CN104311628A - 一种蛋白溶液细菌内毒素去除方法 - Google Patents

一种蛋白溶液细菌内毒素去除方法 Download PDF

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本发明公开了一种蛋白溶液细菌内毒素去除方法，它包括以下步骤：S1.氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5%氯化铝溶液，pH为7.0～7.5，在2℃～8℃条件下反应1～2小时，用4000rpm离心收集凝胶；S2.去除蛋白溶液中细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶加入到蛋白溶液中，在4℃下，100rpm搅拌1.5～2.5小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。本发明利用氢氧化铝凝胶对蛋白质的吸附主要为静电吸附，在磷酸根和高浓度的NaCl（PB缓冲液中均含有）存在时可以减少或防止氢氧化铝对蛋白的吸附，缓冲液下可以去除99%的细菌内毒素。

Description

一种蛋白溶液细菌内毒素去除方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白溶液细菌内毒素去除方法。
背景技术
细菌内毒素(Endotoxin)是革兰氏阴性菌细胞壁上的特有结构，内毒素为外源性致热原，细菌内毒素的主要化学成分为脂多糖(LPS)，其毒性成分主要为类脂质A，内毒素耐热而稳定，180℃2小时才能破坏其活性。各种细菌的内毒素的毒性作用较弱，大致相同，可引起发热、内毒素休克及播散性血管内凝血等。通常LPS以完整的形式存在于细菌细胞外膜上，当其从菌体上游离下来，其活性是细胞壁上内毒素的50～100倍，具有广泛的生物活性，能引起严重的炎症级联反应。
在疫苗生产过程中，特别是采用革兰氏阴性细菌进行发酵的疫苗制品，在发酵后期菌体衰亡，有大量细菌内毒素释放。即使经过纯化工艺处理，细菌内毒素有所降低，但细菌内毒素含量仍然非常高，这也是造成疫苗发热反应的主要原因。临床使用的大多数抗生素在治疗细菌感染(主要是革兰氏阴性细菌感染)时由于杀菌/抑菌的原因而导致大量细菌内毒素释放，使得病情恶化。
目前对溶液中细菌内毒素的去除方法包括：(1)超滤技术通过目标物质和细菌内毒素分子大小的差异进行分离，一般要求目标物和细菌内毒素的分子大小的差异有3倍左右才有效果，适用于小分子物质；(2)酸碱化学处理适用于物品处理，通常不适合蛋白溶液；(3)层析(即离子交换、疏水)设备昂贵、材料耗损大，操作复杂，并且需要定做专门的层析介质；(4)正电荷过滤器过滤通常用于小分子物质和水处理，不适合蛋白类物质。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种蛋白溶液细菌内毒素去除方法，该方法为氢氧化铝凝胶表面铝与内毒素中磷酸基团共价结合，在磷酸根和高浓度NaCl(PB缓冲液中均含有)存在时，可减少或防止氢氧化铝对蛋白的吸附，缓冲液下可以去除99％的细菌内毒素，目标蛋白收率达到99％以上，提高了药品或疫苗的安全性。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种蛋白溶液细菌内毒素去除方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1.氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5％氯化铝溶液，pH为7.0～7.5，在2℃～8℃条件下反应1～2小时，用4000rpm离心收集凝胶；
S2.去除中蛋白溶液细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶加入到蛋白溶液中，在4℃，100rpm搅拌1.5～2.5小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。
进一步地，步骤S1中所述的氢氧化铝凝胶浓度为0.1～0.5％，优选0.2％～0.4％；步骤S2中所述蛋白溶液含百日咳毒素PT或百日咳丝状血凝素FHA，且PT、FHA溶液均含有10～100mmol/L PB，0.1～1.0mol/L NaCl；步骤2中蛋白溶液的PH为7.0～9.0。
本发明具有以下优点：本发明中氢氧化铝凝胶作为反应物，采用氢氧化钠加入氯化铝溶液制备，氢氧化铝凝胶表面铝与内毒素中磷酸基团共价结合，在磷酸根和高浓度NaCl(PB缓冲液中均含有)存在时，减少或防止氢氧化铝对蛋白的吸附，提高了药品或疫苗的安全性；本发明提供的利用氢氧化铝凝胶去除细菌内毒素的方法操作简单实用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1：PT溶液中细菌内毒素去除方法，它包括以下步骤：
S1.氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5％氯化铝溶液，在PH为7.0，温度为2℃的条件下反应2小时，用4000rpm离心收集凝胶；
S2.去除PT溶液中细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶的0.3％加入到PH为7.0的PT溶液中，在温度为4℃的条件下，100rpm搅拌2.5小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。
实施例2：PT溶液中细菌内毒素去除方法，它包括以下步骤：
S1.氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5％氯化铝溶液，在PH为7.3，温度为5℃的条件下反应1.5小时，用4000rpm离心收集凝胶；
S2.去除PT溶液中细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶的0.3％加入到PH为8.0的PT溶液中，在温度为4℃的条件下，100rpm搅拌2小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。
实施例3：PT溶液中细菌内毒素去除方法，它包括以下步骤：
S1.氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5％氯化铝溶液，在PH为7.5，温度为8℃的条件下反应1小时，用4000rpm离心收集凝胶；
S2.去除PT溶液中细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶的0.3％加入到PH为9.0的PT溶液中，在温度为4℃的条件下，100rpm搅拌1.5小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。
实施例4：FHA溶液中细菌内毒素去除方法，它包括以下步骤：
S1.氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5％氯化铝溶液，在PH为7.0，温度为2℃的条件下反应2小时，用4000rpm离心收集凝胶；
S2.去除FHA溶液中细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶的0.3％加入到PH为7的FHA溶液中，在温度为4℃的条件下，100rpm搅拌2.5小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。
实施例5：FHA溶液中细菌内毒素去除方法，它包括以下步骤：
S1.氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5％氯化铝溶液，在PH为7.3，温度为5℃的条件下反应1.5小时，用4000rpm离心收集凝胶；
