JPH05317079A - 遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミンの製造方法、およびそれにより得られるヒト血清アルブミン含有組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒト血清アルブミンの産生宿主の培養上清
を、限外濾過、加熱処理、酸処理し、再び限外濾過した
後、陽イオン交換体、疎水性クロマト、陰イオン交換
体、塩析の各処理に供することにより精製することを特
徴とする遺伝子操作により得られるヒト血清アルブミン
の製造方法、ならびにそれにより得られるヒト血清アル
ブミン含有組成物。 【効果】 本発明によれば、遺伝子操作により得られる
ヒト血清アルブミンを効率よく精製することができ、か
つ、産生宿主関連成分あるいはその他の夾雑成分を含ま
ず、着色も充分に抑えられたヒト血清アルブミンを提供
することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子操作により得られ
るヒト血清アルブミンを特定の工程を組み合わせて、精
製することを特徴とする製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルブミン、特にヒト血清アルブミン
（以下、「ＨＳＡ」ともいう。）は血漿の主要な蛋白構
成成分である。この蛋白は肝臓中で作られ、主に血流中
で正常な浸透圧を維持する責を負う。また種々の血清分
子のキャリアーとしての機能を持っている。ＨＳＡは種
々の臨床上の状況において投与される。例えば、ショッ
クや熱傷患者では血液量を元に戻し、それにより外傷に
関連するいくつかの症状を改善させるために、通常はＨ
ＳＡの頻回投与を必要とする。低蛋白血症や胎児性赤芽
球症に罹っている患者にもＨＳＡによる治療を必要とす
ることがある。従って、ＨＳＡを投与する基本的な治療
上の意義は、外科手術、ショック、火傷、浮腫を起こす
低蛋白血症におけるがごとく、血管からの液体の損失が
ある様な状態を治療する点に存する。

【０００３】現在、ＨＳＡは、主として採取した血液の
分画からの産物として製造されている。この製造法の欠
点は不経済であることと、血液の供給が困難であるとい
うことである。また、血液は肝炎ウイルスのように好ま
しくない物質を含んでいることがある。従って、ＨＳＡ
の代替の原料を開発することが有益となろう。

【０００４】ところで、組換ＤＮＡ技術の出現によっ
て、多種多様の有用なポリペプチドの微生物による生産
が可能となり、多くの哺乳動物ポリペプチド類が既に種
々の微生物により生産されている。ＨＳＡについても、
遺伝子操作の技術により大量生産し、それを高度精製す
る技術が確立されつつある。

【０００５】ＨＳＡを血漿から単離、精製する方法とし
ては各種研究がなされ、実用化されている。例えば、コ
ーンのエタノール分画法、ＰＥＧ分画法、硫安分画法等
が知られている。また最近では、陰イオン交換体処理と
６０℃，１０時間の加熱処理を組み合わせる方法（特開
平２−１９１２２６号公報）、陰イオン交換体処理、陽
イオン交換体処理および６０℃，１０時間の加熱処理を
組み合わせる方法（特開平３−１７１２３号公報）等も
開発されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかし、遺伝子操作に
より得られるＨＳＡを精製するには、上記の血漿由来の
ＨＳＡでの方法をそのまま適用することは適切とは言え
ない。なぜならば、除去すべき夾雑成分が血漿由来ＨＳ
Ａと遺伝子操作由来ＨＳＡとでは全く異なっているから
である。また、着色物質の除去という遺伝子操作由来の
ＨＳＡに特有の問題も存在する。したがって、本発明の
課題は、遺伝子操作により得られ、かつ産生宿主関連成
分あるいはその他の夾雑成分を含まず、着色も充分に抑
えられたＨＳＡを提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑みて、鋭意研究を進めた結果、遺伝子操作により得
られるＨＳＡを効率良く精製する方法を開発するに至っ
た。

【０００８】即ち、第一の発明は、遺伝子操作により得
られるヒト血清アルブミンを以下の〜を含む工程を
用いて精製することを特徴とするヒト血清アルブミンの
製造方法； ヒト血清アルブミンの産生宿主の培養上清を分画分
子量１０万〜５０万、及び１０００〜５万の限外濾過膜
を用いて処理する。 ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。 ｐＨ３〜５で酸処理する。 分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処
理する。 ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で
陽イオン交換体に接触させた後にｐＨ８〜１０、塩濃度
０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収
する、そして ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で
陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。

