CN107082819A - 一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法。该方法包括如下步骤：1)将肺炎链球菌菌体的灭活后，离心收集上清液；2)超滤，收集所得滤液；3)调节步骤2)所得滤液的pH值为3～5，离心收集上清液；4)调节步骤3)所得上清液中加入钙盐，调节pH值为碱性后，离心收集上清液；5)向步骤4)所得上清液中加入沉淀剂进行沉淀，收集所得沉淀，洗涤，干燥，完成所述肺炎链球菌荚膜多糖的纯化。通过对该纯化工艺进行优化，获得了蛋白含量、核酸含量、糖含量、磷含量以及氮含量均符合指标的荚膜多糖。由于该工艺获得的荚膜多糖杂质含量低，收率高，工艺简单，且容易放大，适合作为肺炎链球菌多糖疫苗的生产工艺。
Description
技术领域
本发明属于药物领域，涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法。
背景技术
肺炎链球菌是一种成双排列成矛头状的革兰氏阳性球菌，目前发现90多个血清型，其中约30个血清型的菌株对人类有致病性，常常引起儿童和老年人感染。人感染该致病菌后可导致一系列疾病的发生，包括症状较轻的中耳炎以及严重的肺炎、球血病、脑膜炎、败血症等侵袭型疾病。感染肺炎链球菌是5岁以下儿童的主要死因，世界卫生组织估计，全球每年因感染肺炎链球菌而致死的人数为160万，绝大多数死亡病例发生在低收入国家。此外，肺炎链球菌耐药问题在全世界越来越严重，临床治疗也变得越来越困难。因此，肺炎链球菌疫苗在感染防治中的作用越来越突出。
肺炎链球菌有三层外膜包括质膜层、细胞壁层和荚膜层。研究结果表明荚膜多糖是肺炎链球菌的主要毒力因子，也是人类发现的第一种非蛋白抗原，是开发肺炎链球菌荚膜多糖疫苗和蛋白结合疫苗的最佳抗原。
由于肺炎链球菌荚膜多糖的结构复杂且稳定性较差，在荚膜多糖的纯化过程中需注意分离方法以及除杂方法的选用。蛋白质的去除通常是用酚-氯仿反复抽提，有时需要在酚-氯仿中加入少许异戊醇，以降低表面张力，从而减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。众所周知，苯酚对人体和环境均有危害，并且苯酚是强腐蚀性的物质，操作不便，在制品中的残留量有严格的要求；同时由于工艺繁琐，加上苯酚溶解的部分水相损失了很多荚膜多糖，所以回收率很低。因此，减少苯酚的使用量是必然的趋势。对核酸杂质的去除可采用低浓度乙醇沉淀或使用核酸酶进行酶解。常使用终浓度为25％的乙醇以及单价阳离子如钠离子来沉淀核酸，由于乙醇易燃，对厂房和设备要求很严格。核酸酶酶解法常用脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶去除核酸，使用该方法去除核酸一般比较彻底，但核酸酶的价格比较昂贵，限制了该方法的大规模使用。
通过传统的肺炎链球菌荚膜多糖纯化方法可以获得比较好的荚膜多糖，但是由于各种各样的原因影响了这些纯化方法的使用，因此开发新的方法成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种肺炎链球菌荚膜多糖的纯化方法。
本发明提供的纯化肺炎链球菌荚膜多糖的方法，包括如下步骤：
1)取肺炎链球菌培养液，将菌体灭活，离心收集上清液；
2)超滤，收集所得滤液；
3)调节步骤2)所得滤液的pH值为3～5，离心收集上清液；
4)调节步骤3)所得上清液中加入钙盐，调节pH值为碱性后，离心收集上清液；
5)向步骤4)所得上清液中加入沉淀剂进行沉淀，收集所得沉淀，洗涤，干燥，完成所述肺炎链球菌荚膜多糖的纯化。
上述方法的步骤1)中，肺炎链球菌培养液是本领域技术人员按照现有技术培养得到的肺炎链球菌培养液；如可按照如下方式培养而得：将肺炎链球菌接种于10％脱纤维羊血普通琼脂培养基，于5％的CO2环境中36℃静止培养8h而得；灭活步骤所用灭活剂为脱氧胆酸钠(DOC)，灭活的pH值为7.0；所述灭活剂的加入量为使得含有肺炎链球菌菌体的料液中灭活剂的终浓度为0.1％～0.5％，具体可为0.12％；所述浓度为质量百分浓度；
所述方法还可包括如下步骤：在所述步骤1)灭活步骤之后，离心步骤之前，将灭活所得体系按照如下方式a或方式b进行搅拌：a、室温搅拌过夜；b、先进行一次搅拌，调节体系的pH值为酸性后再进行二次搅拌，静置；
具体的，所述方式b一次搅拌步骤中，搅拌温度为室温；时间为8～12h；所述调节体系的pH值步骤中，pH值为6.6；所述二次搅拌步骤中，搅拌温度为室温；搅拌时间为25-35min或30min；所述静置步骤中，时间为12-24h。
