JP5908496B2 - トランスジェニックイネの子実からヒト血清アルブミンを抽出する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、生物工学分野に属するものであり、具体的にはトランスジェニックイネの子実から組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を抽出する方法に関する。
ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＨＳＡ）は、５８５個のアミノ酸からなる一本鎖構造の非グリコシル化蛋白質であり、分子量が６６．５ｋＤであり、等電点が４．７〜４．９の範囲にある。ヒト血漿中に最も多く含まれる蛋白質として、ヒト血清アルブミンは、血漿総蛋白質の６０％程度を占め、ヒト血液１リットル当たりに約４０ｇのＨＳＡが含まれている。ＨＳＡは血漿中のみならず、組織、体の分泌液、皮膚とリンパ腔にも存在する。正常な生理条件において、ＨＳＡは、血漿中でコロイド浸透圧の維持、栄養物質と傷口癒着の促進に寄与するとともに、キャリアー物質として、血液中で、例えば、ホルモンと言った多くの疎水性生体分子、生理活性物質及び薬物と結合してその輸送に関与することが知られている。従って、ＨＳＡは、一つの重要な医療用蛋白質であり、臨床において主に失血、火傷、熱傷、形成外科手術及び脳損傷による低蛋白質血症、並びに肝硬変、腎性浮腫などの治療に用いられている。
現在、臨床に使われているＨＳＡは、主にヒト由来の血漿から抽出、単離して製造されている。しかし、このような製造法には以下の欠点がある。一方では、血漿供給源に限界がある。即ち、限られた血液供給源によってはＨＳＡとその関連製剤の製造需要を満たすことができない。他方、血液自体が危険要因になる可能性がある。例えば肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などの危険な感染性病原体が混入する恐れもあるので、血漿から抽出するＨＳＡの使用に大きな不安を抱える場合がある。そこで、ヒト血清アルブミンを製造する他の代替法の開発が強く求められている。
新しいＤＮＡ組換えと合成技術の進展に伴い、研究者らは組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の製造と応用に強い関心を示している。今まで既に様々な発現系によってｒＨＳＡを大量に製造する試みが行われてきた。例えば、大腸菌（Ｌａｔｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：１３０９−１３１４，（１９８７））、枯草菌（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃ．Ｗ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２９１７−２９２５，（１９８７））などの原核生物、酵母（ＷＯ００／４４７７２、ＥＰ０６８３２３３Ａ２、ＵＳ５６１２１９６）などの真核生物や培養動物細胞などを利用してｒＨＳＡを製造する技術が確立されているが、これらの方法は、その発現レベルが低く、または製造コストが高いことから産業規模の製造に適したものではない。
本発明者による中国特許出願２００５１００１９０８４号に、生物反応器としてイネ胚乳細胞を利用してｒＨＳＡを製造する方法が開示されており、当該方法に、イネ胚乳に特異的に発現するプロモーターとシグナルペプチドを利用してｒＨＳＡをイネ胚乳細胞の細胞内膜系に導入し、更にイネ胚乳の蛋白質小体に貯蔵することによってｒＨＳＡをイネに大量に蓄積させ、最終的には高い発現レベルに到達させる工程が含まれている。この方法によって得られるｒＨＳＡの発現レベルは、少なくともイネの種籾の重量の０．３％以上である。当該方法は、発現量が高く、コストが低いなどといった有利な点を示し、蛋白質医薬品の製造のための新しい手段の開発を可能にしている。
