CN101060931B - 色谱配体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由下列式(I)R1-R2-N(R3)-R4-R5定义的色谱配体其中R1是取代的或未取代的苯基基团、R2是包括0至4个碳原子的烃链、R3是包括1至3个碳原子的烃链、R4是包括1至5个碳原子的烃链、及R5是OH或H。此发明也包括一种含与多孔载体如颗粒或膜结合的所述配体的分离基体。此发明所述的配体和基体用作生物分子或有机化合物的纯化,例如蛋白、多肽、DNA等。根据此发明的一个便利用途是抗体的纯化。
Description
技术领域
本发明涉及新的色谱配体,其用作纯化生物分子例如蛋白。举例来说此配体用作纯化抗体,优选固定于多孔载体例如颗粒或膜上。因此,发明也包括含新配体的色谱基体、其制备方法和用来纯化抗体的试剂盒。
背景技术
免疫系统是由许多相互依赖的共同使身体免于细菌、寄生虫、真菌、病毒的感染及防止肿瘤细胞生长的细胞类型组成。免疫系统的卫兵是不断漫游在宿主血流中的巨噬细胞。当被感染或免疫挑战时,巨噬细胞通过吞没称作抗原的外来分子标记的侵略者来作出反应。此事件以辅助细胞T细胞为媒介,引发一系列复杂的反应其导致了B细胞兴奋。这些B细胞依次产生结合外来侵略者的称为抗体的蛋白。抗体和抗原问的结合事件标志外来侵略者经吞噬作用或补体系统的活化作用被破坏。存在许多不同种类的抗体,也称作免疫球蛋白,如IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM。它们的区别不仅在于它们的生理学地位还在于它们的结构。从结构的角度看,IgG抗体已被广泛研究,可能是因为它们在成熟免疫反应中扮演的显著地位。根据标准方法用适当的抗原通过动物免疫制造多克隆抗体。反应中动物产生多克隆抗体。然而,出于许多目的,希望有称作单克隆抗体的某个抗体的单一克隆。单克隆抗体(MAb)通过杂交种或由仅产单个抗体的正常B细胞与异常骨髓瘤肿瘤细胞融合组成的融合细胞产生。这产生的杂交种称作杂种细胞,目前用于生产抗体的标准方法。
现今,免疫球蛋白所拥有的生物活性在人及牲畜的诊断、健康护理和治疗部分的一定范围的不同应用被开发。事实上,过去几年,单克隆抗体和重组抗体构造已成为在临床试验和接受FDA批准上作为治疗学和诊断学被普遍研究的最大种类的蛋白。表达系统和生产策略的补充,为了以简单划算的方式获得高度纯化的抗体需要有效的纯化方法。
分离免疫球蛋白的传统方法是基于选择性可逆沉淀含免疫球蛋白的蛋白片段同时舍去溶液中其它组的蛋白。典型的沉淀试剂是乙醇,聚乙二醇,易溶盐例如硫酸铵和磷酸钾,和辛酸。这些沉淀方法典型地提供了非常不纯的产品与此同时消耗了时间并费力。此外,沉淀试剂加入粗材料中使很难为了其它目的使用上清液并造成了处理问题其在谈到免疫球蛋白大规模纯化时特别有关。
分离免疫球蛋白的一个可选方法是色谱,其包括一类密切相关的分离方法。区别色谱和其它大部分分离的物理及化学方法的特征是两个互相不混溶的相进行接触其中一个相固定而另一个相流动。引入流动相内的样本混合物在被流动相带入体系时与固定相和流动相进行一系列相互作用。相互作用开发了样本组分的物理或化学性质的差异。在流经含固定相柱的流动相的影响下这些差异支配个别组分移动的比例。为了提高与固定相的相互作用分离的组分排出。最短滞留的组分最先洗脱,最强保留的材料最后洗脱。当样本组分从柱中洗脱出时一个组分充分滞留以防止与邻近溶质区域的重叠,这时得到分离。为了每个特殊的分离目的,正不断努力设计最佳的固定相。这种固定相一般由附着了含官能团即结合基团的配体的载体或基础基体组成。一般参考每种基于所利用的相互作用原理的色谱法,例如亲和力色谱法、疏水性相互作用色谱法和离子交换色谱法。
根据锁匙识别原理亲和力色谱法是基于目标生物分子与生物特异配体之间的特有作用。因而,目标和配体将组成亲和力配对,例如抗原/抗体、酶/受体等。蛋白基的亲和力配体是众所周知的,例如蛋白A亲和力色谱法和蛋白G亲和力色谱法其均是抗体分离和纯化的普遍方法。众所周知蛋白A色谱法提供显著的特异性,特别是对单克隆抗体,因此能得到高纯度。与离子交换、疏水性相互作用、羟磷灰石层析和/或凝胶过滤步骤联合使用的以蛋白A为基础的方法成为许多生物制药公司抗体纯化方法的选择,参见WO8400773和US5,151,350。然而,由于蛋白的肽键,蛋白A基质表现某种程度的碱性敏感度。另外,当蛋白A基质用于从细胞培养基中纯化抗体时,源自细胞的蛋白酶可能引起蛋白A或其肽片段的损耗。
离子交换色谱法经常用于分离免疫球蛋白。在阴离子交换色谱法中,免疫球蛋白的负电荷氨基酸端链将与色谱基体的正电荷配体相互作用。另一方面在阳离子交换色谱法中,免疫球蛋白的正电荷氨基酸端链将与色谱基体的负电荷配体相互作用。
疏水性相互作用色谱法(HIC)是另一种所述方法并用于分离免疫球蛋白。如果目标是高度纯化的免疫球蛋白产品,一般推荐将HIC与一个或多个进一步的步骤结合。在HIC中,为了使免疫球蛋白有效结合HIC基体,需要将易溶盐加入流动相中。通过降低易溶盐浓度,结合的免疫球蛋白随后从基体中释放出来。因而,此方法的一个缺点是需要将易溶盐加入粗材料中,因为这可能引发问题和增加大规模用户的成本。例如,对于如乳清、血浆、和鸡蛋黄的粗材料,许多实例中易溶盐加入粗材料中在大规模应用上是抑制的,因为盐能阻止免疫球蛋白废弃粗材料任何经济上可行的使用。大规模应用另一个问题是几千升废料的处理。