所述步骤2)中，所用超滤膜的截留分子量为100KDa；
超滤所用缓冲液为磷酸盐缓冲液(PB)；所述缓冲液的浓度为0.1～0.5M，pH值为7.0。所述缓冲液更具体为浓度为0.1～0.5M，pH值为7.0的磷酸盐缓冲液(PB)；
该步骤的目的是为了去除含有肺炎链球菌菌体的料液中的培养基以及小分子量的杂质；
为了提高超滤效果，在超滤之前，可将步骤1)所得上清液进行预过滤；所述预过滤步骤中，所用滤膜的孔径具体可为0.45～0.8μm；
所述步骤3)中，pH值为4.0。
该步骤的目的是采用降低pH值的方法以除去与蛋白和核酸结合的DOC，以及等电点为该pH值的蛋白等杂质；
所述方法还包括如下步骤：在所述步骤3)中调节步骤2)所得滤液的pH值为3～5步骤之后，离心步骤之前，将滤液进行搅拌；所述搅拌步骤中，温度具体可为室温；时间具体可为25-35min，更具体可为30min；
所述步骤4)中，所述钙盐为氯化钙的水溶液，具体可为质量百分浓度为15-25％的氯化钙的水溶液，更具体可为质量百分浓度为20％的氯化钙的水溶液；
所述钙盐的用量为使得加入钙盐后的体系中钙盐的终浓度为2.5-3.5％，具体可为3％；所述浓度为质量百分浓度；
所述调节pH值为碱性步骤中，pH值为9.0。
该步骤的目的是通过加入钙盐形成与核酸和蛋白质具有针对性吸附的Ca(OH)2沉淀；
所述步骤5)沉淀步骤中，所述沉淀剂的加入量为使得加入沉淀剂后的体系中沉淀剂的终浓度为75-85％，具体可为80％；
所述洗涤步骤中，所用溶剂为无水乙醇和丙酮中的至少一种；
所述干燥步骤中，干燥方式为压缩空气吹干。
所述方法还包括如下步骤：在所述步骤4)之后，所述步骤5)加入沉淀剂进行沉淀步骤之前，将步骤4)所得上清液进行超滤换液。
具体的，所述将步骤4)所得上清液进行超滤换液步骤中，超滤所用缓冲液为氯化钠的水溶液，具体可为浓度为0.3M的氯化钠的水溶液；
所用超滤膜的截留分子量可依据肺炎多糖的分子量大小进行适当选择，如具体可为50KDa-100KDa；
所用超滤膜的截留分子量为50KDa-100KDa；
超滤倍数为900-1100倍，具体可为1000倍。
该超滤步骤可根据肺炎链球菌的血清型不同而定；如对于血清型为7F、12F和15B的肺炎链球菌可不进行该超滤操作；而对于血清型为14、18C和23F的肺炎链球菌可进行该超滤操作。
上述步骤1)-步骤5)中，离心步骤均在低温高速条件下进行，具体可在冷冻离心机中进行；具体的，所述低温为-5℃-5℃；转速具体可为9000-10000rpm。
本发明的有益效果在于：
1)本发明采用简单易行的肺炎链球菌灭活方法，该方法只需要将配制好的DOC母液加入到发酵液中搅拌即可。该方法具有很好的可控性和重复性、制备过程简单、低环境污染，有利于大规模的工业生产。
2)本发明仅需要四个步骤，第一步为超滤膜除去培养基以及小分子量的杂质；第二步为采用降低pH来除去与蛋白和核酸结合的DOC，以及等电点为该pH值的蛋白等杂质；第三步为加入CaCl2，并调节pH值至碱性，形成与核酸和蛋白质具有针对性吸附的Ca(OH)2沉淀；第四步为加入乙醇至终浓度80％，沉淀多糖。
3)本发明所使用试剂温和，避免使用酚，氯仿等有毒试剂，以及价格昂贵的蛋白酶，核酸酶等试剂，对环境和人体几乎无损伤。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。离心步骤均在冷冻离心机中进行；离心温度为-5℃，转速为10000rpm。下述实施例所用肺炎链球菌培养液可按照各种现有技术培养而得；具体可按照如下方式培养而得：将肺炎链球菌接种于10％脱纤维羊血普通琼脂培养基、5％CO2环境中36℃培养8h而得。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1
1)取血清型为7F的肺炎链球菌培养液，加入终浓度为0.12％的脱氧胆酸钠(DOC)，搅拌过夜，离心去除大颗粒杂质，收集上清液；
2)使用截留分子量为100KDa的超滤膜进行超滤换液，在超滤前，使用0.45～0.8μm的滤器进行预先过滤，超滤缓冲液使用0.1M的磷酸盐缓冲液，pH值为7.0；
3)将超滤后所得滤液调节pH至4.0，置于冷库中搅拌30min，高速冷冻离心保留上清液；
4)向上清液中加入质量百分浓度为20％的CaCl2水溶液至其在体系中的终浓度为3％，搅拌10～30min，调节pH至9.0左右，置于冷库中搅拌30min，高速冷冻离心保留上清液；
