CN112210002B - 重组人血清白蛋白的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛋白纯化领域，公开了一种重组人血清白蛋白的纯化方法，该方法包括：将含重组人血清白蛋白的发酵液依次进行除杂、第一浓缩换液、第一阳离子交换层析、疏水层析、第二浓缩换液、阴离子交换层析、亲和层析、第三浓缩换液和第二阳离子交换层析；其中，所述第二阳离子交换层析为改性的阳离子交换层析。经过五步层析纯化后，重组人血清白蛋白(rHSA)HPLC纯度能达到99.97％。

Description

重组人血清白蛋白的纯化方法

技术领域

本发明涉及蛋白纯化领域，具体涉及一种重组人血清白蛋白的纯化方法。

背景技术

人血白蛋白HSA是一种单链蛋白质，由585个氨基酸残基组成，相对分子质量为67000Da，pI点4.7，沉降系数(S20，W)4.6，电泳迁移率5.92。N端是天门冬氨酸，C端是亮氨酸。mRNA由2078个核苷酸组成。成熟的HSA分子的氨基酸序列中共有17对二硫键，一个半胱氨酸位点，一个色氨酸位点，空间结构类似椭圆形。

人血白蛋白HSA(Human Serum Albumin)作为人体血浆中最丰富的蛋白质，起着维持血浆渗透压、运输营养和其他重要作用。临床上用于休克、烧伤、创伤、低蛋白血症或急性血容量减少症的治疗，其使用剂量一般高达10g，是其他生物因子类产品的几万至百万倍，占国际市场血液制剂销售额的首位。

目前使用的HSA主要是从人血浆或胎盘血中通过低温乙醇法和层析法进行提取制备的，随着血浆被某些病原体，如肝炎病毒、艾滋病毒的污染，使得原料供应日益紧张，因而HSA不仅成本逐渐上升，而且具有携带致病病毒的潜在危险。随着DNA技术的发展，让开发一种没有病毒污染、能够完全替代HSA的重组白蛋白成为可能，但由于单次使用量大，因而对重组白蛋白的纯度要求非常严格，一套满足要求的纯化工艺将起到决定性的作用。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种重组人血清白蛋白的纯化方法，该方法能够制备得到高纯度的重组人血清白蛋白。

为了实现上述目的，本发明提供一种重组人血清白蛋白的纯化方法，该方法包括：将含重组人血清白蛋白的发酵液依次进行除杂、第一浓缩换液、第一阳离子交换层析、疏水层析、第二浓缩换液、阴离子交换层析、亲和层析、第三浓缩换液和第二阳离子交换层析；

其中，所述第二阳离子交换层析为改性的阳离子交换层析。

优选地，所述除杂的方法包括：在稳定剂的存在下，将所述含重组人血清白蛋白的发酵液在60-75℃、pH为5-6.5的条件下热处理，然后进行固液分离，得到除杂后的物料。

优选地，所述第一浓缩换液的方法包括：对除杂后的物料进行第一超滤和体系置换处理，得到第一浓缩换液后的物料。

优选地，用于第一阳离子交换层析的第一阳离子交换层析介质的配基为磺酸基或羧酸基、磷酸基。

优选地，用于所述疏水层析的疏水层析介质的配基为苯基或丁基、辛基。

优选地，所述第二浓缩换液的方法包括：对疏水层析后的物料进行第二超滤和体系置换处理，得到第二浓缩换液后的物料。

优选地，用于所述阴离子层析的阴离子层析介质的配基为二乙胺乙基或仲胺、叔胺。

优选地，用于所述亲和层析的亲和层析介质的配基为苯基硼酸盐配基。

优选地，所述第三浓缩换液的方法包括：对亲和层析后的物料进行第三超滤和体系置换处理，得到第三浓缩换液后的物料。

优选地，用用于所述改性的阳离子交换层析的改性阳离子交换层析介质的配基为2-甲基丙基磺酸盐。

通过上述技术方案，在建立rHSA的纯化工艺流程时，充分考虑了工业化生产的要求，操作流程相对更加简单，成本也顺势降低，易于后期的工业放大。

借助重组人血清白蛋白的特有热稳定性，在层析前利用热处理就去除了大部分杂蛋白，同时结合特定的填料进行层析纯化，有效的提高产品的回收率及纯度。

经过五步层析纯化后，重组人血清白蛋白的HPLC纯度能达到99.97％。

附图说明

图1是本发明实施例1中阳离子交换层析UV280(UV1，深色)和UV254(UV2，浅色)的色谱图。

图2是本发明实施例1中疏水层析UV280(UV1，深色)和UV254(UV2，浅色)的色谱图。

图3是本发明实施例1中阴离子层析UV280的色谱图。

图4是本发明实施例1中亲和层析UV280的色谱图。

图5是本发明实施例1中改性阳离子交换层析UV280(UV1，深色)和UV254(UV2，浅色)的色谱图。

图6是本发明实施例1中阳离子交换层析、疏水层析、阴离子层析和亲和层析样品SDS凝胶电泳图。其中，图6A为阳离子交换层析和疏水层析样品SDS凝胶电泳图，图6B主要为阴离子层析和亲和层析样品SDS凝胶电泳图。

图7是本发明实施例1中rHSA终产品SDS凝胶电泳图。

图8是本发明实施例1中rHSA终产品HPLC检测图谱。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供一种重组人血清白蛋白的纯化方法，该方法包括：将含重组人血清白蛋白的发酵液依次进行除杂、第一浓缩换液、第一阳离子交换层析、疏水层析、第二浓缩换液、阴离子交换层析、亲和层析、第三浓缩换液和第二阳离子交换层析；

