一个或一个以上(即，指至少一个)的所述冠词的文法宾语。例如，“一个元件”意指一个或一个以上的元件。
说明书中所提及的所有出版物和专利申请案均表现出本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请案均以引用的方式并入本文中，其程度如同将每一个别出版物或专利申请案特定地及个别地所指以引用方式并入本文中一样。
尽管为了清晰理解起见已通过例证和实例对本发明进行了较详细的描述，但是显然可以在随附权利要求的范围内实施某些改变或修改。

Claims (28)

1.一种用于减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)溶胞产物中的蛋白质杂质的方法，所述方法包含以下步骤：
a)将所述溶胞产物加热到50℃至80℃并保持15至60分钟以使蛋白质聚集和沉淀；及
b)从所述溶胞产物中分离出沉淀物；
其中产生实质上纯的含血清3型多糖的溶胞产物。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤a)包含将所述溶胞产物加热到60℃至70℃。
3.如权利要求2所述的方法，其中步骤a)包含将所述溶胞产物加热30分钟至50分钟。
4.如权利要求3所述的方法，其中步骤a)包含将所述溶胞产物加热到65℃并保持40分钟。
5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中步骤b)包含过滤所述溶胞产物以自所述溶胞产物中去除沉淀物。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述溶胞产物是使用至少一种选自由膜过滤器和深度过滤器组成的群组的过滤器来过滤。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述膜过滤器是0.45μm孔径膜过滤器。
8.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其中步骤b)包含使所述溶胞产物离心以自所述溶胞产物中去除沉淀物。
9.一种用于减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物或分离物中的蛋白质杂质的方法，所述方法包含以下步骤：
a)使所述溶胞产物或分离物的pH值增加到8.0至8.4；及
b)过滤所述溶胞产物或分离物；
其中产生实质上纯的含血清3型多糖的溶胞产物或分离物。
10.如权利要求9所述的方法，其中在过滤之前使所述溶胞产物或分离物的pH值增加到8.2。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述溶胞产物是使用至少一种选自由膜过滤器和深度过滤器组成的群组的过滤器来过滤。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述膜过滤器是0.45μm孔径膜过滤器。
13.一种用于减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物中的蛋白质杂质的方法，所述方法包含以下步骤：
a)将所述溶胞产物加热到50℃至80℃并保持15至60分钟以使蛋白质聚集和沉淀；
b)使所述溶胞产物离心并从所述溶胞产物中分离出沉淀的蛋白质以产生分离物；
c)使所述分离物的pH值增加到8.0至8.4；及
d)过滤所述分离物；
其中产生实质上纯的含血清3型多糖的分离物。
14.如权利要求13所述的方法，其中步骤a)包含将所述溶胞产物加热到60℃至70℃。
15.如权利要求13所述的方法，其中步骤a)包含将所述溶胞产物加热30分钟至50分钟。
16.如权利要求13所述的方法，其中步骤a)包含将所述溶胞产物加热到60℃并保持40分钟。
17.如权利要求13至16中任一权利要求所述的方法，其中步骤c)包含使所述分离物的pH值增加到8.2。
18.如权利要求13至16中任一权利要求所述的方法，其中步骤d)包含使用至少一种选自由膜过滤器和深度过滤器组成的群组的过滤器来过滤所述分离物。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述膜过滤器是0.45μm孔径膜过滤器。
20.一种用于减少或去除含血清3型多糖的细胞肺炎链球菌溶胞产物中的蛋白质杂质的方法，所述方法包含以下步骤：
a)使所述溶胞产物的pH值降低到3.0至5.0以使蛋白质聚集和沉淀；
b)使所述溶胞产物离心并从所述溶胞产物中分离出沉淀的蛋白质以产生分离物；
c)使所述分离物的pH值增加到8.0至8.4；及
d)过滤所述分离物；
其中产生实质上纯的含血清3型多糖的分离物。
21.如权利要求20所述的方法，其中步骤a)包含使所述溶胞产物的pH值降低到3.0以使蛋白质聚集和沉淀。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中步骤c)包含使所述分离物的pH值增加到8.2。
23.如权利要求20或21所述的方法，其中所述分离物是使用至少一种选自由膜过滤器和深度过滤器组成的群组的过滤器来过滤。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述膜过滤器是0.45μm孔径膜过滤器。
25.如权利要求20或21所述的方法，其中步骤a)进一步包含将所述溶胞产物加热到50℃至80℃并保持15至60分钟。
26.如权利要求20或21所述的方法，其中步骤a)进一步包含将所述溶胞产物加热到60℃至70℃。
27.如权利要求20或21所述的方法，其中步骤a)进一步包含将所述溶胞产物加热30分钟至50分钟。
28.如权利要求20或21所述的方法，其中步骤a)进一步包含将所述溶胞产物加热到60℃并保持40分钟。
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