JP4644604B2 - ２価陽イオン存在下加熱処理によるヒト血清アルブミンの製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの製造方法に関する。より詳細には、宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を、２価陽イオン存在下に加熱処理することにより当該夾雑物を選択的に凝集させた後、生じた凝集物を低速遠心又はろ過により除去する工程を含むことを特徴とするヒト血清アルブミンの製造方法に関する。
ヒト血清アルブミンは、血漿中の主要な蛋白成分で、585個のアミノ酸の単鎖ポリペプチドからなり、約66,000ダルトンの分子量を有する（例えば、非特許文献１参照）。ヒト血清アルブミンは、主に血液の正常な浸透圧の維持や血中に現れるカルシウムイオン、脂肪酸、ビリルビン、トリプトファン、薬物など様々なものと結合し、これらを運搬するキャリアーとしての役割を果たすことが知られている。純化したヒト血清アルブミンは、例えば、外科手術、出血性ショックあるいは熱傷やネフローゼ症候群などアルブミンの喪失による低アルブミン血症の治療に使用される。
従来、ヒト血清アルブミンは、ヒト血漿からコーンの低温エタノール分画法あるいは該方法に準じて、ヒト血清アルブミン画分（ヒト血清アルブミンは画分Ｖに分画される）を得た後、更に、種々の精製方法を駆使して製造されている。しかしながら、この製造方法では、十分な原料を確保することが難しく、また、病原体が混入する恐れがあり、ヒト血漿に由来しないヒト血清アルブミンの製造方法が求められている。このような問題を解決する方法として、近年では、遺伝子組換え技術を応用して酵母菌（非特許文献２，３，４参照）、大腸菌（非特許文献５，６参照）、枯草菌（非特許文献７参照）や動物細胞にヒト血清アルブミンを生産させる技術が開発されている。
ヒト血清アルブミンの精製方法として、一般に、蛋白質化学において通常使用される精製方法、例えば、塩析法、限外濾過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等を用いることができる。実際には、生体組織、細胞、血液など、多種類の蛋白質が混在するため、ヒト血清アルブミンの精製は、上記方法の複雑な組み合わせにより行われる。これらの方法は、遺伝子組換えにより得られるヒト血清アルブミンの製造方法にも適用されている（例えば、特許文献１，２，３参照）。
ヒト血清アルブミンがアセチルトリプトファン及びカプリル酸の存在下における加熱処理に対し安定であることは、周知の通りである（例えば、非特許文献８参照）。このような熱安定性の特性は、培養上清中のプロテアーゼを不活化するためにヒト血清アルブミンの製造工程に取り入れられており（例えば、特許文献４参照）、また最終製剤の滅菌方法としても利用されている（例えば、特許文献５参照）。製造工程において使用される加熱処理の方法は、大量のヒト血清アルブミン含有溶液を処理できる点で評価される。
ヒト血清アルブミンは前述の治療において大量に投与される場合が多いので、ワクチンやその他の少量を投与する薬剤に比べ、不純物による副作用が大きな問題となる。したがって、遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンに対しては、ワクチンや従来の血漿由来のヒト血清アルブミン製剤よりもはるかに高い純度が要求される。しかも、市場への安定供給を考慮すると、低コストで大量処理できる製造方法を確立する必要がある。
本発明の目的は、改良型加熱処理工程を取り入れた、より効果的なヒト血清アルブミンの製造方法を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、当該製造方法により得られる医薬品として安全性の高いヒト血清アルブミンを提供することにある。
また、本発明の他の目的は、当該製造方法により得られる医薬品として安全性の高いヒト血清アルブミンを提供することにある。
本発明者等は、上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液に、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン及び亜鉛イオンの何れかを添加し、加熱処理したところ、当該夾雑物が選択的に凝集すること、生じた凝集物は低速遠心又はろ過により容易に除去できることを見出した。また、カルシウムイオンの他に、一般に加熱処理に対する安定剤として知られるカプリル酸ナトリウムを加えて加熱処理すると宿主由来の夾雑物の凝集がより効果的であることを発見し、本発明を完成するに至った。
本発明は以下に示すヒト血清アルブミンの製造方法を提供するものである。
１．宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を２価陽イオンの存在下に加熱処理して当該夾雑物を選択的に凝集させた後、生じた凝集物をヒト血清アルブミン溶液から除去することを特徴とするヒト血清アルブミンの精製方法。
２．遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの製造方法であって、宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を２価陽イオンの存在下に加熱処理して当該夾雑物を凝集させた後、生じた凝集物をヒト血清アルブミン溶液から除去する工程を含むことを特徴とする前記の方法。