現在、トランスジェニックイネからｒＨＳＡを抽出する際に利用できる成熟した製造プロセスがまだ確立できていない。よって、トランスジェニックイネの子実から蛋白質を抽出する方法とプロセスを確立する上で、標的蛋白質の抽出効率を高め、非標的蛋白質の抽出率を低減させることは、研究と技術開発にとって最も重要な要素となっている。本発明は、トランスジェニックイネの子実からｒＨＳＡを大規模かつ高効率で抽出するための技術と方法を確立した。
本発明は、トランスジェニックイネから組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を抽出する方法を提供することを目的とする。
上記目的を実現するために、本発明は、以下の技術的解決方法を提供する。即ち、
トランスジェニックイネの子実から組換えヒト血清アルブミンを抽出する方法であって、
（１）組換えヒト血清アルブミンを含むトランスジェニックイネを脱殻し、かかる脱殻済みのイネの子実を砕き、かかるトランスジェニックイネの子実の粉体を抽出用緩衝液と混合し、攪拌しながら抽出して混合物Ｉを得るステップと、
（２）ステップ（１）で得られる混合物ＩのｐＨを４．０〜４．５に調整し、室温において１〜１２時間沈降させて混合物ＩＩ得るステップと、
（３）ステップ（２）で得られる混合物ＩＩを濾過し、濾過液を集めて高濃度のヒト血清アルブミンを含む溶液を得るステップとを含む方法である。
トランスジェニックイネの子実から組換えヒト血清アルブミンを抽出する方法であって、
（１）組換えヒト血清アルブミンを含むトランスジェニックイネを脱殻し、かかる脱殻済みのイネの子実を砕き、かかるトランスジェニックイネの子実の粉体を抽出用緩衝液と混合し、攪拌しながら抽出して混合物Ｉを得るステップと、
（２）ステップ（１）で得られる混合物ＩのｐＨを４．０〜４．５に調整し、室温において１〜１２時間沈降させて混合物ＩＩ得るステップと、
（３）ステップ（２）で得られる混合物ＩＩを濾過し、濾過液を集めて高濃度のヒト血清アルブミンを含む溶液を得るステップとを含む方法である。
具体的には、ステップ（１）において、組換えヒト血清アルブミンがイネ胚乳細胞の澱粉粒の間に存在していることから、非標的蛋白質の抽出率を低減するため、ｒＨＳＡ含有トランスジェニックイネを脱殻し、脱殻済みのイネの子実を粒度が８０〜１２０メッシュの粉体となるように砕いて組換えヒト血清アルブミンの抽出効率を高める。
前記抽出用緩衝液は１０〜３０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）に、酢酸ナトリウム１０〜２０ｍＭと、硫酸アンモニウム１０〜５０ｍＭと、オクタン酸ナトリウム５〜４０ｍＭとを含むものであり、且つ前記抽出用緩衝液のｐＨが６．５〜８である。
前記抽出用緩衝液において、前記硫酸アンモニウムの濃度が１０〜３０ｍＭであることが好ましく、１５〜３０ｍＭであることがより好ましく、２０〜３０ｍＭであることが特に好ましい。
前記抽出用緩衝液において、前記オクタン酸ナトリウムの濃度が５〜３０ｍＭであることが好ましく、５〜２０ｍＭであることがより好ましく、１０〜２０ｍＭであることが特に好ましい。
前記抽出用緩衝液のｐＨは７．０〜７．５であることが好ましい。
前記抽出用緩衝液のｐＨは７．０〜７．５であることが好ましい。
例えば、一つの実施形態において、前記抽出用緩衝液は、１０〜３０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）に、酢酸ナトリウム１０〜２０ｍＭと、硫酸アンモニウム１５〜３０ｍＭと、オクタン酸ナトリウム５〜２０ｍＭとを含むものであり、且つ前記抽出用緩衝液のｐＨが６．５〜８である。
一つの好ましい実施形態において、前記抽出用緩衝液は、２５ｍＭのリン酸塩緩衝液に、酢酸ナトリウム２０ｍＭと、硫酸アンモニウム２０ｍＭと、オクタン酸ナトリウム２０ｍＭとを含むものであり、且つｐＨが７．５である。
