CN109964123A - 抗体的纯化方法 - Google Patents

抗体的纯化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109964123A
CN109964123A CN201780070605.XA CN201780070605A CN109964123A CN 109964123 A CN109964123 A CN 109964123A CN 201780070605 A CN201780070605 A CN 201780070605A CN 109964123 A CN109964123 A CN 109964123A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
carrier
amino
tubing string
solutions
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780070605.XA
Other languages
English (en)
Inventor
松本吉裕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JNC Corp
Original Assignee
JNC Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JNC Corp filed Critical JNC Corp
Publication of CN109964123A publication Critical patent/CN109964123A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3828—Ligand exchange chromatography, e.g. complexation, chelation or metal interaction chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/285—Porous sorbents based on polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/327—Polymers obtained by reactions involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/165—Extraction; Separation; Purification by chromatography mixed-mode chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86

Abstract

根据一实施方式而提供一种方法，其为抗体的纯化方法，包括使包含抗体及HCP的溶液与色谱法载体接触而分离所述抗体与所述HCP，所述色谱法载体包括包含多孔性粒子的基础载体、以及与所述基础载体键结的具有多个一级氨基的化合物，所述具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基的20％～55％由疏水基修饰，所述抗体的回收率为85％以上，纯化后的抗体溶液中的所述HCP量小于45ppm。

Description

抗体的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种抗体的纯化方法。更详细而言，本发明涉及一种自包含抗体及源自宿主的蛋白质(宿主细胞蛋白(Host Cell Protein，HCP))等杂质的溶液分离抗体与杂质的抗体的纯化方法。
背景技术
使用色谱法(chromatography)进行生物医药品等的纯化已广为人知，利用各种分子间相互作用来进行目标物与杂质的分离。例子有：利用静电性相互作用的离子交换色谱法、利用疏水性相互作用的疏水性色谱法及利用对于抗体的亲和(affinity)相互作用的蛋白A(proteinA)色谱法等。
在生物医药品的纯化中最多使用的是离子交换色谱法。已知离子交换色谱法因处理液的导电率增加而吸附能力减少。因此，在导电率高的试样中，需要在进行吸附处理之前，通过稀释或脱盐使导电率下降至例如5mS/cm。
为了弥补此种离子交换色谱法的缺点，近年来正积极开发除了静电性相互作用以外还兼具疏水性相互作用、亲水性相互作用、螯合相互作用等的色谱法载体。
如此，作为兼具多种作用的色谱法载体，市售有：开普特(Capto)(注册商标)adhere、开普特(Capto)(注册商标)MMC(以上，通用电气医疗(GE Healthcare)公司制造)，MEP海帕赛尔(HyperCel)、海帕赛尔(HyperCel)(商标)AX STAR(以上，颇尔(Pall)公司制造)，艾斯木诺(Eshumuno)(注册商标)HCX(默克密理博(EMD Millipore)公司制造)，CHT(注册商标)陶瓷羟磷灰石(Ceramic Hydroxyapatite)(伯乐(Bio-Rad)公司制造)，及东洋珍珠(Toyopearl)(注册商标)MX Trp-650(东曹(Tosoh)公司制造)等。
这些兼具多种作用的色谱法载体可通过如下方式获得：除了具有静电性相互作用的配体(ligand)以外，还将具有原理不同的相互作用的配体导入至同一基础载体中、或者进而对与基础载体键结的配体的一部分进行修饰。如此获得的载体与仅担载具有静电性相互作用的配体的离子交换色谱法载体具有不同的选择性。作为与基础载体键结的配体，例如研究有多胺。
例如，专利文献1中揭示有：具有多胺作为配体的色谱法载体及其在血液凝固因子的纯化中的使用。
专利文献2中揭示有：具有由聚烯丙基胺的交联聚合物被覆的表面的多孔质吸附介质。
专利文献3中揭示有：使聚烯丙基胺与基础载体键结并利用进一步的官能基对所述聚烯丙基胺进行修饰而成的色谱仪介质，且作为进一步的官能基而使用阳离子交换基。
专利文献5中记载有：加成有配体的载体可适宜用于免疫球蛋白(immunoglobulin)的纯化，所述配体包含具有不同的相互作用的多种官能基。暗示有尤其在使用具有氨基与苯基的配体结构体的情况下，可利用pH值为7的流过(flow-through)馏分来回收免疫球蛋白。
专利文献6中记载有：使用作为疏水性阴离子交换载体而已知的斯帕洛希尔(Sperosil)QMA并以流过方式来分离存在于初乳或其血清中的免疫球蛋白的方法。另外，专利文献7中示出有：色素结合型色谱法载体以流过方式而将源自科恩馏分(cohn fraction)II的免疫球蛋白与其他杂质分离的事例。
专利文献8中揭示有：在流过模式(flow-through mode)下使用具有阴离子交换基与芳香族基的载体并对抗体进行纯化的方法。
非专利文献1中记载有：使聚亚乙基亚胺与作为基础载体的琼脂糖凝胶(Sepharose)FF树脂键结、并进而利用苯甲酰基对所述聚亚乙基亚胺进行修饰而成的色谱法载体在牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)的纯化中发挥优异的性能。
如此，提出有多种色谱法载体，但根据纯化对象物质来开发具有适合于所述物质的吸附力、细孔径、比表面积等吸附和/或分离特性的色谱法载体是无穷尽的课题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利特表平4-506030号公报
专利文献2：日本专利特开2009-53191号公报
专利文献3：日本专利特表2004-522479号公报
专利文献4：日本专利特开2016-6410号公报
专利文献5：日本专利特表2001-501595号公报
专利文献6：美国专利第4582580号说明书
专利文献7：澳大利亚专利申请公告第594054号说明书
专利文献8：日本专利第5064225号公报
非专利文献
非专利文献1：《色谱法期刊(Journal of Chromatography)A》，1372(2014)，157-165
发明内容
发明所要解决的问题
基于所述那样的背景，要求一种具有适合于纯化对象物质的吸附和/或分离特性的色谱法载体。
解决问题的技术手段
本发明人等人为了解决所述课题而进行了努力研究，结果发现，对包含多孔性粒子的基础载体加成多胺、其后利用疏水基对多胺中的氨基进行修饰而得的色谱法载体的蛋白质的吸附能力优异，可在蛋白质的分离纯化中使用(专利文献4)。此番，进一步进行研究，由此发现，对包含多孔性粒子的基础载体加成具有多个一级氨基的化合物、其后利用疏水基对所述一级氨基的一部分进行修饰而得的色谱法载体具有尤其适合于抗体的分离纯化的特性，从而完成了本发明。即，本发明例如为以下所述般。
[1]一种方法，其为抗体的纯化方法，包括使包含抗体及源自宿主的蛋白质(HCP)的溶液与色谱法载体接触而分离所述抗体与所述HCP，
所述色谱法载体包括包含多孔性粒子的基础载体、以及与所述基础载体键结的具有多个一级氨基的化合物，所述具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基的20％～55％由疏水基修饰，
所述抗体的回收率为85％以上，纯化后的抗体溶液中的所述HCP量小于45ppm。
[2]根据[1]所述的方法，其中所述方法是以流过模式进行。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中所述具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基的超过40％由所述疏水基修饰。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的方法，其中所述具有多个一级氨基的化合物是选自由聚烯丙基胺、聚乙烯基胺、壳聚糖、聚赖氨酸、聚胍、以及聚鸟氨酸所组成的群组中。
[5]根据[4]所述的方法，其中所述具有多个一级氨基的化合物为聚烯丙基胺。
[6]根据[5]所述的方法，其中所述聚烯丙基胺的重量平均分子量为5,000～15,000。
[7]根据[1]至[6]中任一项所述的方法，其中所述疏水基具有以下的通式(1)～通式(3)的任一者的结构，
[化1]
[式中，
n为0～8的整数，
R1在n为0～3的整数时为苯基，在n为4～8的整数时为H或苯基，
*为与所述具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基的键结部位]。
[8]根据[7]所述的方法，其中所述疏水基具有所述通式(1)的结构。
[9]根据[8]所述的方法，其中在所述通式(1)中，n为4～8的整数，R1为H。
[10]根据[8]所述的方法，其中在所述通式(1)中，n为0～8的整数，R1为苯基。