３．宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を２価陽イオン及び安定剤の存在下に加熱処理して当該夾雑物を凝集させた後、生じた凝集物をヒト血清アルブミン溶液から除去することを特徴とするヒト血清アルブミンの精製方法。
４．遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの製造方法であって、宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を２価陽イオン及び安定剤の存在下に加熱処理して当該夾雑物を凝集させた後、生じた凝集物をヒト血清アルブミン溶液から除去する工程を含むことを特徴とする前記の方法。
１．宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を２価陽イオンの存在下に加熱処理して当該夾雑物を選択的に凝集させた後、生じた凝集物をヒト血清アルブミン溶液から除去することを特徴とするヒト血清アルブミンの精製方法。
２．遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの製造方法であって、宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を２価陽イオンの存在下に加熱処理して当該夾雑物を凝集させた後、生じた凝集物をヒト血清アルブミン溶液から除去する工程を含むことを特徴とする前記の方法。
３．宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を２価陽イオン及び安定剤の存在下に加熱処理して当該夾雑物を凝集させた後、生じた凝集物をヒト血清アルブミン溶液から除去することを特徴とするヒト血清アルブミンの精製方法。
４．遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの製造方法であって、宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を２価陽イオン及び安定剤の存在下に加熱処理して当該夾雑物を凝集させた後、生じた凝集物をヒト血清アルブミン溶液から除去する工程を含むことを特徴とする前記の方法。
５．ヒト血清アルブミン溶液が、０．０１〜３０％濃度であることを特徴とする上記１ないし４のいずれか１項記載の方法。
６．ヒト血清アルブミン溶液が、０．１〜１０％濃度であることを特徴とする上記１ないし４のいずれか１項記載の方法。
７．２価陽イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン及び亜鉛イオンからなる群より選択されることを特徴とする上記１ないし６のいずれか１項記載の方法。
８．２価陽イオンが、１〜１０００ｍＭ濃度であることを特徴とする上記１ないし７のいずれか１項記載の方法。
９．２価陽イオンが、１００〜５００ｍＭ濃度であることを特徴とする上記１ないし７のいずれか１項記載の方法。
６．ヒト血清アルブミン溶液が、０．１〜１０％濃度であることを特徴とする上記１ないし４のいずれか１項記載の方法。
７．２価陽イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン及び亜鉛イオンからなる群より選択されることを特徴とする上記１ないし６のいずれか１項記載の方法。
８．２価陽イオンが、１〜１０００ｍＭ濃度であることを特徴とする上記１ないし７のいずれか１項記載の方法。
９．２価陽イオンが、１００〜５００ｍＭ濃度であることを特徴とする上記１ないし７のいずれか１項記載の方法。
１０．安定剤が、アセチルトリプトファン又はその塩及び／又は脂肪酸（炭素数６〜２０）又はその塩であることを特徴とする上記３ないし９のいずれか１項記載の方法。
１１．脂肪酸塩が、カプリル酸ナトリウムであることを特徴とする上記１０記載の方法。
１２．カプリル酸ナトリウムが、５〜２０ｍＭ濃度であることを特徴とする上記１１記載の方法。
１３．加熱処理が、５０〜９５℃で行われることを特徴とする上記１ないし１２のいずれか１項記載の方法。
１４．加熱処理が、６０〜７５℃で行われることを特徴とする上記１ないし１２のいずれか１項記載の方法。
１５．加熱処理が、１分〜３０時間行われることを特徴とする上記１ないし１４のいずれか１項記載の方法。
１６．加熱処理が、１〜５時間行われることを特徴とする上記１ないし１４のいずれか１項記載の方法。
１７．加熱処理が、ｐＨ４.５〜１０の範囲で行われることを特徴とする上記１ないし１６のいずれか１項記載の方法。
１８．加熱処理が、ｐＨ９〜１０の範囲で行われることを特徴とする上記１ないし１６のいずれか１項記載の方法。
１９．凝集物を除去する工程に、低速遠心分離法、分画分子量１０万〜３０万の限外ろ過膜法又はこれらの両方法を用いることを特徴とする上記１ないし１８のいずれか１項記載の方法。
１１．脂肪酸塩が、カプリル酸ナトリウムであることを特徴とする上記１０記載の方法。
１２．カプリル酸ナトリウムが、５〜２０ｍＭ濃度であることを特徴とする上記１１記載の方法。
１３．加熱処理が、５０〜９５℃で行われることを特徴とする上記１ないし１２のいずれか１項記載の方法。
１４．加熱処理が、６０〜７５℃で行われることを特徴とする上記１ないし１２のいずれか１項記載の方法。
１５．加熱処理が、１分〜３０時間行われることを特徴とする上記１ないし１４のいずれか１項記載の方法。
１６．加熱処理が、１〜５時間行われることを特徴とする上記１ないし１４のいずれか１項記載の方法。
１７．加熱処理が、ｐＨ４.５〜１０の範囲で行われることを特徴とする上記１ないし１６のいずれか１項記載の方法。
１８．加熱処理が、ｐＨ９〜１０の範囲で行われることを特徴とする上記１ないし１６のいずれか１項記載の方法。