組換えヒト血清アルブミンの抽出率を最大限度で高め、且つ、抽出体積と抽出効率との関係を調和させるために、イネの粉体を抽出用緩衝液に重量体積比（ｋｇ／Ｌ、粉体の重量／抽出用緩衝液の体積）が１：５から１：１０までの比率になるよう混合した後、毎分６０回転（ｒｐｍ）の回転速度で撹拌しながら１〜３時間抽出する。実験より示されるように、１：５〜１：１０の範囲の比率において、組換えヒト血清アルブミンの抽出効率に明らかな影響がないと見られる。コストと抽出体積を減らすために、トランスジェニックイネの粉体を抽出用緩衝液に１：５の重量体積比（ｋｇ／Ｌ）で混合することが好ましく、抽出時間を１〜１．５時間にすることが好ましい。
砕いたイネの子実から組換えヒト血清アルブミンを最大効率で抽出するために、ヒト血清アルブミンが６０℃において安定である特性に基づけば、ヒト血清アルブミンを変性させない抽出温度の上昇により総蛋白質と組換えヒト血清アルブミンの抽出率を著しく高めることができる。従って、本発明において加熱処理を行い、組換えヒト血清アルブミンの抽出率を効果的に高めた。前記抽出温度は、４５〜６０℃であり，好ましくは５５〜６０℃である。
加熱し、ｐＨを高くする条件において抽出される組換えヒト血清アルブミンと非標的蛋白質とがともに増えるため、ヒト血清アルブミンの等電点でイネ胚乳の貯蔵蛋白質を沈降させることにより、上記プロセスにおける余分な非標的蛋白質を除去することができる。本発明において、ステップ（２）の沈降プロセスは、低ｐＨにて行う。抽出が終了した後、抽出混合物をｐＨ４．０〜４．５に調整し、その後、混合物を室温にて少なくとも１時間沈降させることで、加熱下の高ｐＨ値での抽出工程により過剰に生じる非標的蛋白質の悪影響を排除することができる。一つの実施形態において、酢酸を用いてｐＨを４．０〜４．５に、好ましくは４．５に調整する。また、沈降時間が１〜１２時間であり、好ましくは３〜１２時間であり、より好ましくは６時間である。
イネの粉体の澱粉粒と液体部分との間の物理的性質が異なることから、通常の技術と設備を用いて蛋白質の抽出液から精製の対象外の物質を分離することができる。ステップ（２）の沈降プロセスで得られる抽出混合物は、加圧濾過またはその他の相当する設備を用いて固体と液体に分離させることで、澱粉廃棄物を標的蛋白質から効率的かつ大規模に分離する目的を達成することができる。つまり、本発明は、簡便、迅速且つ低コストの方法を提供するため、当該方法を利用して最終的に高濃度の組換えヒト血清アルブミンを含む溶液を得ることができる。
一つの実施形態において、前記濾過は、ろ布式のプレートフレーム加圧フィルターにて加圧濾過し、更に中空糸膜にて精密濾過するステップが含まれる。前記中空糸膜は、ポリエーテルスルホン中空糸膜により構成され、孔径が０．２０μｍ〜０．４５μｍ、特に好ましくは０．２２μｍである。
本発明の方法により製造される組換えヒト血清アルブミンを含む溶液において、組換えヒト血清アルブミンの濃度は０．６５〜０．６６ｍｇ／ｍｌに達している。また総蛋白質の初期濃度は６．９０〜７．０５ｍｇ／ｍｌであり、沈降ステップを経た後には約２．８ ｍｇ／ｍｌに下がり、非標的蛋白質の含有量は著しく低下する。
本発明の技術的解決方法は、以下の利点がある。
１）異なるｐＨ値と異なる塩濃度を組み合わせることにより、組換えヒト血清アルブミンの抽出率を高めることができる。データより示されるように、本発明の方法によって得られる抽出液において、組換えヒト血清アルブミンの濃度は０．６５〜０．６６ｍｇ／ｍｌに達しているが、従来の技術によって得られる組換えヒト血清アルブミンの濃度は０．３０〜０．３１５ｍｇ／ｍｌにしかならない。従って、本発明の改善された方法を用いると、同じ重量のイネの粉体からの組換えヒト血清アルブミンの抽出量を１．１５倍高めることができる。
２）非標的蛋白質の抽出率を低減することができる。本発明によれば、初期抽出液における総蛋白質の濃度が６．９０〜７．０５ｍｇ／ｍｌであり、沈降ステップ経た後に総蛋白質の含有量が２．８ｍｇ／ｍｌとなるので、２．４６分の１に低下する。
