CN102660601B - 快速纯化细菌荚膜多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速纯化细菌荚膜多糖的方法，它能从特定细菌发酵液中快速去除其中的污染物，包括蛋白和核酸，保留纯化的荚膜多糖，包括含荚膜多糖细菌的发酵，离心、微滤去除菌体和不溶颗粒物质，加酸调节溶液的pH值来沉淀杂质，超滤浓缩和洗滤溶液获得粗制细菌荚膜多糖溶液。本发明的基本原理是通过加酸调节发酵液pH值至3-5的范围，杂质，保持荚膜多糖在溶液中来进行纯化。可用于纯化肺炎球菌、b型流感嗜血杆菌、流行性脑膜炎球菌以及伤寒杆菌的荚膜多糖。

Description

快速纯化细菌荚膜多糖的方法

技术领域：

本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种能够从细菌发酵液中去除污染物，纯化荚膜多糖的方法。

背景技术：

肺炎球菌，b型流感嗜血杆菌，流行性脑膜炎球菌以及伤寒杆菌是威胁人类生命的重要致病菌。开发疫苗来预防这些病菌的感染是医学界多年奋斗的目标。自上世纪60年代，通过实验发现这些细菌有一个共同的形态学结构特点，就是细胞膜表面包裹着一层荚膜，这层荚膜是由多糖包裹在细菌细胞膜表面形成，故称荚膜多糖。在人体内，荚膜对于这些细菌致病性起着决定性作用，因为，通过防止抗体吸附到细菌膜上，荚膜能够干扰免疫细胞对细菌的吞噬作用，使得细菌能够在体内繁殖而致病。研究发现，细菌荚膜多糖作为疫苗具有很好的免疫原性，可以刺激具有健全的免疫功能的成人产生抗体来抵抗具有荚膜多糖细菌的感染；但是，由于2岁以下儿童的免疫系统发育不完善，对荚膜多糖没有免疫应答，而这一人群是受这些致病菌威胁最为严重人群，开发能够保护这一人群的疫苗是医学界的重点课题。自上世纪80年代，研究发现，当荚膜多糖以共价键和蛋白质结合，如破伤风类毒素、白喉类毒素或者CRM197(变异白喉无毒毒素)后，形成多糖-蛋白结合疫苗，可在2岁以下婴幼儿体内产生针对于荚膜多糖的免疫应答反应，自此，一种以细菌荚膜多糖接至蛋白载体的合成疫苗诞生。

目前，在市场上用于预防成年人肺炎球菌球菌感染的有23价肺炎球菌多糖疫苗，以及预防儿童的7价、10价和13价肺炎球菌多糖结合疫苗在全球范围广泛使用。另外，伤寒(vi)多糖疫苗、b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗、4价流行性脑膜炎多糖结合疫苗也已经应用多年。

从化学结构上来看，不同的细菌具有不同的荚膜多糖，而同一种细菌不同血清型细菌也有不同的荚膜多糖，如肺炎球菌有90种不同血清型，脑膜炎球菌有A、B、C、W135和Y群，它们都具有不同化学结构的荚膜多糖。研究发现，每种荚膜多糖具有严格的重复性化学结构，这个化学结构可由一个单糖单位或含有最多达7-8单糖残基组成的寡聚糖组成。这种重复性单位可为线性或含有非碳水化合物取代基团的分叉结构，这些非碳水化合物取代基团可为O-乙酰基(O-acetyl)、甘油磷酸(glycerol phosphate)或丙酮酸(pyruvate)；另外，肺炎球菌一些荚膜多糖可能含有不常见的单糖残基，如二氨基(diamino-)，脱氧和分叉链糖等。这种细菌多糖结构的多样性，给纯化这些多糖方法带来了挑战和困难。

用荚膜多糖来制备疫苗，包括多糖疫苗或多糖结合疫苗，都需要用符合一定质量标准的荚膜多糖作为原料来制备。为了获得高纯度的荚膜多糖，可用富有营养成分的液体培养液来发酵细菌，进而从发酵液中纯化荚膜多糖，纯化过程中要去除的主要污染物包括细菌蛋白，核酸和培养基成分，如果是制备肺炎球菌荚膜多糖时，还需要控制C-多糖的污染。

