CN115558613B - 一种提高诱导眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30表达效率的培养基及其配制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高诱导眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30表达效率的培养基、配制方法，所述培养基的每1000mL体系中，培养基组成包括：葡萄糖20g，二水硫酸钙0.186g，硫酸钾3.6g，七水硫酸镁2.98g，氢氧化钾0.826g，85%磷酸5.34ml，PTM1 4ml，氨基酸10g，余量为去离子水，上述氨基酸为组氨酸、亮氨酸、缬氨酸或苏氨酸。使用本发明的培养基，利用毕氏酵母菌表达重组蛋白时，能够明显提高毕赤酵母的生长速度，生长18h后即可进入诱导阶段，显著提高眼镜王蛇抗菌肽OH‑CATH30诱导表达效率，且诱导表达后得到的重组蛋白的活性和稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种提高诱导眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30表达效率的培养基及其配制方法。
背景技术
cathelicidins是一种在先天免疫系统中发挥重要作用的阳离子宿主防御肽，眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30为cathelicidins的截短肽，由30个氨基酸序列组成，目前研究发现其对大肠杆菌（Escherichia coli）、铜绿假单胞菌（Pseudomona aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌效果。
目前眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30基因工程表达制备方法中，表达常用的培养基是BSM培养基，以BSM为基础培养基高密度培养毕赤酵母时，存在酵母生长速度较慢、蛋白表达量低等缺点。在眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30制备过程中，发现蛋白表达水平较低，且生物活性也降低了。基于上述表达过程中存在的问题，亟需通过调整优化培养基成分、培养条件等技术来加快毕赤酵母生长速度，提高诱导眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30表达效率、增加表达量及提高产物稳定性。
发明内容：针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种提高诱导眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30表达效率的培养基及其配制方法。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种提高诱导眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30表达效率的培养基及其配制方法。
本发明的目的是通过以下方案实现的：
本发明第一方面提供一种提高诱导眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30表达效率的培养基配方，所述培养基的每1000mL体系中，培养基组成包括：葡萄糖20g，二水硫酸钙0.186g，硫酸钾3.6g，七水硫酸镁2.98g，氢氧化钾0.826g，85%磷酸5.34ml，PTM1 4ml，氨基酸10g，余量为去离子水。可用于提高眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30诱导表达效率。
优选的，所述氨基酸为组氨酸、亮氨酸、缬氨酸或苏氨酸。
本发明的第二方面提供一种上述所述的提高诱导眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30表达效率的培养基的配制方法，包括如下步骤：
S1：按常规方法配制将除上述氨基酸和PTM1的培养基配方，所述除氨基酸和PTM1的培养基配方材料灭菌后待用。
S2：含氨基酸培养基的配制，将氨基酸按10g/L的添加量称量好，添加至上述S1中待用的BSM培养基中，振荡、加热使其溶解。
S3：调pH和抽滤，在无菌室中，加入氨水将pH调至5.0后，在超净工作台抽滤后添加4ml的PTM1，用灭菌去离子水定容至1000mL得到用于提高诱导眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30表达效率的培养基。
本发明的第三方面提供一种上述所述的提高诱导眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30表达效率的培养基的应用，将上述所述培养基用于表达眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30，将含有表达质粒的毕赤酵母菌接种至第一方面所述的培养基中，29℃培养18小时就可进入诱导阶段，诱导阶段29℃培养24h-48h，然后将菌液离心取上清液，过0.22μm滤膜后得到表达量提高的表达液。
本发明优点：
1.使用本发明培养基，能够明显提高毕赤酵母的生长速度，较快的进入诱导阶段，显著提高眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30诱导表达效率。
2.在BSM培养基中添加组氨酸、亮氨酸、缬氨酸或苏氨酸，组氨酸、亮氨酸、缬氨酸或苏氨酸均是眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的组成部分，上述4种氨基酸都可以直接被酵母吸收利用，提高表达量且有明显的抑菌效果。
3.使用本发明优化培养基诱导表达后，能够提高眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的活性及稳定性。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明提供一种提高诱导眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30表达效率的培养基，为眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30大规模发酵提供基础。