【０００９】また、第二の発明は、前記第一の発明の工
程の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度１〜３Ｍの条件下
で疎水性クロマト用担体に接触させた後に、ｐＨ６〜
８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で溶出する工程
を含むヒト血清アルブミンの製造方法。

【００１０】さらに、第三の発明は、前記第一の発明の
工程の代わりに、ｐＨ６〜８、塩濃度０．００１〜
０．０５Ｍの条件下で陰イオン交換体に接触させた後
に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０５〜１Ｍの条件下で溶出
する工程を含むヒト血清アルブミンの製造方法。

【００１１】さらに、第四の発明は、前記第一の発明の
工程との間、との間、またはの後で、ｐＨ３
〜５、塩濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、沈澱
画分を回収する工程をさらに含むヒト血清アルブミンの
製造方法。

【００１２】（１）遺伝子操作による得られるＨＳＡ 本発明において用いられる遺伝子操作により調製された
ＨＳＡ産生性宿主は、遺伝子操作を経て調製されたもの
であれば特に限定されず、既に公知文献記載のものの
他、今後開発されるものであっても適宜利用することが
できる。具体的には、遺伝子操作を経てＨＳＡ産生性と
された菌（例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等）、動物細
胞などが挙げられる。特に、本発明においては、宿主と
して、酵母、就中サッカロマイセス属〔例えば、サッカ
ロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae)
〕、もしくはピキア属〔例えば、ピキア・パストリス
（Pichia pastoris ）〕が使用されることが好ましい。
また、栄養要求性株や抗生物質感受性株が使用できる。
さらにまた、サッカロマイセス・セレビシエＡＨ２２株
（a, his 4, leu 2, can 1) 、ピキア・パストリスＧＴ
Ｓ１１５株 (his 4)等が好適に用いられる。

【００１３】これらのＨＳＡ産生性宿主の調製方法およ
びその培養によるＨＳＡの生産方法、培養物からのＨＳ
Ａの分離採取方法はすべて公知ならびにそれに準じた手
法を採用することによって実施される。例えば、ＨＳＡ
産生性宿主（またはＨＳＡ産生株）の調製方法として
は、例えば通常のヒト血清アルブミン遺伝子を用いる方
法（特開昭５８−５６６８４、同５８−９０５１５、同
５８−１５０５１７号公報）、新規なヒト血清アルブミ
ン遺伝子を用いる方法（特開昭６２−２９９８５、特開
平１−９８４８６号公報）、合成シグナル配列を用いる
方法（特開平１−２４０１９１号公報）、血清アルブミ
ンシグナル配列を用いる方法（特開平２−１６７０９５
号公報）、組換えプラスミドを染色体上に組込む方法
（特開平３−７２８８９号公報）、宿主同士を融合させ
る方法（特開平３−５３８７７号公報）、メタノール含
有培地中で変異を起こさせる方法、変異型ＡＯＸ₂ プロ
モーターを用いる方法（特願平３−６３５９８、同３−
６３５９９号）、枯草菌によるＨＳＡの発現（特開昭６
２−２５１３３号公報）、酵母によるＨＳＡの発現（特
開昭６０−４１４８７、同６３−３９５７６、同６３−
７４４９３号公報）、ピキア酵母によるＨＳＡの発現
（特開平２−１０４２９０号公報）等が例示される。

【００１４】このうち、メタノール含有培地中で変異を
起こさせる方法は具体的には以下のように行う。すなわ
ち、まず適当な宿主、好ましくはピキア酵母、具体的に
はＧＴＳ１１５株（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）
のＡＯＸ₁ 遺伝子領域に常法によりＡＯＸ₁ プロモータ
ー支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを有するプラ
スミドを導入して形質転換体を得る（特開平２−１０４
２９０号公報を参照）。この形質転換体はメタノール培
地中での増殖能は弱い。そこで、この形質転換体をメタ
ノール含有培地中で培養して変異を起こさせ、生育可能
な菌株のみを回収する。この際、メタノール濃度として
は、０．０００１〜５％程度が例示される。培地は人工
培地、天然培地のいずれでもよい。培養条件としては１
５〜４０℃、１〜１０００時間程度が例示される。