[10-1]根据[7]所述的方法，其中n为4～8的整数，R1为H，且所述具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基的超过40％～55％由所述疏水基修饰。
[11]根据[1]至[6]中任一项所述的方法，其中所述疏水基为源自选自由戊酸酐、己酸酐、庚酸酐、辛酸酐、壬酸酐、苯甲酸酐、丁基缩水甘油醚、以及苯基缩水甘油醚所组成的群组中的化合物的基。
[12]根据[11]所述的方法，其中所述疏水基为源自戊酸酐或苯甲酸酐的基。
[12-1]根据[8]所述的方法，其中具有多个由所述疏水基修饰的所述一级氨基的化合物包含以下的通式(a)所表示的重复单元与通式(b)所表示的重复单元，
[化2]
(式(b)中，n及R1如所述通式(1)中所定义般)。
[12-2]根据[12-1]所述的方法，其中具有多个由所述疏水基修饰的所述一级氨基的化合物包含：为亲水性基且具有静电性相互作用的氨基(通式(a)中的-NH2基)、具有静电性相互作用的酰胺基(通式(b)中的-NH-CO-基)、具有疏水性相互作用的疏水性基(通式(b)中的R基)。
[13]根据[1]至[12]中任一项所述的方法，其中所述包含抗体及HCP的溶液的导电率为22mS/cm以下。
[14]根据[1]至[13]中任一项所述的方法，其中所述包含抗体及HCP的溶液中进而包含多价阴离子。
[15]根据[14]所述的方法，其中所述多价阴离子为选自由柠檬酸根离子、磷酸根离子、以及硫酸根离子所组成的群组中的一种以上。
[16]根据[1]至[15]中任一项所述的方法，其中所述抗体为单克隆(monoclonal)抗体。
发明的效果
根据本发明的实施方式，提供一种自包含抗体及HCP等杂质的溶液分离抗体与杂质而以高的纯化度对抗体进行纯化的方法。
附图说明
图1是在参考例1中实施尺寸排除色谱法分析而得的色谱图。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。
根据本发明的一实施方式，提供一种方法，其为抗体的纯化方法，包括使包含抗体及HCP等杂质的溶液与色谱法载体接触而分离所述抗体与所述杂质，所述色谱法载体包括包含多孔性粒子的基础载体、以及与所述基础载体键结的具有多个一级氨基的化合物，所述具有多个一级氨基的化合物中的所述一级氨基的20％～55％由疏水基修饰。
实施方式的方法中使用的色谱法载体包含具有多个一级氨基的化合物作为配体，进而具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基的20％～55％由疏水基修饰。于在抗体的纯化中使用此种构成的色谱法载体的情况下，自包含抗体及HCP等杂质的溶液分离抗体与杂质的能力(尤其是HCP去除能力)高，可以高的纯化度及回收率获得纯化抗体。以前，在离子交换色谱法中，若作为纯化对象的包含抗体及杂质的溶液(以下，也称为“抗体溶液”)的导电率变高，则存在吸附能力及分离能力降低的课题。另外，尤其在抗体医药纯化中以流过模式利用的阴离子交换色谱法中，在因包含于培养基或缓冲液中而抗体溶液中存在柠檬酸根离子、磷酸根离子、硫酸根离子等多价阴离子的情况下，也存在相同的课题。但是，根据实施方式的方法，即便在抗体溶液的导电率比较高的情况和/或抗体溶液中存在多价阴离子的情况下，也可维持高的吸附能力及分离能力，也可以高的纯化度及回收率获得纯化抗体。
如此，无论抗体溶液的导电率如何，实施方式的方法均发挥优异的吸附能力及分离能力，因此可谓能够在广范围的抗体溶液的纯化中使用。另外，可将与抗体培养液具有同等导电率(约14mS/cm)的抗体溶液直接供于管柱中，无需进行以前进行的在纯化前对抗体溶液进行脱盐、稀释等来调整导电率的工序，因此可更简便地进行抗体的纯化。进而，也无需在纯化前自抗体溶液去除多价阴离子，因此，就所述方面而言，也可谓可更简便地进行抗体的纯化。
1.色谱法载体
以下，依次对实施方式中使用的色谱法载体的各构成要素进行说明。
(1)基础载体
色谱法载体通常具有配体键结于基础载体的构成。基础载体包含多孔性粒子，多孔性粒子由用于导入作为配体的具有多个一级氨基的化合物的官能基(例如，羟基、氨甲酰基等)修饰。只要可由此种官能基修饰，则使用的多孔性粒子并无限定，例如可优选地列举：琼脂糖(agarose)、葡聚糖(dextran)、淀粉、纤维素、支链淀粉(pullulan)、甲壳质(chitin)、壳聚糖(chitosan)、三乙酸纤维素、二乙酸纤维素等多糖类及其衍生物；聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚烷基乙烯基醚、聚乙烯基醇等有机聚合物等。就可确保机械强度的方面而言，多孔性粒子优选为形成交联结构。这些中，更优选为使用利用交联反应而增强纤维素粒子的骨架的交联纤维素粒子。
作为交联纤维素粒子，若可作为色谱法载体的基础载体使用，则并无特别限制。成为原料的纤维素可为结晶纤维素，也可为非结晶纤维素，就强度高的方面而言，优选为结晶纤维素。
作为可适宜使用的交联纤维素粒子，例如可列举日本专利特开2009-242770号公报中揭示的多孔性纤维素凝胶。日本专利特开2009-242770号公报中揭示的多孔性纤维素凝胶可通过包括如下工序的方法获得：对未交联纤维素粒子的悬浮液，在纤维素单体的摩尔数的6倍量～20倍量的选自由盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐及硼酸盐所组成的群组中的至少一种无机盐的存在下历时3小时以上连续滴加或分次添加纤维素单体的摩尔数的4倍量～12倍量的交联剂、与交联剂的摩尔数的0.1倍量～1.5倍量的碱。如此获得的交联纤维素粒子的机械强度高，且可在流速快的色谱法条件下使用，并可提供生产性高的阳离子交换色谱法载体。此处，所谓“纤维素单体”，是指作为纤维素的构成单元的葡萄糖单位(glucoseunit)。另外，纤维素单体的摩尔数(即，聚合度)是基于自葡萄糖1单位减去水分而得的量(即，纤维素的干燥重量)来进行计算(将分子量162设为1摩尔)。
多孔性粒子的形状并无特别限制，就可制作机械强度高、凝胶沉降性优异、且均匀的填充床的方面而言，优选为球状。所述情况下，多孔性粒子的真球度优选为0.8～1.0。此处，所谓“真球度”，是指多孔性粒子的短径/长径。
球状纤维素粒子例如可通过如下方式而容易地获得：使结晶纤维素或包含结晶区域与非结晶区域的纤维素溶解并再生。作为球状纤维素粒子的制造方法，例如可列举：日本专利特公昭55-39565号公报、日本专利特公昭55-40618号公报等中记载的经由乙酸酯的方法；日本专利特公昭63-62252号公报等中记载的由包含硫氰酸钙盐的溶液进行制造的方法；日本专利特开昭59-38203号公报等中记载的由包含对甲醛及二甲基亚砜的溶液进行制造的方法；日本专利第3663666号公报中记载的由将纤维素溶解于含有氯化锂的酰胺中而成的纤维素溶液进行制造的方法等。另外，球状的交联纤维素粒子可通过将球状纤维素粒子交联而获得。
多孔性粒子的粒子径优选为10μm～500μm，更优选为30μm～200μm，特别优选为50μm～150μm。另外，平均粒子径优选为30μm～1000μm，更优选为40μm～200μm，特别优选为50μm～100μm。此处，所谓“粒子径”，是指各多孔性粒子的粒子径的实测值，所谓“平均粒子径”，是指基于所述粒子径而算出的平均值。
在本说明书中，多孔性粒子的粒子径及平均粒子径例如可使用激光衍射/散射式粒子径分布测定装置来测定。所述装置中，对粒子群照射激光光并根据自此发出的衍射/散射光的强度分布图案求出粒度分布，基于粒度分布而算出粒子径及平均粒子径。作为具体的测定装置，可使用激光衍射/绕射式粒子径分布测定装置LA-950(堀场制作所股份有限公司制造)等。
或者，也可使用利用光学显微镜拍摄的图像来测定粒子径。具体而言，使用游标(vernier)等测量图像上的粒子径，并根据拍摄倍率求出原来的粒子径。而且，根据由光学显微镜图像求出的各粒子径的值并利用下述式子算出平均粒子径。
体积平均粒子径(MV)＝Σ(nd4)/Σ(nd3)
[式中，d表示由光学显微镜图像求出的各粒子的粒子径的值，n表示测定的粒子的个数。]
多孔性粒子的多孔性可凭借细孔尺寸特性而具有特征。作为表示细孔尺寸特性的指标之一，有凝胶分配系数Kav。细孔尺寸对粒子的物理强度或成为纯化对象的目标物质在多孔性粒子内的扩散性造成影响。因此，根据细孔尺寸而于在多孔性粒子中通过的液体的流速或多孔性粒子的动态吸附容量中产生差异。因此，需要设计变成与目标相应的细孔尺寸的那样的多孔性粒子。尤其，就动态吸附容量的观点而言，多孔性粒子的凝胶分配系数Kav在使用重量平均分子量1.5×105Da的标准聚环氧乙烷作为样品且使用纯水作为移动相的情况下，优选为0.15～0.6的范围，更优选为0.2～0.55，特别优选为0.3～0.5。
在实施方式的发明中，就吸附特性的观点而言，优选为使用具有可获得所述范围的凝胶分配系数的那样的细孔尺寸的多孔性粒子。在使用交联纤维素粒子作为多孔性粒子的情况下，其凝胶分配系数Kav例如可通过控制粒子形成时的纤维素的溶解浓度来调整。
凝胶分配系数Kav可根据使用具有特定分子量的标准物质(例如，聚环氧乙烷)作为样品时的保持容量与管柱体积的关系并利用下式来求出。
Kav＝(Ve-V0)/(Vt-V0)
[式中，Ve表示样品的保持容量(mL)，Vt表示空管柱体积(mL)，V0表示蓝色葡聚糖的保持容量(mL)。]
凝胶分配系数Kav的具体的测定方法例如在L.费舍尔(L.Fischer)编著的生物化学实验法2《凝胶色谱法》第1版(东京化学同人)等中有所记载。
(2)配体
实施方式的方法中使用的色谱法载体包含具有多个一级氨基的化合物作为配体，进而，具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基的20％～55％由疏水基修饰。此处，“具有多个一级氨基的化合物”以与所述基础载体键结的状态存在，因此，在本说明书中，用语“具有多个一级氨基的化合物”也可表示为“具有多个一级氨基的配体”。
(具有多个一级氨基的化合物)
首先，对具有多个一级氨基的化合物进行说明。
作为配体而使用的具有多个一级氨基的化合物若可与基础载体上的官能基键结，则并无特别限定。具体而言，可列举：聚烯丙基胺、聚乙烯基胺等多胺；壳聚糖等多糖类；聚赖氨酸、聚胍、聚鸟氨酸等聚氨基酸等。其中，优选为聚烯丙基胺及聚赖氨酸，更优选为聚烯丙基胺。
具有多个一级氨基的化合物的重量平均分子量可为300,000以下，优选为1,000～100,000，更优选为3,000～50,000，特别优选为5,000～15,000。在使用聚烯丙基胺的情况下，重量平均分子量可为150,000以下，优选为1,000～100,000，更优选为3,000～50,000，特别优选为5,000～15,000，最优选为10,000～15,000。