３）精密濾過ステップにかかる進歩により除菌または滅菌効果が向上することで、後の精製ステップに持ち込まれ易い微生物汚染を排除し、製造プロセスにて生じる細菌エンドトキシンの量が低減される。
以下、本発明の特徴と利点をより容易に理解できるように実施例を挙げて説明を行う。これらの実施例は本発明を説明するものであり、本発明の範囲はこれらの実施例によって何ら制限されるものではない。
本発明の進歩的な方法によるｒＨＳＡの抽出
本発明の発明者による中国特許出願２００５１００１９０８４号に開示された方法に従い、トランスジェニックイネを作製された。かかるイネを脱殻して半精米を得、その後、粒度が８０〜１００メッシュの粉体となるように砕いた。砕いたイネを抽出用緩衝液に１：５（重量／体積、ｋｇ／Ｌ）の割合で混合し、６０℃にて１．５時間抽出した。抽出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液２５ｍＭに、酢酸ナトリウム２０ｍＭと、硫酸アンモニウム１０ｍＭと、オクタン酸ナトリウム１０ｍＭとを含むものであり、ｐＨが７．５であった。上記で得られる混合物を酢酸でｐＨ４．５に調整し、更に少なくとも３時間置いて非標的蛋白質を沈降させた。その後、得られる混合物を、順に（ろ布式の）プレートフレーム加圧フィルターで加圧濾過した後、孔径が０．２２μｍの中空糸カラムで精密濾過し、ｒＨＳＡを含む上清液を得た。ｒＨＳＡの濃度は、約０．６６ ｍｇ／ｍＬであった。
本発明の発明者による中国特許出願２００５１００１９０８４号に開示された方法に従い、トランスジェニックイネを作製された。かかるイネを脱殻して半精米を得、その後、粒度が８０〜１００メッシュの粉体となるように砕いた。砕いたイネを抽出用緩衝液に１：５（重量／体積、ｋｇ／Ｌ）の割合で混合し、６０℃にて１．５時間抽出した。抽出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液２５ｍＭに、酢酸ナトリウム２０ｍＭと、硫酸アンモニウム１０ｍＭと、オクタン酸ナトリウム１０ｍＭとを含むものであり、ｐＨが７．５であった。上記で得られる混合物を酢酸でｐＨ４．５に調整し、更に少なくとも３時間置いて非標的蛋白質を沈降させた。その後、得られる混合物を、順に（ろ布式の）プレートフレーム加圧フィルターで加圧濾過した後、孔径が０．２２μｍの中空糸カラムで精密濾過し、ｒＨＳＡを含む上清液を得た。ｒＨＳＡの濃度は、約０．６６ ｍｇ／ｍＬであった。
当分野の従来の方法によるｒＨＳＡの抽出
本発明の発明者による中国特許出願２００５１００１９０８４号に開示された方法に従い、トランスジェニックイネを作製できる。かかるイネを脱殻して玄米を得、その後、粒度が８０〜１００メッシュの粉体となるように砕いた。砕いたイネを抽出用緩衝液に１：５（重量／体積、ｋｇ／Ｌ）の割合で混合し、常温にて少なくとも１時間抽出した。抽出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液２５ｍＭに、酢酸ナトリウム２０ｍＭを含むものであり、ｐＨが６．５である。上記で得られる混合物を酢酸でｐＨ４．５に調整し、更に１時間置いて沈降させた。その後、得られた混合物を、順に（ろ布式の）プレートフレーム加圧フィルターで加圧濾過した後、孔径が０．４５μｍの中空糸カラムで精密濾過し、ｒＨＳＡを含む上清液を得た。ｒＨＳＡの濃度は、約０．３１４ ｍｇ／ｍＬであった。本発明の進歩的な方法による結果と比べると、総蛋白質の含有量が４５．５％にとどまり、ｒＨＳＡの含有量が４７．７％であった（図１〜図３）。