１９．凝集物を除去する工程に、低速遠心分離法、分画分子量１０万〜３０万の限外ろ過膜法又はこれらの両方法を用いることを特徴とする上記１ないし１８のいずれか１項記載の方法。
２０．遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの製造方法であって、
（１）宿主由来の夾雑物を含有する５〜１０％ヒト血清アルブミン溶液を１００〜５００ミリモル濃度のカルシウムイオン存在下に、場合によっては、５〜２０ミリモル濃度のカプリル酸ナトリウムを添加し、ｐＨ９〜１０、温度６０〜７５℃で１〜５時間加熱処理して該夾雑物を凝集させる工程、及び
（２）生じた凝集物を低速遠心分離法、分画分子量１０万〜３０万の限外ろ過膜法又はこれらの両方法を用いてヒト血清アルブミン溶液から除去する工程
を含むことを特徴とする前記の方法。
また、本発明は、斯かる方法により得られた高純度のヒト血清アルブミンを提供するものである。
（１）宿主由来の夾雑物を含有する５〜１０％ヒト血清アルブミン溶液を１００〜５００ミリモル濃度のカルシウムイオン存在下に、場合によっては、５〜２０ミリモル濃度のカプリル酸ナトリウムを添加し、ｐＨ９〜１０、温度６０〜７５℃で１〜５時間加熱処理して該夾雑物を凝集させる工程、及び
（２）生じた凝集物を低速遠心分離法、分画分子量１０万〜３０万の限外ろ過膜法又はこれらの両方法を用いてヒト血清アルブミン溶液から除去する工程
を含むことを特徴とする前記の方法。
また、本発明は、斯かる方法により得られた高純度のヒト血清アルブミンを提供するものである。
本発明によれば、血漿または宿主由来の夾雑物が混在するヒト血清アルブミン溶液を、２価陽イオンの存在下に加熱処理する方法が提供される。当該方法により、前記夾雑物が選択的に凝集し、生じた凝集物は、低速遠心又はろ過により容易に除去できる。本発明の方法は、簡便で、ヒト血清アルブミン溶液を一度に大量に処理することができる。また、本発明の方法により得られるヒト血清アルブミンは、夾雑物をほとんど含まない高度に精製されたもので、ヒト血清アルブミンに対する抗体の作製や抗原抗体反応を利用した種々の検出試薬の構成因子として利用できる。
本発明の方法は、宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を、２価陽イオンの存在下に加熱処理し、これにより生じた凝集物を除去することを特徴とするものである。この方法を実施することによって、宿主由来の夾雑物を実質的に含有しない高純度のヒト血清アルブミンを効率良く得ることができる。
前記の加熱処理に供されるヒト血清アルブミンとしては、遺伝子組換え技術によって得られた組換え型ヒト血清アルブミン（以下、ｒＨＡと称することもある）溶液であれば特に制限されない。本発明は、遺伝子操作により得られるｒＨＡ含有溶液を加熱処理する方法に係るものであるが、血漿由来のヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡと称することもある）に応用しても良い。
前記の加熱処理に供されるヒト血清アルブミンとしては、遺伝子組換え技術によって得られた組換え型ヒト血清アルブミン（以下、ｒＨＡと称することもある）溶液であれば特に制限されない。本発明は、遺伝子操作により得られるｒＨＡ含有溶液を加熱処理する方法に係るものであるが、血漿由来のヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡと称することもある）に応用しても良い。
本発明に使用されるｒＨＡ溶液として、遺伝子操作によって得られるヒト血清アルブミン産生宿主を培養して得られる培養上清または該ヒト血清アルブミン産生宿主の破砕液を使用することができる。ｒＨＡの生産に使用できる宿主としては、酵母、大腸菌、枯草菌及び動物細胞などが挙げられるが、好ましくは、酵母、例えば、サッカロミセス属、ピキア属が使用される。更に好ましくは、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）ＡＨ２２株［cir+，a，leu2，his4，can1］；以下、ＡＨ２２株と称することもある）またはその変異株である。
ヒト血清アルブミン産生酵母の調製、培養及び培養物からのｒＨＡの分離採取は、公知の方法に準じて行われる。例えば、ヒト血清アルブミン遺伝子のクローニング方法（特許１８９６８７７号公報）、ヒト血清アルブミン遺伝子を含む発現ベクターの構築、該発現ベクターによる酵母の形質転換、形質転換された細胞の培養及びヒト血清アルブミンの回収方法（特許第２９６８０５２号公報）、分泌型のｒＨＡ産生酵母の調製方法（特許２１３６５４７号公報）、変異型のｒＨＡ遺伝子の作製方法（特開平８‐２２８７９０号）、ｒＨＡ産生酵母培養物からのｒＨＡの精製方法（特許文献２、３）などが公知の技術として挙げられる。
実際に酵母変異株を作製、ｒＨＡ遺伝子をクローニング、発現ベクターを構築する場合には、市販のキットを使用すれば良い。例えば、RNAの抽出には、TRIzol試薬（インビトロジェン社）、ISOGEN（ニッポンジーン社）、StrataPrep Total RNA Purification Kit（東洋紡）などの試薬、mRNAの精製には、mRNA Purification Kit（アマシャムバイオサイエンス社）、Poly(A) Quick mRNA Isolation Kit（東洋紡）、mRNA Separator Kit（クロンテック社）などのキット、ｃDNAへの変換には、SuperScript plasmid system for cDNA synthesis and plasmid cloning（インビトロジェン社）、cDNA Synthesis Kit（宝酒造）、SMART PCR cDNA Synthesis & Library Construction Kits（クロンテック社）、Directionary cDNA Library Construction systems（ノバジェン社）などが市販されている。化学合成により、目的の遺伝子を作製することもできる。