具有多个一级氨基的化合物对基础载体的加成方法并无特别限定，可利用公知的方法进行。例如，可通过如下方式进行：在规定条件下，对包含由具有多个一级氨基的化合物可键结的官能基(例如，羟基、氨甲酰基等)修饰的多孔性粒子、与具有多个一级氨基的化合物的溶液进行搅拌。
或者，也可在基础载体上使单体接枝聚合而加成具有多个一级氨基的化合物。所述情况下，作为单体，可使用包含一级氨基的化合物，也可使甲基丙烯酸缩水甘油酯那样的具有对胺为反应性的基的单体在基础载体上接枝聚合，其后与氨进行反应而加成具有多个一级氨基的化合物。
(疏水基)
作为疏水基，只要与具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基键结且具有疏水性，则并无特别限定，优选为疏水性色谱法载体中通常使用的疏水基。作为此种疏水基，可列举包含饱和烷基和/或苯基的基。饱和烷基优选为直链状的饱和烷基，更优选为碳数4～8的直链状饱和烷基，特别优选为正丁基。
作为优选的疏水基的结构，可列举以下的通式(1)～通式(3)的任一者的结构。
[化3]
[式(1)～式(3)中，
n为0～8的整数，
R1在n为0～3的整数时为苯基，在n为4～8的整数时为H或苯基，
*为与所述具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基的键结部位。]
换句话说，n在R1为苯基时为0～8的整数，在R1为H时为4～8的整数。
所述式(1)～式(3)所表示的结构中的碳原子也可具有碳数1～2的烷基或烷氧基等取代基、例如甲基、乙基、甲氧基及乙氧基等。
所述通式(1)～通式(3)的结构中，更优选为通式(1)的结构。作为进而适宜的结构，优选为通式(1)的结构中n为4。
疏水基对一级氨基的键结方式若为共价键结则并无特别限制。具体而言，例如可为通过酸酐、酸性氯化物、或活性酯与氨基的反应而形成的酰胺键、或者通过环氧化合物或卤化物与氨基的反应而形成的碳-氮键。
作为用于导入所述那样的疏水基的化合物，可列举：戊酸酐、己酸酐、庚酸酐、辛酸酐、壬酸酐、苯甲酸酐、丁基缩水甘油醚、苯基缩水甘油醚等。即，作为疏水基，合适的是源自这些化合物的基。通过使这些化合物与具有多个一级氨基的化合物反应，可使疏水基与具有多个一级氨基的化合物的一级氨基键结。所述化合物中，更优选为戊酸酐及苯甲酸酐。就与具有多个一级氨基的化合物的反应在温和的条件下效率良好地进行的方面而言，优选为酸酐。
利用疏水基对具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基进行修饰时的方法并无特别限定，可利用公知方法进行。例如，可通过如下方式进行：在规定条件下，对包含具有多个一级氨基的化合物与用于导入疏水基的化合物的溶液进行搅拌。
疏水基的结构可为以下的通式(4)或通式(5)的结构。
[化4]
[式(4)及式(5)中，
R1为杂环基，
*为与具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基的键结部位。]
R1的杂环基并无特别限定，优选为包含氮原子的杂环基，更优选为具有氮原子的芳香族杂环基。作为杂环基中的杂环，具体而言，可列举：吡啶、咪唑、苯并咪唑、吡唑、咪唑啉、吡嗪、吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹噁啉等，优选为吡啶、咪唑、及苯并咪唑。
杂环基中的碳原子也可具有取代基。作为取代基，可列举碳数1～4的烷基或烷氧基，优选为甲基、乙基、丙基、丁基、甲氧基、乙氧基、丙基氧基、以及丁氧基。
在将所述式(4)所表示的疏水基导入至具有多个一级氨基的化合物时，例如，使甲基丙烯酸基与具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基键结，进而使含有杂环的基与甲基丙烯酸基键结。甲基丙烯酸基可通过如下方式导入：使具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基、与甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酸的酸性氯化物、或由甲基丙烯酸衍生的活性酯化合物等进行反应。另外，含有杂环的基可通过如下方式导入：使含有杂环基的化合物和与一级氨基键结的甲基丙烯酸基进行反应。含有杂环基的化合物例如包含杂环基及硫醇基，所述情况下，硫醇基与甲基丙烯酸基反应。
在将所述式(5)所表示的疏水基加成于具有多个一级氨基的化合物时，例如，使烯丙基与具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基键结，进而使含有杂环的基与烯丙基键结。烯丙基可通过如下方式导入：使具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基、和兼具与一级氨基键结的官能基及烯丙基的化合物(例如，烯丙基缩水甘油醚)进行反应。另外，含有杂环的基可通过如下方式导入：使含有杂环基的化合物和与一级氨基键结的烯丙基进行反应。含有杂环基的化合物例如包含杂环基及硫醇基，所述情况下，硫醇基与烯丙基或由烯丙基衍生的官能基进行反应。
所述式(4)及式(5)所表示的疏水基的导入中使用的含有杂环基的化合物只要可导入杂环基，则并无特别限定，优选为包含杂环基及硫醇基的化合物。作为此种化合物，例如可列举：2-巯基乙基吡啶、2-巯基苯并咪唑、2-巯基-4-甲基咪唑、2-巯基-4,5-甲基咪唑等。
关于具有多个一级氨基的化合物，所述化合物中的一级氨基的20％～55％由疏水基修饰。所述氨基的修饰率为基于具有多个一级氨基的化合物中存在的一级氨基的总数的值，例如是指于在具有多个一级氨基的化合物中存在100个一级氨基的情况下，其中的20个～55个由疏水基修饰。氨基的修饰率更优选为25％～55％。或者，在本发明的一实施方式中，氨基的修饰率可为10％～75％。再者，在疏水基包含丁基等饱和烷基而不包含苯基的情况下，若氨基的修饰率为超过40％～55％、更优选为45％～55％、或50％～55％，则回收馏分中的HCP量少，可获得高纯度的纯化抗体。另外，在疏水基包含苯基的情况下，氨基的修饰率越变高，越确认到抗体回收率的降低，因此优选为将抗体回收率与纯度的平衡最优化。
在使具有多个一级氨基的化合物与用于导入疏水基的化合物进行反应时，通过调节用于导入疏水基的化合物的量而可以氨基的修饰率为所述范围的方式进行调节。氨基的修饰率可通过如下方式算出：在导入疏水基前后分别测定色谱法载体的离子交换容量并对所述值进行比较。
所述配体例如包含以下的通式(a)所表示的重复单元与通式(b)所表示的重复单元。
[化5]
式(b)中，n及R1如所述通式(1)中定义般。本实施方式中使用的配体优选为包含：为亲水性基且具有静电性相互作用的氨基(通式(a)中的-NH2基)、具有静电性相互作用的酰胺基(通式(b)中的-NH-CO-基)、具有疏水性相互作用的疏水性基(通式(b)中的-(CH2)n-R1基)，通过这些三种基相互作用而可获得特别优选的特性。
如上所述，无论抗体溶液的导电率如何，实施方式的方法均可使用，例如，关于具有22mS/cm左右(例如，14mS/cm～22mS/cm)的比较高的导电率的抗体溶液，也可以高效率进行纯化。因此，根据实施方式的方法，可自具有22mS/cm以下、优选为2mS/cm～22mS/cm、更优选为6mS/cm～22mS/cm的导电率的抗体溶液对抗体进行纯化。
另外，如上所述，实施方式的方法即便于在抗体溶液中存在多价阴离子的情况下也可使用。作为抗体溶液中可存在的多价阴离子，可列举柠檬酸根离子、磷酸根离子、硫酸根离子等，优选为选自由柠檬酸根离子、磷酸根离子及硫酸根离子所组成的群组中的一种以上。
2.抗体
作为纯化对象的抗体，可列举单克隆抗体或多克隆抗体，优选为单克隆抗体。作为抗体的种类，例如可列举小鼠(mouse)抗体、美洲驼(llama)抗体、嵌合抗体(chimericantibody)、人源化抗体、人类抗体或对这些的Fc区域等进行改变而成的抗体等，作为分子型，例如可列举：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、Fab、Fc、Fc-融合蛋白、VH、VL、VHH、Fab'2、scFv、scFab、scDb、scDbFc等。
另外，作为抗体，也包含使单克隆抗体或多克隆抗体的一部分积极地改性而成的单克隆抗体或多克隆抗体。作为单克隆抗体或多克隆抗体的改性方法，例如可列举：《药物科学期刊(Journal of PHARMACEUTICAL SCIENCES)》(2011、100、2104-2119)中记载的方法。
抗体可为单量体也可为聚合物，优选为单量体。所谓抗体单量体，为包含1分子的抗体的分子。所谓抗体聚合物，为2分子以上的抗体的单量体利用共价键结或非共价键结进行聚合而成的分子，例如可列举二聚体、三聚体、多聚体、凝聚体、凝聚块等。
作为抗体溶液中所含的杂质，除了源自宿主的蛋白质(HCP)以外，例如可列举：核酸、病毒、泄漏蛋白A(protein A leak)、抗体的分解物、及受到改性、糖链成分的去除、氧化、脱酰胺等的修饰抗体等可在培养过程或其他色谱法处理工序等中产生的成分。
作为抗体溶液，例如可列举：自血浆、血清、乳汁或尿等生物体获得组合物、使用基因转变技术或细胞融合技术而获得的抗体产生细胞、大肠菌等菌类的培养液、或自转基因(transgenic)非人类动物、植物或昆虫等获得的组合物等。
作为抗体产生细胞，例如可列举：在宿主细胞中组入有对所需的抗体进行编码的基因的转化(transformation)细胞等。作为宿主细胞，例如可列举：动物细胞、植物细胞、酵母细胞等细胞株。具体而言，例如可列举：中国仓鼠卵巢细胞(CHO(Chinese hamsterovary)细胞)、作为小鼠骨髓瘤(myeloma)细胞的NS0细胞、SP2/0细胞、作为大鼠(rat)骨髓瘤细胞的YB2/0细胞、IR983F细胞、作为源自叙利亚仓鼠(Syrian hamster)肾脏的细胞的BHK(BabyHamster Syrian Kidney(幼年叙利亚仓鼠肾细胞))细胞、作为人类骨髓瘤细胞的纳马瓦(Namalwa)细胞、胚胎干细胞、受精卵细胞等。
作为培养抗体产生细胞的培养基，若为适合于各种细胞的培养的培养基，则均可使用。例如可列举：含有血清的培养基、不含血清蛋白或血清分馏物等源自动物的成分的培养基、无血清培养基、无蛋白培养基等，优选为无血清培养基或无蛋白培养基。另外，视需要可添加抗体产生细胞的繁殖所需的生理活性物质、营养因子等。这些添加剂可在培养前预先含有于培养基中，或者在培养中作为添加培养基或添加溶液而适宜地追加供给至培养基中。添加剂可为一种也可为两种以上，另外，可连续地添加，也可间断地添加。
作为产生抗体的转基因非人类动物、植物或昆虫，可列举在细胞内组入有对蛋白质进行编码的基因的非人类动物、植物或昆虫。作为非人类动物，例如可列举：小鼠、大鼠、豚鼠(guinea pig)、仓鼠、兔子、狗、绵羊、猪、山羊、牛、猴等。作为植物，例如可列举：烟草、马铃薯、西红柿、胡萝卜、大豆(soybean)、油菜、苜蓿(alfalfa)、稻、小麦、大麦、玉米等。