细菌荚膜多糖纯化工艺的建立经历了多年的发展过程，传统方法纯化荚膜多糖过程中，去除多糖溶液中的核酸污染以达到疫苗制剂所需纯度要求比较困难，由于不同细菌的荚膜多糖的化学特性不同，每种细菌荚膜多糖需要用特殊方法来去除核酸污染，没有一种方法能够纯化其它细菌的荚膜多糖。有些细菌荚膜多糖需要通过大量的乙醇来进行沉淀，同时，要用不同的有机溶剂萃取，如乙醚等，来帮助纯化。乙醇沉淀通常能够有效地去除多糖中的蛋白污染物，并将其浓度降低至比较低的水平；但是，难以降低到用于注射用的疫苗要求的水平，包括采用有机溶剂氯仿和丁醇混合溶剂或者苯酚，和多糖溶液混合，震摇4-6小时，然后，用低速离心，聚集在水相和有机相之间的变性蛋白能够与水相中的多糖分离。不过这种方法的缺点是在萃取过程中，多糖会被降解，断裂或者失去其原始空间构象，纯化出来的多糖已经不是有效的免疫原。由于不同细菌多糖结构的多变性限制了这些分离方法的有效性。由此，得出结论是早期的传统方法中没有一种方法能够有效地纯化不同细菌或者血清型细菌的荚膜多糖。

尽管如此，有几种纯化出高纯度和保存有其免疫原性的不同细菌荚膜多糖方法被发明，特别是在纯化不同血清型肺炎球菌荚膜多糖时，这些方法能够有效地纯化出包括24种血清型荚膜多糖，包括1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，并用于配制23价肺炎球菌多糖疫苗的荚膜多糖原料。

1980年，美国American Cyanamid Company公司的专利US4242501阐述了一种纯化肺炎球菌荚膜多糖方法，在这一专利基础上，随后该公司又于1987年注册了另一个专利US4686102，用以纯化23个不同的血清型肺炎球菌荚膜多糖。该专利的基本工艺途径是肺炎球菌发酵后，加入脱氧胆酸钠(sodiumdeoxycholate)溶解细菌，将菌体上的荚膜多糖释放至发酵液中，离心去除了细胞碎片后，用乙醇沉淀两次，这一步骤能够去除包括蛋白质在内的大量污染物；加入十六烷基三甲基溴化铵至乙醇沉淀后的多糖溶液，进一步去除污染物。通过控制十六烷基三甲基溴化铵浓度，能够吸附沉淀大部分血清型多糖沉淀下来，这些沉淀多糖随后能够溶解于氯化钠溶液中，离心去除那些不溶解的大分子污染物。不过，有四种血清型多糖不能够和十六烷基三甲基溴化铵形成沉淀，加入十六烷基三甲基溴化铵的作用是沉淀污染物，离心去除这些污染物。随后，再加入乙醇以去除十六烷基三甲基溴化铵。离心去除沉淀后，加入活性炭吸附残留的污染物，如蛋白和核酸。最后，通过透析获得纯化荚膜多糖。从工艺过程可见，尽管该方法建立了一个纯肺炎球菌荚膜多糖的纯化平台，用同一种方法能够纯化出不同血清型多糖，但是步骤繁杂，不宜掌握；其中还包括了多步乙醇沉淀、离心，费时，设备费用高昂；而且不宜扩大生产。十六烷基三甲基溴化铵沉淀步骤技术复杂，不同血清型处理方法不同。另外，最终纯化出来的多糖仅仅能够满足制备23价肺炎多糖疫苗的质量标准，即蛋白和核酸含量低于2％-7％，无法满足现有的肺炎球菌多糖结合疫苗对多糖原料中蛋白和核酸含量低于1％的质量要求。