S2.去除FHA溶液中细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶的0.3％加入到PH为8.0的FHA溶液中，在温度为4℃的条件下，100rpm搅拌2小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。
实施例6：FHA溶液中细菌内毒素去除方法，它包括以下步骤：
S1.氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5％氯化铝溶液，在PH为7.5，温度为8℃的条件下反应1小时，用4000rpm离心收集凝胶；
S2.去除FHA溶液中细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶的0.3％加入到PH为9.0的FHA溶液中，在温度为4℃的条件下，100rpm搅拌1.5小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。
实施例7：PT溶液中细菌内毒素去除方法，它包括以下步骤：
S1.氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5％氯化铝溶液，在PH为7.0，温度为6℃的条件下反应2小时，用4000rpm离心收集凝胶；
S2.去除PT溶液中细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶的0.1％加入到PH为9.0的PT溶液中，在温度为4℃的条件下，100rpm搅拌2.5小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。
实施例8：PT溶液中细菌内毒素去除方法，它包括以下步骤：
S1.氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5％氯化铝溶液，在PH为7.0，温度为6℃的条件下反应2小时，用4000rpm离心收集凝胶；
S2.去除PT溶液中细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶的0.3％加入到PH为8.0的PT溶液中，在温度为4℃的条件下，100rpm搅拌2小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。
实施例9：PT溶液中细菌内毒素去除方法，它包括以下步骤：
S1.氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5％氯化铝溶液，在PH为7.0，温度为6℃的条件下反应2小时，用4000rpm离心收集凝胶；
S2.去除PT溶液中细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶的0.5％加入到PH为7.0的PT溶液中，在温度为4℃的条件下，100rpm搅拌1.5小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。
实施例10：FHA溶液中细菌内毒素去除方法，它包括以下步骤：
S1.氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5％氯化铝溶液，在PH为7.0，温度为6℃的条件下反应2小时，用4000rpm离心收集凝胶；
S2.去除FHA溶液中细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶的0.1％加入到PH为9.0的FHA溶液中，在温度为4℃的条件下，100rpm搅拌2.5小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。
实施例11：FHA溶液中细菌内毒素去除方法，它包括以下步骤：
S1.氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5％氯化铝溶液，在PH为7.0，温度为6℃的条件下反应2小时，用4000rpm离心收集凝胶；
S2.去除FHA溶液中细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶的0.3％加入到PH为8.0的FHA溶液中，在温度为4℃的条件下，100rpm搅拌2小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。
实施例12：FHA溶液中细菌内毒素去除方法，它包括以下步骤：
S1.氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5％氯化铝溶液，在PH为7.0，温度为6℃的条件下反应2小时，用4000rpm离心收集凝胶；
S2.去除FHA溶液中细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶的0.5％加入到PH为7.0的FHA溶液中，在温度为4℃的条件下，100rpm搅拌1.5小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。
以下通过实验说明本发明的有益效果：
PH变化时，PT溶液中细菌内毒素去除结果：如表1所示。
表1：PT溶液中细菌内毒素去除结果
pH 内毒素含量(EU/ml) 内毒素去除率 PT(mg/ml)
样品处理前 357000 203
5.0 9000 97.48％ 160
6.0 4800 98.66％ 172
7.0 300 99.92％ 189
8.0 200 99.94％ 192
9.0 500 99.86％ 192
10.0 190000 46.78％ 195
PH变化时，FHA溶液中细菌内毒素去除结果：如表2所示。
表2：FHA溶液中细菌内毒素去除结果
pH 内毒素含量(EU/ml) 内毒素去除率 FHA(mg/ml)
样品处理前 389000 323
5.0 7900 97.97％ 151
6.0 4500 98.74％ 183
7.0 200 99.94％ 305
8.0 100 99.97％ 311
9.0 900 99.75％ 324
10.0 17000 95.24％ 323
氢氧化铝凝胶加量改变时，PT溶液中细菌内毒素去除结果：如表3所示。
表3：PT溶液中细菌内毒素去除结果
氢氧化铝加量(％) 内毒素含量(EU/ml) 内毒素去除率 PT(mg/ml) PT收率(％)
0 357000 203
0.2 6300 98.24％ 200 98.52％
0.4 500 99.86％ 198 97.54％
0.6 320 99.91％ 193 95.07％
0.8 200 99.94％ 170 83.74％
1.0 80 99.98％ 102 50.25％
1.2 50 99.99％ 76 37.44％
氢氧化铝凝胶加量改变时，FHA溶液中细菌内毒素去除结果：如表4所示。
表4：FHA溶液中细菌内毒素去除结果
氢氧化铝加量(％) 内毒素含量(EU/ml) 内毒素去除率 FHA(mg/ml) FHA收率(％)
0 389000 323
0.2 5700 98.53％ 320 99.07％
0.4 630 99.82％ 315 97.52％
0.6 310 99.91％ 290 89.78％
0.8 180 99.95％ 160 49.54％
1.0 120 99.97％ 100 30.96％
1.2 50 99.99％ 50 15.48％
由表1、表2可知：在50mmol/L PB、0.5mol/L NaCl的条件下，氢氧化铝凝胶在pH为7～9范围内对细菌内毒素的吸附较好；由表3、表4可知：增加氢氧化铝浓度会显著增加对细菌内毒素和蛋白的吸附，氢氧化铝浓度的较好平衡点为0.2％～0.4％。
进一步地，用氢氧化铝凝胶去除PT或FHA溶液中细菌内毒素的方法适用于其他类似的蛋白溶液去除细菌内毒素。所述方法的条件为：PB：10～100mmol/L，NaCl：0.1～1.0mol/L，pH：7.0～9.0，氢氧化铝凝胶浓度：0.1％～0.5％。