US5,945,520(Burton等人)公开了混合式色谱树脂在结合pH下显示疏水性特征和在解吸附pH下显示疏水性特征和/或静电特征。树脂特别设计成在低离子浓度和高离子浓度下均从水溶液中结合目标化合物。这是通过包括一条间隔臂的经过选择的可离子化配体和至少一种可离子化官能度完成的,其中固体载体基体上可离子化配体的密度大于约150μmol/ml树脂或1mmol/g树脂干重中更小者。另外,包括所述可离子化配体的树脂的疏水性特征是在第一pH时在高离子浓度和低离子浓度下充分结合水介质中至少50%的目标化合物。可离子化官能度说明性的例子是4-(氨基甲基)吡啶,3-(氨基甲基)吡啶,2-(氨基甲基)吡啶,1-(3-氨基丙基)-咪唑,2-(氨基甲基)-苯并咪唑,4-(3-氨基丙基)吗啉。
此外,WO01/38228(Belew等人.)涉及阴离子交换吸附方法其中硫醚阴离子交换剂用于从液体中通过结合除去负电荷物质。每个配体包括一个正电荷氮和一个距所述电荷氮1-7个原子距离的硫醚键。所要物质如细胞、细胞的部分和含肽结构的物质在0.25M NaCl盐浓度区域被吸附。
最后,US6,702,943(Johansson等人)公开了通过吸附在载有多个含阴离子交换基团和疏水性结构的配体的基体上来从液体中除去目标物质的方法。更特别地,配体含有邻近正电荷阴离子交换基团的芳香环。所要物质是细胞、细胞的部分和含肽结构的物质。由于能在高盐浓度如0.25M NaC1下吸附目标物质,公开的配体表示为“高盐配体”。
然而,为了优选涉及纯化特定目标分子的方法,需要唯一的操作条件,并且最佳分离基体不同情形下有变化。例如,在生物技术工业中,需要设计特有的方法纯化肽和蛋白、核酸、病毒等。此外,抗体纯化中,抗体的类型将决定分离基体的选择。因而,为了许多经常发展的新产品的纯化,仍需要在可选择的分离基质的领域提供广泛选择。
发明简述
本发明的一个方面是提供新配体其用于从液体的其它组分中分离抗体。
发明一个特别的方面是提供这样的配体其能吸附杂质蛋白而不吸附目标抗体。
发明进一步的方面和优点将从以下的详细描述中体现。
附图简述
图1是根据发明说明性的色谱配体,即通过胺结合在载体上的N-苄基-N-甲基乙醇胺。
图2显示在包括固定于SepharoseTM6FF的N-苄基-N-甲基乙醇胺配体的分离基体上单克隆抗体分离的色谱图;和如下所述,强阴离子交换剂Q SepharoseTMFF作为参考。
图3a)和b)显示用mAb1-重组蛋白A的混合物在配体原型上进行的色谱的结果。
图4a)-c)显示样本使用Mab1、1%重组蛋白A及从图3的色谱试验中汇集的流经级份和洗出液级份的分析尺寸排阻色谱(SEC)结果。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本说明书中可交换使用。
术语“分离基体”此处用于表示由结合了一种或多种含官能团的配体的载体组成的材料。在这个领域术语“树脂”有时用作分离基体。
术语“多模态”分离基体指的是能提供至少两个不同的但联合操作的与结合的化合物相互作用的位置的基体。例如,这些位置中的一个可提供一种有吸引力类型的配体与兴趣物质问的电荷-电荷相互作用。另一个位置可提供电子受体-供体相互作用和/或疏水性相互作用和/或亲水性相互作用。电子供体-受体相互作用包括例如氢结合、π-π、阳离子-π、电荷转移、偶极-偶极、感应偶极子等的相互作用。“多模态”分离基质也称作“混合模式”分离基质。
术语“表面”此处意指所有的外部表面,并包括多孔载体情况中的外部表面及孔表面。
术语“洗脱液”在这个领域使用它的常规含意,也就是从分离基体中释放一种或多种化合物的合适pH和/或离子浓度的缓冲液。
术语“捕获步骤”在液相色谱的范围内指的是分离过程的最初步骤。最普遍地,捕获步骤包括净化、浓缩、稳定和从可溶杂质中有效纯化。在捕获步骤之后,可以接着中间纯化其进一步减少杂质例如宿主细胞蛋白,DNA,病毒,内毒素,营养素,细胞培养基组分例如消泡剂和抗生素,和产品有关的杂质例如聚集体、错误折叠的种类和凝集物的残留量。术语“一次性”此处意指在色谱柱和其它分离基质的范围内基体被打算单次使用或有限次使用。一次性产品方便使用以除去甚至很小量也有害的杂质,这种情形下方便吸附所述杂质到基体上并再丢弃基体。另一种想要一次性产品的情形是为了无菌处理,这种情形下基体是消过毒的或至少无菌的。
术语“磨光步骤”在液相色谱的范围内指的是最后的纯化步骤,其中微量杂质被除去留下活性安全的产品。在磨光步骤除去的杂质通常是目标分子或疑似泄漏产品的构象构体。
术语“Fc-结合蛋白”意指能结合抗体可结晶部分(Fc)的蛋白并包括如蛋白A和蛋白G、或保留所述结合性质的任意片段或其融合蛋白。
发明详述
第一个方面,本发明是包括芳香族乙醇胺的色谱配体。发明所述的配体特别用于纯化抗体,这将在下面更详细地讨论。
第一个实施方案中,此配体由下列式R1-R2-N(R3)-R4-R5定义
其中
R1是取代的或未取代的芳香环体系,例如苯基基团;
R2是包括0至4个碳原子的烃链;
R3是包括1至3个碳原子的烃链;
R4是包括1至5个碳原子的烃链;且
R5是OH或H。
如前所示,基团R1通过可能不含碳原子的碳链R2与胺连接,即R1和胺之间构成键;或通过1至4个碳原子例如2至3个碳原子,其任意被取代。用R5连接胺的碳链R4可以包括1至5个碳原子例如2至4个碳原子,其任意被取代。胺的R3可以包括包括1至3个碳原子例如2个碳原子,其任意被取代。