本発明の発明者による中国特許出願２００５１００１９０８４号に開示された方法に従い、トランスジェニックイネを作製できる。かかるイネを脱殻して玄米を得、その後、粒度が８０〜１００メッシュの粉体となるように砕いた。砕いたイネを抽出用緩衝液に１：５（重量／体積、ｋｇ／Ｌ）の割合で混合し、常温にて少なくとも１時間抽出した。抽出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液２５ｍＭに、酢酸ナトリウム２０ｍＭを含むものであり、ｐＨが６．５である。上記で得られる混合物を酢酸でｐＨ４．５に調整し、更に１時間置いて沈降させた。その後、得られた混合物を、順に（ろ布式の）プレートフレーム加圧フィルターで加圧濾過した後、孔径が０．４５μｍの中空糸カラムで精密濾過し、ｒＨＳＡを含む上清液を得た。ｒＨＳＡの濃度は、約０．３１４ ｍｇ／ｍＬであった。本発明の進歩的な方法による結果と比べると、総蛋白質の含有量が４５．５％にとどまり、ｒＨＳＡの含有量が４７．７％であった（図１〜図３）。
抽出温度と抽出時間のｒＨＳＡの抽出率への影響
本実施例において、抽出用緩衝液を一定にし、異なる温度（それぞれ４５℃、５０℃、５５℃、６０℃）と異なる抽出時間（それぞれ２０分間、４０分間、６０分間、８０分間）を直交的に組み合わせることにより異なる抽出液のサンプルを得た。ＢＣＡ法を用いて各サンプル中の総蛋白質の濃度を測定し、ＥＬＩＳＡ法を用いて各サンプル中のｒＨＳＡの濃度を測定した。結果は、それぞれ図１と図２に示した。各サンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行い、電気泳動図は、図３に示した。
本実施例において、抽出用緩衝液を一定にし、異なる温度（それぞれ４５℃、５０℃、５５℃、６０℃）と異なる抽出時間（それぞれ２０分間、４０分間、６０分間、８０分間）を直交的に組み合わせることにより異なる抽出液のサンプルを得た。ＢＣＡ法を用いて各サンプル中の総蛋白質の濃度を測定し、ＥＬＩＳＡ法を用いて各サンプル中のｒＨＳＡの濃度を測定した。結果は、それぞれ図１と図２に示した。各サンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行い、電気泳動図は、図３に示した。
図１と図２から分かるように、イネの粉体の抽出液において、総蛋白質とｒＨＳＡの濃度は、抽出時間の増加と抽出温度の上昇につれて増加する傾向を呈する。抽出時間と比べ、抽出温度が抽出効率に与える影響が大きかった。６０℃にて６０分間抽出する場合、ｒＨＳＡの抽出効率が最も高かった。図３の電気泳動図から分かるように、異なる温度と時間条件において、抽出された蛋白質のスぺクトルバンドは、ｒＨＳＡの分子量より大きい区域において明らかな区別があったが、ｒＨＳＡの分子量より小さい区域においては異なる抽出条件による差が見られなかった。
抽出用緩衝液のｐＨと硫酸アンモニウム塩濃度のｒＨＳＡの抽出率への影響
本実施例において、５５℃の定温にて６０分間抽出する一定条件を採用した。イネの粉体と抽出用緩衝液の重量体積比（ｋｇ／Ｌ）は１：５であった。異なる硫酸アンモニウム濃度（それぞれ０、１０、３０、５０ｍＭ）と抽出用緩衝液のｐＨ値（それぞれｐＨ６．５、７、７．５、８）を直交的に組み合わせた。各サンプルについて、ＢＣＡ法で総蛋白質の濃度を測定し、ＥＬＩＳＡ法でｒＨＳＡの濃度を測定した。測定結果は、図４と図５に示した。異なる硫酸アンモニウム塩濃度と抽出用緩衝液のｐＨ値との直交結合により得られた各サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果は、図６に示した。
本実施例において、５５℃の定温にて６０分間抽出する一定条件を採用した。イネの粉体と抽出用緩衝液の重量体積比（ｋｇ／Ｌ）は１：５であった。異なる硫酸アンモニウム濃度（それぞれ０、１０、３０、５０ｍＭ）と抽出用緩衝液のｐＨ値（それぞれｐＨ６．５、７、７．５、８）を直交的に組み合わせた。各サンプルについて、ＢＣＡ法で総蛋白質の濃度を測定し、ＥＬＩＳＡ法でｒＨＳＡの濃度を測定した。測定結果は、図４と図５に示した。異なる硫酸アンモニウム塩濃度と抽出用緩衝液のｐＨ値との直交結合により得られた各サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果は、図６に示した。