至1998年，美国American Home Products公司的专利US5714354提出了一种无乙醇沉淀来纯化肺炎球菌荚膜多糖的改进方法。该方法是通过用十六烷基三甲基溴化铵来沉淀23种肺炎球菌血清型中的20个荚膜多糖，然后用活性炭过滤、羟基磷酸灰质盐(Hydroxyapatite)色谱法和阴离子交换色谱法来进一步分离多糖中的污染物，该纯化工艺步骤能够纯化出大部分血清型荚膜多糖。而其它3个不能够和十六烷基三甲基溴化铵沉淀的血清型(血清型7F、14和33F)的纯化，是采用修饰方法来进行纯化，包括阴离子交换树脂色谱法。和前一专利纯化工艺比较，这一纯化工艺能够节省75％纯化时间，费用也降低，不需要特殊设备。该方法纯化出来的所有23个血清型荚膜多糖的质量达到多糖疫苗的质量指标。

同在1998年，美国Merck公司的专利US5847112也发布一种纯化肺炎荚膜多糖的方法。基本方法为用乙醇来分两步从发酵破菌液中分离多糖；第一步是用低百分比的乙醇来沉淀细胞碎片和污染物，如C-多糖，保留多糖于溶液中；接下来，加入高浓度的乙醇来沉淀荚膜多糖，将留在溶液中的其它污染物丢弃。将沉淀多糖溶解后，再用常规方法，比如核酸和蛋白酶消化，或者有机溶剂，进一步来去除污染的蛋白和核酸，冻干后获得粗制多糖。随后，通过阴离子交换色谱纯化获得精制的全多糖或者部分水解多糖。用以上两种方法纯化出来的多糖尽管能够达到较高的纯度标准，但是，步骤仍然繁杂，工艺条件控制要求高，特别是多步骤的沉淀分离步骤耗时长。

美国Wyeth公司的专利US20060228381提出了一种更加简洁的纯化肺炎球菌荚膜多糖的方法。基本途径是用豆类培养基发酵肺炎球菌后，加入脱氧胆酸钠来溶解菌体，然后加酸调节溶液pH至5.5以下来沉淀脱氧胆酸钠和大部分可溶性蛋白，通过离心过滤和超滤去除溶液中的细胞碎片和沉淀物。由此获得的粗制多糖仍然需要传统方法进一步纯化，包括用活性炭过滤、羟基磷灰石柱吸附残留的杂质，以及超滤洗滤来获得精制多糖。这样纯化方法的特点在于通过酸化破菌发酵液这一步来将大部分的污染物，如蛋白、核酸、内毒素等，和溶液中的荚膜多糖分离，简化了后续工艺，缩短了纯化时间。但是，由于是使用的用脱氧胆酸钠溶菌液来进行纯化，有些血清型的细胞壁中含有的C-多糖被释放出来，由于C-多糖和荚膜多糖的化学特性相似，不易在后续的纯化工艺中被去除，造成了纯化多糖中C-多糖含量过高。