如果取代基不削弱配体的结合性质至相当的基本范围,芳香环体系R1可以包括一种或多种取代的或未取代的苯基基团。因而,R1可以包括一种或多种芳香环,例如亚苯基、亚联苯基或亚萘基结构和其它芳香环体系。芳香环可以是杂环的,即含一个或多个氮、氧或硫原子,例如吡啶、嘧啶、吡咯、咪唑、噻吩、或吡喃。说明性的R1取代基团选自由羟苯基(2-,3-和4-)、2-苯并咪唑基;甲硫基氧基苯基(2-,3-和4-)、3-吲哚基、2-羟基3-硝基苯基、氨苯基(2-,3-和4-)、4-(2-氨基乙基)苯基、3,4-二羟基苯基、4-硝基苯基、3-三氟甲基苯基、4-咪唑基、4-氨基吡啶、6-氨基嘧啶基、2-噻吩基、2,4,5-三氨基苯基、4-氨基三嗪基和4-砜酰氨基苯基组成的组。
在一个优选实施方案中,R1是未取代的苯基.在一个可选实施方案中,R1是由一个或多个OH基团取代的苯基。
此外,R1、R2、R3和R4的一个或多个可以由任何适合的取代基取代,只要配体的结合性质不被削弱至相当的基本范围。例如,如果一个更多的亲水性配体被要,它可以包括一种或多种亲水性基团例如OH基团。作为选择,取代基可以提高配体的疏水性,这种情形下配体可包括一种或多种疏水性基团例如烷基和/或氟。最后,取代基可以被用于引进一种或多种附加的官能度例如带电实体,也提高配体的多模态特征。此外,碳链R2和R3可以是直链或支链的,只要支链不削弱配体的结合性质至相当的基本范围。
在此配体一个特别的实施方案中,R2是-CH2-.在另一个实施方案中,R3是-CH3。在一个进一步的实施方案中,R4是-CH2-CH2-CH2-或-CH2-CH2-。在另一个实施方案中,R1是未取代的苯基。
因而,在一个优选实施方案中,本发明所述的配体包括N-苄基-N-甲基乙醇胺(BMEA)。在一个可选的实施方案中,配体是N,N-二甲基苄胺。
本领域技术人员使用有机化学的标准方法易合成本发明所述的配体。
发明一个进一步的方面是制备分离基体的方法,所述方法包括固定多个前面所述的配体到载体上。为了提供适合在医学或诊断领域特别单独使用的基体,根据本发明制备的分离基体也在随后的步骤中被灭菌。因而,在一个实施方案中,方法包括制备如前所述的基体、将如此制备的基体装入柱内、和将如此制备的基体灭菌。本领域技术人员在适合条件下易进行灭菌,例如热处理、辐射、或任何其它常规使用的方法。
如前式所示,在不固定的状态下,本发明所述的配体包括一个叔胺其构成一个结合到载体上的适合的柄,因而产生包括季胺和苯基基团的结合配体。因此,固定时,本发明所述的配体被认为是多模态阴离子交换配体,因为除正电荷季胺基团外它也包括疏水性的芳香环结构。将配体固定到多孔或非多孔表面的方法是本领域众所周知的,参见亲和力配体固定技术,Hermanson等人,Greg T.Hermanson,A·Krishna Mallia和Paul K.Smith,Academic Press,INC,1992。在一个实施方案中,载体表面上配体密度是接近常规离子交换基质一般所用的范围。
在一个优选实施方案中,配体结合到载体是通过引进载体和连接基团之间的连接基团。结合可以根据任何常规共价结合方法例如通过使用表氯醇、表溴醇、烯丙基-缩水甘油醚、双环氧化物如丁二醇二环氧甘油醚、卤素取代的脂肪族物质如二氯丙醇、和二乙烯基砜来进行。这些方法都是本领域众所周知的并且本领城技术人员易进行。
在一个特别的实施方案中,本发明所述的配体通过也称作扩展器的更长的连接基团分子结合到载体上。扩展器是本领域众所周知的,一般用于增加配体和载体问的空间距离。扩展器有时表示为触角或可伸缩臂,对于可能的化学结构的更详细描述参见US6,428,707,其通过引用在此处被包含。简单扼要地,扩展器可以是聚合物的形式例如均聚物或共聚物。亲水性聚合的扩展器可以是合成起源即用合成的骨架,或生物起源即使用天然存在的骨架的生物聚合物。典型合成的聚合物是聚乙烯醇、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺、聚乙烯醚等。典型的生物聚合物是多糖例如淀粉、纤维素、葡聚糖、琼脂糖。
载体可以由有机材料或无机材料制成,并可以是多孔的或非多孔的。在一个实施方案中,载体由天然聚合物制备,例如交叉结合的糖类材料如琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、魔芋胶、卡拉胶、结冷胶、藻朊酸盐、果胶、淀粉等。天然聚合物载体易制备并任选根据标准方法如逆悬浮胶凝作用(S Hjertén:Biochim Biophys Acta 79(2),393-398(1964))交叉结合。在一个特别优选的实施方案中,载体是一种相对刚性但多孔的琼脂糖,其通过增强流动性质的方法制备,参见US6,602,990(Berg)或SE0402322-2(Berg等人.).在一个可选的实施方案中,载体由合成的聚合物或共聚物制成,例如交叉结合的合成聚合物如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等。这种合成的聚合物易制备并任选根据标准方法交叉结合,参见“悬浮聚合扩展的苯乙烯基聚合物载体”(RArshady:Chimica e L'Industria 70(9),70-75(1988))。天然的或合成的聚合物载体也可以利用商业来源例如GE
Healthcare,Uppsala,Sweden的,比如多孔颗粒形式。在另一个可选的实施方案中,载体由无机聚合物制成,例如硅石。无机的多孔和非多孔载体是本领域众所周知的并根据标准方法是容易制备的。