Claims (6)

1.一种蛋白溶液细菌内毒素去除方法，其特征在于，它包括以下步骤：
S1. 氢氧化铝凝胶制备：将2mol/L氢氧化钠加入到4.5%氯化铝溶液，pH为7.0～7.5，在2℃～8℃条件下反应1～2小时，用4000rpm离心收集得到氢氧化铝凝胶；
S2. 去除蛋白溶液中细菌内毒素：将步骤S1制得的氢氧化铝凝胶加入到蛋白溶液中，在4℃下，100rpm搅拌1.5～2.5小时，用4000rpm离心收集得去除内毒素后的上清液。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白溶液细菌内毒素去除方法，其特征在于，所述氢氧化铝凝胶浓度为0.1%～0.5%，较好平衡点为0.2%～0.4%。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白溶液细菌内毒素去除方法，其特征在于，所述蛋白溶液含百日咳毒素PT或百日咳丝状血凝素FHA。
4.根据权利要求3所述的一种蛋白溶液细菌内毒素去除方法，其特征在于，所述PT溶液含10～100mmol/L PB，0.1～1.0mol/L NaCl。
5.根据权利要求3所述的一种蛋白溶液细菌内毒素去除方法，其特征在于，所述FHA溶液含10～100mmol/L PB，0.1～1.0mol/L NaCl。
6.根据权利要求3所述的一种蛋白溶液细菌内毒素去除方法，其特征在于，所述蛋白溶液的PH为7.0～9.0。
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