得られたｒＨＡ発現ベクターを酵母に導入し、当該酵母を形質転換する際には、一般に良く用いられるプロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などを利用すれば良い。
ｒＨＡ産生酵母の培養には、例えば選択培地としてYNB液体培地、合成培地としてYPD液体培地が使用される。培養方法・条件等は、培養スケールによって任意に設定されるが、基本的には微生物の培養に一般的に使用されているバッチ培養、フェド-バッチ培養などの方法に従って行われる。より具体的には、ｒＨＡ産生組換え酵母を選択合成培地で、順次継代し、前培養液を調製する。これを合成培地に植え継ぎ、３０℃、７０〜９０時間流加培養し、ｒＨＡ産生細胞を増殖させる。こうして得られるｒＨＡ含有培養物が精製工程に供される。
ｒＨＡ産生酵母の培養及び培養上清または酵母細胞破砕液からｒＨＡを精製する場合には、特許文献２及び３などに記載された方法が応用される。前記の方法には、限外ろ過膜処理、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、酸処理、加熱処理、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー及び塩析などの精製方法が含まれる。ｒＨＡ製造工程におけるこれらの実施条件は、ｒＨＡ溶液の量・濃度、これに含まれる夾雑物の含量、処理工程の位置等によって任意に設定される。
本発明の加熱処理は、ｒＨＡ製造工程のいずれの段階でも、また何回でも実施できる。当該加熱処理には、好ましくは０．０１〜３０％（Ｗ／Ｖ）濃度のｒＨＡまたはＨＳＡ溶液を使用できるが、さらに好ましい濃度は、０．１〜１０％である。加熱処理に用いる２価の陽イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン及び亜鉛イオンなどを例示することができる。好ましくは、カルシウムイオンが使用される。また、２価の陽イオンを構成する化合物としては、例えば、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなどが挙げられる。これらの２価陽イオンは、好ましくは１〜１０００ｍＭの濃度範囲で使用される。さらに好ましくは、１００〜５００ｍＭである。加熱処理するときのｐＨは、好ましくは、カプリル酸塩の溶解下限値であるｐＨ４.５以上、溶液がゲル化するｐＨ１１以下の範囲であり、さらに好ましくは、ｐＨ９〜１０である。加熱処理するときの温度は、好ましくは５０〜９５℃、さらに好ましくは、６０〜７５℃が使用される。加熱処理は、好ましくは１分〜３０時間の範囲で行われるが、全ｒＨＡ製造工程における本加熱処理工程の位置により変更しても良い。例えば、製造工程の初期段階では、夾雑物の除去率よりも製造時間の短縮が優先され、後半では、夾雑物をできる限り排除することが優先される。このように加熱処理時間は、夾雑物の除去率に応じて設定されるが、さらに好ましくは、１〜５時間である。本発明の加熱処理条件のより好ましい組み合わせは、約５〜１０％のｒＨＡ溶液、１００〜５００ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ９〜１０、温度６０〜７５℃、１〜５時間である。
本発明の加熱処理を、アルブミンの安定剤として知られるアセチルトリプトファンまたはその塩及び／または脂肪酸（炭素数６〜２０）またはその塩の存在下で行うことによりさらに大きな効果が期待できる。これら安定剤は、非特許文献８、特許文献１、４及び５に開示されている濃度範囲で使用することが望ましい。例えば、本発明の加熱処理には、好適なカプリル酸ナトリウムの濃度として、５〜２０ｍＭが使用される。
本発明の加熱処理により生じた宿主由来の凝集物は、例えば、加熱処理の直後に限外ろ過膜で処理することにより除去することができる。本発明に使用される限外ろ過膜の分画分子量は、好ましくは１０万〜３０万の範囲で使用される。また、限外ろ過膜処理と他の方法とを組み合わせることにより効果的に凝集物を除去することができる。凝集物を除去する他の方法として、遠心分離、特に低速遠心分離（例えば、２，０００〜３，０００ｒｐｍ）、ろ過（例えば、φ0.22μmの無菌フィルター）などの方法が挙げられる。これらの方法の実施条件は、製造スケール、夾雑物の種類、凝集物のサイズ等によって適宜設定されるが、一般に蛋白の精製に使用される条件に準じて行われる。例えば、加熱処理により生じた凝集物の大部分を遠心分離により除去した後、限外ろ過膜処理する方法が取られる。