5)向上清液中加入乙醇至终浓度为80％，此时有大量的多糖沉淀，置于冷库中搅拌1～2h，离心收集多糖沉淀，使用无水乙醇和丙酮洗涤，压缩空气吹干即得精制荚膜多糖。
实施例2
取血清型为12F的肺炎链球菌培养液，加入终浓度为0.12％的脱氧胆酸钠(DOC)，搅拌过夜，离心去除大颗粒杂质，收集上清液；并使用截留分子量为100KDa的超滤膜进行超滤换液，在超滤前，使用0.45～0.8μm的滤器进行预先过滤，超滤缓冲液使用0.1M的磷酸盐缓冲液，pH值为7.0左右；将超滤后样品调节pH至4.0，置于冷库中搅拌30min，高速冷冻离心保留上清液；向上清液中加入终浓度为3％的CaCl2溶液，搅拌10～30min，调节pH至9.0左右，置于冷库中搅拌30min，高速冷冻离心保留上清液；然后向上清液中加入乙醇至终浓度为80％，此时有大量的多糖沉淀，置于冷库中搅拌1～2h，离心收集多糖沉淀，使用无水乙醇和丙酮洗涤，压缩空气吹干即得精制荚膜多糖。
实施例3
取血清型为14的肺炎链球菌培养液，加入终浓度为0.12％的脱氧胆酸钠(DOC)，搅拌过夜，离心去除大颗粒杂质，收集上清液；并使用截留分子量为100KDa的超滤膜进行超滤换液，在超滤前，使用0.45～0.8μm的滤器进行预先过滤，超滤缓冲液使用0.1M的磷酸盐缓冲液，pH值为7.0左右；将超滤后样品调节pH至4.0，置于室温中搅拌30min，高速冷冻离心保留上清液；向上清液中加入终浓度为3％的CaCl2溶液，搅拌10～30min，调节pH至9.0左右，置于室温中搅拌30min，高速冷冻离心保留上清液；滤液使用50KDa膜包进行超滤浓缩，超滤洗滤倍数约为1000倍，所使用缓冲液为0.5M的氯化钠，然后向上清液中加入乙醇至终浓度为80％，此时有大量的多糖沉淀，置于室温中搅拌1～2h，离心收集多糖沉淀，使用无水乙醇和丙酮洗涤，压缩空气吹干即得精制荚膜多糖。
实施例4
取血清型为15B的肺炎链球菌培养液，加入终浓度为0.12％的脱氧胆酸钠(DOC)，搅拌过夜，离心去除大颗粒杂质，收集上清液；并使用截留分子量为100KDa的超滤膜进行超滤换液，在超滤前，使用0.45～0.8μm的滤器进行预先过滤，超滤缓冲液使用0.1M的磷酸盐缓冲液，pH值为7.0左右；将超滤后样品调节pH至4.0，置于冷库中搅拌30min，高速冷冻离心保留上清液；向上清液中加入终浓度为3％的CaCl2溶液，搅拌10～30min，调节pH至9.0左右，置于室温中搅拌30min，高速冷冻离心保留上清液；上清液使用3um滤器过滤去除小颗粒杂质，然后向上清液中加入乙醇至终浓度为80％，此时有大量的多糖沉淀，置于室温中搅拌1～2h，离心收集多糖沉淀，沉淀使用无水乙醇和丙酮分别洗涤两次，使用无水乙醇和丙酮洗涤，压缩空气吹干即得精制荚膜多糖。
实施例5
取血清型为18C的肺炎链球菌培养液，加入终浓度为0.12％的脱氧胆酸钠(DOC)，搅拌过夜，离心去除大颗粒杂质，收集上清液；并使用截留分子量为100KDa的超滤膜进行超滤换液，在超滤前，使用0.45～0.8μm的滤器进行预先过滤，超滤缓冲液使用0.1M的磷酸盐缓冲液，pH值为7.0左右；将超滤后样品调节pH至4.0，置于室温下搅拌30min，高速冷冻离心保留上清液；向上清液中加入终浓度为3％的CaCl2溶液，搅拌10～30min，调节pH至9.0左右，置于室温下搅拌30min，高速冷冻离心保留上清液；滤液使用100KDa膜包进行超滤浓缩，超滤洗滤倍数约为1000倍，所使用缓冲液为0.5M的氯化钠，然后向上清液中加入乙醇至终浓度为80％，此时有大量的多糖沉淀，置于室温中搅拌1～2h，离心收集多糖沉淀，使用无水乙醇和丙酮洗涤，压缩空气吹干即得精制荚膜多糖。
实施例6
取血清型为23F的肺炎链球菌培养液，加入终浓度为0.12％的脱氧胆酸钠(DOC)，搅拌过夜，离心去除大颗粒杂质，收集上清液；并使用截留分子量为100KDa的超滤膜进行超滤换液，在超滤前，使用0.45～0.8μm的滤器进行预先过滤，超滤缓冲液使用0.1M的磷酸盐缓冲液，pH值为7.0左右；将超滤后样品调节pH至4.0，置于冷库中搅拌30min，高速冷冻离心保留上清液；向上清液中加入终浓度为3％的CaCl2溶液，搅拌10～30min，调节pH至9.0左右，置于室温中搅拌30min，高速冷冻离心保留上清液；滤液使用100KDa膜包进行超滤浓缩，超滤洗滤倍数约为1000倍，所使用缓冲液为0.3M的氯化钠，然后向上清液中加入乙醇至终浓度为80％，此时有大量的多糖沉淀，置于室温中搅拌1～2h，离心收集多糖沉淀，使用无水乙醇和丙酮洗涤，压缩空气吹干即得精制荚膜多糖。