另外，作为负载于色谱法载体的抗体溶液，除了所述那样的含有抗体的血浆、尿等自生物体获得的溶液以外，还包含在进行纯化的过程中获得的抗体溶液。具体而言，例如可列举：细胞去除液、沉淀物去除液、醇分馏液、盐析分馏液、色谱法溶出液等。进而，于在抗体溶液中存在粒子等不溶物的情况下，也可预先将这些不溶物去除，其后供于实施方式的纯化方法。作为粒子等不溶物的去除方法，例如可列举：离心分离法、横流(cross flow)过滤法(切向流(tangential flow)过滤法)、利用深层过滤器(depth filter)的过滤法、利用薄膜过滤器的过滤法、透析法、将这些方法组合而成的方法等。
另外，视需要，也可将抗体溶液的pH值、导电率、缓冲液、盐浓度、添加物、抗体浓度、色谱法载体的每单位体积的抗体负载量等预先调整为适宜的条件，之后供于实施方式的纯化方法。作为这些的调整方法，例如可列举使用超滤膜的超滤法。
3.纯化方法
实施方式的抗体的纯化方法包括：使包含抗体及HCP等杂质的溶液与所述色谱法载体接触而分离抗体与杂质。具体而言，在管柱中填充所述色谱法载体，并向其中流入抗体溶液，选择性地使抗体或杂质的其中任一者吸附于载体，由此可对抗体进行纯化。或者，使抗体与杂质一同吸附于载体，并阶段性或连续性地增加溶出时的盐浓度，由此也可利用对于色谱法载体的亲和性的差异来对抗体进行纯化。
实施方式的方法中使用的色谱法载体因吸附及分离抗体溶液中所含的HCP等杂质的能力高，因此优选为在实施方式的方法中采用流过模式。此处，所谓流过模式，是指使杂质与色谱法载体键结且目标物质不与色谱法载体键结而流动并被回收的纯化方法。例如，在目标物质为抗体且杂质为源自宿主的蛋白质(HCP)的情况下，HCP与色谱法载体键结，抗体不与色谱法载体键结而在管柱中流动。此时，抗体多少也会进行键结，但HCP进一步选择性地与色谱法载体键结，由此抗体得到纯化。
相对于此，键结-洗脱模式(bind and elute mode)是指使目标物质暂且与色谱法载体键结，其后，将目标物质溶出(洗脱)并加以回收的纯化方法。例如，在对抗体进行纯化的情况下，首先，使抗体与色谱法载体键结，杂质不与色谱法载体键结而在管柱中通过。继而，使用具有适当的盐浓度或pH值的移动相且仅使抗体溶出至移动相中，并进行回收。作为溶出方法，可列举：使抗体与色谱法载体的亲和性降低的那样的具有特定的盐浓度或pH值的缓冲液通过并进行溶出的一阶段溶出法、阶段性地使盐浓度或pH值发生变化而溶出抗体的逐步(stepwise)法、或连续地使盐浓度或pH值发生变化而溶出抗体的渐变(gradient)法。
在色谱法条件的设定中，利用抗体与杂质对于色谱法载体的亲和性的差异。例如，考虑载体结构(配体种类、配体密度、配体取向性、粒子径、细孔径、基础基质组成等)、或抗体及杂质的物理化学性质(等电点、电荷、疏水性度、分子尺寸、立体结构等)的差异来进行条件设定。
作为抗体溶液及管柱的清洗或溶出中使用的缓冲液中所含的成分，若具有缓冲能力，则并无特别限定，例如可列举：1mmol/L～300mmol/L的磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、硼酸盐、Tris(base)、HEPES、MES、PIPES、MOPS、TES、Tricine等。另外，所述盐例如也可与氯化钠、氯化钾、氯化钙、柠檬酸钠、硫酸钠、硫酸铵等其他盐组合来使用。进而，缓冲液中例如也可包含甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、组氨酸等氨基酸、葡萄糖、蔗糖、乳糖、唾液酸等糖、或这些的衍生物等。
作为抗体溶液及管柱的清洗或溶出中使用的缓冲液的pH值，优选为2～9的范围，更优选为3～8的范围。
作为抗体溶液及管柱的清洗或溶出中使用的缓冲液的线速度，优选为50cm/h～1000cm/h的范围。
作为色谱法载体的每单位体积的抗体负载量，优选为10g/L～500g/L，更优选为60g/L～200g/L。
实施方式的纯化方法也可与其他纯化方法组合来实施。作为其他纯化方法，若为适合于抗体的纯化的方法，则均可使用，例如可列举：色谱法、活性炭处理、醇分馏、沉淀物去除、盐析、缓冲液交换、浓缩、稀释、过滤、病毒灭活、病毒去除等。作为其他纯化方法，可选择一种或多种方法，可在实施方式的纯化方法之前进行，也可在其后进行。
另外，在单克隆抗体的制造领域中，通常在键结-洗脱模式中使用阳离子交换体，在流过模式中使用阴离子交换体，若使用本发明的色谱法载体，则也可适应于在流过模式中使用阳离子交换体的方法。
在其他纯化方法为色谱法的情况下，作为所使用的载体或膜，可列举：肝素(heparin)载体及蛋白A载体等亲和载体、阳离子交换载体、阳离子交换膜、阴离子交换载体、阴离子交换膜、凝胶过滤载体、疏水性相互作用载体、逆相载体、羟磷灰石载体、氟磷灰石载体、硫酸化纤维素载体、硫酸化琼脂糖载体、混合模式(多模式(multimodal))载体等。
根据实施方式的方法，可以85％以上、优选为90％以上的回收率对抗体进行纯化。此处，所谓回收率，是指抗体回收量相对于负载于色谱法载体的抗体量(即，纯化前的抗体溶液中的抗体量)的比例。另外，如上所述，实施方式的方法中使用的色谱法载体因吸附抗体溶液中的HCP等杂质的能力优异，因此可以高的纯化度获得抗体。具体而言，纯化后的抗体溶液(回收馏分)中所含的HCP量优选为小于50ppm(0ppm～小于50ppm)，更优选为35ppm以下(0ppm～35ppm)，进而优选为25ppm以下(0ppm～25ppm)，特别优选为10ppm以下(0ppm～10ppm)。再者，所述HCP量是根据式{纯化后的抗体溶液中的HCP量(ng)/纯化后的抗体溶液中的抗体量(mg)}而算出的值。
无论抗体溶液的导电率的高低如何，所述优选的HCP量均可达成，例如，即便在纯化前的抗体溶液的导电率为6mS/cm及14mS/cm任一者的情况下，纯化后的抗体溶液(回收馏分)中所含的HCP量也优选为小于45ppm(0ppm～小于45ppm)，更优选为35ppm以下(0ppm～35ppm)，进而优选为25ppm以下(0ppm～25ppm)，特别优选为10ppm以下(0ppm～10ppm)。尤其，通过在供于阳离子色谱法后对实施方式的纯化方法进行实施，即便为具有比较高的导电率的抗体溶液，也可以高的纯化度(即，低的HCP量)进行纯化。另外，根据本发明的优选方式，即便于在抗体溶液中存在多价阴离子的情况下，也可以所述那样的回收率及HCP量对抗体进行纯化。
实施例
1.色谱法载体的制造
(1)载体A(无疏水基)
〔6％球状纤维素粒子(含水)的制造〕
按照以下顺序来制造6％球状纤维素粒子。此处，于在以下的(i)工序中结晶性纤维素的浓度为6重量％的情况下，将所制造的纤维素粒子称为“6％球状纤维素粒子”。
(i)在100g的硫氰酸钙60重量％水溶液中添加6.4g的结晶性纤维素(旭化成化学股份有限公司制造，商品名：赛奥拉丝(Ceolus)PH101)并加热至110℃～120℃来进行溶解。
(ii)在所述溶液中添加作为表面活性剂的脱水山梨糖醇单油酸酯6g。将其滴加至预先加热至130℃～140℃的邻二氯苯480mL中，并以200rpm～300rpm进行搅拌，获得分散液。
(iii)继而，将所述分散液冷却至40℃以下。将其注入至甲醇190mL中，获得粒子的悬浮液。
(iv)对所获得的悬浮液进行过滤分离并回收粒子，利用甲醇190mL对所述粒子进行清洗。将所述清洗操作进行数次。
(v)进而以大量的水对粒子进行清洗，获得球状纤维素粒子。
(vi)继而，对所述球状纤维素粒子以JIS标准、筛规格53μm～125μm进行筛选，获得具有所需的粒子径(粒子径：50μm～150μm，平均粒子径：约100μm)的6％球状纤维素粒子(含水，纤维素溶解浓度：6重量％)。
再者，此处的平均粒子径是使用利用光学显微镜拍摄的图像来进行测定。具体而言，使用游标测量图像上的粒子径，并根据拍摄倍率求出原来的粒子径。而且，根据由光学显微镜图像求出的各粒子径的值并利用下述式子算出平均粒子径。
体积平均粒子径(MV)＝Σ(nd4)/Σ(nd3)
[式中，d表示由光学显微镜图像求出的各粒子的粒子径的值，n表示测定的粒子的个数。]
〔交联6％纤维素粒子的制造〕
使所述制造的6％球状纤维素粒子进行交联反应来制造交联6％纤维素粒子。其顺序为以下所述般。
(i)在所述获得的6％球状纤维素粒子(含水)100g中添加121g的纯水，一边进行搅拌一边加温。在到达30℃时，添加45重量％的NaOH水溶液3.3g及NaBH 40.5g，进而进行加温及搅拌。此处的初期碱浓度为0.69％(w/w)。
(ii)30分钟后，将60g的Na2SO4添加至反应液中并使其溶解。自混合物的温度到达50℃的时间点起，一边将温度维持为50℃，一边进而继续搅拌2小时。
(iii)在50℃下一边继续搅拌混合物，一边以15分钟为间隔历时约6小时添加对45重量％的NaOH水溶液48g、与表氯醇50g分别进行25等分的量。
(iv)添加结束后，使所述混合物在温度50℃下反应16小时。
(v)将反应混合物冷却至40℃以下的温度后，添加乙酸2.6g进行中和。
(vi)对反应混合物进行过滤并回收纤维素粒子，利用纯水对纤维素粒子进行过滤清洗而获得交联6％纤维素粒子。
如以下般测定所获得的交联6％纤维素粒子的平均粒子径及Kav值。
(平均粒子径的测定)
使用激光衍射/绕射式的粒子径分布测定装置LA-950(堀场制作所股份有限公司制造)测定平均粒子径，结果为85μm。
(Kav值的测定)
凝胶分配系数Kav是使用重量平均分子量1.5×105Da的标准聚环氧乙烷作为样品、并根据其保持容量与管柱体积的关系且利用下式来算出。再者，作为移动相而使用纯水。
Kav＝(Ve-V0)/(Vt-V0)
[式中，Ve表示样品的保持容量(mL)，Vt表示空管柱体积(mL)，V0表示蓝色葡聚糖的保持容量(mL)。]
所述获得的交联6％纤维素粒子的凝胶分配系数Kav为0.38。
〔交联6％纤维素粒子的环氧化〕
将所述获得的湿润纤维素粒子3000g与纯水1952g添加至10L的不锈钢(SteelUseStainless，SUS)容器中，制成浆料。其次，添加1764g的表氯醇。升温至28度后，以液温不会超过30度的方式历时2小时滴加48.7％氢氧化钠水溶液1655g。滴加结束后，进而在30度下搅拌3小时。其次，添加145g的乙酸，并搅拌10分钟。在反应结束后，过滤并回收湿润粒子，利用6L的纯水对所回收的湿润粒子清洗16次，获得目标环氧化纤维素粒子。
〔聚烯丙基胺加成〕