【００１５】また、ＨＳＡ産生性宿主の培養方法（すな
わちＨＳＡの産生方法）としては、上記の各公報に記載
された方法の他に、フェッドバッチ培養により、高濃度
のグルコースを適度に少量づつ供給し、産生菌体に対す
る高濃度基質阻害を避けて高濃度の菌体と産生物を得る
方法（特願平１−２１９５６１号）、培地中に脂肪酸を
添加してＨＳＡの産生を増強する方法（特願平３−８１
７１９号）等が例示される。さらにＨＳＡの分離採取方
法としては、上記の各公報に記載された方法の他に加熱
処理によるプロテアーゼの不活化（特開平３−１０３１
８８号公報）、陰イオン交換体、疎水性担体および活性
炭からなる群より選ばれた少なくとも一を用いてＨＳＡ
と着色成分を分離することによる着色抑制方法（特開平
４−５４１９８号公報）等が例示される。

【００１６】形質転換宿主の培養に用いられる培地は、
通常この分野で既知の培地に炭素数１０〜２６の脂肪酸
またはその塩を添加したものが使用され、培養条件は一
般的な常法に準じて実施される。培地は合成培地、天然
培地のいずれでもよく、液体培地が好ましい。例えば、
合成培地としては、一般に炭素源として各種糖類、窒素
源として尿素、アンモニウム塩、硝酸塩など、微量栄養
素として各種ビタミン、ヌクレオチドなどの他、無機塩
としてＭｇ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｕ
などが例示される。ＹＮＢ液体培地〔０．７％イースト
ナイトロジエンのベース（Difco 社製）、２％グルコー
ス〕などが挙げられる。また天然培地としては、ＹＰＤ
液体培地〔１％イーストエキストラクト（Difco 社
製）、２％バクトペプトン（Difco 社製）、２％グルコ
ース〕が例示される。培地のｐＨは中性または弱塩基
性、弱酸性でよい。またメタノール資化性宿主の場合
は、メタノール含有培地を用いることができる。この場
合メタノール濃度は０．０１〜５％程度である。

【００１７】培養温度は、１５〜４３℃（酵母は２０〜
３０℃、細菌は２０〜３７℃）が好ましい。培養時間は
１〜１０００時間程度であり、培養は静置または振盪、
攪拌、通気下に回分培養法や半回分培養法あるいは連続
培養法により実施される。なお、当該培養に先立って前
培養を行うことが好ましい。この際の培地としては、例
えばＹＮＢ液体培地やＹＰＤ液体培地が使用される。前
培養の培養条件は次の通りである。すなわち、培養時間
は１０〜１００時間、温度は酵母では３０℃、細菌では
３７℃程度が好ましい。

【００１８】かくして培養終了後、ＨＳＡは培養濾液ま
たは菌体、細胞からそれぞれ公知の分離手段により採取
される。

【００１９】（２）ＨＳＡの精製 (i) 限外濾過 本工程は、ＨＳＡ産生宿主を分離した培養上清から、Ｈ
ＳＡ以外の高分子量物質および低分子量物質を限外濾過
法により分離除去する工程である。高分子量物質の除去
には分画分子量１０万〜５０万程度、好ましくは３０万
程度の限外濾過膜を、低分子量物質の除去には分画分子
量１０００〜５万程度、好ましくは１万〜３万程度の限
外濾過膜を使用する。高分子量物質の除去では残存する
ＨＳＡ産生宿主の分離が、また、低分子量物質の除去で
は液量の濃縮が同時に行われる。

【００２０】(ii) 加熱処理 (i) で得られた濃縮液を50〜70℃で30分〜５時間程度、
好ましくは60℃で１〜３時間程度加熱処理する。本工程
は安定化剤の存在下に行うことが好ましい。安定化剤と
しては、アセチルトリプトファン、炭素数６〜１８の有
機カルボン酸またはその塩等が例示される。両者は併用
してもよい。アセチルトリプトファンの添加量としては
１〜100mM 程度が例示される。炭素数６〜１８の有機カ
ルボン酸としては、カプロン酸（炭素数６）、カプリル
酸（炭素数８）、カプリン酸（炭素数１０）、ラウリン
酸（炭素数１２）、パルミチン酸（炭素数１６）、オレ
イン酸（炭素数１８）等が例示される。その塩として
は、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム
塩等）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩
等）が例示される。炭素数６〜１８の有機カルボン酸ま
たはその塩の添加量としては、１〜１００ｍＭ程度が例
示される。また、加熱処理時にチオール系化合物（例え
ば、メルカプトエタノール、システイン、還元型グルタ
チオン等）を１〜１００ｍＭ程度、好ましくは５〜３０
ｍＭ、さらにアミノグアニジンを１０〜１０００ｍＭ添
加することにより加熱で生じる着色を抑制できる。本工
程は一部公知である（特開平３−１０３１８８号公
報）。