其中，所述第二阳离子交换层析为改性的阳离子交换层析。

在本发明中，含重组人血清白蛋白的发酵液可以通过本领域常规的技术手段获得，比如，通过能够分泌表达重组人血清白蛋白的基因工程菌发酵得到；也可以通过商购或者其他渠道获得。

在本发明中，所述基因工程菌可以是本领域常规用于生产重组人血清白蛋白的菌株，比如可以为酵母菌、植物或动物细胞等，优选为毕赤酵母。

在本发明中，所述毕赤酵母发酵产重组人血清白蛋白的方法可以是本领域常规的方法，在此不再赘述，比如，可以参见CN1854155A或“钱立生，金光明.生物工程综合实验实训教程[M],安徽科学技术出版社,2018:150-152”。

在本发明中，所述基因工程菌发酵得到的含重组人血清白蛋白的发酵液通过除杂使得其中的一部分杂蛋白和蛋白降解酶失活，同时去除颗粒杂质。

在本发明中，所述除杂的方法可以为本领域常规使用的方法，优选地，所述除杂的方法包括：在稳定剂的存在下，将所述含重组人血清白蛋白的发酵液在60-75℃、pH为5-6.5的条件下热处理，然后进行固液分离，得到除杂后的物料。

在本发明中，所述稳定剂可以是本领域常规使用的稳定剂，优选地，所述稳定剂为棕榈酸和/或辛酸钠。

在本发明中，所述稳定剂的添加量可以在较宽的范围内选择，优选地，以所述含重组人血清白蛋白的发酵液的体积为基准，所述稳定剂的添加量为5-15mM。

在本发明中，可以通过酸或碱调节使得热处理的pH为5-6.5。所述酸或碱可以为本领域常用的酸或碱，比如可以为氢氧化钠和醋酸。

在本发明中，所述热处理的时间可以在较宽的范围内选择，优选地，所述热处理的时间为15-45min。通过热处理使得发酵液中的一部分杂蛋白和蛋白降解酶失活，既可去除一定量的杂蛋白，还可以避免蛋白酶对目标蛋白的降解作用。

在本发明中，所述固液分离的方法可以是本领域常规的方法，优选地，所述固液分离的方法包括离心、过滤和微滤中的至少一种。

在本发明的一种优选的实施方式中，所述固液分离的方法包括离心和微滤。

在本发明中，所述离心的条件可以在较宽的范围内选择，只要能够去除发酵液中的大部分颗粒物质即可，优选地，所述离心的转速为8000-12000rpm，离心的时间为10-30min。

热处理样品通过高速离心后，得到的热处理后清液中还是含有少量的细胞碎片等固体物杂质，且离子浓度过高(一般在15-19ms/cm范围内)，这些问题都将严重影响后期的层析纯化。而在层析步骤前增加一步微滤和超滤，可有效去除大颗粒杂质及沉淀物，然后进行体系置换，降低离子浓度和样品色素，提高纯化的效果。

在本发明中，微滤的目的在于去除热处理后清液中的颗粒杂质，微滤的条件可以在较宽的范围内选择，优选地，所述微滤的条件包括：截留分子量为0.22-0.5μm，压力为0.1-0.2MPa。

在本发明中，所述微滤过程中还优选使用微滤补充液用于洗涤截留的热处理后清液，所述微滤补充液的种类可以不受特别的限制，优选地，所述微滤补充液为醋酸钠溶液和/或柠檬酸溶液，更优选为醋酸钠溶液。在所述优选的情况下，能够提高纯化效果。

在本发明中，所述微滤补充液中无机盐的浓度可以在较宽的范围内选择，优选地，所述微滤补充液中的无机盐浓度为10-60mM。在所述优选的情况下，能够提高纯化效果。

优选地，所述微滤补充液的pH为4-5。

在本发明的一种优选的实施方式中，所述热处理后清液经微滤后得到截留的热处理后清液，当所述截留后的热处理后清液为热处理后清液体积的0.05-0.1倍时，使用微滤补充液进行洗涤，得到除杂后的物料；其中，所述微滤补充液的体积为所述截留的热处理后清液体积的0.5-2倍。

在本发明中，所述微滤可以在本领域常规使用的微滤设备中进行，本领域技术人员可以根据需要进行选择。

在本发明的一种优选的实施方式中，所述除杂的方法包括：取含rHSA的发酵液，加入辛酸钠使得发酵液中辛酸钠的浓度为8-12mM，调pH至5.8-6.2，65-70℃热处理25-35min。热处理结束后9000-11000rpm离心15-25min获取清液。热处理后清液经0.4-0.6μm聚醚砜平板膜微滤澄清和洗涤，得澄清液，微滤补充液为48-52mM的醋酸钠溶液，pH 4.4-4.6。热处理过程中样品逐渐变浑浊，部分蛋白发变性失活。

在本发明中，第一浓缩换液的目的在于去除热处理除杂后清液中的小分子杂质、色素，并进行体系置换。所述第一浓缩换液的方法可以是本领域常规使用的方法，优选地，所述第一浓缩换液的方法包括：对除杂后的物料进行第一超滤和体系置换处理，得到第一浓缩换液后的物料。

在本发明中，第一超滤的条件可以在较宽的范围内选择，优选地，所述第一超滤的条件包括：截留分子量为10-40KD。

优选地，所述第一超滤的条件包括：压力为0.1-0.2MPa，温度为4-8℃。

在本发明中，所述第一超滤过程中优选使用第一超滤置换液用于第一超滤截留液的体系置换，所述第一超滤置换液的种类可以不受特别的限制，优选地，所述第一超滤置换液为醋酸钠溶液和/或柠檬酸溶液，更优选为醋酸钠溶液。在所述优选的情况下，能够提高纯化效果。

在本发明中，所述第一超滤置换液中无机盐的浓度可以在较宽的范围内选择，优选地，所述第一超滤置换液中的无机盐浓度为10-60mM，pH为4-5.5。在所述优选的情况下，能够提高纯化效果。

在本发明的一种优选的实施方式中，所述除杂后的物料经第一超滤后得到第一超滤截留液，当所述第一超滤截留液为除杂后的物料体积的0.05-0.1倍时，使用第一超滤置换液进行体系置换，得到第一浓缩换液后的物料；其中，所述第一超滤置换液的体积为所述第一超滤截留液体积的0.5-2倍。

在本发明的一种优选的实施方式中，所述除杂后的物料经25-35KD聚醚砜平板膜超滤浓缩，并在第一超滤置换液的存在下进行体系置换，得第一浓缩换液后的物料。第一超滤置换液为48-52mM的醋酸钠溶液，pH 4.4-4.6。

在本发明中，所述超滤可以在本领域常规使用的超滤设备中进行，本领域技术人员可以根据需要进行选择。

在本发明中，通过五步层析逐步对rHSA进行纯化，第一步层析为第一阳离子交换层析，用于从第一浓缩换液后的物料中捕获目标蛋白(rHSA)，同时去除大部分的杂蛋白和色素。

在本发明中，用于第一阳离子交换层析的第一阳离子交换层析介质可以为本领域常规使用的阳离子交换层析介质，用于第一阳离子交换层析的第一阳离子交换层析介质的配基优选为磺酸基、羧酸基或磷酸基。

应当理解的是，层析介质又可称为填料。

在本发明中，所述第一阳离子交换层析介质可以通过商购得到，只要具备以上结构特征即可，优选为日本JNC株式会社的Cellufine MAX S-h或GE的capto S等。

在本发明中，在各个层析过程中，各层析柱可根据本领域常规的使用方法进行操作，在此不再赘述。

在本发明中，层析柱的尺寸根据需要处理的物料的量进行确定，本领域技术人员可以根据需要进行选择，在此不再赘述。

在本发明中，优选地，所述第一阳离子交换层析的方法包括：依次使用第一平衡液、A1洗脱液和A2洗脱液进行洗脱。其中，A1洗脱液洗脱得到的物料中含有rHSA蛋白。

在本发明中，第一阳离子交换层析过程中使用的第一平衡液可以是本领域常规使用的平衡液，优选地，所述第一平衡液为醋酸钠溶液和/或柠檬酸溶液，更优选为醋酸钠溶液。

在本发明中，优选地，所述第一平衡液的参数包括：pH为4-5，无机盐离子浓度为10-60mM。

在本发明中，优选地，所述A1洗脱液的pH为6.5-7.5。

优选地，所述A1洗脱液为含磷酸盐和氯化钠的水溶液。更优选地，所述A1洗脱液为含10-60mM磷酸盐和50-150mM氯化钠的水溶液。

在本发明中，磷酸盐为磷酸钠盐，磷酸盐缓冲液为磷酸钠盐缓冲液。

在本发明中，优选地，所述A2洗脱液的pH为6.5-7.5。

优选地，所述A2洗脱液为含磷酸盐和氯化钠的水溶液。更优选地，所述A2洗脱液为含10-60mM磷酸盐和0.5-1.2M氯化钠的水溶液。

在本发明的一种优选的实施方式中，以日本JNC株式会社的Cellufine MAX S-h作为第一阳离子交换层析介质制备第一阳离子交换层析柱，以10-60mM的醋酸钠溶液为第一平衡液平衡第一阳离子交换层析柱并洗脱，含10-60mM醋酸钠和50-150mM磷酸盐的水溶液作为A1洗脱液，含10-60mM磷酸盐和0.5-1M氯化钠的水溶液作为A2洗脱液依次进行洗脱。A1洗脱液洗脱得到的物料中含有rHSA蛋白。

在本发明中，优选通过碱洗对第一阳离子交换层析介质再生。

其中，所述碱洗使用的碱优选为氢氧化钠。所述氢氧化钠的浓度优选为0.05-0.6M。

应当理解的是，根据待处理样品的体积调整层析柱的大小和流速，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择。

在本发明的一种优选的实施方式中，第一阳离子交换层析的方法包括：

填料:Cellufine MAX s-h；

再生:0.08-0.12M NaOH；

清洗:超纯水洗至中性；

第一平衡液平衡:45-55mM醋酸钠溶液，pH 4.3-4.7；

上样:第一浓缩换液后的物料；

第一平衡液洗脱:45-55mM醋酸钠溶液，pH 4.3-4.7；

A1洗脱液洗脱:45-55mM磷酸盐和90-110mM氯化钠溶液，pH 6.8-7.2；

A2洗脱液洗脱:45-55mM磷酸盐和900-1100mM氯化钠溶液，pH6.8-7.2。

其中，第一浓缩换液后的物料为500mL为例，使用的层析柱可以是购自GE公司的Column XK16/40，柱体积可以为40-60mL，流速可以为1-1.5mL/min。

在本发明中，第二步层析为疏水层析，用于从第一阳离子交换层析后的物料中除去降解片段和残留色素。其中，所述降解片段是指rHSA的降解片段。

在本发明中，用于疏水层析的疏水层析介质可以为本领域常规使用的疏水层析介质，优选地，用于所述疏水层析的疏水层析介质的配基为苯基、丁基或辛基。

在本发明中，所述疏水层析介质可以通过商购得到，只要具备以上结构特征即可，优选为日本JNC株式会社的Cellufine MAX Phenyl或GE的Capto Phenyl。

在本发明中，疏水层析过程中使用的第二平衡液可以是本领域常规使用的平衡液，优选地，所述第二平衡液为含磷酸盐和氯化钠的水溶液。优选地，所述第二平衡液为含10-60mM磷酸盐和50-150mM氯化钠的水溶液。

优选地，所述第二平衡液的pH为6.5-7.5。

在本发明中，优选地，所述第一阳离子交换层析后的物料经过稀释后上样，所述稀释的倍数使得上样的物料的电导率为15-20ms/cm。

在本发明中，所述疏水层析的方法优选包括：使用第二平衡液和B1洗脱液进行洗脱。其中，目标蛋白不与疏水层析填料结合，在上样过程中流穿出来，降解片段和残留色素被吸附，并被B1洗脱液洗脱，从而实现分离纯化的目的。

在本发明中，优选地，所述B1洗脱液为水或磷酸盐缓冲液。

其中，所述水优选为超纯水。

其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度优选为10-60mM，pH为6.5-7.5。

在本发明的一种优选的实施方式中，以日本JNC株式会社的Cellufine MAXPhenyl作为疏水层析介质制备疏水层析柱，以含10-60mM磷酸盐和50-150mM氯化钠的水溶液为第二平衡液平衡疏水层析柱并洗脱，以超纯水为B1洗脱液进行洗脱。上样流穿液物料中含有目标rHSA蛋白。

在本发明中，优选通过碱洗对疏水层析介质再生。所述碱洗使用的碱优选为氢氧化钠。所述氢氧化钠的浓度优选为0.05-0.6M。

本发明的发明人发现，发酵液经过上述处理后，纯度基本已达到90％以上，但是由于疏水层析后的物料中电导率高，样品体积增大，rHSA浓度降低，给后续的纯化带来了困难。经研究发现，再进行后续的层析步骤前进行一次浓缩换液，能够有效去除大部分小分子杂蛋白和降解片段及色素，同时能够完成体系置换。

在本发明的一种优选的实施方式中，所述疏水层析的方法包括：

填料:Cellufine MAX Phenyl；

再生:0.09-0.11M NaOH；

清洗:超纯水洗至中性；

第二平衡液平衡:45-55mM磷酸盐和90-110mM氯化钠溶液，pH为6.8-7.2；

上样:使用第二平衡液稀释3-5倍的第一阳离子交换层析后的物料；

第二平衡液洗脱:45-55mM磷酸盐和90-110mM氯化钠溶液，pH为6.8-7.2；

B1洗脱液洗脱:超纯水。

其中，第一浓缩换液后的物料为500mL为例，使用的层析柱可以是SNAP columnI.D.10x length 125mm(ELS)，柱体积可以是7-10mL，流速可以为1.4-1.6mL/min。

在本发明中，第二浓缩换液的方法可以是本领域常规使用的方法，优选地，所述第二浓缩换液的方法包括：对疏水层析后的物料进行第二超滤和体系置换处理，得到第二浓缩换液后的物料。

在本发明中，第二超滤的条件可以在较宽的范围内选择，优选地，所述第二超滤的条件包括：截留分子量为10-40KD。

优选地，所述第二超滤的条件包括：压力为0.1-0.2MPa，温度为4-8℃。

在本发明中，所述第二超滤过程中优选使用第二超滤置换液用于第二超滤截留液的体系置换，所述第二超滤置换液的种类可以不受特别的限制，优选地，所述第二超滤置换液为磷酸盐缓冲液和/或醋酸钠溶液，更优选为磷酸盐缓冲液。在所述优选的情况下，能够提高纯化效果。

在本发明中，所述第二超滤置换液可以为本领域常规使用的第二超滤置换液，优选地，所述第二超滤置换液中的无机盐浓度为10-60mM，更优选为45-55mM；pH为4.5-5.5。在所述优选的情况下，能够提高纯化效果。

在本发明的一种优选的实施方式中，所述疏水层析后的物料经第二超滤后得到第二超滤截留液，当所述第二超滤截留液为疏水层析后的物料体积的0.05-0.1倍时，使用第二超滤置换液进行体系置换，得到第二浓缩换液后的物料；其中，所述第二超滤置换液的体积为所述第二超滤截留液体积的0.5-2倍。

在本发明中，第三步层析为阴离子层析，用于从第二浓缩换液后的物料中除去杂蛋白、核酸和内毒素等。

在本发明中，用于阴离子层析的阴离子层析介质可以为本领域常规使用的阴离子层析介质，优选地，用于所述阴离子层析的阴离子层析介质的配基为二乙胺乙基、仲胺或叔胺。

在本发明中，所述阴离子层析介质可以通过商购得到，只要具备以上结构特征即可，优选为日本JNC株式会社的Cellufine MAX DEAE或GE的capto DEAE。在所述优选的情况下，能够显著提高目标产物的纯度。

在本发明中，阴离子层析过程中使用的第三平衡液可以是本领域常规使用的平衡液，优选地，所述第三平衡液为含磷酸盐和氯化钠的水溶液。

优选地，所述第三平衡液的pH为4.5-5.5。

优选地，所述第三平衡液为含10-60mM磷酸盐和10-60mM氯化钠的水溶液。

在本发明中，所述阴离子层析的方法优选包括：使用第三平衡液和C1洗脱液进行洗脱。目标蛋白不与阴离子层析填料结合，在上样过程中目标蛋白rHSA流穿出来，C1洗脱液使得杂蛋白、核酸和内毒素等被洗脱。

在本发明中，优选地，所述C1洗脱液为含磷酸盐和氯化钠的水溶液。

优选地，所述C1洗脱液的pH为5.5-6.5。

优选地，所述C1洗脱液为含10-60mM磷酸盐和0.4-0.6M氯化钠的水溶液。

在本发明的一种优选的实施方式中，以日本JNC株式会社的Cellufine MAX DEAE作为阴离子层析介质制备阴离子层析柱，以含10-60mM磷酸盐和10-60mM氯化钠的水溶液为第三平衡液平衡阴离子层析柱并洗脱，然后以含10-60mM磷酸盐和0.4-0.6M氯化钠的水溶液作为C1洗脱液进行洗脱。上样流穿液物料中含有目标rHSA蛋白。在所述优选的情况下，能够显著提高目标产物的纯度。

在本发明中，优选通过碱洗对阴离子层析介质再生。所述碱洗使用的碱优选为氢氧化钠。所述氢氧化钠的浓度优选为0.05-0.6M。

在本发明的一种优选的实施方式中，阴离子交换层析的方法包括：

填料:Cellufine MAX DEAE；

再生:0.45-0.55M NaOH；

清洗:超纯水洗至中性；

第三平衡液平衡:45-55mM磷酸盐和45-55mM氯化钠溶液，pH 4.8-5.2；

上样:第二浓缩换液后的产物；

第三平衡液洗脱:45-55mM磷酸盐和45-55mM氯化钠溶液，pH 4.8-5.2；

C1洗脱液洗脱:45-55mM磷酸盐和480-520mM氯化钠溶液，pH5.8-6.2；

其中，第一浓缩换液后的物料为500mL为例，阴离子交换层析使用的层析柱可以是Biocomma FPLC Empty Cartridges，柱体积可以是3-8mL，流速可以为1.8-2.2mL/min。

在本发明中，第四步层析为亲和层析，用于从阴离子层析后的物料中除去糖蛋白和多糖等。

在本发明中，用于亲和层析的亲和层析介质可以为本领域常规使用的亲和层析介质，优选地，用于所述亲和层析的亲和层析介质的配基为苯基硼酸盐配体或刀豆凝集素配体。在所述优选的情况下，能够显著提高目标产物的纯度。

在本发明中，所述亲和层析介质可以通过商购得到，只要具备以上结构特征即可，优选为日本JNC株式会社的Cellufine MAX PB或GE的Con A Sepharose 4B。在所述优选的情况下，能够显著提高目标产物的纯度。

在本发明中，亲和层析过程中使用的第四平衡液可以是本领域常规使用的平衡液，优选地，所述第四平衡液为含磷酸盐和氯化钠的水溶液。

优选地，所述第四平衡液的pH为5.5-6.5。

优选地，所述第四平衡液为含10-60mM磷酸盐和0.4-0.6M氯化钠的水溶液。

在本发明中，所述亲和层析的方法优选包括：使用第四平衡液和D1洗脱液进行洗脱。目标蛋白不与亲和层析填料结合，在上样过程中目标蛋白rHSA流穿出来，其中，D1洗脱液使得糖蛋白和多糖等被洗脱。

在本发明中，优选地，所述D1洗脱液为碱溶液。更优选地，所述D1洗脱液为0.05-0.2M的氢氧化钠溶液。

在本发明的一种优选的实施方式中，以日本JNC株式会社的Cellufine MAX PB作为亲和层析介质制备亲和层析柱，以含10-60mM磷酸盐和0.4-0.6M氯化钠的水溶液为第四平衡液平衡亲和层析柱并洗脱，然后以0.1-0.2M氢氧化钠溶液作为D1洗脱液进行洗脱。上样流穿液物料中含有目标rHSA蛋白。在所述优选的情况下，能够显著提高目标产物的纯度。

在本发明中，优选通过碱洗对亲和层析介质再生。所述碱洗使用的碱优选为氢氧化钠。所述氢氧化钠的浓度优选为0.05-0.6M。

在本发明的一种优选的实施方式中，亲和层析的方法包括：

填料:Cellufine MAX PB；

再生:0.45-0.55M NaOH；

清洗:超纯水洗至中性；

所述第四平衡液平衡:45-55mM磷酸盐和450-550mM氯化钠溶液，pH 5.8-6.2；

上样:阴离子交换层析后的物料；

第四平衡液洗脱:45-55mM磷酸盐和450-550mM氯化钠溶液，5.8-6.2；

D1洗脱液洗脱:0.08-0.12M NaOH溶液。

其中，第一浓缩换液后的物料为500mL为例，亲和层析使用的层析柱可以是层析柱:Biocomma FPLC Empty Cartridges，柱体积可以为3-8mL，流速可以为1.8-2.2mL/min。

本发明的发明人发现，发酵液经过上述处理后，纯度基本已达到95％以上，但是由于亲和层析后的物料中样品体积增大，rHSA浓度降低，给后续的纯化带来了困难。经研究发现，再进行后续的层析步骤前进行一次浓缩换液，能够有效去除部分残留的小分子杂蛋白和色素，同时能够完成体系置换。

在本发明中，第三浓缩换液的方法可以是本领域常规使用的方法，优选地，所述第三浓缩换液的方法包括：对亲和层析后的物料进行第三超滤和体系置换处理，得到第三浓缩换液后的物料。

在本发明中，第三超滤的条件可以在较宽的范围内选择，优选地，所述第三超滤的条件包括：截留分子量为10-40KD，压力为0.1-0.2MPa，温度为4-8℃。

在本发明中，所述第三超滤过程中优选使用第三超滤置换液用于第三超滤截留液的体系置换，所述第三超滤置换液的种类可以不受特别的限制，优选地，所述第三超滤置换液为醋酸钠溶液和/或柠檬酸溶液，更优选为醋酸钠溶液。在所述优选的情况下，能够提高纯化效果。

在本发明的一种优选的实施方式中，所述除杂后的物料经第三超滤后得到第三超滤截留液，当所述第三超滤截留液为除杂后的物料体积的0.05-0.1倍时，使用第三超滤置换液进行体系置换，得到第一浓缩换液后的物料；其中，所述第三超滤置换液的体积为所述第三超滤截留液体积的0.5-2倍。

在本发明中，所述第三超滤置换液可以为本领域常规使用的第三超滤置换液，优选地，所述第三超滤置换液中的无机盐浓度为10-60mM，pH为4-5。在所述优选的情况下，能够提高纯化效果。

在本发明中，第五步层析为第二阳离子交换层析，为改性的阳离子交换层析，用于从第三浓缩换液后的物料中除去与重组人血清白蛋白性质相近的降解片段和残余色素等。

在本发明中，优选地，所述改性阳离子交换层析介质的配基为2-甲基丙烷磺酸盐(2-methylpropane sulfonate)。在所述优选的情况下，能够显著提高产品的收率和纯度。

优选地，所述改性阳离子交换层析介质还含有酰胺间隔臂。

在本发明中，所述改性阳离子交换层析介质可以通过商购得到，为日本JNC株式会社的Cellufine MAX GS。通过此步层析能够显著提高目标产物的纯度。

在本发明中，改性阳离子交换层析过程中使用的第五平衡液可以是本领域常规使用的平衡液，优选地，所述第五平衡液为醋酸钠溶液和/或柠檬酸溶液。

优选地，所述第五平衡液的pH为4-5。

优选地，所述第五平衡液为10-60mM醋酸钠溶液。

在本发明中，优选地，所述改性阳离子交换层析的方法包括：使用第五平衡液和E1洗脱液进行洗脱。目标蛋白在上样过程中与改性阳离子交换层析填料结合，与目标蛋白rHSA性能相近的降解片段流穿出来。其中，E1洗脱液使得目标蛋白rHSA被洗脱。

在本发明中，优选地，所述E1洗脱液为含磷酸盐和氯化钠的水溶液。

优选地，所述E1洗脱液的pH为6.5-7.5。

优选地，所述E1洗脱液为含10-60mM磷酸盐和0.6-1.2M氯化钠的水溶液。

在本发明的一种优选的实施方式中，以日本JNC株式会社的Cellufine MAX GS作为改性阳离子交换层析介质制备改性阳离子交换层析柱，以10-60mM醋酸钠溶液为第五平衡液平衡改性阳离子交换层析柱，然后以含10-60mM磷酸盐和0.4-0.6M氯化钠的水溶液作为E1洗脱液进行洗脱。E1洗脱液洗脱得到的物料中含有rHSA蛋白。在所述优选的情况下，能够显著提高目标产物的纯度。

在本发明中，优选通过碱洗对改性阳离子交换层析介质再生。所述碱洗使用的碱优选为氢氧化钠。所述氢氧化钠的浓度优选为0.05-0.6M。

在本发明的一种优选的实施方式中，第二阳离子交换层析的方法包括：

填料:Cellufine MAX GS；

再生:0.45-0.55M NaOH；

清洗:超纯水洗至中性；

第五平衡液平衡:45-55mM醋酸钠溶液，pH 4-4.5；

上样:第三浓缩换液后的产物；

第五平衡液洗脱:45-55mM醋酸钠溶液，pH 4-4.5；

E1洗脱液洗脱:45-55mM磷酸盐和900-1100mM氯化钠溶液，pH6.8-7.2。

其中，第一浓缩换液后的物料为500mL为例，第二阳离子交换层析使用的层析柱可以是Biocomma FPLC Empty Cartridges，柱体积可以是3-8mL，流速可以为1.8-2.2mL/min。

在本发明中，通过上述处理制备得到的重组人血清白蛋白的纯度可以通过多种手段进行评价，比如可以用SDS-PAGE法、HPLC法和HCP法。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中，如无特殊说明，所用试剂和仪器均为本领域常规使用的试剂和仪器，所有试剂均采用AR及以上级别。

填料Cellufine MAX S-h、Cellufine MAX Phenyl、Cellufine MAX DEAE、Cellufine MAX PB和Cellufine MAX GS均购自日本JNC株式会社。

填料Con A Sepharose 4B购自Cytiva思拓凡公司，填料SP-Sepharose FF购自北京索莱宝科技有限公司。

微滤在购自Millipore的pellicon微滤系统中进行；超滤在购自Millipore的pellicon超滤系统中进行。

以下实施例中使用的含rHSA的发酵液的制备方法参见CN1854155A。

以下实施例中，使用的磷酸盐为磷酸钠盐。

实施例1

本实施例用于说明本发明所述的rHSA的纯化方法

(1)除杂

取含rHSA的发酵液800mL，加入辛酸钠使得发酵液中辛酸钠的浓度为10mM，调pH6.0，68℃热处理30min，热处理过程中样品逐渐变浑浊，部分蛋白发变性失活。热处理结束后10000rpm离心20min获取清液。

热处理清液经0.45μm 50cm²聚醚砜平板膜微滤澄清和洗涤，得澄清液900mL，微滤补充液为50mM醋酸钠溶液，pH 4.5。

(2)第一浓缩换液

除杂后清液经30KD 50cm²聚醚砜平板膜超滤浓缩及体系置换，得第一浓缩换液后的物料500mL。超滤置换液为50mM醋酸钠溶液，pH 4.5。

(3)第一阳离子交换层析

层析柱:Column XK16/40

填料:Cellufine MAX s-h

柱高及体积：24.3cm(48.8mL)

流速:1.2mL/min

再生:0.1M NaOH(4CV)

清洗:超纯水洗至中性

第一平衡液平衡:50mM醋酸钠溶液，pH 4.5

上样:500mL第一浓缩换液后的物料，pH4.45

第一平衡液洗脱:50mM醋酸钠溶液，pH 4.5

A1洗脱液洗脱:50mM磷酸盐和100mM氯化钠溶液，pH 7.0

A2洗脱液洗脱:50mM磷酸盐和1000mM氯化钠溶液，pH 7.0

检出:Abs.254nm、280nm

如图1所示，大量色素和杂蛋白在上样时流穿，目标蛋白rHSA与填料结合，洗脱1洗出一个目标蛋白峰，体积40mL；洗脱2洗出一个杂质峰，体积15mL；碱洗再生一个杂质峰，体积5mL。

(4)疏水层析

层析柱:SNAP column I.D.10x length 125mm(ELS)

填料:Cellufine MAX Phenyl

柱高及体积：11.1cm(8.7mL)

流速:1.5mL/min

再生:0.1M NaOH(4CV)

清洗:超纯水洗至中性

第二平衡液平衡:50mM磷酸盐和100mM氯化钠溶液，pH 7.08

上样:158mL阳离子交换层析后的物料(已使用平衡液稀释4倍)，pH7.04

第二平衡液洗脱:50mM磷酸盐和100mM氯化钠溶液，pH 7.08

洗脱:超纯水

检出:Abs.254，280nm

如图2所示，层析上样时，目标蛋白rHSA不与填料结合，在上样时流穿出来，收集目标流穿峰177mL，大量杂蛋白和色素结合到填料上，用超纯水洗脱杂质峰25mL。

(5)第二浓缩换液

阳离子交换层析后的物料(流穿液)经30KD 50cm²聚醚砜平板膜超滤浓缩及体系置换，得第二浓缩换液后的产物80mL。超滤置换液为50mM磷酸盐缓冲液，pH 5.03。

(6)阴离子交换层析

层析柱:Biocomma FPLC Empty Cartridges 5mL

填料:Cellufine MAX DEAE

柱高及体积：2.5cm(5.0mL)

流速:2.0mL/min

再生:0.5M NaOH(4CV)

清洗:超纯水洗至中性

第三平衡液平衡:50mM磷酸盐和50mM氯化钠溶液，pH 5.03

上样:80mL第二浓缩换液后的产物，pH5.05(样品为phenyl流穿超滤置换样)

第三平衡液洗脱:50mM磷酸盐和50mM氯化钠溶液，pH 5.03

洗脱:50mM磷酸盐和500mM氯化钠溶液，pH 6.04

检出:Abs.280nm

如图3所示，层析上样时，目标蛋白rHSA不与填料结合，在上样时流穿出来，收集目标流穿峰97mL，大量杂蛋白和色素、内毒素等结合到填料上，洗脱液洗脱杂质峰15mL，碱洗再生一个杂质峰11mL。

(7)亲和层析

层析柱:Biocomma FPLC Empty Cartridges 5mL

填料:Cellufine MAX PB

柱高及体积：2.5cm(5.0mL)

流速:2.0mL/min

再生:0.5M NaOH(4CV)

清洗:超纯水洗至中性

第四平衡液平衡:50mM磷酸盐和500mM氯化钠溶液，pH 6.04

上样:97mL阴离子交换层析后的物料，pH6.0

第四平衡液洗脱:50mM磷酸盐和500mM氯化钠溶液，pH 6.04

D1洗脱液洗脱:0.1M NaOH溶液

检出:Abs.280nm

如图4所示，层析上样时，目标蛋白rHSA不与填料结合，在上样时流穿出来，收集目标流穿峰105mL，大量糖蛋白杂质和糖类杂质结合到填料上，碱洗一个杂质峰19mL。

(8)第三浓缩换液

亲和层析后的物料(流穿液)经30KD 50cm²聚醚砜平板膜超滤浓缩及体系置换，得第三浓缩换液后的产物60mL。超滤置换液为50mM醋酸钠溶液，pH 4.3。

(9)第二阳离子交换层析

层析柱:Biocomma FPLC Empty Cartridges 5mL

填料:Cellufine MAX GS

柱高及体积：2.5cm(5.0mL)

流速:2.0mL/min

再生:0.5M NaOH(4CV)

清洗:超纯水洗至中性

第五平衡液平衡:50mM醋酸钠溶液，pH 4.3

上样:60mL第三浓缩换液后的产物，pH4.3

第五平衡液洗脱:50mM醋酸钠溶液，pH 4.3

E1洗脱液洗脱:50mM磷酸盐和1000mM氯化钠溶液，pH 7.01

检出:Abs.254，280nm

如图5所示，残留的微量色素和杂蛋白在上样时流穿，目标蛋白rHSA与填料结合，洗脱出一个目标蛋白峰，体积20mL。经过改性阳离子交换层析处理后，得到rHSA终产品。

图6是第一阳离子交换层析、疏水层析、阴离子层析和亲和层析样品SDS凝胶电泳图。其中，图6A为阳离子交换层析和疏水层析样品SDS凝胶电泳图，图6B主要为阴离子层析和亲和层析样品SDS凝胶电泳图。

其中，marker是指标准分子量marker。S-h、Phenyl、PB和DEAE分别是指阳离子交换层析、疏水层析、亲和层析和阴离子交换层析过程。S-h原样是指阳离子交换层析过程中第一浓缩换液后的物料。FT表示流穿样品，ET表示洗脱样品。序号表示依次取样的样品编号。

图7是rHSA终产品SDS凝胶电泳图，其中，泳道1-5分别是标准分子量marker、含rHSA的发酵液、rHSA终产品10μL上样量、rHSA终产品5μL上样量和rHSA终产品5μL上样量的电泳图。

图8为rHSA终产品HPLC纯度分析图谱，得到终产品的HPLC纯度为99.97％。

对以上层析后的产物进行分析，测定其回收率和纯度，结果见表1。

计算第(5)、(6)、(7)和(9)步回收率的乘积，得到总回收率为30.7％。

表1

步骤	回收率％	纯度％(SDS-PAGE灰度分析)	HPLC	HCP
					(3)	90.00％	66.80％	-	-
(4)	68.40％	90.00％	-	-
					(5)	76.50％	95.00％	-	-
(6)	83.70％	98.00％	-	-
					(7)	77.90％	98.00％	-	99.999％
(9)	61.57％	100％	99.97％	99.999％

对比例1

本对比例用于说明参比的rHSA的纯化方法

按照实施例1所述的方法进行操作，不同的是，亲和层析的填料使用Con ASepharose 4B替换Cellufine MAX PB，第二阳离子交换层析的填料使用SP-Sepharose FF替换Cellufine MAX GS。

对得到的重组人血清白蛋白进行分析，计算第(5)、(6)、(7)和(9)步回收率的乘积，得到总回收率为24.5％，经检测最终产品的HPLC纯度为97.2％。

通过上述的结果可以看出，采用本发明所述的方法制备rHSA能够获得更高回收率和更高纯度的rHSA。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (14)

1.一种重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，该方法包括：将含重组人血清白蛋白的发酵液依次进行除杂、第一浓缩换液、第一阳离子交换层析、疏水层析、第二浓缩换液、阴离子交换层析、亲和层析、第三浓缩换液和第二阳离子交换层析；

其中，用于所述第一阳离子交换层析的填料为Cellufine MAX s-h填料；

用于所述疏水层析的填料为Cellufine MAX Phenyl填料；

用于阴离子交换层析的填料为Cellufine MAX DEAE填料；

用于亲和层析的填料为Cellufine PB填料；

用于第二阳离子交换层析的填料为Cellufine MAX GS填料。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述除杂的方法包括：在稳定剂的存在下，将所述含重组人血清白蛋白的发酵液在60-75℃、pH为5-6.5的条件下热处理，然后进行固液分离，得到除杂后的物料。

3.根据权利要求2所述的纯化方法，其中，所述稳定剂为棕榈酸和/或辛酸钠。

4.根据权利要求2所述的纯化方法，其中，以所述含重组人血清白蛋白的发酵液的体积为基准，所述稳定剂的添加量为5-15 mM。

5.根据权利要求2所述的纯化方法，其中，所述热处理的时间为15-45min。

6.根据权利要求2所述的纯化方法，其中，所述固液分离的方法包括离心和/或过滤。

7.根据权利要求6所述的纯化方法，其中，所述过滤为微滤。

8.根据权利要求7所述的纯化方法，其中，所述微滤的条件包括：截留分子量为0.22-0.5μm，压力为0.1-0.2MPa。

9.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述第一浓缩换液的方法包括：对除杂后的物料进行第一超滤和体系置换处理，得到第一浓缩换液后的物料。

10.根据权利要求9所述的纯化方法，其中，所述第一超滤的条件包括：截留分子量为10-40KD，压力为0.1-0.2MPa，温度为4-8℃。

11.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述第二浓缩换液的方法包括：对疏水层析后的物料进行第二超滤和体系置换处理，得到第二浓缩换液后的物料。

12.根据权利要求11所述的纯化方法，其中，所述第二超滤的条件包括：截留分子量为10-40KD，压力为0.1-0.2MPa，温度为4-8℃。

13.根据权利要求1-12中任意一项所述的纯化方法，其中，所述第三浓缩换液的方法包括：对亲和层析后的物料进行第三超滤和体系置换处理，得到第三浓缩换液后的物料。

14.根据权利要求13所述的纯化方法，其中，所述第三超滤的条件包括：截留分子量为10-40KD，压力为0.1-0.2MPa，温度为4-8℃。

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