在10L的SUS容器中放入所述获得的环氧化纤维素粒子3000g与重量平均分子量15000的聚烯丙基胺15.3％水溶液PA-15C(日东宝医疗(Nittobo medical)股份有限公司)4995g，在45℃下搅拌18小时。反应结束后，对湿润粒子进行过滤，利用6L的纯水对所回收的湿润粒子进行10次清洗，获得目标聚烯丙基胺加成纤维素粒子(载体A)。所述聚烯丙基胺加成纤维素粒子的离子交换容量为0.23mmol/mL。离子交换容量的测定方法如后述般。
(2)载体B(疏水基加成；戊酸酐；氨基修饰率26％)
利用90mL的甲醇对所述获得的载体A 30g进行5次清洗。将经甲醇清洗的粒子与甲醇50mL添加至150mL容器中，制成浆料。其后，添加戊酸酐0.57g与三乙基胺0.31g，并在25℃下搅拌24小时。反应结束后，对湿润粒子进行过滤，并对所回收的湿润粒子以45mL的甲醇清洗1次、以45mL的0.1M氢氧化钠水溶液清洗1次、以45mL的纯水清洗10次，从而获得目标物。所获得的粒子的离子交换容量为0.17mmol/mL。
(3)载体C(疏水基加成；戊酸酐；氨基修饰率52％)
将戊酸酐的量变更为1.12g且将三乙基胺的量变更为0.61g，除此以外，利用与载体B相同的方法制造载体C。所获得的粒子的离子交换容量为0.11mmol/mL。
(4)载体D(疏水基加成；苯甲酸酐；氨基修饰率26％)
代替戊酸酐而使用苯甲酸酐0.57g，除此以外，利用与载体B相同的方法制造载体D。所获得的粒子的离子交换容量为0.17mmol/mL。
(5)载体E(疏水基加成；苯甲酸酐；氨基修饰率52％)
代替戊酸酐而使用苯甲酸酐1.36g且将三乙基胺的量变更为0.60g，除此以外，利用与载体B相同的方法制造载体E。所获得的粒子的离子交换容量为0.11mmol/mL。
2.抗体溶液的制备
(1)抗体溶液a
〔利用蛋白A管柱的纯化〕
(i)使用树脂、设备
蛋白A树脂：钟化康卡普(KANEKA KanCap)A(钟化(KANEKA)股份有限公司)
管柱：内径2.6cm、高度40cm
系统：阿卡塔艾帆(Akta avant)25
(ii)纯化中使用的培养液及溶液
培养液：产生单克隆抗体(IgG1)的CHO细胞培养液(已去除细胞)
A1缓冲液(buffer)：20mM磷酸钠缓冲液(pH值7.4)+0.15M NaCl
A2缓冲液：20mM磷酸钠缓冲液(pH值7.4)
B1缓冲液：60mM柠檬酸钠缓冲液(pH值3.5)
0.1M氢氧化钠水溶液
(iii)顺序
将蛋白A树脂在管柱中填充至10cm的高度。将管柱连接至系统，并使2管柱体积份的A1缓冲液以13.25mL/分钟在管柱中通过，并加以平衡化。在以后的工序中，也以流速均为13.25mL/分钟来实施。其次，使培养液1400mL在管柱中通过。利用3管柱体积份的A1缓冲液对未吸附的培养液进行清洗后，进而使2管柱体积份的A2缓冲液通过。其次，使4.8管柱体积份的B1缓冲液通过，从而使吸附于蛋白A树脂的单克隆抗体溶出。以测定波长280nm测定吸光度，由此对抗体的回收进行确认，且回收4.8管柱体积份中的约2管柱体积份作为回收馏分。在溶出后的管柱中，使2管柱体积份的A1缓冲液与3管柱体积份的0.1M氢氧化钠水溶液通过并进行清洗。最后，使5管柱体积份的A1缓冲液通过并再次加以平衡化。
〔回收馏分的病毒灭活处理〕
对所述获得的回收馏分添加0.1M的柠檬酸直至pH值为3.4为止。在25℃下静置1小时后，添加1M三羟基氨基甲烷水溶液直至pH值为7.0为止。因确认到浑浊而使用1.2μm及0.45μm的孔径的过滤器进行过滤。滤液中的单克隆抗体的浓度为16.37mg/mL，HCP量为184ppm。
〔溶液制备〕
利用超纯水对所述获得的滤液的一部分进行稀释。其后，使用1M三羟基氨基甲烷水溶液及5M氯化钠水溶液调整为pH值7.0、导电率6mS/cm，获得抗体溶液a。抗体溶液a中的单克隆抗体的浓度为10.42mg/mL。
(2)抗体溶液b
在溶液制备的工序中，将导电率调整为14mS/cm，除此以外，利用与抗体溶液a相同的方法制备抗体溶液b。抗体溶液b中的单克隆抗体的浓度为10.63mg/mL。
(3)抗体溶液c
〔利用蛋白A管柱的纯化〕
(i)使用树脂、设备
与抗体溶液a相同
(ii)纯化中使用的培养液及溶液
培养液：产生单克隆抗体(IgG1)的CHO细胞培养液(已去除细胞)
A1缓冲液：20mM磷酸钠缓冲液(pH值7.4)+0.15M NaCl
A2缓冲液：20mM磷酸钠缓冲液(pH值7.4)
B2缓冲液：60mM乙酸钠缓冲液(pH值3.5)
0.1M氢氧化钠水溶液
(iii)顺序
代替B1缓冲液而使用B2缓冲液，除此以外，进行与抗体溶液a相同的处理。
〔回收馏分的病毒灭活处理〕
对所述获得的回收馏分添加1M的盐酸直至pH值为3.4为止。在25℃下静置1小时后，添加1M氢氧化钠水溶液直至pH值为5.0为止。因确认到浑浊而使用1.2μm及0.45μm、0.2μm的孔径的过滤器进行过滤。滤液中的单克隆抗体的浓度为18.17mg/ml，HCP量为72ppm。
〔溶液调整〕
利用超纯水对所述获得的滤液的一部分进行稀释。其后，使用1M三羟基氨基甲烷水溶液及5M氯化钠水溶液调整为pH值7.0、导电率6mS/cm，获得抗体溶液c。抗体溶液c中的单克隆抗体的浓度为10.79mg/mL。
(4)抗体溶液d
在溶液制备的工序中，将导电率调整为14mS/cm，除此以外，利用与抗体溶液c相同的方法制备抗体溶液d。抗体溶液d中的单克隆抗体的浓度为10.48mg/mL。
(5)抗体溶液e
〔利用蛋白A管柱的纯化〕
(i)使用树脂、设备
与抗体溶液a相同
(ii)纯化中使用的培养液及溶液
培养液：产生单克隆抗体(IgG1)的CHO细胞培养液(已去除细胞)
A3缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH值7.4)+0.15M NaCl
A4缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH值7.4)
B2缓冲液：60mM乙酸钠缓冲液(pH值3.5)
0.1M氢氧化钠水溶液
(iii)顺序
将蛋白A树脂在管柱中填充至10cm的高度。将管柱连接至系统，并使2管柱体积份的A3缓冲液以13.25mL/分钟在管柱中通过，并加以平衡化。在以后的工序中，也以流速均为13.25mL/分钟来实施。其次，使培养液1500mL在管柱中通过。利用3管柱体积份的A3缓冲液对未吸附的培养液进行清洗后，进而使2管柱体积份的A4缓冲液通过。其次，使4.8管柱体积份的B2缓冲液通过，从而使吸附于蛋白A树脂的单克隆抗体溶出。以测定波长280nm测定吸光度，由此对抗体的回收进行确认，且回收4.8管柱体积份中的约2管柱体积份作为回收馏分。在溶出后的管柱中，使2管柱体积份的A3缓冲液与3管柱体积份的0.1M氢氧化钠水溶液通过并进行清洗。最后，使5管柱体积份的A3缓冲液通过并再次加以平衡化。
〔回收馏分的病毒灭活处理〕
对所述获得的回收馏分添加1M的盐酸直至pH值为3.4为止。在25℃下静置1小时后，添加1M氢氧化钠水溶液直至pH值为5.0为止。因确认到浑浊而使用1.2μm、0.45μm及0.2μm的孔径的过滤器进行过滤。滤液中的单克隆抗体的浓度为16.5mg/ml，HCP量为955ppm。
〔溶液调整〕
使用1M三羟基氨基甲烷水溶液及5M氯化钠水溶液将所述获得的滤液的一部分调整为pH值7.0、导电率22mS/cm，获得抗体溶液e。抗体溶液e中的单克隆抗体的浓度为14.00mg/mL。
(6)抗体溶液f
将试剂即源自人血清的γ球蛋白(和光纯药)溶解于20mM磷酸钠缓冲液(pH值6.5)而获得抗体溶液f。抗体溶液f的浓度为9.43mg/ml。利用尺寸排除色谱法测定的单量体的纯度为84.5％。
(7)抗体溶液g
〔利用蛋白A管柱的纯化〕
(i)使用树脂、设备
与抗体溶液a相同
(ii)纯化中使用的培养液及溶液
培养液：产生单克隆抗体(IgG1)的CHO细胞培养液(已去除细胞)
A3缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH值7.4)+0.15M NaCl
A4缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH值7.4)
B2缓冲液：60mM乙酸钠缓冲液(pH值3.5)
0.10M氢氧化钠水溶液
(iii)顺序
将蛋白A树脂在管柱中填充至10cm的高度。将管柱连接至系统，并使2管柱体积份的A3缓冲液以13.25mL/分钟在管柱中通过，并加以平衡化。在以后的工序中，也以流速均为13.25mL/分钟来实施。其次，使培养液800mL在管柱中通过。利用3管柱体积份的A3缓冲液对未吸附的培养液进行清洗后，进而使2管柱体积份的A4缓冲液通过。其次，使4.8管柱体积份的B2缓冲液通过，从而使吸附于蛋白A树脂上的单克隆抗体溶出。以测定波长280nm测定吸光度，由此对抗体的回收进行确认，且回收4.8管柱体积份中的约2管柱体积份作为回收馏分。在溶出后的管柱中，使2管柱体积份的A3缓冲液与3管柱体积份的0.10M氢氧化钠水溶液通过并进行清洗。最后，使5管柱体积份的A3缓冲液通过并再次加以平衡化。
〔回收馏分的病毒灭活处理〕
对所述获得的回收馏分添加1M的盐酸直至pH值为3.4为止。在25℃下静置1小时后，添加1M氢氧化钠水溶液直至pH值为5.0为止。因确认到浑浊而使用过滤器进行过滤。滤液中的单克隆抗体的浓度为13.10mg/ml，HCP量为480ppm。
〔溶液调整〕
使用5M氯化钠水溶液将所述获得的滤液的一部分调整为导电率22mS/cm，获得抗体溶液g。抗体溶液g中的单克隆抗体的浓度为12.9mg/mL。
(8)抗体溶液h
〔阳离子交换色谱法工序〕
(i)色谱法载体、设备
载体：赛璐玢(Cellufine)MAX GS
管柱：内径0.5cm、高度2.5cm
系统：阿卡塔艾帆(Akta avant)25
(ii)纯化中使用的抗体溶液及溶液
抗体溶液：抗体溶液g
A6缓冲液：20mM乙酸酯-Na缓冲液+NaCl(pH值5.0，22mS/cm)
1M NaCl水溶液
1M氢氧化钠水溶液
(iii)顺序
将载体在管柱中填充至2.5cm的高度。将管柱连接至系统，并使5管柱体积份的A6缓冲液以0.245mL/分钟在管柱中通过，并加以平衡化。其次，使抗体溶液16mL以0.245mL/分钟在管柱中通过。继而，使10管柱体积份的A6缓冲液以0.245mL/分钟通过并进行清洗。其后，使10管柱体积份的1M NaCl水溶液以0.245mL/分钟通过。其次，使5管柱体积份的1.0M氢氧化钠水溶液以0.245mL/分钟通过并进行清洗。最后，使10管柱体积份的A6缓冲液以1.0mL/分钟通过并再次加以平衡化。
将抗体溶液通过时的管柱通过液16mL总量与未吸附物清洗时的管柱清洗液2.5mL份一并作为回收馏分。单克隆抗体的回收率(抗体回收量相对于负载于色谱法载体的抗体量的比例)为96％，回收馏分中的HCP量为253ppm。
〔溶液调整〕
使用1M三羟基氨基甲烷水溶液及5M氯化钠水溶液将所述获得的回收馏分的一部分调整为pH值7.0、导电率22mS/cm，获得抗体溶液h。抗体溶液h中的单克隆抗体的浓度为9.41mg/mL。