【００２１】(iii) 酸処理 (ii)の処理液のｐＨを３〜５程度、好ましくは４〜４．
６程度に調製し、１〜１２時間程度静置する。

【００２２】(iv) 限外濾過 本工程は、高分子化した夾雑物質を限外濾過法により分
離除去する工程である。高分子量物質の除去には、分画
分子量１０万〜５０万程度、好ましくは３０万程度の限
外濾過膜を使用する。また、必要に応じて、分画分子量
１０００〜５万程度、好ましくは１万〜３万程度の限外
濾過膜を用いて、次工程の陽イオン交換体処理のための
緩衝液交換を行うことができる。

【００２３】(v) 陽イオン交換体処理 陽イオン交換体としては、スルホ基型、カルボキシル基
型等が例示される。スルホ基型としては、スルホ−アガ
ロース（商品名Ｓ−セファロース、ファルマシア社
製）、スルホプロピル−デキストラン（商品名ＳＰ−セ
ファデックス、ファルマシア社製）、スルホプロピル−
ポリビニル（商品名ＳＰ−トヨパール、東ソー社製）等
が例示される。また、カルボキシル基型としては、カル
ボキシメチル−デキストラン〔商品名ＣＭ−セファデッ
クス（ファルマシア社製）、商品名ＣＭ−セルロファイ
ン（生化学工業社製）〕等が例示される。接触、洗浄条
件としては、ｐＨ３〜５程度、好ましくは４〜４．６程
度、塩濃度０．０１〜０．２Ｍ程度、好ましくは０．０
５〜０．１Ｍ程度が例示される。溶出条件としては、ｐ
Ｈ８〜１０程度、好ましくは８．５〜９．５程度、塩濃
度０．２〜０．５Ｍ程度、好ましくは０．３〜０．４Ｍ
程度が例示される。

【００２４】(vi) 疎水性クロマト処理 疎水性クロマト用担体としては、炭素数４〜１８のアル
キル基型（ブチル基型、オクチル基型、オクチルデシル
基型等）、フェニル基型等が例示される。ブチル基型と
しては、ブチル−アガロース、ブチル−ポリビニル（商
品名ブチル−トヨパール、東ソー社製）、オクチル基型
としては、オクチル−アガロース、オクチルデシル基型
としては、オクチルデシル−アガロース、フェニル基型
としては、フェニル−セルロース（商品名フェニルセロ
ファイン、生化学工業社製）等が例示される。本工程で
は、ＨＳＡを非吸着画分に回収することができる。その
場合、接触条件は、ｐＨ６〜８程度、好ましくは６．５
〜７程度、塩濃度０．０１〜０．５Ｍ程度、好ましくは
０．０５〜０．２Ｍ程度である。また、ＨＳＡを上記担
体に吸着させた後に溶出することができる。この場合、
接触、洗浄条件としては、ｐＨ６〜８程度、好ましくは
６．５〜７程度、塩濃度１〜３Ｍ程度、好ましくは１．
５〜２Ｍ程度である。溶出条件としては、ｐＨ６〜８程
度、好ましくは６．５〜７程度、塩濃度０．０１〜０．
５Ｍ程度、好ましくは０．０５〜０．２Ｍ程度である。

【００２５】(vii) 陰イオン交換体処理 陰イオン交換体としては、ジエチルアミノエチル（ＤＥ
ＡＥ）基型、四級アミノエチル（ＱＡＥ）基型等が例示
される。ＤＥＡＥ基型としては、ＤＥＡＥ−アガロース
（商品名ＤＥＡＥ−セファロース、ファルマシア社
製）、ＤＥＡＥ−デキストラン（商品名ＤＥＡＥ−セフ
ァデックス、ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−ポリビニ
ル（商品名ＤＥＡＥ−トヨパール、東ソー社製）等が例
示される。また、ＱＡＥ基型としては、ＱＡＥ−アガロ
ース（商品名Ｑ−セファロース、ファルマシア社製）、
ＱＡＥ−ポリビニル（商品名ＱＡＥ−トヨパール、東ソ
ー社製）等が例示される。本工程では、ＨＳＡを非吸着
画分に回収することができる。その場合、接触条件は、
ｐＨ６〜８程度、好ましくは６．５〜７程度、塩濃度
０．０１〜０．１Ｍ程度である。また、ＨＳＡを上記担
体に吸着させた後に溶出することができる。この場合、
接触、洗浄条件としては、ｐＨ６〜８程度、好ましくは
６．５〜７程度、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍ程度、
好ましくは０．０１〜０．０２Ｍ程度である。溶出条件
としては、ｐＨ６〜８程度、好ましくは６．５〜７程
度、塩濃度０．０５〜１Ｍ程度である。

【００２６】(viii) 塩析処理 本工程では、塩濃度が０．１〜３Ｍ、好ましくは０．５
〜１．５Ｍ程度になるように塩成分を添加し、ｐＨ３〜
５程度、好ましくは３．５〜４．５程度に調節すること
で、ＨＳＡを特異的に沈澱させ、これを分離することで
上清に存在しているＨＳＡ以外の不純物を分離すること
ができる。沈澱したＨＳＡは、適当な緩衝液に溶解す
る。イオン強度を調整するための塩成分は、特に限定し
ないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニ
ウム、チオシアン酸ナトリウム（または、カリウム）、
硫酸ナトリウム等が適当である。また、ＨＳＡ沈澱と上
清の分離方法は特に限定しないが、遠心分離、圧搾分
離、クロスフローによる膜分離等が適当である。本工程
は、(vii) の陰イオン交換体処理後に行うことは好まし
いが、(v) の陽イオン交換体処理と(vi)の疎水性クロマ
ト処理の間、あるいは (vi) の疎水性クロマト処理と(v
ii) の陰イオン交換体処理の間に行ってもよい。

【００２７】（３）製剤化 得られたＨＳＡは公知の手法（限外濾過、安定化剤の添
加、除菌濾過、分注、凍結乾燥等）により製剤化するこ
とができる。こうして調製されたＨＳＡ製剤は注射剤と
して血漿由来ＨＳＡ製剤と同様に臨床上用いることがで
きる。また、医薬品の安定化剤あるいは担体、運搬体と
しても利用可能である。

【００２８】（４）精製された遺伝子操作由来のＨＳＡ
の性状 本発明のＨＳＡは分子量約６７０００，等電点４．７の
単一物質である。単量体のみから成り、二量体あるいは
重合体、分解物（分子量約４３０００）を実質的に含ま
ない。また、産生宿主に由来する夾雑成分、多糖類も実
質的に含まない。着色度がＨＳＡ２５％溶液の場合でＡ
₃₅₀ ／Ａ ₂₈₀が０．０１〜０．０５、Ａ ₄₅₀／Ａ ₂₈₀が
０．００１〜０．０２程度である。

【００２９】

【発明の効果】本発明によれば、遺伝子操作により得ら
れるＨＳＡを効率よく精製することができる。また、遺
伝子操作により得られ、かつ、産生宿主関連成分あるい
はその他の夾雑成分を含まず、着色も充分に抑えられた
ＨＳＡを提供することができる。

【００３０】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために、実施例
を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるも
のではない。

【００３１】参考例１ (1) 使用菌株：Pichia pastoris GCP101株 特開平２−１０４２９０号公報に述べられている方法に
より、ピキアパストリス（Pichia pastoris)ＧＴＳ１１
５（ｈｉｓ４）のＡＯＸ₁ 遺伝子領域に、ＡＯＸ₁ プロ
モーター支配下にＨＳＡが発現する転写ユニットを持つ
プラスミドｐＰＧＰ１のＮｏｔ１で切断した断片を置換
して、ＰＣ４１３０が得られている。この株はＡＯＸ₁
遺伝子が存在しないためにメタノールを炭素源とする培
地での増殖能が低くなっている（Ｍｕｔ−株）。

【００３２】ＰＣ４１３０をＹＰＤ培地（１％イースト
エキストラクト、２％バクトペプトン、２％グルコー
ス）３mlに植菌し、２４時間後に初期ＯＤ₅₄₀ ＝０．１
となるようにＹＰＤ培地５０mlに植菌した。３日間３０
℃で培養後に初期ＯＤ₅₄₀ ＝０．１となるようにＹＰＤ
培地５０mlに植菌した。さらに３日毎に同様の継代を繰
り返した。継代毎に菌体を１０⁷ cells/plate になるよ
うに滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．
ａ．プレート（０．７％イーストナイトロジエンベース
ウイズアウトアミノアシッド、２％メタノール、１．５
％寒天末）に塗布し、３０℃５日間培養してコロニーの
有無を判断した。その結果、１２日間継代後に塗布した
２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏａ．ａ．プレートから２０
個のコロニーが生じた。このプレートではＭｕｔ−株は
ほとんど生育できず、Ｍｕｔ＋株は生育できる。すなわ
ち、このプレートではコロニーが生じるということはメ
タノールの資化性が上昇し、Ｍｕｔ＋に変換した株が得
られたことを示している。生じたコロニーの内の１つを
適当に滅菌水で希釈して２％ＭｅＯＨ−ＹＮＢｗ／ｏ
ａ．ａ．プレートに拡げシングルコロニーに単離した。
その１つをＧＣＰ１０１と名付けた。

【００３３】(2) 菌株の培養 （前々培養）グリセロール凍結ストック菌株１mlを２０
０mlのＹＰＤ培地（表１）を含むバッフル付１，０００
ml容三角フラスコに植菌、３０℃にて２４時間振盪培養
した。

【００３４】

【表１】

【００３５】（前培養）ＹＰＤ培地５Ｌを含む１０Ｌ容
ジャーファーメンターに前々培養液を植菌し、２４時間
通気攪拌培養した。培養温度は３０℃、通気量は５Ｌ／
分とした。また、前培養においてはｐＨの制御は実施し
なかった。

【００３６】（本培養）バッチ培養用培地（表２）２５
０Ｌに前培養液を植菌し、１，２００Ｌ容ファーメンタ
ーを用いて通気攪拌培養した。槽内圧は０．５kg／c
m² 、最大通気量を８００Ｎ−L/min として溶存酸素濃
度が飽和溶存酸素濃度の５０％〜３０％程度を保持する
ように、攪拌速度を制御しながら回分培養を開始した。
回分培養において培地中のグリセロールが消費された時
点よりフィード培地（表３）の添加を開始した。このフ
ィード培地の添加にはコンピュータを使用し、培地中に
メタノールが蓄積しないように制御しながら高密度培養
を実施した。ｐＨは２８％アンモニア水を添加すること
により、ｐＨ５．８５に定値制御した。消泡は消泡剤
（Adecanol、旭電化工業製) を回分培養開始時に０．３
０ml／Ｌ添加しておき、その後は必要に応じて少量添加
することで実施した。

【００３７】

【表２】

【００３８】

【表３】

【００３９】参考例２ 参考例１のＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモ
ーター [変異型。天然型ＡＯＸ２プロモーター（TEAST,
5, 167-177 (1988)またはMol. Cell, Biol.,9, 1316-1
323 (1989))中、開始コドン上流の２５５番目の塩基が
ＴからＣに変異したもの] を用いてＨＳＡ発現用プラス
ミドｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス(Pichia
pastoris) ＧＴＴ１１５株に導入し、形質転換体ＵＨＧ
４２−３株を得た（特願平３−６３５９９号）。参考例
１に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養し、ＨＳＡを産
生させた。

【００４０】実施例１ [i] 培養上清の分離〜膜分画（ＩＩ） 参考例１で得られた培養液約８００Ｌを圧搾することに
より培養上清を分離した。培養上清を分画分子量が３０
万の限外濾過膜で処理した。次いで、分画分子量が３万
の限外濾過膜を用いて液量を約８０Ｌに濃縮した〔膜分
画（Ｉ）〕。続いて、６０℃、３時間の加熱処理を行っ
た。加熱処理は５ｍＭカプリル酸ナトリウム、１０ｍＭ
システイン、１００ｍＭアミノグアニジンの共存下にｐ
Ｈ７．５で行った。加熱処理液を急速に約１５℃に冷却
し、ｐＨ４．５に調整した後に、再度分画分子量が３０
万の限外濾過膜を用いて処理した〔膜分画（ＩＩ）〕。
次いで、分画分子量が３万の限外濾過膜を用いてアルブ
ミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５
０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５に交換した。

【００４１】[ii] 陽イオン交換体処理 ５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐ
Ｈ４．５で平衡化したＳ−セファロース充填カラムにア
ルブミンを吸着させ、同緩衝液で十分洗浄したのち、
０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ９でアルブミンの溶出を行った。本処理前後の多糖
体含量をフェノール硫酸法で測定したところ、処理後の
サンプルでは処理前の１／２０に低下した。

【００４２】[iii] 疎水性クロマト処理 Ｓ−セファロース充填カラムから溶出されたアルブミン
溶液を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸
緩衝液，ｐＨ６．８で平衡化したフェニルセルロファイ
ンを充填したカラムに添加した。この条件ではアルブミ
ンはフェニルセルロファインに吸着することなく、カラ
ムを通過した。カラムを通過したアルブミンは、分画分
子量３万の限外濾過膜を用いて液量を約５０Ｌに濃縮す
るとともに、アルブミン溶液中の緩衝液を５０ｍＭリン
酸緩衝液、ｐＨ６．８に交換した。