将上述实施例1-6所得精制荚膜多糖按照如下方法进行杂质含量检测：核酸含量检测方法参见中国药典三部附录II A紫外-可见分光光度法；蛋白质含量检测方法按照中国药典三部附录VI B Lowry法；总氮含量参见中国药典三部附录VI A凯氏定氮法；磷含量检测方法参见中国药典三部附录VII A比色法。甲基戊糖按照欧洲药典所述方法进行检测。所得精制荚膜多糖中各杂质及多糖成分含量如表1至表6所示。
表1、实施例1实验结果
表2、实施例2实验结果
表3、实施例3实验结果
表4、实施例4实验结果
表5、实施例5实验结果
表6、实施例6实验结果
由表可知，按照本发明提供的方法对肺炎链球菌中的荚膜多糖进行纯化，荚膜多糖中各杂质成分含量的检测结果均符合欧洲药典中关于各成分含量的限定值，多糖含量均高于标准限定值，且该方法具有很好的可控性和重复性、制备过程简单、低环境污染，有利于大规模的工业生产。
上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (8)
1.一种纯化肺炎链球菌中荚膜多糖的方法，包括如下步骤：
1)取肺炎链球菌培养液，将菌体灭活，离心收集上清液；
2)超滤，收集所得滤液；
3)调节步骤2)所得滤液的pH值为3～5，离心收集上清液；
4)调节步骤3)所得上清液中加入钙盐，调节pH值为碱性后，离心收集上清液；
5)向步骤4)所得上清液中加入沉淀剂进行沉淀，收集所得沉淀，洗涤，干燥，完成所述肺炎链球菌荚膜多糖的纯化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，灭活步骤所用灭活剂为脱氧胆酸钠，灭活的pH值为7.0；所述灭活剂的加入量为使得含有肺炎链球菌菌体的料液中灭活剂的终浓度为0.1％～0.5％或0.12％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所用超滤膜的截留分子量为100KDa；
超滤所用缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述缓冲液的浓度为0.1～0.5M，pH值为7.0。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，pH值为4.0。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述钙盐为氯化钙的水溶液或质量百分浓度为15-25％或20％的氯化钙的水溶液；
所述钙盐的用量为使得加入钙盐后的体系中钙盐的终浓度为2.5-3.5％或3％；
所述调节pH值为碱性步骤中，pH值为9.0。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤5)沉淀步骤中，所述沉淀剂为低级醇或乙醇；
所述沉淀剂的加入量为使得加入沉淀剂后的体系中沉淀剂的终浓度为75-85％或80％；
所述洗涤步骤中，所用溶剂为无水乙醇和丙酮中的至少一种；
所述干燥步骤中，干燥方式为压缩空气吹干。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：在所述步骤4)之后，所述步骤5)加入沉淀剂进行沉淀步骤之前，将步骤4)所得上清液进行超滤换液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述将步骤4)所得上清液进行超滤换液步骤中，超滤所用缓冲液为氯化钠的水溶液或浓度为0.3M的氯化钠的水溶液；
所用超滤膜的截留分子量为50KDa-100KDa；
超滤倍数为900-1100倍或1000倍。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: An Wenqi Inventor after: Gao Ruifang Inventor after: Li Tao Inventor after: Wang Bin Inventor after: Ma Hongen Inventor after: Xu Yang Inventor before: Wang Libo Inventor before: Wu He Inventor before: Gao Ruifang Inventor before: Li Tao |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20170822 |
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |