CN101619308B - 从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法，步骤：A、在室温下，往蛋清中加入软化水，稀释；B、进行均质；C、均质后的溶液，调pH值；D、离子交换树脂再生：用氢氧化钠溶液，树脂与氢氧化钠溶液在搅拌罐里搅拌，用软化水洗；E、将活化好的离子交换树脂与蛋清混合搅拌；F、将搅拌罐的上清液倾出，滤干，用软化水清洗树脂中的杂蛋白；G、将氯化钠溶液与清洗干净的树脂搅拌，洗脱吸附到离子交换树脂中的溶菌酶；H、将搅拌罐中上清液倾出，滤干，用软化水清洗树脂中的残留溶菌酶；J、超滤，浓缩，除盐；K、将浓缩得到的溶菌酶通过干燥得到溶菌酶粉。本发明简单易行，价格低廉，鸡蛋清没有发生变化，保持了品质，大规模工业化生产。

Description

从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法

技术领域

本发明涉及生物、医药及食品工业技术领域，更具体涉及一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法。

背景技术

1.溶菌酶的用途广泛

溶菌酶的用途很广，生物技术中，溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶，国外多用于菌体内容物质的提取；在医药上，溶菌酶具有多种药理作用，广泛应用于临床医学，溶菌酶作为存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效；在食品工业中由于溶菌酶本身是天然蛋白质，无毒性，是安全性高的食品添加剂，可以作为防腐、保鲜剂，广泛应用于乳制品、低度酒、饮料、水产品、肉类制品和糕点等的防腐保鲜。

如今，全国各地鸡蛋生产发展迅猛，鸡蛋的销量不断增加，蛋品的深加工成为大家日益关注的问题。因此，蛋清中溶菌酶提取的研究成为当今一大热门课题。

2.溶菌酶的特殊生物学活性

溶菌酶纯品为白色粉状晶体，无臭、微甜，易溶于水和盐溶液，不溶于丙酮、乙醚，遇碱易被破坏。溶菌酶对革兰氏阳性菌(如溶壁小球菌、黄色八叠球菌、枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌)有溶菌作用，一般对革兰氏阴性菌无效。实验证明，溶菌酶可催化某些细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解细菌的细胞壁。底物与酶结合后，溶菌酶专一性地作用于NAM-NAG键。细胞壁肽聚糖支架被破坏，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。因此，溶菌酶能选择性地分解微生物的细胞壁，同时不破坏其他组织，对人体细胞不会产生降解作用，不但安全性很高，而且具有一定的保健作用。

3溶菌酶及其研究进展

溶菌酶(lysozyme)是由弗莱明在(1922)年发现的有效的抗菌剂，全称为1-4-β-N-溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，分子量为14000-15000，等电点11左右。蛋清中溶菌酶是由129个氨基酸组成的碱性球蛋白，它能切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1-4，糖苷键，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。

目前，国外已经生产出活性达50000U/mg的溶菌酶，而国内生产溶菌酶的酶活性较低，大多只有18000U/mg左右，纯度也不高。本课题研究了提取高活性溶菌酶的方法及大规模生产的工艺参数，可以工业化生产出活性大于等于40000U/mg的溶菌酶。

溶菌酶的提取主要有以下的几种方法：

直接结晶法：溶菌酶是一种盐溶性蛋白质，而蛋清中其他蛋白质的等电点都为酸性条件，利用这一特点，在蛋清中加入一定量的氯化物、碘化物或碳酸盐等盐类，并调pH值至9.5-10.0，降低温度，溶菌酶会以结晶形式慢慢析出，而大多数蛋白质仍然存留在溶液中。在超滤浓缩脱盐后，为获得较纯产品，采用结晶纯化步骤，酶液经超滤处理后，用氢氧化钠调整pH 9.5，离心去除杂质，上清液在缓缓搅拌下，加氯化钠至5％，静置一周，得粗结晶。粗结晶溶于pH 4.6的醋酸水中，分去不溶物后，进行重结晶，二次结晶的最终得率为60％左右。活力测定为8000U/mg。

直接结晶法生产周期长，收率低，纯度和活性低，不适合工业化生产。

聚丙烯酸沉淀法：聚丙烯酸沉淀法首先经过吸附步骤，即将鸡蛋清用20％的氯化氢溶液调pH至6.0，在调pH值的过程中不停的搅拌。有少量的乳白色沉淀析出，然后加入15％聚丙烯酸，立即有白色沉淀析出，加至pH值为3.0为止，静置17个小时进行倾析，得到粘附于底部的乳白色胶状物。第二步解离，将前步得到的溶菌酶聚丙烯酸凝聚物。加入少量蒸馏水并用0.5mol/L的碳酸钠溶液，将其溶解，转移后，将pH值调到9.5。加入5％氯化钙溶液将溶菌酶聚丙烯酸解离，至无沉淀析出，然后过滤，得到澄清溶液。第三步盐析，将所得澄清溶液加入5％的NaCl溶液搅拌均匀.放入冰箱调温度为0℃。待有晶体析出后，用无水乙醇洗涤数次，置恒温培养箱中40℃条件下干燥称重。

聚丙烯酸沉淀法生产周期较长，提取过程中使用的试剂存在不安全因素，产品不适用于食品医药等行业。

超滤法：超滤是一种以压力为动力，利用超滤膜不同孔径对液体进行分离的物理筛分过程。蛋清溶菌酶是小分子物质，并且与蛋清中其他相对分子质量高的蛋白质存在着静电作用力，以结合态存在，采用不同的前处理工艺，降低溶菌酶与其他蛋清蛋白之间的作用力，使溶菌酶处于解离状态后，采用超滤的方法对蛋清溶菌酶进行分离提取。张灏等人通过试验初步确立了蛋清溶菌酶的超滤工艺：即料液的pH值8.5，采用截留相对分子质量为3万的PES膜，连续方式稀释3倍进行超滤；透过液用截留相对分子质量为3000的PES膜进行浓缩，冷冻干燥后得到蛋清溶菌酶样品，酶活力为每毫克蛋白质14610U或16831U，经电泳检测酶的纯度较高。

超滤法操作简单，提取过程无有害物质引入，适合工业化生产，但提取方法比较粗放，产品质量较差。

离子交换树脂法：离子交换法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间所发生的交换反应来进行分离的，分离的效果较好，广泛用于微量组分的富集。一般流程为：鲜蛋-预处理-搅拌吸附-上柱洗脱-等电点沉淀-透析-喷雾干燥-成品。蛋清将调至pH-4.6(卵粘蛋白等电点，于沸水浴迅速升温至75℃，维持5min，流水冷却至室温，用质量浓度为20％的氢氧化钠调pH至9.5，静置5-6h，过滤或离心除去沉淀，再将pH调至中性。724树脂经浸泡处理去杂质，以2mol/L氢氧化钠转型为Na+型阳离子树脂，1/15(mol/L)磷酸缓冲液(pH6.46)平衡过夜。动态交换法洗脱，先将处理转型后的树脂装柱，鸡蛋清以1.6mL/min流速缓慢通过处理好的724树脂柱，再用3倍体积1/15(mol/L)磷酸缓冲液(pH6.46)洗涤树脂柱，除去未吸附杂质，以质量浓度为10％的硫酸铵溶液洗脱，洗脱液经核酸蛋白检测仪(λ＝280nm)检测，部分收集器收集含溶菌酶的洗脱液。树脂则进行充分清洗转型后备用。含酶洗脱液经截留分子量为5000Da的聚砜膜超滤浓缩脱盐，冷冻干燥得成品。亦可加终浓度至5％的NaCl，4℃静置24h得结晶。

离子交换树脂法比较先进，但是提取过程中引入了硫酸铵，产品不适用于食品医药行业。

亲和层析法：亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具有的专一性亲和力而设计的色谱技术。酶-底物复合物形成之后，在一定的条件下分离复合物便得到纯净的酶。常常使用的吸附剂为几丁质及其衍生物，如：几丁质粉、羧甲基几丁质、几丁质包埋纤维素、脱氨几丁质粉、N-酰化壳聚糖、脱氨再生几丁质凝胶。王炜军等人探讨了磁性亲和分离方法，磁性介质已被广泛用于分离细胞及核酸、蛋白质等生物大分子和激素等小分子生物活性物质。其优点在于通过外磁场的作用可快速地实现固液及磁性介质与其他固形物杂质间的分离，尤其是当待分离的液体样品含有固形物或较为粘稠时更显现其优越性。蛋清粘度较大，用一般的亲和层析时易造成层析柱的堵塞.在原有亲和凝胶介质的基础上进一步制备了具磁性的几丁质凝胶亲和介质，即在原有亲和层析介质的基础上引入具磁响应性的四氧化三铁颗粒，使得介质复合了特异亲和吸附和磁响应性的功能，但使用这种方法时，随着四氧化三铁颗粒的引入同时又导致了介质对杂蛋白的非特异吸附。为克服这种非特异吸附，采用了内含0.5mol/L醋酸铵的磷酸缓冲液进行充分洗涤，取得了较好的效果，但这种吸附最终也导致了部分活力回收的丧失。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法。该方法利用溶菌酶有带电荷基团的特点，使用D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂提取，再用高浓度钠离子洗脱，工艺简单易行，操作方便，提取液的超滤除盐技术也已成熟。而且应用此法提取溶菌酶的活性较高，纯度也很高。此外，鸡蛋清来源广泛，提取后的鸡蛋清不改变性状，还可以再回收加工，提取成本低廉。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法，其步骤是：

1.在室温下18-25℃，往30公斤的蛋清中加入30升的软化水(俗称去离子水)，将蛋清稀释0.5-1.5倍。

2.用均质机于常温18-25℃，压力8-11MPa条件下，进行均质。

3.均质后的蛋清溶液，用2mol/L的氯化氢溶液调pH值到4-6.8。

4.离子交换树脂再生：用质量浓度为4-6％的氢氧化钠溶液，D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂与氢氧化钠溶液的以体积比1∶2混合，在搅拌罐里搅拌2-2.5小时后，用软化水洗至流出液pH值＝9.5-12.5，D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂才活化好。

5.将活化好的D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂与蛋清以体积比例1∶6混合，在搅拌罐内搅拌吸附30-90分钟。

6.将搅拌罐的上清液倾出，滤干。用软化水清洗D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的杂蛋白，直到D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中溶液的TDS(可溶性固形物含量)为300-500mg/L，D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂方洗干净，去掉溶菌酶的蛋清(回收)。

7.将0.4mol/L的氯化钠溶液与清洗干净的D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂以以比体积比5∶1混合，在搅拌罐中搅拌，洗脱吸附到D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的溶菌酶，洗脱时间为120-150分钟。

8.将搅拌罐中上清液倾出，滤干。用软化水清洗D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的残留溶菌酶2-3次。

9.超滤机在温度23-28℃，进膜压力6-8bar时超滤，浓缩，除盐。其间不断加水，直到流出液的盐度达到0.1％(质量比)；

10.将浓缩得到的溶菌酶通过喷雾干燥得到溶菌酶粉。干燥塔进口温度：120-160℃；出口温度：50-75℃。

本发明具有以下优点：

1.本发明涉及的提取原料鸡蛋清来源广泛，价格低廉；

2.溶菌酶的提取、浓缩工艺简单易行，技术成熟；

3.本方法提取过程中未使用任何有毒有害化学物质，确保了产品质量的安全性。

4.提取后的鸡蛋清没有发生任何化学变化，保持了原有品质，使其能够完全回收，再进行其它深加工。

5.溶菌酶在生物技术、医学技术及食品工业等领域都有广泛的应用，具有重要的科学价值和经济效益；

6.溶菌酶的高度专一性使其只对细菌的细胞壁有分解作用而对人体无任何副作用，因此它的安全性是非常高的。

7.本方法可以大规模工业化生产，在产品有较高活性和纯度的基础上保证了高产量。

附图说明

图1为一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的方框示意图

图2为一种溶菌酶纯度检测电泳图。

具体实施方式

一、一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法，具体步骤如下：

1.在室温18或20或22或24或25℃下，往30公斤的蛋清1中加入30升的软化水(俗称去离子水)，将蛋清1稀释0.5或0.7或1或1.2或1.5倍。

2.用均质机3于常温18或20或22或24或25℃，压力8或9或10或11MPa条件下，进行均质3。

3.均质3后的溶液，用2mol/L的氯化氢溶液调pH值4或5或5.5或6或6.5或6.8。

4.D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂再生5：用质量浓度为4或5或6％的氢氧化钠溶液，D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂与氢氧化钠溶液以体积比1∶2混合，在搅拌罐里搅拌120或130或135或140或142或145或150分钟后，用软化水洗7至流出液pH值＝9.5或10或10.5或11或11.5或12或12.5，D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂才活化好。

5.将活化好的D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂与蛋清以体积比例1∶6混合，在搅拌罐内搅拌吸附6，搅拌吸附30或35或45或50或60或70或80或90分钟。

6.将搅拌罐的上清液倾出，滤干。用软化水清洗7D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的杂蛋白，直到D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中溶液的TDS(可溶性固形物含量)为300-500mg/L，D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂方洗干净，去掉溶菌酶的蛋清13(回收)

7.将0.4mol/L的氯化钠溶液与清洗干净的D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂以比体积比5∶1混合，在搅拌罐中搅拌，洗脱8吸附到D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的溶菌酶，洗脱8时间为120或130或140或150分钟。

8.将搅拌罐中上清液倾出，滤干。用软化水清洗D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的残留9溶菌酶2-3次。

上述步骤4、5、6、7、8中所述用的树脂还有D151大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂和D113大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂。

9.超滤机在温度23或24或25或26或27或28℃，进膜压力6或7或8或9或10bar时超滤10，浓缩，除盐。其间不断加水，直到流出液的盐度达到0.1％(质量比)；

10.将浓缩得到的溶菌酶通过喷雾干燥11得到溶菌酶粉12。进口温度：120或125或135或137或139或141或143或145或151或155或160℃；出口温度：50或55或60或61或62或63或64或65或70或75℃6。

a：树脂对蛋清饱和吸附时间的测定

吸附从10分钟开始取样，每次间隔10分钟至60分钟，取出的样用传统方法进行检测。

(注：，0min均质过的蛋清，样品活性在132000U/ml，10min到60min的样没稀释，检测时加样0.05ml进行测定)

b：Nacl溶液对吸附后树脂饱和洗脱的测定

洗脱从30分钟开始取样，每次间隔10分钟至90分钟，样液稀释1000倍检测。

(注：以上样检测时都加样0.5ml)

二、溶菌酶活性及纯度的测定：

1.溶菌酶活性的测定：

(1)检测原理：

溶菌酶是能切断N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺间的B-1，4糖苷键的水解酶，微球菌(革兰氏阳性)的细胞壁结构组织主要含有以上成分，所以溶菌酶能破坏微球菌的细胞壁，使细菌在渗透压差的作用下破裂而被溶解，降低菌液的吸光度值。根据国际酶活力单位定义，在25℃，酶反应最适条件下，溶菌酶与微球菌的反应体系一分钟内吸光度值每下降0.001为一个活力单位(U)。

(2)实验试剂与器材：

①实验样品：溶菌酶(湖北神地农业科贸有限公司溶菌酶中试基地生产)，微球菌(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供，均能购买)。

②试剂：无菌生理盐水，营养琼脂培养基，营养肉汤培养基。磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠10.4g与磷酸氢二钠7.86g乙二胺四乙酸二钠0.39g，加入溶解成1000ml，调PH值至6.24)

③器材：超净工作台，水浴振荡培养箱，高压灭菌锅，高速离心机，紫外可见分光光度计，水浴锅等。

(3)实验内容：

①供试品溶液的制备

取样品约250mg用磷酸盐缓冲液溶解，置100ml量瓶中，加磷酸盐缓冲液适量定容，再用磷酸盐缓冲液稀释1000倍，配置成每1ml含溶菌酶活力约50U的溶液

②底物悬浮液的制备

将微球菌接种于营养琼脂培养基，28℃培养20-22h使其恢复活性。再将菌接种于营养肉汤培养基，28℃、160r/min，振荡培养48h。取培养物于4000rpm下离心20min，沉淀为菌体。加入少量无菌生理盐水洗涤菌体，再离心，重复2-3次。加磷酸盐缓冲液稀释菌体，使悬浮液于25±1℃时，在450nm处的波长处测得的吸光度为1.000±0.05。(现配现用)

③测定法

$\frac{\mathrm{\Δ}{E}_{450}}{0.001\×\mathrm{Ew}}=U/\mathrm{mg}$

式中ΔE ₄₅₀ 为450nm处每分钟吸光度的变化

Ew为每0.5ml所用酶溶液中含有酶的重量(mg)

0.001为一个单位在每分钟内使吸光度下降0.001

(4)测定结果：

经反复测定，本方法生产的各批次溶菌酶活性均大于40000U/mg

2.溶菌酶纯度的测定：

SDS-PAGE凝胶电泳法测定产品

【1】实验材料及仪器：

(1)样品：

溶菌酶(湖北神地农业科贸有限公司溶菌酶中试基地生产，均能购买)、电泳专用Maker。

(2)试剂：A液(丙烯酰胺29.2g，亚甲基双丙烯酰胺0.8g，定容至100ml)

B液(Tris 18.2g，SDS 0.4g，定容至100ml，用氯化氢调节pH到8.8)

C液(Tris 15g，SDS 0.4g，定容至100ml，用氯化氢调节pH值到6.8)

I液(过硫酸铵0.2g+纯净水1.8ml)

J液(四甲基乙二胺)

样品处理液(①C液20ml+甘油15g+SDS 0.4g，取①0.5ml加入尿素0.36g，巯基乙醇20ul，溴酚蓝20ul，加纯净水至1ml)