【００４３】[iv] 陰イオン交換体処理 疎水性クロマト処理後、濃縮及び緩衝液交換を行ったア
ルブミン溶液を５０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．８で平
衡化したＤＥＡＥ−セファロースを充填したカラムに添
加した。この条件ではアルブミンはＤＥＡＥ−セファロ
ースに吸着することなく、カラムを通過した。

【００４４】[v] ＨＳＡの塩析処理 ５％濃度のＨＳＡに塩化ナトリウムを添加して最終濃度
１Ｍとした溶液を、酢酸でｐＨ３．５に調整し、ＨＳＡ
を沈澱させた。この沈澱を遠心により上清と分離し、不
純物を除去した。沈澱したアルブミンは溶解させ、分画
分子量３万の限外濾過膜を用いて濃縮および緩衝液交換
を行い、必要に応じ安定化剤を添加したのち、除菌濾過
することにより、注射剤として使用することができる。

【００４５】[vi] 精製工程のＨＰＬＣ分析 疎水性クロマト処理までの精製工程を終了したＨＳＡを
ＨＰＬＣゲル濾過により分析した。ゲル濾過分析は下記
の条件で行った。 カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社
製） 展開液：0.1M KH₂PO₄/0.3M NaCl 緩衝液 検出：波長２８０ｎｍでの吸光度 図１に示すように、精製ＨＳＡはＨＳＡモノマーのシン
グルピークとなった。

【００４６】[vii] 酵母由来成分分析 アルブミン非産生酵母の培養上清を本法と同様の方法で
粗精製したものをウサギに免疫し、得られた抗血清を用
いて精製アルブミン溶液中に存在する酵母由来成分の検
出を行った。測定は酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）で行っ
た。表４に塩析処理後のサンプルについての酵母由来成
分の検出結果を示す。サンプルはアルブミン濃度として
250 mg／mlに調整したものを用いて測定した。

【００４７】

【表４】

【００４８】アルブミン濃度250 mg/ml 中の酵母由来成
分量は疎水性クロマト処理後のサンプルで1,360 ng/ml
、陰イオン交換体処理後のサンプルでは5.4 ng/ml と
なり、１／２５０に低下した。さらに、塩析処理後の精
製アルブミンでは、0.1 ng/mlの検出限界において、酵
母由来成分は検出されなかった。

【００４９】実施例２ 本発明の精製ＨＳＡの性状 （１）分子量 分子量測定は前述のＨＰＬＣゲル濾過法によった。本発
明の精製ＨＳＡの分子量は約６７０００であり、血漿由
来のＨＳＡと同程度であった。 （２）等電点 等電点は薄層ポリアクリルアミドゲルを用い、Allen ら
の方法 [J. Chromatog., 146, 1 (1978)] に準じて測定
した。本発明の精製ＨＳＡの等電点は約４．６であり、
血漿由来のＨＳＡと同程度であった。 （３）着色度 着色度は２８０ｎｍ、３５０ｎｍ、４５０ｎｍでの吸光
度を測定し、Ａ₃₅₀ ／Ａ ₂₈₀、Ａ ₄₅₀／Ａ ₂₈₀を算出し
た。本発明の精製ＨＳＡの着色度はＡ₃₅₀ ／Ａ ₂₈₀は約
０．０２、Ａ ₄₅₀／Ａ ₂₈₀は約０．０１であり、血漿由
来のＨＳＡと同程度であった。

【００５０】実施例３ 参考例２で得た培養液を実施例１と同様に処理した。精
製されたＨＳＡの性状は実施例２で開示した分子量・等
電点および着色度、実施例１で開示した多糖体含量、ゲ
ル濾過パターンおよび酵母由来成分量と同程度であっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】疎水性クロマト精製工程後のＨＰＬＣ分析結果
を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成４年６月３日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３９】参考例２ 参考例１のＧＣＰ１０１株から単離したＡＯＸ２プロモ
ーター〔変異型。天然型ＡＯＸ２プロモーター（ＴＥＡ
ＳＴ，５，１６７−１７７（１９８８）またはＭｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９，１３１６−１３２３（１９
８９））中、開始コドン上流の２５５番目の塩基がＴか
らＣに変異したもの〕を用いてＨＳＡ発現用プラスミド
ｐＭＭ０４２を構築し、ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉ
ａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＴＳ１１５株に導入し、形質
転換体ＵＨＧ４２−３株を得た（特願平３−６３５９９
号）。参考例１に準じてこのＵＨＧ４２−３株を培養
し、ＨＳＡを産生させた。 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年９月２日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の名称