此分离基体适合的颗粒大小可以是5-500μm直径范围,例如10-100μm,例如20-80μm。在基本上球形颗粒的情形中,平均颗粒大小可以在5-1000μm范围内,例如10-500μm。在一个特别的实施方案中,平均颗粒大小是在10-200μm范围内。本领域技术人员根据所用方法能容易选择适合的颗粒大小和孔隙率。例如,对于大规模处理,出于经济原因,可优选更多孔但刚性的载体以允许大体积处理,特别是对于捕获步骤。在色谱法中,方法参数如柱的大小和形状将影响选择。在膨胀床方法中,基体一般含有高密度填充物,优选不锈钢填充物。对于其它方法,其它标准可影响基体的性质。
因而,本发明的第二个方面是包括结合在载体上的前述配体的分离基体。如本领域技术人员所理解,每个载体一般包括多个配体。在一个特别的实施方案中,载体包括结合了第二种配体的前述配体,其中发明所述的配体占总配体量的至少约30%、优选至少约50%、更优选至少约70%和最优选至少约90%。这种结合的配体分离基体可以为特殊情形而设计,其中进一步相互作用的因素改善了它的分离性质。第二种配体可以包括一种或多种带电基团,例如通过电荷排斥洗脱化合物的阳离子交换剂、疏水性基团、能结合氢的基团、亲和力基团或类似物。
在第一个实施方案中,发明所述的基体是颗粒的形式,例如基本上球形的、伸长的或不规则形状的颗粒。在一个特别的实施方案中,分离基体被干燥,例如干燥的颗粒其使用前浸在液体中以保持原始形状。在一个说明性的实施方案中,这种干燥的分离基体由干燥的琼脂糖颗粒组成。然而,发明所述的基体可任选分离中常规使用的其它任何形状,例如单块、过滤器或膜、毛细管、薄片、表面等。因此,在第二个实施方案中,基体包括膜状结构,例如单膜、许多膜或过滤器。
本发明的第三个方面是前面所述分离基体的使用。在第一个实施方案中,本发明在蛋白纯化中使用如前所述的分离基体。在此使用的优选实施方案中,蛋白是抗体、抗体片段、或包括抗体的融合蛋白。在另一个实施方案中,本发明在任何其它化合物的分离中使用如前所述的分离基体,举例来说选自由多肽,核酸例如DNA、RNA或其寡核苷酸、质粒,病毒,朊病毒,细胞例如原核或真核细胞,脂类,糖类,有机分子例如小的有机分子,药靶,诊断标记分子组成的组。将在下面更详细地讨论使用。在另一个实施方案中,本发明在细胞培养中使用如前所述的分离基体作为载体,即固定细胞在表面生长。如本领域技术人员所知,在此应用中,术语分离用作化合物的纯化、离析和去除,但它也包括目标化合物的识别例如为了诊断目的。
本发明的第四个方面是分离方法,其中通过将含所述液体样本的流动相与如前所述的分离基体接触来从液体样本的一种或多种其它化合物中分离出所要化合物例如抗体。在一个优选的实施方案中,本发明是利用液相色谱的原理进行的,即用流动相流经含发明所述分离基体的色谱柱。在另一个可选的实施方案中,本发明是使用分批式色谱方法进行的,其中分离基体加到含液体样本的管中。在一个特别的实施方案中,加到分批模式中的分离基体包括干燥的颗粒,例如干燥的琼脂糖颗粒。在另一个实施方案中,方法是利用膨胀床色谱原理进行的即将流动相加至膨胀床如液化床上,其中的分离基体是含高密度填充物的基本上球形颗粒形式。
在本方法的第一个实施方案中,不想要的化合物吸附到分离基体上与此同时想要的化合物例如抗体留在流动相中没有被吸附。如本领域技术人员所知,所吸附的化合物的性质和同一性将取决于液体样本的来源。想要抗体不被吸附的实施方案中所吸附化合物的例子是细胞和细胞碎片,蛋白和肽,核酸例如DNA和RNA,内毒素,病毒,培养基的残留物等。在一个特别的实施方案中,此分离基体装在色谱柱中并且流动相通过重力和/或泵入流经所述柱,流经柱时抗体被回收。因为,此实施方案的一个优点是不需要从柱中洗脱抗体产品。从方法角度看避免特别的洗脱步骤是有吸引力的,因为越少的步骤将导致更快速的纯化方法并因此减少方法成本。另外抗体对某些条件是敏感的,例如会削弱它们的折叠型或通过破坏肽键降解它们。因而,即使一般而言阴离子交换剂的洗脱条件不包括极端的化学制品,但盐和/或pH的变化可能影响敏感的抗体,各种类问影响根据pI、电荷分布等有变化。因此,此实施方案的另一个优点是避免加入洗脱液和将洗脱条件应用到所要的化合物上。为了得到化合物吸附最适合的条件,液体样本与适合的缓冲液或其它液体结合以提供流动相。本实施方案在阴离子交换色谱的常规条件下方便试验,其一般包括在相对低盐浓度下吸附。因而,在本方法的一个实施方案中,流动相的传导率在0-25范围内,例如10-15mS/cm。在一个实施方案中,流动相的pH大约是5-6。如果想要释放吸附的化合物,例如重新使用基体,可在更高盐浓度下进行洗脱例如通过使用渐增的盐梯度。pH值也可或可选被变换例如渐减的pH梯度以洗脱吸附的化合物。
在本方法第二个并可选的实施方案中,想要的化合物如在常规液相色谱中一样吸附到基体上。然后基体可在产品选择性洗脱之后被重新使用。通过将适当缓冲液流经柱易进行洗脱。如果需要,可在任何这种流经前或之间应用一种或多种洗涤步骤。在一个实施方案中,此实施方案的操作条件与常规离子交换中一样,即如前所述使用低传导率的流动相吸附并使用高传导率的缓冲液洗脱。本领域技术人员能容易通过试验不同的条件来调整条件和分析吸附的化合物及流经。在一个特别的实施方案中,想要的化合物是抗体。