3.抗体的纯化
＜实施例1＞
(i)色谱法载体、设备
载体：载体B
管柱：内径0.5cm、高度3cm
系统：阿卡塔艾帆(Akta avant)25
(ii)纯化中使用的抗体溶液及溶液
抗体溶液：抗体溶液a
A3缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH值7.0)+NaCl(6mS/cm)
B2缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH值7.0)+1M NaCl
0.5M氢氧化钠水溶液
(iii)顺序
将载体在管柱中填充至1.5cm的高度。将管柱连接至系统，并使10管柱体积份的A3缓冲液以0.3mL/分钟在管柱中通过，并加以平衡化。其次，使抗体溶液5.4mL以0.075mL/分钟在管柱中通过。继而，使10管柱体积份的A3缓冲液以0.075mL/分钟通过并进行清洗。其后，使10管柱体积份的B2缓冲液以0.3mL/分钟通过。其次，使5管柱体积份的0.5M氢氧化钠水溶液以0.075mL/分钟通过并进行清洗。最后，使20管柱体积份的A3缓冲液以0.3mL/分钟通过并再次加以平衡化。
将抗体溶液通过时的管柱通过液5.4mL总量与未吸附物清洗时的管柱清洗液1.8mL一并作为回收馏分。单克隆抗体的回收率(抗体回收量相对于负载于色谱法载体的抗体量的比例)为96％，回收馏分中的HCP量为22ppm。
＜实施例2＞
使用载体C作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例1相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为95％，回收馏分中的HCP量为23ppm。
＜实施例3＞
使用载体D作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例1相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为95％，回收馏分中的HCP量为22ppm。
＜实施例4＞
使用载体E作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例1相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为90％，回收馏分中的HCP量为21ppm。
＜比较例1＞
使用赛璐玢(Cellufine)MAX Q-h(JNC股份有限公司制造)作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例1相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为98％，回收馏分中的HCP量为114ppm。
＜比较例2＞
使用开普特(Capto)Q(通用电气医疗(GE Healthcare)制造)作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例1相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为97％，回收馏分中的HCP量为133ppm。
＜比较例3＞
使用载体A作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例1相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为97％，回收馏分中的HCP量为145ppm。
＜实施例5＞
(i)色谱法载体、设备
载体：载体B
管柱：内径0.5cm、高度3cm
系统：阿卡塔艾帆(Akta avant)25
(ii)纯化中使用的抗体溶液及溶液
抗体溶液：抗体溶液b
A4缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH值7.0)+NaCl(14mS/cm)
B2缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH值7.0)+1M NaCl
0.5M氢氧化钠水溶液
(iii)顺序
将载体在管柱中填充至1.5cm的高度。将管柱连接至系统，并使10管柱体积份的A4缓冲液以0.3mL/分钟在管柱中通过，并加以平衡化。其次，使抗体溶液5.4mL以0.075mL/分钟在管柱中通过。继而，使10管柱体积份的A4缓冲液以0.075mL/分钟通过并进行清洗。其后，使10管柱体积份的B2缓冲液以0.3mL/分钟通过。其次，使5管柱体积份的0.5M氢氧化钠水溶液以0.075mL/分钟通过并进行清洗。最后，使20管柱体积份的A4缓冲液以0.3mL/分钟通过并再次加以平衡化。
将抗体溶液通过时的管柱通过液5.4mL总量与未吸附物清洗时的管柱清洗液1.8mL一并作为回收馏分。单克隆抗体的回收率为97％，回收馏分中的HCP量为35ppm。
＜实施例6＞
使用载体C作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例5相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为96％，回收馏分中的HCP量为22ppm。
＜实施例7＞
使用载体D作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例5相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为95％，回收馏分中的HCP量为42ppm。
＜实施例8＞
使用载体E作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例5相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为91％，回收馏分中的HCP量为19ppm。
＜比较例4＞
使用赛璐玢(Cellufine)MAX Q-h(JNC股份有限公司制造)作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例5相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为97％，回收馏分中的HCP量为147ppm。
＜比较例5＞
使用载体A作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例5相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为99％，回收馏分中的HCP量为145ppm。
＜实施例9＞
(i)色谱法载体、设备
载体：载体C
管柱：内径0.5cm、高度3cm
系统：阿卡塔艾帆(Akta avant)25
(ii)纯化中使用的抗体溶液及溶液
抗体溶液：抗体溶液c
A3缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH值7.0)+NaCl(6mS/cm)
B2缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH值7.0)+1M NaCl
0.5M氢氧化钠水溶液
(iii)顺序
将载体在管柱中填充至1.5cm的高度。将管柱连接至系统，并使10管柱体积份的A3缓冲液以0.3mL/分钟在管柱中通过，并加以平衡化。其次，使抗体溶液5.4mL以0.075mL/分钟在管柱中通过。继而，使10管柱体积份的A3缓冲液以0.075mL/分钟通过并进行清洗。其后，使10管柱体积份的B2缓冲液以0.3mL/分钟通过。其次，使5管柱体积份的0.5M氢氧化钠水溶液以0.075mL/分钟通过并进行清洗。最后，使20管柱体积份的A3缓冲液以0.3mL/分钟通过并再次加以平衡化。
将抗体溶液通过时的管柱通过液5.4mL总量与未吸附物清洗时的管柱清洗液1.8mL一并作为回收馏分。单克隆抗体的回收率为95％，回收馏分中的HCP量为3ppm。
＜比较例6＞
使用赛璐玢(Cellufine)MAX Q-h(JNC股份有限公司制造)作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例9相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为97％，回收馏分中的HCP量为22ppm。
＜比较例7＞
使用开普特(Capto)Q(通用电气医疗(GE Healthcare)制造)作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例9相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为96％，回收馏分中的HCP量为27ppm。
＜实施例10＞
(i)色谱法载体、设备
载体：载体B
管柱：内径0.5cm、高度3cm
系统：阿卡塔艾帆(Akta avant)25
(ii)纯化中使用的抗体溶液及溶液
抗体溶液：抗体溶液d
A4缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH值7.0)+NaCl(14mS/cm)
B2缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH值7.0)+1M NaCl
0.5M氢氧化钠水溶液
(iii)顺序
将载体在管柱中填充至1.5cm的高度。将管柱连接至系统，并使10管柱体积份的A4缓冲液以0.3mL/分钟在管柱中通过，并加以平衡化。其次，使抗体溶液5.4mL以0.075mL/分钟在管柱中通过。继而，使10管柱体积份的A4缓冲液以0.075mL/分钟通过并进行清洗。其后，使10管柱体积份的B2缓冲液以0.3mL/分钟通过。其次，使5管柱体积份的0.5M氢氧化钠水溶液以0.075mL/分钟通过并进行清洗。最后，使20管柱体积份的A4缓冲液以0.3mL/分钟通过并再次加以平衡化。
将抗体溶液通过时的管柱通过液5.4mL总量与未吸附液清洗时的管柱清洗液1.8mL一并作为回收馏分。单克隆抗体的回收率为96％，HCP量为8ppm。
＜实施例11＞
使用载体C作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例10相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为94％，回收馏分中的HCP量为5ppm。
＜比较例8＞