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】 遺伝子操作により得られるヒト血清ア
ルブミンの製造方法、およびそれにより得られるヒト血
清アルブミン含有組成物

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項５】 遺伝子操作により得られる（ｉ）分子量
約６万７千（ｉｉ）等電点４．６〜４．７のヒト血清ア
ルブミンを含有し、以下の特徴を有するヒト血清アルブ
ミン含有組成物； （１）ヒト血清アルブミンの単量体のみからなり、二量
体、重合体または分解物を実質的に含まない （２）産生宿主に由来する夾雑成分あるいは多糖類を実
質的に含まない （３）着色度は当該アルブミン２５％溶液の場合でＡ
_３５０／Ａ_２８０が０．０１〜０．０５、Ａ_４５０／Ａ
_２８０が０．００１ 〜０．０２。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００１

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子操作により得られ
るヒト血清アルブミンを特定の工程を組み合わせて、精
製することを特徴とする製造方法、ならびにそれにより
得られるヒト血清アルブミン含有組成物に関する。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１１】さらに、第四の発明は、前記第一の発明の
工程との間、との間、またはの後で、ｐＨ３
〜５、塩濃度０．５〜３Ｍの条件下で塩析処理し、沈澱
画分を回収する工程をさらに含むヒト血清アルブミンの
製造方法。また、上記第一から第四いずれかの発明の製
造方法により得られる、遺伝子操作により得られる
（ｉ）分子量約６万７千（ｉｉ）等電点４．６〜４．７
のヒト血清アルブミンを含有し、以下の特徴を有するヒ
ト血清アルブミン含有組成物； （１）単量体のみからなり、二量体、重合体または分解
物を実質的に含まない （２）産生宿主に由来する夾雑成分あるいは多糖類を実
質的に含まない （３）着色度は当該アルブミン２５％溶液の場合でＡ
_３５０／Ａ_２８０が０．０１〜０．０５、Ａ_４５０／Ａ
_２８０が０．００１ 〜０．０２。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 古畑 直人 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 竹島 一哉 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 上出 佳永子 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 野田 宗宏 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 近藤 雅英 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 石川 昭一 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 大原 和宏 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 横山 和正 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子操作により得られるヒト血清アル
   ブミンを以下の〜を含む工程を用いて精製すること
   を特徴とするヒト血清アルブミンの製造方法； ヒト血清アルブミンの産生宿主の培養上清を分画分
   子量１０万〜５０万、及び１０００〜５万の限外濾過膜
   を用いて処理する。 ５０〜７０℃で３０分〜５時間加熱処理する。 ｐＨ３〜５で酸処理する。 分画分子量１０万〜５０万の限外濾過膜を用いて処
   理する。 ｐＨ３〜５、塩濃度０．０１〜０．２Ｍの条件下で
   陽イオン交換体に接触させた後にｐＨ８〜１０、塩濃度
   ０．２〜０．５Ｍの条件下で溶出する。 ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５Ｍの条件下で
   疎水性クロマト用担体に接触させて、非吸着画分を回収
   する、そして ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．１Ｍの条件下で
   陰イオン交換体に接触させて、非吸着画分を回収する。
2. 【請求項２】 請求項１の工程の代わりに、ｐＨ６〜
   ８、塩濃度１〜３Ｍの条件下で疎水性クロマト用担体に
   接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０１〜０．５
   Ｍの条件下で溶出する工程を含むヒト血清アルブミンの
   製造方法。
3. 【請求項３】 請求項１の工程の代わりに、ｐＨ６〜
   ８、塩濃度０．００１〜０．０５Ｍの条件下で陰イオン
   交換体に接触させた後に、ｐＨ６〜８、塩濃度０．０５
   〜１Ｍの条件下で溶出する工程を含むヒト血清アルブミ
   ンの製造方法。
4. 【請求項４】 請求項１の工程との間、との
   間、またはの後で、ｐＨ３〜５、塩濃度０．５〜３Ｍ
   の条件下で塩析処理し、沈澱画分を回収する工程をさら
   に含むヒト血清アルブミンの製造方法。