在前面的第一个和第二个实施方案问选择,本领域技术人员通过控制pH和/或传导率能容易改变条件以吸附特定的化合物。例如,在抗体的分离中,不同种类的抗体具有不同的电荷和电荷分布图,其以分离为目的共同决定更优选吸附抗体还是让它们不被吸附流过柱。
根据本发明一个实施方案分离的抗体可来自任何众所周知的来源,例如表面培养的或来自发酵罐或管中分批或连续细胞培养的细胞。因而,在一个实施方案中,液体是从细胞发酵中获得的上清液。抗体需要从中被分离出的化合物的例子蛋白,DNA,病毒,内毒素,营养素,细胞培养基的组分例如消泡剂和抗生素,和产品有关的杂质例如错误折叠的种类和聚集体。流动相和此分离基体间接触的步骤,即吸附步骤,可在机械过滤、离心和/或色谱步骤之后。例如,如果液体样本是发酵肉汤,则方便在使用此基体的步骤前机械除去细胞碎片、完整的细胞和其它相对大的组分。
在一个实施方案中,本方法设立纯化的捕获步骤。在一个特别的实施方案中,液体样本是粗饲料其在与发明所述色谱基体接触前被过滤。因此,此实施方案还设立捕获步骤,即使液体样本已通过机械手段被预纯化。众所周知,产生抗体的宿主细胞也包括许多一般称作宿主细胞蛋白(HCP)的其它蛋白。这种HCP包括酶如蛋白酶和宿主细胞产生的其它蛋白。因而,在一个实施方案中,液体样本的所有宿主细胞蛋白通过本方法被充分除去,例如通过吸附到分离基体上。
在一个可选的实施方案中,本方法在洗涤方法中被用作第二个、第三个或甚至第四个色谱步骤,例如中间纯化或磨光步骤。因而,在一个实施方案中,应用于此分离基体的流动相包括来自分离基体的含抗体的洗出液。在一个实施方案中,液体样本是来自前面亲和力色谱基体的洗出液。在一个优选的实施方案中,获得洗出液的分离基体包括一种或多种Fc-结合蛋白配体,例如蛋白A配体。术语蛋白A配体在此上下文中包括天然的及重组的蛋白A,或其功能片段。在此上下文中,术语“功能”片段意指保留蛋白原始结合性质的片段。这种亲和力基质是商用的,例如来自GE Healthcare的MabSelectTM。因此,在此实施方案中,除去的优选吸附的化合物可以是选自由释放蛋白A,蛋白A和抗体形成的复合体例如每个蛋白A分子可包括许多抗体的蛋白A-MAb复合体、例如与一个蛋白A分子复合的2-4个抗体,和释放蛋白A或抗体的聚集体组成的组中的一种或多种。如本领域技术人员所知,根据前面步骤所用的特定条件例如亲和力色谱,洗出液可通过适合的添加或调整来调节。因而,洗出液与适合的缓冲液或液体结合以提供流动相。
本方法用于分离任何单克隆或多克隆抗体,例如来自哺乳动物宿主如鼠、啮齿动物、灵长类动物和人的抗体或来自杂交瘤的抗体。在一个实施方案中,分离的抗体是人的或人源化的抗体。抗体可以是任何种类,即选自由IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM组成的组。在一个实施方案中,抗体是能结合蛋白A、或含Fc的抗体片段或融合蛋白的抗体。在一个特别的实施方案中,抗体是免疫球蛋白G(IgG),例如IgG1。在一个实施方案中,本方法用于纯化pI在6-9范围内的抗体,例如7-8范围内。在一个特别的实施方案中,纯化抗体pI约为9。在此上下文中,术语“抗体”理解为也包括抗体片段和任何包括抗体或抗体片段的融合蛋白。因而,本发明也包括前述抗体和含这种抗体的融合蛋白中任一种的片段的分离。在一个实施方案中,抗体是单克隆抗体。在一个特别的实施方案中,抗体是人源化的抗体。
如前面所示,在本方法中,回收未吸附抗体充分纯的级份。在此上下文中,术语“充分纯”理解为意指所有非抗体化合物已充分除去。最有利地,在此分离基体上除去杂质总量的至少约80%,例如至少约95%即95-100%问,例如至少约98%即98-100%间和优选至少约99%即99-100%问。然而,如本领域技术人员所致,获得的纯度将取决于应用于分离基体上液体样本中抗体的浓度及其它所用条件。因而,在一个实施方案中,根据本方法分离的抗体是治疗级抗体。因而,根据发明纯化的抗体用于研究和抗体药品的制备例如MAb药品。纯化抗体的一个可选用途是用于诊断。此外,纯化抗体也用于食品产品例如用于人的食品添加剂。例如,根据本发明纯化的牛抗体用于食品产品。
在本方法的一个特别实施方案中,此分离基体作为一次性色谱柱或一次性过滤器被提供。在治疗化合物如抗体的纯化方法中使用一次性产品的优点是能避免两个不同步骤问的交叉污染。因而,在一个实施方案中,此分离基体作为无菌的色谱柱或过滤器被提供。在一个实施方案中,本方法是分批式进行的,其中一次性分离基体加到装有含被回收抗体的液体的管中。于是所用基体可以不是否所吸附化合物,其从安全角度看又是有利的因为化合物例如内毒素和/或某些宿主细胞蛋白不需要进一步处理。在一个可选的实施方案中,此基体作为一次性产品装在色谱柱内其用于吸附抗体的模式。在一个优选的实施方案中,柱和基体已被灭菌以允许使用者在无菌或甚至消过毒的条件下纯化抗体产品。
第二个方面,本发明涉及用于从液体的一种或多种其它组分中纯化抗体的试剂盒,其试剂盒包括在分隔格内的装有如前所述分离基体的色谱柱、一种或多种缓冲液、和所写的说明书。分离基体可以是如前所述。所述说明书详细描述了上文定义的方法。
附图详述
图1显示了原型配体N-苄基-N-甲基乙醇胺通过氮原子固定到珠子形式的载体上的。结合的配体在左边显示用示意图所画的连接基团,而在右边用说明性的亲水性连接基团。在实验部分,原型配体结合6%琼脂糖基体SepharoseTM6FF(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)。