本发明通过总结了现有的细菌荚膜多糖的纯化方法，提出了一种更为快速的纯化方法，所获得的纯化荚膜多糖的各项标准都达到了现有的WHO质量标准。

发明内容：

本发明的目的是提供一种快速纯化细菌荚膜多糖的方法，它能从指定细菌发酵液中快速去除其中的污染物，包括蛋白和核酸，保留纯化的荚膜多糖溶液，包括如下步骤：

步骤一，荚膜多糖细菌的发酵：在装有细菌培养基的发酵罐中发酵出特定荚膜多糖的细菌；

步骤二，加酸分离发酵液中的菌体和杂质：加酸调节步骤一所得发酵液的pH值，控制pH值≤5，用此方法来沉淀菌体和杂质；

步骤三，用微滤膜对步骤二所获得的含有沉淀菌体和杂质的发酵液进行微滤，以去除其中的不溶颗粒物，包括菌体，沉淀杂质，残留细胞碎片和不溶小颗粒物质；

步骤四，超滤浓缩和洗滤：用超滤膜浓缩和洗滤步骤三的微滤液，获得粗制细菌荚膜多糖溶液。

在上述快速纯化细菌荚膜多糖的方法中，所述细菌包括：肺炎球菌、b型流感嗜血杆菌、流行性脑膜炎球菌和伤寒杆菌。

在上述快速纯化细菌荚膜多糖的方法中，在步骤二中所加的酸是磷酸、醋酸、盐酸、硫酸或硝酸中的任意一种。

在上述快速纯化细菌荚膜多糖的方法中，在步骤二中pH值的范围是3.0～5.0。

在上述快速纯化细菌荚膜多糖的方法中，在步骤三中所用微滤膜的膜孔径为0.22，0.45，0.65，1.0μm中的任意一种。

在上述快速纯化细菌荚膜多糖的方法中，在步骤四中，所用的超滤膜是分子量为5kD至500kD范围内的任意一种膜。

在上述快速纯化细菌荚膜多糖的方法中，在步骤四中，洗滤所用溶液为纯水、缓冲液或者盐溶液或它们的混合液。

在通过上述纯化工艺过程所获得的荚膜多糖溶液中，包括可溶性蛋白和核酸杂质含量都显着地降低。

本发明可用于从含有荚膜多糖细菌中纯化多糖，此处只是举例，而不限于这些细菌，如肺炎球菌不同血清型，包括1，2，3，4，5，6A，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F，b型流感嗜血杆菌，流行性脑膜炎球菌，以及伤寒杆菌。

在本发明中，步骤二加酸分离菌体和杂质是核心，即通过加入磷酸将发酵菌液pH调节至3.0-5.0之间，用此方案来沉淀菌体、蛋白和核酸。

在本发明中，采用微滤和超滤浓缩二步法来去除步骤二发酵液中的沉淀物和不溶性颗粒，能够满足分离要求，根据细菌种类不同，或者肺炎球菌的血清型不同，选用0.22，0.45，0.65或者1.0μm膜来微滤获得的加酸分离后的上清液，去除溶液中残留的细胞颗粒和碎片，以及不溶颗粒；用30至500kD膜对微滤液进行超滤浓缩，并用去离子水或者缓冲液来超滤清洗溶液，去除小分子污染物，通过这些步骤的纯化处理，可以去除荚膜多糖溶液中的90-98％蛋白和95-99％核酸。

具体实施方式：

本发明与传统的将发酵液中的细菌破菌/或者溶菌后来进行纯化方法的不同之处是，通过将溶液中的污染物快速而简便地去除，保留溶液中的完整分子量的荚膜多糖。本发明可用于，如肺炎球菌，b型流感嗜血杆菌，流行性脑膜炎球菌以及伤寒杆菌荚膜多糖的纯化，纯化后的多糖溶液中杂蛋白和核酸含量可降低90-98％。目前采用的荚膜多糖纯化工艺繁杂，含有多步的沉淀分离步骤，不易工业化大规模生产，需要大量贵重的设备的投入和人力来进行操作。

细菌荚膜多糖的纯化工艺经过半个世纪的发展变迁，随着新型生物材料不断推出，大分子纯化技术也随之改善，以适应对生物制剂质量不断提高的标准。对于用细菌荚膜多糖来制备的疫苗，如肺炎球菌多糖疫苗和多价肺炎球菌多糖结合疫苗，b型流感嗜血杆菌结合疫苗，流行性脑膜炎多糖疫苗和多糖结合疫苗，以及伤寒Vi多糖疫苗和Vi多糖结合疫苗，其荚膜多糖的质量标准也在不断的提高，以多糖中的杂质蛋白含量容许标准为例，从上世纪80年代23价肺炎球菌多糖疫苗的质量标准之一是要求杂质蛋白和核酸标准低于2-7％，到2000年的各种不同细菌多糖结合疫苗所用的荚膜多糖原料质量标准是低于1％。细菌荚膜多糖的纯化工艺也从早期的多达16道工艺，改进到目前正在采用的10道主要工艺步骤，缩短了纯化需要的时间和成本，同时，在质量上也达到了现代的多糖疫苗制剂要求的标准。