宿主由来の不純物としてのタンパク質の含有量は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）により、また、多糖類の含有量はフェノール硫酸法により、それぞれ知ることができる。これらの一般的なプロトコールは、それぞれAntibodies a laboratory manual（Ed Harlow・David Lane、Cold Spring Harbor Laboratory 1988）及び生物化学実験法２３ 糖蛋白質糖鎖研究法（高橋禮子編著、学会出版センター）などに記載されている。また、ｒＨＡ溶液の着色の程度については、吸光度（ＯＤ３５０／Ａ２８０、４５０／Ａ２８０、５００／Ａ２８０）を測定することにより調べることができる。宿主由来の不純タンパク質含量は、例えば、アルブミン非産生酵母の培養液を陽イオン交換クロマトグラフィーで部分精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用いて、加熱処理／凝集物除去後のアルブミン溶液中に存在する宿主由来の夾雑物を検出することにより測定できる。本発明の実施例に使用されたＥＩＡ法による蛋白質の検出限界は、０．００８μｇ／ｇｒＨＡである。
カルシウムイオン存在下における部分精製ヒト血清アルブミン溶液の加熱処理
（１）ｒＨＡ産生組換え酵母の培養
ｒＨＡ産生組換え酵母（サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ））を選択合成培地で、順次継代し前培養液を調製する。これを合成培地に植え継ぎ、３０℃、７０〜９０時間流加培養し、ｒＨＡ産生細胞を増殖させた。
（２）ｒＨＡの部分精製
上記の培養液を精製水にて２倍に希釈し、最終濃度５ｍＭとなるようにカプリル酸ナトリウムを添加した後、酢酸にてｐＨ４．５に調整した。これを、酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した流動床陽イオン交換体に吸着させ、３００ｍＭの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）により溶出させた。得られた溶出液を０．５Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ９．０に調整後、５時間静置した。これを、５ｍＭのカプリル酸を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）へ置換後、ヒト血清アルブミン濃度１０％（Ｗ／Ｖ）に濃縮し、６０℃１時間加熱処理した遠心上清を部分精製ｒＨＡ液とした。この部分精製ｒＨＡ液の夾雑物含量は１１９５．８（μｇ／ｇｒＨＡ）であった。
（３）部分精製ｒＨＡの加熱処理（Ｃａイオン存在下）
工程（２）で得られた部分精製ｒＨＡ液（夾雑物含量：１１９５．８μｇ／ｇｒＨＡ）４ｍｌに、１Ｍの塩化カルシウムを２０〜４００μｌ添加し、ｐＨを０．５Ｎ水酸化ナトリウムで、５．５に調整し、６０℃、１時間加熱した。これを３０００ｒｐｍで３０分遠心分離し、得られた上清を精製水で透析し、酵素免疫測定法に供した。その結果を夾雑物の除去率とともに表１に示す。夾雑物の除去率は以下の式により求めたものである。
除去率（％）＝１００×（Ａ−Ｂ）／Ａ
Ａ＝加熱処理前のｒＨＡ液の夾雑物含量
Ｂ＝加熱処理後のｒＨＡ液の夾雑物含量
（１）ｒＨＡ産生組換え酵母の培養
ｒＨＡ産生組換え酵母（サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ））を選択合成培地で、順次継代し前培養液を調製する。これを合成培地に植え継ぎ、３０℃、７０〜９０時間流加培養し、ｒＨＡ産生細胞を増殖させた。
（２）ｒＨＡの部分精製
上記の培養液を精製水にて２倍に希釈し、最終濃度５ｍＭとなるようにカプリル酸ナトリウムを添加した後、酢酸にてｐＨ４．５に調整した。これを、酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した流動床陽イオン交換体に吸着させ、３００ｍＭの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）により溶出させた。得られた溶出液を０．５Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ９．０に調整後、５時間静置した。これを、５ｍＭのカプリル酸を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）へ置換後、ヒト血清アルブミン濃度１０％（Ｗ／Ｖ）に濃縮し、６０℃１時間加熱処理した遠心上清を部分精製ｒＨＡ液とした。この部分精製ｒＨＡ液の夾雑物含量は１１９５．８（μｇ／ｇｒＨＡ）であった。
（３）部分精製ｒＨＡの加熱処理（Ｃａイオン存在下）
工程（２）で得られた部分精製ｒＨＡ液（夾雑物含量：１１９５．８μｇ／ｇｒＨＡ）４ｍｌに、１Ｍの塩化カルシウムを２０〜４００μｌ添加し、ｐＨを０．５Ｎ水酸化ナトリウムで、５．５に調整し、６０℃、１時間加熱した。これを３０００ｒｐｍで３０分遠心分離し、得られた上清を精製水で透析し、酵素免疫測定法に供した。その結果を夾雑物の除去率とともに表１に示す。夾雑物の除去率は以下の式により求めたものである。
除去率（％）＝１００×（Ａ−Ｂ）／Ａ
Ａ＝加熱処理前のｒＨＡ液の夾雑物含量
Ｂ＝加熱処理後のｒＨＡ液の夾雑物含量
（４）部分精製ｒＨＡの加熱処理（Ｃａイオン＋カプリル酸存在下）
工程（２）で得られた部分精製ｒＨＡ液（夾雑物含量：１１９５．８μｇ／ｇｒＨＡ）４ｍｌに、１Ｍの塩化カルシウムを２０〜４００μｌ、２Ｍカプリル酸３０μｌを添加し、ｐＨを１％酢酸で、５．５に調整し、６０℃、１時間加熱した。これを３０００ｒｐｍで３０分遠心分離し、得られた上清を精製水で透析し、酵素免疫測定法に供した。その結果を夾雑物の除去率とともに表２に示す。
工程（２）で得られた部分精製ｒＨＡ液（夾雑物含量：１１９５．８μｇ／ｇｒＨＡ）４ｍｌに、１Ｍの塩化カルシウムを２０〜４００μｌ、２Ｍカプリル酸３０μｌを添加し、ｐＨを１％酢酸で、５．５に調整し、６０℃、１時間加熱した。これを３０００ｒｐｍで３０分遠心分離し、得られた上清を精製水で透析し、酵素免疫測定法に供した。その結果を夾雑物の除去率とともに表２に示す。