图2显示含50mg Mab1的样本在25mM Bis-Tris、100mM NaCl(~12mS/cm)、pH6.5中应用于含固定于SepharoseTM6FF(901035A)的N-苄基-N-甲基乙醇胺配体、固定于Sepharose6FF的N,N-二甲基苄胺和Q SepharoseTMFF的分离基质的色谱图。用25mM Bis-Tris、0.5mM NaCl、pH6.5进行洗脱。
图3a)和b)显示用mAb1-重组蛋白A在原型上进行的色谱的结果。缓冲液A是25mM Bis-Tris、50mM NaCl、pH6.0。传导率约7mS/cm。缓冲液B,0.5M醋酸钠、pH4.0,用于洗脱。流速是0.5mL/min(150cm/h)。样本是10mg Mab1,0.10mg重组蛋白A,浓度为4mg/mlMab1和1%重组蛋白A(W/W).3a)参考Q SepharoseTMFF;b)N-苄基-N-甲基乙醇胺,146μmol/mL(901035A)。
图4a)-c)显示样本使用Mab1、1%重组蛋白A及从图3的色谱试验中汇集的流经级份和洗出液级份的分析尺寸排阻色谱(SEC)结果。蓝色曲线是流经(FT)级份,红色是洗出液。更明确的,图4a)显示含4mg/mL Mab1、0.04mg/mL即1%(W/W)重组蛋白A的样本;4b)显示图3a)Q SepharoseTMFF中的FT和洗出液;4c)显示图3b)N-苄基-N-甲基乙醇胺,146μmol/mL(901035A)中的FT和洗出液。
实验部分
本实施例仅为说明性目的而提供,不应以任何方式解释为限制如提交的权利要求书所定义的发明范围。
实施例1:发明所述分离基体的制备
BMEA Sepharose Fast Flow的制备
发明所述分离基体的制备方法的一个实施方案如下所示,从交联的琼脂糖凝胶(SepharoseTM 6Fast Flow,GE Healthcare,Uppsala,Sweden)开始。
A.基体上烯丙基基团的引入
用烯丙基缩水甘油醚活化Sepharose 6Fast Flow如下:100mlSepharose 6Fast Flow被吸干,与0.3g NaBH4、12g Na2SO4及35ml 50%NaOH水溶液混合。混合物在50℃下搅拌1小时。加入100ml烯丙基缩水甘油醚后,悬浮液在50℃下再有力搅拌16小时。混合物过滤后,相继用500ml蒸馏水、500ml乙醇、200ml蒸馏水、200ml 0.2M醋酸和500ml蒸馏水洗涤凝胶。
滴定至0.22mmol烯丙基/ml凝胶的取代度。
B.通过溴化作用活化烯丙基Sepharose 6Fast Flow
溴加入50ml烯丙基活化的Sepharose 6Fast Flow(0.22mmol烯丙基基团/ml沥干的凝胶)、1g醋酸钠和15ml蒸馏水的搅拌过的悬浮液中,直至获得持久的黄色。再加入甲酸钠直至悬浮液完全脱色。反应混合物被过滤并且用500ml蒸馏水洗涤凝胶。活化的凝胶再直接转移到一个反应管中进一步与N-苄基-N-甲基乙醇胺反应。
C.活化基体上BMEA(N-苄基-N-甲基乙醇胺)基团的引入
胺基团直接通过胺基团的氮原子引入到基体上。在一个典型的过程中,与基体的结合通过烯炳基基团的溴和亲核取代在基本条件下实现。25ml溴活化的凝胶(0.22mmol烯丙基基团/ml沥干的凝胶)转移至含N-苄基-N-甲基乙醇胺溶液(16.0ml)的反应瓶中。加5ml水并用氢氧化钠溶液将反应溶液pH调整至12.0。在50℃搅拌下反应16小时。凝胶反应混合物过滤后,相继用3×10ml蒸馏水、3×10ml 0.5HCl水溶液和最后3×10ml蒸馏水洗涤。BMEA Sepharose Fast Flow凝胶得到0.15mmol胺/ml凝胶的取代程度。
实施例2:流经中抗体的纯化
实施例2A)配置
在非结合条件下,含约50mg mAb1的样本以约5mS/cm和12mS/cm装到原型901035A(N-苄基-N-甲基乙醇胺)上。在5,10和15柱体积(CV)时收集流经级份(FT)。汇集洗脱峰级份。FT级份分析HCP和蛋白A含量。
为了确认色谱实行不是唯一针对某一特殊的mAb,用含mAb2的样本在pH6.0和约12mS/cm下重复试验色谱。原型的实行首先用分析的SEC评价。选出的级份分析HCP和蛋白A含量。用SEC筛级份后,选出的级份送至HCP和蛋白A含量分析。
为了检验原型的重组蛋白A清除率,用1%(w/w)重组蛋白A(rPrA)强化MAb1。用对应10mg MAb1、pH6.0的1%重组蛋白A和传导率约7mS/cm的一个样本量注入原型。流经级份和洗出液级份分别汇集并用SEC分析。
材料/研究单位
柱和凝胶从GE Healthcare,Uppsala,Sweden获得
HiPrepTM26/10脱盐 目录号17-5087-01 CV=53.09ml
TricornTM5/50 目录号18-1163-09 CV=1ml
HR5/5TM 目录号18-0338-01 CV=1ml
SuperdexTM20010/300GL, 目录号17-5175-01 CV=23.56ml
仪器
分光光度计 Spectra MAX plus
化学制品
所有化学制品均是分析级.水是MilliQ过滤的.
色谱介质
Q SepharoseTM Fast Flow(FF)(GE Heaithcare,Uppsala,Sweden)。分离基质的配体是如下面表1所述的原型.