使用赛璐玢(Cellufine)MAX Q-h(JNC股份有限公司制造)作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例10相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为101％，回收馏分中的HCP量为50ppm。
＜比较例9＞
使用开普特(Capto)Q(通用电气医疗(GE Healthcare)制造)作为色谱法载体，除此以外，利用与实施例10相同的方法实施抗体的纯化。单克隆抗体的回收率为100％，回收馏分中的HCP量为52ppm。
＜实施例12＞
(i)色谱法载体、设备
载体：载体C
管柱：内径0.5cm、高度2.5cm
系统：阿卡塔艾帆(Akta avant)25
(ii)纯化中使用的抗体溶液及溶液
抗体溶液：抗体溶液e
A5缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液(pH值7.5)
1M NaCl水溶液
0.5M氢氧化钠水溶液
(iii)顺序
将载体在管柱中填充至5.0cm的高度。将管柱连接至系统，并使10管柱体积份的A5缓冲液以0.49mL/分钟在管柱中通过，并加以平衡化。其次，使抗体溶液5.5mL以0.25mL/分钟在管柱中通过。继而，使10管柱体积份的A5缓冲液以0.49mL/分钟通过并进行清洗。其后，使10管柱体积份的1M NaCl水溶液以1.0mL/分钟通过。其次，使5管柱体积份的0.5M氢氧化钠水溶液以0.075mL/分钟通过并进行清洗。最后，使15管柱体积份的A5缓冲液以1.0mL/分钟通过并再次加以平衡化。
将抗体溶液通过时的管柱通过液5.5mL总量与未吸附物清洗时的管柱清洗液2.5mL份一并作为回收馏分。单克隆抗体的回收率(抗体回收量相对于负载于色谱法载体的抗体量的比例)为96％，回收馏分中的HCP量为16ppm。
＜实施例13＞
(i)色谱法载体、设备
载体：载体C
管柱：内径0.5cm、高度2.5cm
系统：阿卡塔艾帆(Akta avant)25
(ii)纯化中使用的抗体溶液及溶液
抗体溶液：抗体溶液h
A7缓冲液：20mM Tris-HCl缓冲液+NaCl(pH值7.0，22mS/cm)
1M NaCl水溶液
1M氢氧化钠水溶液
(iii)顺序
将载体在管柱中填充至5.0cm的高度。将管柱连接至系统，并使10管柱体积份的A7缓冲液以0.245mL/分钟在管柱中通过，并加以平衡化。其次，使抗体溶液17mL以0.245mL/分钟在管柱中通过。继而，使10管柱体积份的A7缓冲液以0.245mL/分钟通过并进行清洗。其后，使5管柱体积份的1M NaCl水溶液以0.245mL/分钟通过。其次，使5管柱体积份的1M氢氧化钠水溶液以0.245mL/分钟通过并进行清洗。最后，使10管柱体积份的A7缓冲液以0.245mL/分钟通过并再次加以平衡化。
将抗体溶液通过时的管柱通过液17mL总量与未吸附物清洗时的管柱清洗液4.9mL份一并作为回收馏分。单克隆抗体的回收率(抗体回收量相对于负载于色谱法载体的抗体量的比例)为93％，回收馏分中的HCP量为2ppm。
＜参考例1＞
(i)色谱法载体、设备
载体：载体C
管柱：内径0.5cm、高度5.0cm
系统：阿卡塔艾帆(Akta avant)25
(ii)纯化中使用的抗体溶液及溶液
抗体溶液：抗体溶液f
A6缓冲液：20mM磷酸钠缓冲液(pH值6.5)
1M NaCl水溶液
0.5M氢氧化钠水溶液
(iii)顺序
将载体在管柱中填充至5.0cm的高度。将管柱连接至系统，并使10管柱体积份的A6缓冲液以1.0mL/分钟在管柱中通过，并加以平衡化。其次，使抗体溶液20mL以0.25mL/分钟在管柱中通过。继而，使5管柱体积份的A6缓冲液以0.25mL/分钟通过并进行清洗。其后，使5管柱体积份的1M NaCl水溶液以1.0mL/分钟通过。其次，使5管柱体积份的0.5M氢氧化钠水溶液以0.25mL/分钟通过并进行清洗。最后，使20管柱体积份的A6缓冲液以1.0mL/分钟通过并再次加以平衡化。
将抗体溶液通过时的管柱通过液20mL总量与未吸附物清洗时的管柱清洗液4.9mL一并作为回收馏分。抗体的回收率(抗体回收量相对于负载于色谱法载体的抗体量的比例)为87％，回收馏分中的单量体的纯度为89.8％。
4.分析方法
(1)离子交换容量
将1mL的色谱法载体(以湿润凝胶的状态填满管柱时构成容积1mL的量的色谱法载体)添加至50mL锥形烧瓶中。向其中添加0.01mol/L的盐酸水溶液50mL并轻轻地振荡。在室温下静置1小时后，利用全量吸移管(whole pipette)将上清液10mL量取至50mL烧杯中。向其中添加酚酞溶液，并利用0.01mol/L的氢氧化钠水溶液进行滴定。根据滴定量计算盐酸的吸附量，并求出每1mL色谱法载体的离子交换容量。
(2)氨基修饰率
对于利用疏水基对与基础载体键结的具有多个一级氨基的化合物的氨基进行修饰之前及之后(以下，也称为“由疏水基修饰前”及“由疏水基修饰后”)的色谱法载体，分别利用所述方法测定离子交换容量。使用测定的离子交换容量的值，并利用下式计算具有多个一级氨基的化合物中的氨基的修饰率。
[数式1]
(3)单克隆抗体的回收率(％)
对于实施例1～实施例12及比较例1～比较例9中使用的纯化前的抗体溶液及所获得的回收馏分(纯化后的抗体溶液)，分别利用分光光度计来对测定波长280nm下的吸光度进行测定。使用吸光系数E1％1.40将测定值换算为抗体量，并根据式(回收馏分中的抗体量/纯化前的抗体溶液中的抗体量)×100来计算回收率(％)。
(4)HCP量
使用酶联免疫试剂盒(Elisa kit)(西格纳斯(Cygnus)，F550)测定抗体溶液制备工序中的回收馏分中的HCP量、以及实施例及比较例中所获得的回收馏分中的HCP量。使用所获得的HCP量及根据测定波长280nm下的吸光度算出的单克隆抗体量并根据式{回收馏分中的HCP量(ng)/回收馏分中的单克隆抗体量(mg)}以浓度(ppm)来表示HCP量。
(5)多克隆抗体的回收率(％)
对于参考例1中使用的纯化前的抗体溶液(抗体溶液f)及所获得的回收馏分(纯化后的抗体溶液)，分别利用分光光度计来对测定波长280nm下的吸光度进行测定。使用吸光系数E1％1.35将测定值换算为抗体量，并根据式(回收馏分中的抗体量/纯化前的抗体溶液中的抗体量)×100来计算回收率(％)。
(6)尺寸排除色谱法分析法
管柱：TSK gel SuperSW mAb HR(东曹(Tosoh))
系统：英菲尼蒂(Infinity)1200(安捷伦(Agilent))
移动相：0.2M磷酸钠缓冲液+0.1M硫酸钠(pH值6.7)
流速：0.7ml/分钟
注射量：50μL
对参考例1中使用的抗体溶液(抗体溶液f)及回收馏分以移动相进行10倍稀释并实施尺寸排除色谱法分析。将所获得的色谱图示于图1中。根据所获得的色谱图分别求出单量体与凝聚体的峰值面积，并使用以下的计算式来计算单量体纯度。
单量体纯度(％)＝((单量体的峰值面积/(单量体的峰值面积+凝聚体的峰值面积))×100
将所述实施例及比较例中所获得的结果汇总于表1中。
[表1]
根据表1，得知使用实施方式的纯化方法的实施例1～实施例13中，获得高的抗体回收率，且回收馏分中的杂质(HCP)的量少。另外，无论抗体溶液的导电率的高低如何，实施例1～实施例13中均可达成高的抗体回收率及低的HCP量。进而，即便在使用存在作为多价阴离子的柠檬酸根离子的抗体溶液a及抗体溶液b的情况下(实施例1～实施例8)，也可达成高的抗体回收率及低的杂质量。
另一方面，根据使用其他载体的比较例，存在回收馏分中会包含大量HCP的倾向，另外，HCP量由抗体溶液的导电率及抗体溶液中的多价阴离子的存在左右。比较例中，在抗体溶液的导电率高的情况(比较例4、比较例5、比较例8及比较例9)以及抗体溶液中存在多价阴离子的情况(比较例1～比较例5)下，HCP量尤其变多。
抗体溶液c为容易去除HCP的溶液组成，但在使用所述溶液时，与比较例6、比较例7相比，实施例7为低1数位的HCP含量。
抗体溶液h为在使用载体C的纯化之前使用阳离子交换载体以流过模式对抗体溶液g进行纯化而获得的抗体溶液。使用此种抗体溶液h的实施例13与使用未进行阳离子交换色谱法的抗体溶液g的实施例12相比，为低的HCP含量。
另外，根据参考例1的结果，通过以流过模式使用载体C，可减少多克隆抗体中所含的作为杂质的凝聚体，可将抗体纯度自84.5％提高至89.8％。
对本发明的若干实施方式进行了说明，这些实施方式是作为例子来进行提示，并不意图限定发明范明。这些新颖的实施方式可由其他各种形态来实施，可在并不脱离发明主旨的范围内进行各种省略、置换、变更。这些实施方式或其变形包含于发明范围或主旨中，并且包含于权利要求中记载的发明与其均等的范围内。

Claims (16)

1.一种方法，其为抗体的纯化方法，包括使包含抗体及源自宿主的蛋白质(宿主细胞蛋白)的溶液与色谱法载体接触而分离所述抗体与所述宿主细胞蛋白，
所述色谱法载体包括包含多孔性粒子的基础载体、以及与所述基础载体键结的具有多个一级氨基的化合物，所述具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基的20％～55％由疏水基修饰，
所述抗体的回收率为85％以上，纯化后的抗体溶液中的所述宿主细胞蛋白量小于45ppm。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是以流过模式进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基的超过40％由所述疏水基修饰。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述具有多个一级氨基的化合物是选自由聚烯丙基胺、聚乙烯基胺、壳聚糖、聚赖氨酸、聚胍、以及聚鸟氨酸所组成的群组中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述具有多个一级氨基的化合物为聚烯丙基胺。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述聚烯丙基胺的重量平均分子量为5,000～15,000。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述疏水基具有以下的通式(1)～通式(3)的任一者的结构，
[化1]
[式中，
n为0～8的整数，
R1在n为0～3的整数时为苯基，在n为4～8的整数时为H或苯基，
*为与所述具有多个一级氨基的化合物中的一级氨基的键结部位]。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述疏水基具有所述通式(1)的结构。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在所述通式(1)中，n为4～8的整数，R1为H。