図４と図５の結果から分かるように、個別の状況において若干偏移が見られる以外、緩衝液のｐＨ値と塩濃度の増加につれてイネの粉体抽出液中の総蛋白質とｒＨＳＡの濃度が増加する傾向を呈した。また、抽出液の塩濃度と比べて、抽出用緩衝液のｐＨ値がｒＨＳＡの抽出率に与える影響が明らかに大きかった。抽出用緩衝液のｐＨが７．５であり、且つ塩濃度が１０ｍＭであった場合、ｒＨＳＡの抽出効率が最も高かった。異なる抽出時間と温度と比べて、異なるｐＨと塩濃度が抽出される蛋白質のスぺクトルバンドに与える影響は非常に小さかった。図６に示されるように、ｐＨが高い方であれば、ｒＨＳＡのメインバンドの上方に微小バンドがやや多くなっているが、その他の各メインバンドは変化が無かった。
沈降時間とオクタン酸ナトリウム濃度のｒＨＳＡの抽出率への影響
オクタン酸ナトリウムの濃度をそれぞれ１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、及び４０ｍＭに調整し、オクタン酸ナトリウムの濃度増加によりｒＨＳＡに対しより高い保護効果をもたらすか否かについて検討を行った。抽出が終了した後、酢酸でｐＨを４．５に調整し、得られた混合物をそれぞれ０、１、２、３時間かけて、又はオーバーナイトにて沈降させてから蛋白質濃度を測定した。異なる沈降時間とオクタン酸ナトリウム濃度が総蛋白質の抽出液に与える影響は、図７に示した。異なるオクタン酸ナトリウム濃度と沈降時間で得られるサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果は、図８に示した。図７と図８における抽出液は、抽出が終了した後で、且つｐＨ調整前の混合物サンプルを指す。
オクタン酸ナトリウムの濃度をそれぞれ１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、及び４０ｍＭに調整し、オクタン酸ナトリウムの濃度増加によりｒＨＳＡに対しより高い保護効果をもたらすか否かについて検討を行った。抽出が終了した後、酢酸でｐＨを４．５に調整し、得られた混合物をそれぞれ０、１、２、３時間かけて、又はオーバーナイトにて沈降させてから蛋白質濃度を測定した。異なる沈降時間とオクタン酸ナトリウム濃度が総蛋白質の抽出液に与える影響は、図７に示した。異なるオクタン酸ナトリウム濃度と沈降時間で得られるサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果は、図８に示した。図７と図８における抽出液は、抽出が終了した後で、且つｐＨ調整前の混合物サンプルを指す。
図７と図８に示されるように、抽出液をｐＨ４．５に調整したことによるショック（the shock of adjusting pH）でｒＨＳＡが大量に沈降した。沈降時間の増加により一部の沈降したｒＨＳＡが再び溶解した。また、オーバーナイト沈降の場合において、総蛋白質の平均濃度が沈降前の値の７８％であり、オーバーナイト沈降による分解が殆ど見られなかった。同時に、沈降過程において分解バンドと非標的蛋白質も大量に沈降した。この結果から、２０ｍＭ オクタン酸ナトリウムの保護効果が最も理想的であるが、濃度が高くなるにつれて沈降が増加した。
ｐＨと沈降時間の沈降効率への影響
ｐＨと沈降時間の沈降効率への影響を測定するため、イネの粉体と抽出用緩衝液（２５ｍＭ リン酸塩緩衝液、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ オクタン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）を１：５の重量体積比（ｋｇ／Ｌ）で混合し、更に６０℃にて攪拌しながら１時間かけて抽出を行った。得られたイネ子実の粉体抽出液を六等分し、ｐＨをそれぞれ４．５、４．４、４．３、４．２、４．１、４．０となるように調整した。ｐＨ調整済みの抽出液を、シェーカー（shaking bed）で常温にてそれぞれ１時間又は２時間振とうした後にサンプルを取って解析した。サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果は、図９に示した。図９における抽出液は、抽出が終了した後で、且つｐＨ調整前の混合物サンプルを指す。