表1:配体
原型参考 | 配体 | Cl-容量(pmol/mL) |
901035A | N.苄基-N·甲基乙醇胺 | 146 |
样本
使用两种不同的人源化IgG抗体,亚纲1,表示为MAbl和Mab2,消光系数分别为1.46和1.50。两种抗体均在cHO培养物中表达并随后在本实验之前用常规蛋白A亲和力色谱纯化。
缓冲液交换在HiPrepTM脱盐柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上被制得,用感兴趣的缓冲液平衡,通过用SuperloopTM(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)注入大约体积(5-15mL)。流速为5 mL/min并收集5 mL级份。为了根据方程式l计算浓度,汇集含洗脱峰的级份并重复测定280nm下的吸光度:
A280=ε·C·l (Eqn 1)
其中 A280是280nm下的吸光度。
ε(mL*mg-l*cm-1)是特别蛋白的消光系数。
C(mg/mL)是蛋白浓度。
1是路径长度。
在SuperdexTM20010/300柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)上以0.5mL/min流速进行尺寸排阻色谱(SEC)。缓冲液是PBS(磷酸盐缓冲盐水),从片剂(Sigma,P-4417)制备的,10mM磷酸盐、0.137M NaCl、2.7m MKCl、pH7.4。
方法
平衡 2/0.1CV 2CV 第一次使用 0.1CV试验间
样本注射 50μl
等度洗脱 1.5CV
使用mAB的原型的色谱
缓冲液A是25mM Bis-Tris,pH6.0或6.5。为了想要的传导率约5mS/cm或12mS/cm,包括35mM或100mM NaCl。洗脱缓冲液(缓冲液B)是25mM Bis-Tris、0.5M NaCl、pH6.5.流速是0.5mL/min(150cm/h)。
方法: 平衡 5CV 缓冲液A
样本注射 5-25mL 样本含20mg或50mg mAB
洗涤 5CV 缓冲液A
梯度洗脱 10CV 0-100%缓冲液B
洗脱 10CV 100%缓冲液B
回收 5CV 缓冲液A
使用MAb-重组蛋白A的原型的色谱
缓冲液A是25mM Bis-Tris,pH6.0。通过添加50mM NaCl,传导率约为7mS/cm。缓冲液B是0.5M醋酸钠,pH4.0。流速是0.5mL/min(150cm/h)。样本浓度是4mg/mL MAb1-0.04mg/mL即1%(W/W)rPrA.
方法: 平衡 5CV 缓冲液A
样本注射 2.5mL 10mg MAb,1%rPrA
洗涤 5CV 缓冲液A
梯度洗脱 10CV 0-100%缓冲液B
洗脱 10CV 100%缓冲液B
回收 5CV 缓冲液A
CIP(适当清除)
在每次色谱试验后,原型和参考基体Q SepharoseTMFF进行以下CIP步骤;
30%异丙醇 5CV(柱体积)
H2O 5CV
1.0M NaOH 4CV(包括15分钟暂停)
H2O 5CV
缓冲液A 5CV
H2O 5CV
20%EtOH 5CV
蛋白A分析
选出的级份与比例为800μlSPA样本稀释液+200μl样本的SPA样本稀释液混合。混合后,级份在加热区段99℃下加热10分钟,然后再次混合。然后样本被分析重组蛋白A。
宿主细胞蛋白(HCP)分析
样本(最少600μl)被分析HCP含量。更低的检测界限是10ng/mL。
实施例2B)在原型配体N-苄基-N-甲基乙醇胺(901035A)上纯化含
MAb1的样本
含50mg_MAb1的样本在25mM Bis-Tris、100mM NaCl(~12mS/cm)、pH6.5中应用于固定在如前面实施例1所述制备的SepharoseTM6FF(901035A)和参考基体Q SepharoseTMFF上的N-苄基-N·甲基乙醇胺。用25mM Bis-Tris、0.5M NaC1、pH6.5进行洗脱。
实施例2的色谱图如图2所示,其显示原型N-苄基-N-甲基乙醇胺SepharoseTM6FF(901035A)相比于Q SepharoseTMFF。选来分析的流经(FT)级份用箭头指示。下面表2和表3所示的HCP和蛋白A清除的结果显示原型在那方面优于Q SepharoseTMFF。
表2:HCP分析结果
柱 | pH | 开始(ng/mL) | FTI(ng/mL) | FT2(ng/mL) | FT3(ng/mL) |
Q SepharoseTM FF(参考) | 6.5 | 890 | 160 | 200 | 180 |
N-苄基-N-甲基乙醇胺,146μmol/mL(901035A) | 6.5 | 890 | 10 | 20 | 35 |
表3:PrA分析结果
柱 | pH | 开始(ng/mL) | FT1(ng/mL) | FT2(ng/mL) | FT3(ng/mL) |
Q SepharoseTM FF(参考) | 6.5 | 0.40 | 0.69 | 0.46 | 0.31 |
N-苄基-N-甲基乙醇胺,146μmol/mL(901035A) | 6.5 | 0.40 | 0 | 0 | 0 |
实施例3:
流经时在原型配体N-苄基-N-甲基乙醇胺上从含MAb1和重组蛋白A
(rPrA)的样本中纯化MAb1
在此实施例中,用含mAb1-重组蛋白A的样本进行原型色谱。缓冲液A是25mM Bis-Tris、50mM NaC1、pH6.0。传导率约7mS/cm。缓冲液B是0.5M醋酸钠、pH4.0。流速是0.5mL/min(150cm/h)。样本是10mgMab1,0.10mg重组蛋白A,浓度为4mg/ml mAb1和1%重组蛋白A(W/W)。结果如图3所示。
最后,用mAb1、1%rPrA和汇集的来自图4中色谱试验的流经级份和洗出液级份在样本上进行分析的SEC。结果如图4所示。图4a中,阴影峰是MAb1-蛋白A的复合体。蓝色曲线是流经(FT)级份而红色是洗出液。
实施例4:吸附模式
4A)配置
为了检验BMEA Sepharose Fast Flow(BMEA;N-苄基-N-甲基乙醇胺)在吸附模式中的选择性,人IgG和8种不同的蛋白的保持时问被检验。结果与商用阴离子交换剂Q Sepharose Fast Flow对比。检验方法的原理是将蛋白注入用缓冲液A(含哌嗪作为缓冲组分)平衡的HR5/5柱(含固定在SepharoseTM Fast Flow上的BMEA配体)中。盐梯度用来洗脱蛋白(参见下面的方法)。
材料/研究单位
柱和Q Sepharose Fast Flow从GE Healthcare,Uppsala,Sweden获得。
HR5/5TM: 目录号18-0338-01 柱体积(CV=1mL)
仪器
化学制品和样本