本发明是在对现有的细菌荚膜多糖纯化工艺环节的中间产物进行检测和评估的基础上，进一步优化而建立的纯化工艺平台，能够快速、简便地纯化出不同细菌的荚膜多糖，步骤如下：

步骤一，荚膜多糖细菌的发酵：在装有细菌培养基的发酵罐中发酵出特定荚膜多糖的细菌；

步骤二，加酸分离发酵液中的菌体和杂质：加酸调节步骤一所得发酵液的pH值，控制pH值≤5，用此方法来沉淀菌体和杂质；

步骤三，用微滤膜对步骤二所获得的含有沉淀菌体和杂质的发酵液进行微滤，以去除其中的不溶颗粒物，包括菌体，沉淀杂质，残留细胞碎片和不溶小颗粒物质；

步骤四，用超滤膜浓缩和洗滤步骤三所获得的微滤液，得粗制细菌荚膜多糖溶液；

通过以上四个工艺步骤，能够将溶液中的主要杂质，如蛋白和核酸的含量降低90-98％，同时，纯化出来的荚膜多糖的免疫原性、分子的完整性都优于或等同于现有的纯化方法所获得的多糖。

步骤五，采用现有技术对细菌荚膜多糖进行后续纯化。

本发明提出的纯化细菌荚膜多糖的方法的设计原理及试验条件的控制如下：

(一)、细菌发酵过程的控制

要纯化出高纯度的荚膜多糖，需要对多糖生产过程中的各个可能造成污染的环节加以控制，特别是在发酵环节上应该尽量减少污染物进入到用于纯化多糖的发酵液中，其中，由于菌体破碎而释放出来的杂质污染物，如蛋白和核酸，以及培养基中含有的杂质，包括蛋白，核酸和杂质多糖等是污染物的主要来源。以肺炎球菌为例，该细菌是革兰氏阳性菌，能够耐受氧气，其形态具有多样性的特点，可以在光滑(Transparent)和粗糙(Opaque)菌落形态间转化。在处于光滑菌态时，细菌表面只具有少量的荚膜多糖，是人体鼻腔内寄生菌落存在的形态；而处于粗糙菌态的细菌表面含有大量的荚膜多糖，是人体血液中的肺炎球菌存在的形态，荚膜多糖的存在能够阻止宿主免疫细胞吞噬作用，使得细菌能够存活下来并繁殖。

实验表明在液体培养基中，肺炎球菌表面包裹的部分荚膜多糖会脱落到发酵液中，能够用来纯化荚膜多糖。显而易见，从菌体表面获取荚膜多糖，必须将菌体破碎后获得，这就使得细菌体内杂质蛋白、核酸等污染物都释放至发酵液中，因而增加了纯化多糖的难度。为了避免这一问题，同时，根据肺炎球菌的培养特性，本发明首先采用严格的无氧发酵，使得肺炎球菌在发酵液中以粗糙菌态为主，在此条件下，肺炎球菌会生产大量的荚膜多糖，部分荚膜多糖会从细菌表面释放至培养液中。在控制发酵液的pH值在中性范围内(7.0-7.6)，多糖能够稳定地存在于溶液中而不降解。另一方面，由于肺炎球菌含有溶菌酶，当细菌死亡后，会释放出该酶自溶，因此，在细菌发酵至生长平台期后要及时地停止发酵，进行收获，以便减少细菌死亡，释放出细胞内容物，污染发酵液的情况发生。

目前市场上使用的肺炎疫苗，包括23价肺炎多糖疫苗和13价肺炎球菌多糖结合疫苗，以及b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗，生产所用的荚膜多糖原料都是由加入表面活性剂至发酵液中来溶解菌体，以释放出细菌细胞壁上的荚膜多糖进行纯化，最终荚膜多糖的来源实际上有两途径，即在发酵过程中从细菌表面脱落至发酵液中的多糖和溶菌后由细胞壁上释放出来的多糖。尽管用这种方法来纯化荚膜多糖时，起始多糖总量要多于仅仅从去除菌体的发酵液上清液中纯化荚膜多糖的起始量；但是，溶菌发酵液中起始溶液中的杂质成分含量要远高于发酵上清液，这给后续纯化工序增加了负担，需要更多的步骤来进行纯化，因此，一方面溶液中的多糖会在在过多的纯化步骤中损失增加，其收率和从发酵液中进行纯化相比较，并不占优势；另一方面，加入表面活性剂来溶菌后，尽管可释放出更多的多糖，但是，存在于细胞壁的杂质多糖成分，比如C-多糖也被释放出来。而C-多糖的化学特性和荚膜多糖相似，在后续的纯化过程中，去除非常困难。现有市场上的产品中C-多糖污染是一个突出的问题，因为C-多糖在检测过程中，容易被计入荚膜多糖，但C-多糖并没有免疫原性，不能够刺激机体产生保护性抗体来杀菌。其结果是混入制剂中致使多糖疫苗的免疫效果受到影响。