ｐＨと沈降時間の沈降効率への影響を測定するため、イネの粉体と抽出用緩衝液（２５ｍＭ リン酸塩緩衝液、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、１０ｍＭ オクタン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）を１：５の重量体積比（ｋｇ／Ｌ）で混合し、更に６０℃にて攪拌しながら１時間かけて抽出を行った。得られたイネ子実の粉体抽出液を六等分し、ｐＨをそれぞれ４．５、４．４、４．３、４．２、４．１、４．０となるように調整した。ｐＨ調整済みの抽出液を、シェーカー（shaking bed）で常温にてそれぞれ１時間又は２時間振とうした後にサンプルを取って解析した。サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果は、図９に示した。図９における抽出液は、抽出が終了した後で、且つｐＨ調整前の混合物サンプルを指す。
図９のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果に示されるように、ｐＨが低下するにつれて非標的蛋白質の沈降効率が増大するとともに、ｒＨＳＡの損失が生じる。沈降時間を延長することで沈降効率に正の影響を与える。ｐＨが４．１未満の場合、分子量の大きいバンドは完全に沈降する。従って、工程全体に対する技術的要求と標的ｒＨＳＡの損失を最小限にすることを考慮すれば、ｐＨ４．５で沈降することが好ましい。
精密濾過ステップにおける孔径の異なるポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空糸膜の使用時の除菌効果の比較
（１）イネ中の細菌の除去に対する異なる濾過膜による精密濾過の影響
本実施例で用いる溶液サンプルは、加圧濾過した後の透明濾過液であり、パイロット生産において本発明による進歩的なプロセスを利用してトランスジェニックイネの粉体を処理することによって得られたものである。ここで、サンプルをそれぞれ孔径が０．２０μｍと０．４５μｍの小型の中空糸カラムで処理した。処理前の原液と処理後の濾過液を回収した。０．１ｍｌの原液またはその希釈液をＬＢ培地に塗布し、二つの濾過膜による除菌効果を検討した。検討結果は、表１に示した。濾過前後の溶液中の組換えヒト血清アルブミンと総蛋白質の濃度を測定し、総蛋白質における組換えヒト血清アルブミンの百分率を算出した。百分率の棒グラフは、図１０に示した。
（１）イネ中の細菌の除去に対する異なる濾過膜による精密濾過の影響
本実施例で用いる溶液サンプルは、加圧濾過した後の透明濾過液であり、パイロット生産において本発明による進歩的なプロセスを利用してトランスジェニックイネの粉体を処理することによって得られたものである。ここで、サンプルをそれぞれ孔径が０．２０μｍと０．４５μｍの小型の中空糸カラムで処理した。処理前の原液と処理後の濾過液を回収した。０．１ｍｌの原液またはその希釈液をＬＢ培地に塗布し、二つの濾過膜による除菌効果を検討した。検討結果は、表１に示した。濾過前後の溶液中の組換えヒト血清アルブミンと総蛋白質の濃度を測定し、総蛋白質における組換えヒト血清アルブミンの百分率を算出した。百分率の棒グラフは、図１０に示した。
表１の結果から分かるように、０．４５μｍの中空糸膜は、加圧濾過後の濾過液中の５０％〜９０％の生菌を除去することができ、０．２０μｍの中空糸膜は、加圧濾過後の濾過液中の生菌を１００％で全部除去することができる。よって、微生物が濾過液を介して後の精製ステップに混入することを回避できるので、製造プロセスにおける細菌エンドトキシンの量が低減する。