蛋白、卵清蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、α-乳清蛋白、肌红蛋白、乳铁蛋白、核糖核酸酶A和细胞色素C购自Sigma而人IgG(Gammanorm)购自Octapharma。蛋白以1-10mg/ml的浓度溶解于缓冲液A中。Q Sepharose Fast Flow从GE Healthcare,Uppsala,Sweden获得。所有所用化学制品是分析级并且所用水是MilliQ过滤的。
色谱
在应用100μl样本溶液前柱用缓冲液以0.6ml/min的流速平衡。一次仅分析一个蛋白。蛋白通过从缓冲液A到缓冲液B的线性梯度用21个柱体积的梯度体积洗脱(参见下面的方法)。缓冲液A是25mM哌嗪、pH10.0而缓冲液B是25mM哌嗪、1.0M NaCl、pH10.0。所有试验中检测280nm下吸光度。
方法:
平衡 5CV缓冲液A
样本注射 100μl(约0.2mg蛋白)
梯度 21CV 100%缓冲液B
梯度后等度 5CV缓冲液A
结果
为了证明BMEA配体是否选择性与免疫球蛋白相互作用,人IgG应用于装有新介质的1ml柱(HR5/5)。另外,也应用蛋白卵清蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、α-乳清蛋白、肌红蛋白、乳铁蛋白、核糖核酸酶A和细胞色素C。结果与从Q Sepharose Fast Flow观察到的蛋白保持时间对比。Q Sepharose Fast Flow是强阴离子交换剂并用作参考的阴离子交换剂,因为它具有相同的载体基体(载体材料,珠子大小,孔大小,孔体积,组装过程等)和基本具有相同的取代程度(测得的离子交换容量)。如表1所示,BMEA Sepharose Fast Flow与Q Sepharose Fast Flow相比更强烈阻滞所有研究的蛋白。此外,IgG是用BMEA Sepharose Fast Flow保持时间最长的蛋白(表1)。这反映了与BMEA介质结合比与Q Sepharose Fast Flow结合要强得多。与Q Sepharose Fast Flow相比,使用BMEA Sepharose Fast Flow时IgG的保持时间增加了27.3分钟(表1)。这些结果清楚显示了BMEASepharose Fast Flow能以选择的方式用于捕获及洗脱IgG。
表1:不同蛋白在Q Sepharose Fast Flow和BMEA Sepharose FastFlow上的保持时间(tr)
蛋白 | 分子重量 | pI | Q Sepharose FastFlow上tr(min) | BMEA SepharoseFastFlow上tr(min) | Δtr(trBMEA-trQ) |
细胞色素C | 12400 | 9.6 | 15.3 | 16.8 | 1.5 |
核糖核酸酶A | 13700 | 9.4 | 15.8 | 22.6 | 6.8 |
乳铁蛋白 | 75000 | 7.9 | 15.1 | 19.4 | 4.3 |
肌红蛋白 | 17600 | 7.2 | 16.1 | 20.5 | 4.4 |
人IgG | 160000 | 16.5 | 43.8 | 27.3 | |
α-乳清蛋白 | 14400 | 5.2 | 24.6 | 40.3 | 15.7 |
牛血清白蛋白 | 69000 | 5.1 | 25.3 | 32.6 | 7.3 |
β-乳球蛋白 | 35000 | 5.1 | 25.1 | 37.1 | 12.0 |
β-乳球蛋白 | 35000 | 5.1 | 30.0x | 37.1 | 7.1 |
卵清蛋白 | 43500 | 4.7 | 21.8 | 30.8 | 9.0 |
na=未分析 x观测到两个峰
Claims (26)
1.一种分离基体,所述基体包括偶联于载体上的一种由下列式R1-R2-N(R3)-R4-R5定义的色谱配体
其中
R1是取代的或未取代的苯基基团;
R2是包括0至4个碳原子的烃链;
R3是包括1至3个碳原子的烃链;
R4是包括1至5个碳原子的烃链;且
R5是OH或H;
其中载体由有机材料制得且配体通过胺基团被固定。
2.根据权利要求1所述的配体,其中在配体的式中,R5是OH。
3.根据权利要求1或2所述的分离基体,其中在配体的式中,R1、R2、R3和R4中的一个或多个是被OH取代的。
4.根据权利要求1或2所述的分离基体,其中在配体的式中,R1是未取代的苯基基团。
5.根据权利要求1或2所述的分离基体,其中在配体的式中,R2是-CH2-。
6.根据权利要求1或2所述的分离基体,其中在配体的式中,R3是-CH3。
7.根据权利要求1或2所述的分离基体,其中在配体的式中,R4是-CH2-CH2-CH2-或-CH2-CH2-。
8.根据权利要求1或2所述的分离基体,其中所述配体包括N-苄基-N-甲基乙醇胺。
9.根据权利要求1或2所述的分离基体,其中载体包括颗粒。
10.根据权利要求1或2所述的分离基体,其中载体包括膜结构。
11.一种制备根据权利要求1-10任一项所述的分离基体的方法,所述方法包括将多个权利要求1-10任一项所述的配体固定到载体上。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述配体包括N-苄基-N-甲基乙醇胺。
13.根据权利要求11或12所述的方法,其中载体是多孔的。
14.根据权利要求11或12所述的方法,其中载体由有机材料制得。
15.一种制备色谱柱的方法,所述方法包括制备如权利要求1-10任一项所述的基体;将如此制备的基体装入柱内;和将含基体的柱灭菌。
16.一种制备分离膜的方法,所述方法包括制备如权利要求10所述的膜;和将膜灭菌。
17.一种在液体样本中将一种或多种蛋白与一种或多种其它化合物分离开的方法,其中将包含所述蛋白和化合物的流动相与权利要求1-10任一项所述的分离基体接触。
18.根据权利要求17所述的用途,其中蛋白是抗体、抗体片段、或含抗体的融合蛋白。
19.根据权利要求17所述的方法,其中分离基体装在色谱柱内,流动相通过重力和/或泵作用通过所述柱,和蛋白在柱的流经中被回收。
20.根据权利要求17或18所述的方法,其中液体样本包括从细胞发酵中获得的上清液。
21.根据权利要求17或18所述的方法,其中机械过滤和/或色谱的步骤在与分离基体的接触之前。
22.根据权利要求17或18所述的方法,其中液体样本包括天然饲料。
23.根据权利要求17或18所述的方法,其中所述化合物是宿主细胞蛋白并且基本上所有所述蛋白吸附于分离基体上。
24.一种用来在液体中从一种或多种其它组分纯化抗体的试剂盒,所述试剂盒包括在分隔格内的装有权利要求1-10任一项所述分离基体的色谱柱、一种或多种缓冲液和所写的说明书。
25.一种用来纯化抗体的一次性色谱柱,所述色谱柱包括权利要求1-10任一项所述的分离基体。
26.根据权利要求25所述的色谱柱,其中所述色谱柱已被灭菌。
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