(二)、发酵液酸化过程的控制

在获得含有荚膜多糖的发酵液后，将其和污染物，包括菌体、蛋白和核酸，进行分离的步骤繁杂，常用方法有离心去除大颗粒菌体，随后通过过滤，来去除小颗粒的细胞碎片以获得含有荚膜多糖的澄清发酵上清液。在下游的纯化过程中，采用诸如乙醇沉淀、核酸和蛋白酶消化、有机溶剂和苯酚抽提以及超滤清洗步骤进一步纯化，最终获取纯化多糖。

本发明采用了将含有菌体的发酵液直接进行酸化，一次性地沉淀菌体，蛋白以及核酸杂质，这一方法将大大地减少传统的多步骤去除方法。根据生产细菌的品种不同，或者血清型的不同，当将溶液的pH调节至3.0-5.0范围时，能够沉淀发酵液中90％-98％的菌体，蛋白以及核酸。酸化溶液所用的酸可为磷酸、醋酸、盐酸、硫酸，硝酸或者是这些酸溶液的不同浓度的混合液。酸化时间为10分钟-24小时，需要根据不同的细菌或血清型来决定。酸化时发酵液温度可为4-37℃。通过对以上条件的控制，发酵液中的菌体、蛋白和核酸等主要污染物能够快速形成沉淀，而荚膜多糖能够稳定地存在于溶液中达到分离杂质的目的。

(三)、微滤过程的控制

在本发明的纯化平台程序中，省去离心分离步骤，直接通过微滤来去除溶液中的细胞碎片以及小颗粒不溶物，微滤膜的分子量范围在0.22至1μm。收集含有荚膜多糖的澄清滤溶液，丢弃微滤回流液。

(四)、超滤浓缩和洗滤过程的控制

本发明纯化技术平台程序中对微滤液进行超滤浓缩并清洗采用的超滤膜分子量可为5、10、30、50、100或者500Kd中的任何一种，需要根据细菌种类或者特定血清型来决定。浓缩最终溶液体积范围为原溶液的2-10倍，根据细菌种类或者血清型不同而定。超滤洗滤浓缩液工艺步骤时采用纯水、缓冲液、盐溶液或者酸化盐溶液中的任何一种，需要更不同血清型多糖的稳定性来决定。通过以上纯化工艺过程，溶液中的杂质含量逐步降低，下表为肺炎球菌部分血清型荚膜多糖溶液经过纯化后杂质浓度测定结果：

从上表可见，根据肺炎球菌血清型的不同，通过本发明纯化方法，能够去除多糖溶液中90-98％蛋白，而核酸去除的效果更明显，可达97-99％。

应该指出的是，本发明纯化荚膜多糖工艺，可以和其它纯化方法并用。一般来说，可用本发明纯化方法对发酵液中的多糖进行初步纯化后，去除大部分杂质，然后在下游的纯化工艺中，可采用其它精纯化方法，比如活性炭过滤，磷羟基灰质岩吸附，色谱法，乙醇沉淀，以及苯酚萃取等方法结合来进一步纯化，去除残留的蛋白或者核酸污染物，而获得精制多糖。

需要进一步强调的是，在本发明中加酸分离发酵液中的菌体和杂质是关键，它是快速纯化细菌荚膜多糖的关键一步。本发明可以应用于其它荚膜多糖纯化工艺的一部分，通过结合其它多糖纯化方法，可将蛋白和核酸含量降至1.0％以下。

以上对本发明进行了概括，为了进一步详细说明和理解，可以阅读以下具体例子。描述这些例子的目的仅仅是为了对本发明进行说明，而不是限制本发明在这些例子范围内。

实施例1：

从肺炎球菌血清型19F的发酵液中纯化荚膜多糖，具体方法步骤如下：

步骤一，荚膜多糖细菌的发酵：在装有细菌培养基的发酵罐中发酵出特定荚膜多糖的细菌；

(一)、主种子和工作种子制备

肺炎球菌血清型19F从从美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection)获得，将冻干种子管中的菌种接种于5ml酵母-酸水解酪素培养液，36℃±2℃培养12-24小时，当细菌生长至OD₆₀₀读数为1.0-1.5时，将菌液转接种至150ml的新鲜酵母-酸水解酪素培养液中，在36℃±2℃下，培养5-10小时至指数生长期，停止培养，分装冻干，储存于2-8℃为主种子。