カルシウムイオン存在下における部分精製ヒト血清アルブミン溶液の経時的加熱処理
（１）ｒＨＡ産生組換え酵母の培養
ｒＨＡ産生組換え酵母（サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ））を選択合成培地で、順次継代し前培養液を調製する。これを合成培地に植え継ぎ、３０℃、７０〜９０時間流加培養し、ｒＨＡ産生細胞を増殖させた。
（２）ｒＨＡの部分精製
上記の培養液を精製水にて２倍希釈し、最終濃度５ｍＭとなるようにカプリル酸ナトリウムを添加した後、酢酸にてｐＨ４．５に調整した。これを、酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した流動床陽イオン交換体に吸着させ、３００ｍＭの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）により溶出させた。得られた溶出液を０．５Ｎ 水酸化ナトリウムでｐＨ９．０に調整後、５時間静置した。これを、分画分子量１０ＫＤａの限外ろ過膜を用いてｒＨＡ濃度約１０％（Ｗ／Ｖ）まで濃縮し、精製水にて約５倍希釈後、再度ｒＨＡ濃度約１０％（Ｗ／Ｖ）まで濃縮したものを部分精製ｒＨＡ液とした。この部分精製ｒＨＡ液の夾雑物含量は７２１４５（μｇ／ｇｒＨＡ）であった。
（３）部分精製ｒＨＡの加熱処理（Ｃａイオン＋カプリル酸Ｎａ存在下）
実施例２（２）の方法に従って得られた部分精製ｒＨＡ液（夾雑物含量：７２１４５μｇ／ｇｒＨＡ）５ｍｌを、終濃度１００ｍＭ塩化カルシウム、２０ｍＭカプリル酸ナトリウム存在下、ｐＨ９．５にて６０℃、１時間〜２４時間加熱処理した。これを３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離した。得られた上清を精製水に透析し、酵素免疫測定法に供した。その結果を夾雑物除去率とともに表３に示す。
（１）ｒＨＡ産生組換え酵母の培養
ｒＨＡ産生組換え酵母（サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ））を選択合成培地で、順次継代し前培養液を調製する。これを合成培地に植え継ぎ、３０℃、７０〜９０時間流加培養し、ｒＨＡ産生細胞を増殖させた。
（２）ｒＨＡの部分精製
上記の培養液を精製水にて２倍希釈し、最終濃度５ｍＭとなるようにカプリル酸ナトリウムを添加した後、酢酸にてｐＨ４．５に調整した。これを、酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した流動床陽イオン交換体に吸着させ、３００ｍＭの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）により溶出させた。得られた溶出液を０．５Ｎ 水酸化ナトリウムでｐＨ９．０に調整後、５時間静置した。これを、分画分子量１０ＫＤａの限外ろ過膜を用いてｒＨＡ濃度約１０％（Ｗ／Ｖ）まで濃縮し、精製水にて約５倍希釈後、再度ｒＨＡ濃度約１０％（Ｗ／Ｖ）まで濃縮したものを部分精製ｒＨＡ液とした。この部分精製ｒＨＡ液の夾雑物含量は７２１４５（μｇ／ｇｒＨＡ）であった。
（３）部分精製ｒＨＡの加熱処理（Ｃａイオン＋カプリル酸Ｎａ存在下）
実施例２（２）の方法に従って得られた部分精製ｒＨＡ液（夾雑物含量：７２１４５μｇ／ｇｒＨＡ）５ｍｌを、終濃度１００ｍＭ塩化カルシウム、２０ｍＭカプリル酸ナトリウム存在下、ｐＨ９．５にて６０℃、１時間〜２４時間加熱処理した。これを３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離した。得られた上清を精製水に透析し、酵素免疫測定法に供した。その結果を夾雑物除去率とともに表３に示す。
（４）部分精製ｒＨＡの加熱処理（Ｃａイオン＋カプリル酸Ｎａ存在下）
実施例２（２）の方法に従って得られた部分精製ｒＨＡ液（夾雑物含量：６０１４６μｇ／ｇｒＨＡ）５ｍｌを、２０ｍＭカプリル酸ナトリウム存在下、終濃度１００ｍＭ塩化カルシウム添加有り無しで、ｐＨ９．５にて５０℃〜８０℃、１分〜６０分間加熱処理した。これを３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離した。得られた上清を精製水に透析し、酵素免疫測定法に供した。その結果を夾雑物除去率とともに表４に示す。
実施例２（２）の方法に従って得られた部分精製ｒＨＡ液（夾雑物含量：６０１４６μｇ／ｇｒＨＡ）５ｍｌを、２０ｍＭカプリル酸ナトリウム存在下、終濃度１００ｍＭ塩化カルシウム添加有り無しで、ｐＨ９．５にて５０℃〜８０℃、１分〜６０分間加熱処理した。これを３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離した。得られた上清を精製水に透析し、酵素免疫測定法に供した。その結果を夾雑物除去率とともに表４に示す。
２価イオン存在下におけるヒト血清アルブミン溶液の加熱処理
（１）ｒＨＡの部分精製
実施例２（１）の培養液を精製水にて２倍希釈し、最終濃度５ｍＭとなるようカプリル酸ナトリウムを添加した後、酢酸にてｐＨ４．５に調整した。これを、酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した流動床陽イオン交換体に吸着させ、３００ｍＭの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）により溶出させた。得られた溶出液を０．５Ｎ 水酸化ナトリウムでｐＨ９．０に調整し、５時間静置した後、ヒト血清アルブミン濃度１０％（Ｗ／Ｖ）に濃縮した。これを、２０ｍＭのカプリル酸を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）へ置換したものを部分精製ｒＨＡ液とした。この部分精製ｒＨＡ液の夾雑物含量は６７１８２（μｇ／ｇｒＨＡ）であった。