实施例1：培养基组分的优化
①.添加不同氨基酸的培养基对毕赤酵母菌生长速度影响的实验
对葡萄糖，二水硫酸钙，硫酸钾，七水硫酸镁，氢氧化钾，85%磷酸，PTM1，氨基酸进行优化试验，实验步骤参考实施例2。具体5种氨基酸添加方式对毕赤酵母菌生长速度影响实验数据如表1所示：
表1：添加5种氨基酸对毕赤酵母菌生长速度影响实验数据
由上述试验结果可以得知，生长阶段分别添加缬氨酸、组氨酸、苏氨酸或亮氨酸都能够提高重组毕赤酵母菌的生长速度，添加量都为10g/L，pH＝5，接种10％，29℃培养18h即可。
实施例2：配制培养基
（1）.试剂与材料
葡萄糖购于临沂市兰山区丰源食品添加剂经营部；
赖氨酸、苯丙氨酸购于广州康荻尔生物科技有限公司；
二水硫酸钙、硫酸钾、胰蛋白胨、酵母浸膏、氢氧化钠、氨水、二水钼酸钠、浓硫酸、五水硫酸铜、硼酸购于国药集团；
七水硫酸镁、氢氧化钾、85%磷酸、七水硫酸铁购于天津市福晨化学试剂厂；
碘化钾购于西胧科学股份有限公司；六水氯化钴购于无锡市亚泰联合化工有限公司；生物素购于生工生物工程（上海）股份有限公司；氯化锌购于无锡市亚泰联合化工有限公司；一水硫酸锰购于江苏强盛功能化学股份有限公司；
（2）.配制培养基
①.配制YPD基础培养基：
a：称取6g胰蛋白胨、3g酵母浸膏，加入270ml纯水溶解，用1M氢氧化钠溶液调整pH至7，121℃高压灭菌 20min；
b：称取20g葡萄糖，加入60ml纯水溶解后定容至100ml，108℃高压灭菌 30min，得到20%（W/V）质量浓度葡萄糖溶液；
c：在步骤1中所配制的溶液，缓慢加入30ml的20%（W/V）质量浓度葡萄糖溶液，得到基础培养基YPD。
②.配制BSM培养基：
a：称取20g葡萄糖、0.186g二水硫酸钙、3.6g硫酸钾、2.98g七水硫酸镁、0.826g氢氧化钾，加入800 mL去离子水溶解，加入5.34 mL 85%磷酸，定容至1000 mL，121℃高压灭菌20min；
b：称取3g上述氨基酸，加入300 mL步骤（1）所配制的溶液中，65℃加热使其溶解，用氨水调整pH 到5.0，过0.22μm滤膜，待用；
c：配制PTM1溶液，称取6g五水硫酸铜、0.08g碘化钾、3g一水硫酸锰、0.2g二水钼酸钠、0.02g硼酸、0.5g六水氯化钴、20g氯化锌、65g七水硫酸铁、0.2g生物素、5mL浓硫酸，加入800 mL纯水溶解，定容至1000 mL，得到微量盐溶液PTM1；
d：取1.2 mL PTM1 加入到步骤b所配制待用的溶液中，得到BSM培养基。
实施例3：眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的表达实验
（1）眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的生长期扩增
a：挑取含有表达质粒的毕赤酵母菌单菌落，接种于20 mLYPD培养基中，29℃，220rpm培养16h，制得一级种子液；
b：按1%的比例将一级种子液接种于100 mL YPD培养基中，29℃，220rpm扩大培养16h，制得二级种子液；
c：按10%的比例将二级种子液接种于300mL实施例2中配制的BSM培养基中，29℃，220rpm培养66h。
（2）眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30的诱导期表达
a：将上述5种添加不同氨基酸的培养基分别添加甲醇、山梨醇，对重组酵母开始诱导表达。
（3）进行抑菌实验
a：收集24h、48h表达液，过0.22μm滤膜去除大分子后做金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、铜绿假单胞菌（Pseudomona aeruginosa）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）4种病原菌的平板抑菌实验，37℃培养约16h后取出观察抑菌圈的大小。结果如表2和表3。
表2:24h表达液的抑菌圈大小
表3:48h表达液的抑菌圈大小
注：“/”表示表达量过低不足以达到抑菌效果。
结果显示：分别添加的组氨酸、亮氨酸、缬氨酸或苏氨酸，在生长阶段能够提高重组毕赤酵母的生长速度，培养18小时就可进入诱导阶段，提高重组酵母诱导表达效率，但异亮氨酸的效果不明显。重组酵母表达24、48h后取其表达液进行抑菌实验，均对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有明显抑制作用，添加组氨酸、亮氨酸、缬氨酸或苏氨酸均对铜绿假单胞菌（Pseudomona aeruginosa）有明显抑制作用，添加组氨酸对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）有明显抑制作用，添加异亮氨酸、缬氨酸或苏氨酸均对蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）有抑制作用。
Claims (2)
1.一种提高诱导眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30表达效率的培养基，其特征在于所述培养基的每1000mL体系中，培养基组成包括：葡萄糖20g，二水硫酸钙0.186g，硫酸钾3.6g，七水硫酸镁2.98g，氢氧化钾0.826g，85%磷酸5.34ml，PTM1 4mL，氨基酸 10g，余量为去离子水；
所述氨基酸为组氨酸、亮氨酸、缬氨酸或苏氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种提高诱导眼镜王蛇抗菌肽OH-CATH30表达效率的培养基的配制方法，其特征在于，所述配制方法步骤如下：
S1：按常规方法配制除上述氨基酸和PTM1的培养基配方，所述除氨基酸和PTM1的培养基配方材料灭菌后待用；
S2：含氨基酸培养基的配制，将氨基酸按10g/L的添加量称量好，添加至上述S1中的配方材料中，振荡、加热使其溶解；
S3：调pH和抽滤，在无菌室中，加入氨水将pH调至5.0后，在超净工作台抽滤后添加4mL的PTM1，用灭菌去离子水定容至1000mL得到所述培养基。
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