电极缓冲液(Tris 3g，甘氨酸14.4g，SDS 1g，定容至1000ml)

固定液(甲醇330ml，三氯乙酸120g，纯净水550ml)

染色液(①考马斯亮蓝G2500.95g+纯净水450ml，②浓硫酸25ml+纯净水425ml，③KOH 65.25g+纯净水100ml。①和②混合搅拌，静置3h，过滤取上清液，加入③，再加入三氯乙酸120g)

脱色液(体积比7％醋酸)

(3)仪器：电泳设备一套，烧杯，移液器(50ul、1ml、5ml)，小号离心管，振荡器等。

【2】实验原理：

SDS-PAGE凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作支持物的区带电泳，由于此种凝胶具有分子筛的性质，其中SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是阴离子去污剂，能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就是电泳迁移率只取决于分子量大小这个因素，因此可根据已知相对分子量的标准蛋白质的对数迁移率所做的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。

【3】实验内容：

(1)样品的制备：

精密称取样品5mg，加入样品处理液混匀，静置12h以上。

(2)凝胶的制备：

①分离胶的制备：按次序在烧杯中加入A液2.5ml、B液1.5ml、纯净水2ml、J液20ul、I液20ul，缓慢摇匀，避免产生气泡。沿着玻璃板缓慢将液体灌入胶模，至总体积2/3后水封静置。约50min后胶可凝固。

②浓缩胶的制备：按次序在烧杯中加入A液0.4ml、C液0.75ml、纯净水1.85ml、J液10ul、I液10ul，缓慢摇匀，避免产生气泡。去除分离胶上部的水，沿着玻璃板缓慢将液体灌入胶模，至液体高度约1.5cm，插入梳板，静置。约50min观察到梳齿附近凝胶中呈现光线折射的波纹时，浓缩胶凝聚完成。小心拔去梳板，用电极缓冲液清洗梳孔。

(3)电泳：

调节电压为15V，待样品泳动至浓缩胶与分离胶界面时调节电压为25V。待样品移动至分离胶低端时停止电泳。

(4)固定：

将分离胶取下，放入固定液中缓慢振动固定2h。

(5)染色：

将分离胶移入染色液中缓慢振动染色2h。

(6)脱色：

将分离胶移入脱色液中缓慢振动脱色至无背景色。

(7)结果观察：

根据染色所出现的区带，分析样品的纯度(图2)。

根据电泳图(图2)分析，所生产溶菌酶的纯度很高，大于98％；生产工艺成熟，每个批次产品的纯度均能得到保证。

目前，国外已经生产出活性达50000U/mg的溶菌酶，而国内生产溶菌酶的酶活性较低，大多只有18000U/mg左右，纯度也不高。本课题研究了提取高活性溶菌酶的方法及大规模生产的工艺参数，可以工业化生产出活性大于等于40000U/mg的溶菌酶。

Claims (1)

1.一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法，其步骤是：

A、在室温下18-25℃，往蛋清中加入软化水，将蛋清稀释0.5-1.5倍；

B、用均质机于常温18-25℃，压力8-11MPa条件下，进行均质；

C、均质后的蛋清溶液，用2mol/L的氯化氢溶液调pH值到4-6.8；

D、离子交换树脂再生：用质量浓度为4-6％的氢氧化钠溶液，D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂与氢氧化钠溶液的以体积比1∶2混合，在搅拌罐里搅拌2-2.5小时后，用软化水洗至流出液pH值＝9.5-12.5，D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂才活化好；

E、将活化好的D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂与蛋清以体积比例1∶6混合，在搅拌罐内搅拌吸附30-90分钟；

F、将搅拌罐的上清液倾出，滤干，用软化水清洗D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的杂蛋白，直到D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中溶液的TDS为300-500mg/L，D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂方洗干净，去掉溶菌酶的蛋清；

G、将0.4mol/L的氯化钠溶液与清洗干净的D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂以体积比5∶1混合，在搅拌罐中搅拌，洗脱吸附到D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的溶菌酶，洗脱时间为120-150分钟；

H、将搅拌罐中上清液倾出，滤干，用软化水清洗D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的残留溶菌酶2-3次；

J、超滤机在温度23-28℃，进膜压力6-8bar时超滤，浓缩，除盐，其间不断加水，直到流出液的盐度达到0.1％质量比；

K、将浓缩得到的溶菌酶通过喷雾干燥得到溶菌酶粉，干燥塔进口温度：120-160℃；出口温度：50-75℃。

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