（２）部分精製ｒＨＡの加熱処理
上記の部分精製ｒＨＡ液（夾雑物含量：６７１８２μｇ／ｇｒＨＡ）４ｍｌを、５０ｍＭの２価の陽イオン存在下、ｐＨ５．５、６０℃、１時間加熱処理した。これを３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離し、その上清をろ過した。得られたろ液を精製水で透析し、酵素免疫測定法に供した。その結果を除去率とともに表５に示す。
（１）ｒＨＡの部分精製
実施例２（１）の培養液を精製水にて２倍希釈し、最終濃度５ｍＭとなるようカプリル酸ナトリウムを添加した後、酢酸にてｐＨ４．５に調整した。これを、酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化した流動床陽イオン交換体に吸着させ、３００ｍＭの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ９．０）により溶出させた。得られた溶出液を０．５Ｎ 水酸化ナトリウムでｐＨ９．０に調整し、５時間静置した後、ヒト血清アルブミン濃度１０％（Ｗ／Ｖ）に濃縮した。これを、２０ｍＭのカプリル酸を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ５．５）へ置換したものを部分精製ｒＨＡ液とした。この部分精製ｒＨＡ液の夾雑物含量は６７１８２（μｇ／ｇｒＨＡ）であった。
（２）部分精製ｒＨＡの加熱処理
上記の部分精製ｒＨＡ液（夾雑物含量：６７１８２μｇ／ｇｒＨＡ）４ｍｌを、５０ｍＭの２価の陽イオン存在下、ｐＨ５．５、６０℃、１時間加熱処理した。これを３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離し、その上清をろ過した。得られたろ液を精製水で透析し、酵素免疫測定法に供した。その結果を除去率とともに表５に示す。
カルシウムイオン存在下における高度精製ヒト血清アルブミン溶液の加熱処理
（１）ｒＨＡの高度精製
実施例１で得られた部分精製ｒＨＡ液を、５ｍＭカプリル酸を含有するリン緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化した陽イオン交換体に供し、その素通り画分に１Ｍ 塩化ナトリウムおよびｐＨ７．０となるよう塩化ナトリウムおよび０．５Ｎ 水酸化ナトリウムを添加し、１Ｍ 塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した疎水性リガンドを有するクロマト樹脂に供した。この素通り画分を、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ 塩化カルシウムを含有するグリシン緩衝液（ｐＨ８．４５）に置換し、同様の緩衝液で平衡化したアフィニティクロマト担体に供した。この素通り画分を、ｒＨＡ濃度約１０％まで濃縮し、精製水にて４倍希釈して得たものを高度精製ｒＨＡとした。
（２）高度精製ｒＨＡの加熱処理１（Ｃａイオン＋カプリル酸Ｎａ存在下）
上記の高度精製ｒＨＡ液（夾雑物含量：１３．３５μｇ／ｇｒＨＡ）を、１００〜１０００ｍＭカルシウムイオン、２０ｍＭカプリル酸ナトリウム存在下、６０℃、１時間加熱処理した。これを３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離し、その上清をろ過した。得られたろ液を精製水で透析し、酵素免疫測定法に供した。その結果を除去率とともに表６に示す。
（１）ｒＨＡの高度精製
実施例１で得られた部分精製ｒＨＡ液を、５ｍＭカプリル酸を含有するリン緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化した陽イオン交換体に供し、その素通り画分に１Ｍ 塩化ナトリウムおよびｐＨ７．０となるよう塩化ナトリウムおよび０．５Ｎ 水酸化ナトリウムを添加し、１Ｍ 塩化ナトリウムを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した疎水性リガンドを有するクロマト樹脂に供した。この素通り画分を、１００ｍＭ 塩化ナトリウム、５０ｍＭ 塩化カルシウムを含有するグリシン緩衝液（ｐＨ８．４５）に置換し、同様の緩衝液で平衡化したアフィニティクロマト担体に供した。この素通り画分を、ｒＨＡ濃度約１０％まで濃縮し、精製水にて４倍希釈して得たものを高度精製ｒＨＡとした。
（２）高度精製ｒＨＡの加熱処理１（Ｃａイオン＋カプリル酸Ｎａ存在下）
上記の高度精製ｒＨＡ液（夾雑物含量：１３．３５μｇ／ｇｒＨＡ）を、１００〜１０００ｍＭカルシウムイオン、２０ｍＭカプリル酸ナトリウム存在下、６０℃、１時間加熱処理した。これを３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離し、その上清をろ過した。得られたろ液を精製水で透析し、酵素免疫測定法に供した。その結果を除去率とともに表６に示す。
（３）高度精製ｒＨＡの加熱処理２（Ｃａイオン＋カプリル酸Ｎａ存在下）
上記の高度精製ｒＨＡ液（夾雑物含量：２１．２６５μｇ／ｇｒＨＡ）を、１００ｍＭカルシウムイオン、２０ｍＭカプリル酸ナトリウム存在下、６０℃、１時間および１６時間加熱処理した。これを３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離し、その上清をろ過した。得られたろ液を精製水で透析し、酵素免疫測定法に供した。その結果を除去率とともに表７に示す。