図１０に示されるように、０．２μｍと０．４５μｍの中空糸膜で濾過したサンプルを比較すると、０．２０μｍの膜で濾過する場合、組換えヒト血清アルブミンの損失が総蛋白質の損失と比べて遥かに小さい。０．２０μｍの膜で濾過した後の抽出液に比較的高い濃度の組換えヒト血清アルブミンが含まれていることが確認できた。
Claims (11)
- （１）組換えヒト血清アルブミンを含むトランスジェニックイネを脱殻し、かかる脱殻済みのイネの子実を砕き、かかるトランスジェニックイネの子実の粉体を抽出用緩衝液と混合し、攪拌しながら抽出して混合物Ｉを得るステップと、
（２）ステップ（１）で得られる混合物ＩのｐＨを４．０〜４．５に調整してから、室温において３〜１２時間沈降させて混合物ＩＩを得るステップと、
（３）ステップ（２）で得られる混合物ＩＩを濾過し、濾過液を集めて高濃度のヒト血清アルブミンを含む溶液を得るステップと
を含み、
前記ステップ（１）において、前記抽出用緩衝液は、１０〜３０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）に、酢酸ナトリウム１０〜２０ｍＭと、硫酸アンモニウム１０〜５０ｍＭと、オクタン酸ナトリウム５〜４０ｍＭとを含み、且つｐＨが６．５〜８であり、
前記ステップ（１）において、前記トランスジェニックイネの子実の粉体と前記抽出用緩衝液とが１：５〜１：１０の重量体積比（ｋｇ／Ｌ）で混合され、抽出時間が１〜３時間であり、抽出温度が４５〜６０℃である、
トランスジェニックイネの子実から組換えヒト血清アルブミンを抽出する方法。 - ステップ（１）において、前記トランスジェニックイネの子実の粉体の粒度が８０〜１２０メッシュである、請求項１に記載の方法。
- 前記硫酸アンモニウムの濃度が１０〜３０ｍＭであり、前記オクタン酸ナトリウムの濃度が５〜３０ｍＭである、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記硫酸アンモニウムの濃度が１５〜３０ｍＭであり、前記オクタン酸ナトリウムの濃度が５〜２０ｍＭである、請求項３に記載の方法。
- 前記抽出用緩衝液のｐＨが７．０〜７．５である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 前記抽出用緩衝液は、２５ｍＭのリン酸塩緩衝液に、酢酸ナトリウム２０ｍＭと、硫酸アンモニウム２０ｍＭと、オクタン酸ナトリウム２０ｍＭとを含むものであり、ｐＨが７．５である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- ステップ（１）において、前記トランスジェニックイネの子実の粉体と前記抽出用緩衝液が１：５の重量体積比（ｋｇ／Ｌ）で混合され、抽出時間が１〜１．５時間であり、抽出温度が５５〜６０℃である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
- ステップ（２）において、前記混合物ＩのｐＨを４．５に調整し、オーバーナイトで、または６時間沈降させる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
- ステップ（３）において、前記濾過するステップは、ろ布式のプレートフレーム加圧フィルターで加圧濾過した後、ポリエーテルスルホン中空糸膜で精密濾過するステップを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリエーテルスルホン中空糸膜の孔径が０．２０μｍ〜０．４５μｍである、請求項９に記載の方法。
- 前記ポリエーテルスルホン中空糸膜の孔径が０．２２μｍである、請求項１０に記載の方法。
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