10.根据权利要求8所述的方法，其中在所述通式(1)中，n为0～8的整数，R1为苯基。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述疏水基为源自选自由戊酸酐、己酸酐、庚酸酐、辛酸酐、壬酸酐、苯甲酸酐、丁基缩水甘油醚、以及苯基缩水甘油醚所组成的群组中的化合物的基。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述疏水基为源自戊酸酐或苯甲酸酐的基。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述包含抗体及宿主细胞蛋白的溶液的导电率为22mS/cm以下。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述包含抗体及宿主细胞蛋白的溶液中进而包含多价阴离子。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述多价阴离子为选自由柠檬酸根离子、磷酸根离子、以及硫酸根离子所组成的群组中的一种以上。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
CN201780070605.XA 2016-11-18 2017-11-10 抗体的纯化方法 Pending CN109964123A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016224782 2016-11-18
JP2016-224782 2016-11-18
PCT/JP2017/040599 WO2018092691A1 (ja) 2016-11-18 2017-11-10 抗体の精製方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109964123A true CN109964123A (zh) 2019-07-02

Family

ID=62146043

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780070605.XA Pending CN109964123A (zh) 2016-11-18 2017-11-10 抗体的纯化方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20190345194A1 (zh)
JP (1) JPWO2018092691A1 (zh)
CN (1) CN109964123A (zh)
WO (1) WO2018092691A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112210002A (zh) * 2020-10-15 2021-01-12 湖南科众源创科技有限公司 重组人血清白蛋白的纯化方法
TWI774425B (zh) * 2020-06-17 2022-08-11 美商恩特葛瑞斯股份有限公司 離子交換膜、過濾器及方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020022941A (ja) * 2018-08-08 2020-02-13 日立化成株式会社 吸着材及びそれを用いた標的物質の精製方法
JP6927247B2 (ja) * 2019-04-08 2021-08-25 昭和電工マテリアルズ株式会社 抗体の精製方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012006864A (ja) * 2010-06-24 2012-01-12 Asahi Kasei Chemicals Corp 親水性分子鎖を有する多孔膜を用いた抗体タンパク質の精製方法
CN102977182A (zh) * 2011-08-19 2013-03-20 Emd密理博公司 在蛋白质纯化过程中降低样品中的一种或多种杂质水平的方法
CN103959057A (zh) * 2011-05-03 2014-07-30 安万托特性材料股份有限公司 用于蛋白质纯化的基于烯丙胺及其衍生物的新型色谱介质
CN104507955A (zh) * 2012-05-31 2015-04-08 新加坡科技研究局 采用具有多形式官能性的颗粒对免疫球蛋白g制备物的色谱纯化
US20150344520A1 (en) * 2014-05-27 2015-12-03 Jnc Corporation Chromatography media and protein purification method using the same
CN105457335A (zh) * 2007-08-14 2016-04-06 Emd密理博公司 多孔性吸附介质，含有该介质的吸附装置和层析系统
JP6303379B2 (ja) * 2012-10-10 2018-04-04 東ソー株式会社 抗体の精製方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005296352B2 (en) * 2004-10-21 2011-01-06 Cytiva Bioprocess R&D Ab Chromatography ligand

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105457335A (zh) * 2007-08-14 2016-04-06 Emd密理博公司 多孔性吸附介质，含有该介质的吸附装置和层析系统
JP2012006864A (ja) * 2010-06-24 2012-01-12 Asahi Kasei Chemicals Corp 親水性分子鎖を有する多孔膜を用いた抗体タンパク質の精製方法
CN103959057A (zh) * 2011-05-03 2014-07-30 安万托特性材料股份有限公司 用于蛋白质纯化的基于烯丙胺及其衍生物的新型色谱介质
CN102977182A (zh) * 2011-08-19 2013-03-20 Emd密理博公司 在蛋白质纯化过程中降低样品中的一种或多种杂质水平的方法
CN104507955A (zh) * 2012-05-31 2015-04-08 新加坡科技研究局 采用具有多形式官能性的颗粒对免疫球蛋白g制备物的色谱纯化
JP6303379B2 (ja) * 2012-10-10 2018-04-04 東ソー株式会社 抗体の精製方法
US20150344520A1 (en) * 2014-05-27 2015-12-03 Jnc Corporation Chromatography media and protein purification method using the same

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI774425B (zh) * 2020-06-17 2022-08-11 美商恩特葛瑞斯股份有限公司 離子交換膜、過濾器及方法
US11918990B2 (en) 2020-06-17 2024-03-05 Entegris, Inc. Ion-exchange membranes, filters, and methods
CN112210002A (zh) * 2020-10-15 2021-01-12 湖南科众源创科技有限公司 重组人血清白蛋白的纯化方法
CN112210002B (zh) * 2020-10-15 2022-06-10 楚天源创生物技术(长沙)有限公司 重组人血清白蛋白的纯化方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018092691A1 (ja) 2018-05-24
US20190345194A1 (en) 2019-11-14
JPWO2018092691A1 (ja) 2019-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10751645B2 (en) Chromatography ligand
CN109964123A (zh) 抗体的纯化方法
Castilho et al. Comparison of affinity membranes for the purification of immunoglobulins
CN103998456B (zh) 用于蛋白质的混合式色谱纯化的固相
CN107001432A (zh) 突变的免疫球蛋白结合多肽
BR112013008738B1 (pt) Method for purification of a protein
CN103998469A (zh) 抗体纯化方法
CN102811805A (zh) 结合蛋白质和肽的特异性吸附剂及使用所述吸附剂的分离方法
KR20070001969A (ko) 항체 정제
CN103038247A (zh) 蛋白质提纯的装置和方法
CN104718450B (zh) 抗体精制用阳离子交换色谱法载体及抗体医药的制程中生产的抗体单体与其聚合物的分离法
KR20160054597A (ko) 신규 항체 정제 방법 및 그로부터 얻어지는 항체, 및 양이온 교환기를 사용한 신규 항체 정제법 및 그로부터 얻어지는 항체
CN105358228A (zh) 亲和层析基质
CN1972746A (zh) 分离基质和纯化方法
CN101060931B (zh) 色谱配体
CN102753570A (zh) A蛋白晶体和交联晶体及其使用方法
CN109219613A (zh) 分离方法
CN109641969A (zh) 用于分开单克隆抗体的同种型的方法
CN104812491A (zh) 阴离子交换-疏水性混合模式
CN107964044B (zh) 从乳样中纯化抗cd20单克隆抗体的方法
JP5089924B2 (ja) ＩｇＭ型抗体の精製方法、ＩｇＭ型抗体認識抗原の吸着材
ES2869232T3 (es) Eliminación selectiva de una proteína de una mezcla de proteínas mediante el uso de carbón activado mediante el ajuste de las condiciones de la solución
CN116063491A (zh) 一种增强水性抗体制剂稳定性的方法及其应用
JP2019182791A (ja) 抗体凝集体の低減方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190702