上記の高度精製ｒＨＡ液（夾雑物含量：２１．２６５μｇ／ｇｒＨＡ）を、１００ｍＭカルシウムイオン、２０ｍＭカプリル酸ナトリウム存在下、６０℃、１時間および１６時間加熱処理した。これを３０００ｒｐｍ、３０分遠心分離し、その上清をろ過した。得られたろ液を精製水で透析し、酵素免疫測定法に供した。その結果を除去率とともに表７に示す。
本発明で使用する塩化カルシウムは一般に使用される安価な化合物であり、この使用により、製造コストの低減化が期待される。本発明の方法により、ヒトに投与された場合、ショックやアレルギーなどの副作用の原因となる可能性のある宿主由来の夾雑物を実質的に含まない高純度のヒト血清アルブミンが提供され、外科手術、出血性ショックあるいは熱傷やネフローゼ症候群などアルブミンの喪失による低アルブミン血症等の治療薬として、また、種々の活性蛋白やワクチンの安定剤として使用される。
Claims (19)
- 宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を、１００〜１０００ｍＭ濃度の２価陽イオンの存在下に加熱処理して当該夾雑物を選択的に凝集させた後、生じた凝集物をヒト血清アルブミン溶液から除去することを特徴とするヒト血清アルブミンの精製方法。
- 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの製造方法であって、宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を、１００〜１０００ｍＭ濃度の２価陽イオンの存在下に加熱処理して当該夾雑物を凝集させた後、生じた凝集物をヒト血清アルブミン溶液から除去する工程を含むことを特徴とする前記の方法。
- 宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を、１００〜１０００ｍＭ濃度の２価陽イオン及び安定剤の存在下に加熱処理して当該夾雑物を凝集させた後、生じた凝集物をヒト血清アルブミン溶液から除去することを特徴とするヒト血清アルブミンの精製方法。
- 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの製造方法であって、宿主由来の夾雑物を含有するヒト血清アルブミン溶液を、１００〜１０００ｍＭ濃度の２価陽イオン及び安定剤の存在下に加熱処理して当該夾雑物を凝集させた後、生じた凝集物をヒト血清アルブミン溶液から除去する工程を含むことを特徴とする前記の方法。
- ヒト血清アルブミン溶液が、０．０１〜３０％濃度であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
- ヒト血清アルブミン溶液が、０．１〜１０％濃度であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
- ２価陽イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン及び亜鉛イオンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１ないし６のいずれか１項記載の方法。
- ２価陽イオンが、１００〜５００ｍＭ濃度であることを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項記載の方法。
- 安定剤が、アセチルトリプトファン又はその塩及び／又は脂肪酸（炭素数６〜２０）又はその塩であることを特徴とする請求項３ないし８のいずれか１項記載の方法。
- 脂肪酸塩が、カプリル酸ナトリウムであることを特徴とする請求項９記載の方法。
- カプリル酸ナトリウムが、５〜２０ｍＭ濃度であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
- 加熱処理が、５０〜９５℃で行われることを特徴とする請求項１ないし１１のいずれか１項記載の方法。
- 加熱処理が、６０〜７５℃で行われることを特徴とする請求項１ないし１１のいずれか１項記載の方法。
- 加熱処理が、１分〜３０時間行われることを特徴とする請求項１ないし１３のいずれか１項記載の方法。
- 加熱処理が、１〜５時間行われることを特徴とする請求項１ないし１３のいずれか１項記載の方法。
- 加熱処理が、ｐＨ４.５〜１０の範囲で行われることを特徴とする請求項１ないし１５のいずれか１項記載の方法。
- 加熱処理が、ｐＨ９〜１０の範囲で行われることを特徴とする請求項１ないし１５のいずれか１項記載の方法。
- 凝集物を除去する工程に、低速遠心分離法、分画分子量１０万〜３０万の限外ろ過膜法又はこれらの両方法を用いることを特徴とする請求項１ないし１７のいずれか１項記載の方法。
- 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの製造方法であって、
（１）宿主由来の夾雑物を含有する５〜１０％ヒト血清アルブミン溶液を１００〜５００ミリモル濃度のカルシウムイオン存在下に、場合によっては、５〜２０ミリモル濃度のカプリル酸ナトリウムを添加し、ｐＨ９〜１０、温度６０〜７５℃で１〜５時間加熱処理して該夾雑物を凝集させる工程、及び
（２）生じた凝集物を低速遠心分離法、分画分子量１０万〜３０万の限外ろ過膜法又はこれらの両方法を用いてヒト血清アルブミン溶液から除去する工程
を含むことを特徴とする前記の方法。
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