肺炎球菌血清型19F的主种子冻干管的菌种接种于5ml酵母-酸水解酪素培养液，36℃±2℃培养12-24小时，当细菌生长至OD₆₀₀读数为1.0-1.5时，将菌液转接种至150ml的新鲜酵母-酸水解酪素培养液中，在36℃±2℃下，培养5-10小时至指数生长期，停止培养，分装冻干，储存于2-8℃为该血清型的工作种子。

(二)、细菌发酵

从工作种子库取出种子管接种至5ml酵母-酸水解酪素培养液中，在36℃±2℃培养至细菌生长指数中期。将菌液转接种至150ml的新鲜酵母-酸水解酪素培养液中，在36℃±2℃下，培养5-10小时至指数生长期，将50ml菌液转接种至2L新鲜酵母-酸水解酪素培养液中，在36℃±2℃下，培养至指数生长期中期而制备成发酵种子液，将发酵种子液接种至装有30升酵母-酸水解酪素培养液的50升发酵罐中。用氢氧化钠来维持发酵液pH在6.8±0.2，待细菌生长至指数后期。

步骤二，加酸分离菌体和杂质：加入磷酸调节发酵液的pH值，使发酵液的pH值控制3～5之间，静至30分钟，用此方法来沉淀菌体和杂质；

步骤三，用微滤膜对步骤二所获得的上清液进行微滤，以去除其中的残留细胞碎片和不溶小颗粒物质，用0.22μm膜微滤发酵离心上清液，收集过滤液，弃回流液；

步骤四，用超滤膜浓缩和洗滤步骤三的微滤液，获得粗制细菌荚膜多糖溶液，以30Kd膜超滤浓缩微滤液至原体积的10倍后，用纯水进行洗滤，去除溶液中残留的蛋白和核酸等杂质，真空冻干多糖，在-70℃下储存。

步骤五，采用现有技术对细菌荚膜多糖进行后续纯化。

Claims (5)

1.快速纯化细菌荚膜多糖的方法，包括以下步骤：

步骤一，荚膜多糖的发酵，在装有细菌培养基的发酵罐中发酵出生产荚膜多糖的细菌，该细菌为肺炎球菌，其为在装有细菌培养基的发酵罐中无氧发酵使得该肺炎球菌在发酵液中以粗糙菌态为主；所述肺炎球菌包括1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F血清型；

步骤二，加酸分离发酵液中的菌体和杂质，其为将含有菌体的发酵液直接进行酸化，加酸调节步骤一所得发酵液的pH值，控制pH3.0-5.0，用此方法来沉淀菌体和杂质；

步骤三，用微滤膜对步骤二所获得的含有沉淀菌体和杂质的发酵液进行微滤，以去除其中的不溶颗粒物，包括菌体，沉淀杂质，残留细胞碎片和不溶小颗粒物质；

步骤四，超滤浓缩和洗滤：用超滤膜浓缩和洗滤步骤三的微滤液，获得粗制细菌荚膜多糖溶液。

2.根据权利要求1所述快速纯化细菌荚膜多糖的方法，其特征是：在步骤二中所加的酸是磷酸、醋酸、盐酸、硫酸或硝酸中的任意一种。

3.根据权利要求1所述快速纯化细菌荚膜多糖的方法，其特征是：微滤所用微滤膜的膜孔径为0.22，0.45，0.65，1.0μm中的任意一种。

4.根据权利要求1所述快速纯化细菌荚膜多糖的方法，其特征是：超滤所用的超滤膜是分子量为5kD至500kD范围内的任意一种。

5.根据权利要求1所述快速纯化细菌荚膜多糖的方法，其特征是：洗滤所用溶液为纯水、缓冲液或者盐溶液或它们的混合液。