CN109482162A - 一种层析介质及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种层析介质及其制备方法。本发明的层析介质包括层析基质和功能配基，所述层析基质为琼脂糖凝胶微球，所述功能配基为经烯丙基缩水甘油醚活化后偶联的N‑苄基‑N‑甲基乙醇胺。本发明的制备方法包括下述步骤：1)将层析基质用烯丙基缩水甘油醚活化，得到活化后的层析基质；2)将步骤1)中活化层析基质用溴水进行溴化，以形成溴化后的层析基质；3)将步骤2)中溴化的层析基质与功能配基N‑苄基‑N‑甲基乙醇胺反应，以形成层析介质。本发明的层析介质制备过程简单、抗体吸附容量大，通过改变pH可以在实现抗体的吸附和洗脱的同时较好去除脱落的蛋白A，可以利用蛋白A捕获和该介质的精纯实现抗体的两步纯化。

Description

一种层析介质及其制备方法
技术领域
本发明属于生物化工领域中的蛋白质层析分离领域，具体涉及一种层析介质及其制备方法。
背景技术
随着现代生物技术的快速发展，对生物分离方法也提出了新的要求，越来越多的生物产品需要高效的生物下游技术进行分离和纯化。其中层析技术是目前最有效的生物分离纯化技术，而层析介质是层析技术的关键与核心。
对于抗体的分离纯化备受关注。抗体具有靶向性强、特异性高和毒副作用小的特点，广泛应用于肿瘤及自身免疫病等重大疾病治疗、体外诊断与检测，成为当前生物技术药物的重点发展方向。目前通过哺乳动物细胞培养，抗体的表达量可以达到5g/L以上，但是抗体下游分离纯化过程成本较高，成为了抗体药物快速发展的瓶颈。抗体产品纯度要求较高，还必须保持生物活性，分离纯化的难度较大。离子交换层析和疏水相互作用层析等技术虽然可以分离抗体，但是特异性和选择性较差，分离步骤多，影响抗体的纯度和活性收率。基于蛋白A或蛋白G的亲和层析，是目前抗体分离的关键技术，选择性高、特异性强，但介质价格昂贵，吸附容量有限，且蛋白类亲和配基易被降解而脱落，重复使用次数有限，洗脱条件受限，因此操作成本较高。
1998年，Burton和Harding(Burton and Harding，J.Chromatogr.A,1998,814:71)提出了以疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic charge-induction chromatorgraphy,HCIC)为代表的新方法—多模式混合层析技术(Mutilmodal-mixed chromatography,MMC)，有效地结合了静电、疏水、氢键和亲硫等多种相互作用，在中性pH条件下，配基不带电荷，可以通过疏水等相互作用与目标蛋白结合，通过调节溶液pH，使配基带上电荷，通过静电排斥作用与目标蛋白解离，从而实现洗脱。MMC具有对目标蛋白选择性高、洗脱条件温和、介质再生简单等优点，可以有效调控对目标蛋白的吸附与解吸，显示出良好的应用前景。美国专利5,652,348描述了以巯基杂环化合物作为配基的MMC介质及其制备方法。美国专利7,144,743、5,719,269也报道了MMC介质的制备工艺。专利CN101284224、CN101279243、CN101279244报道了在MMC介质空间臂中引入砜基来提高介质对抗体的选择性及相关制备方法。专利CN104096544、CN104117345报道了以氨基苯并咪唑为配基以及色氨酸和氨基苯并咪唑为双功能基团的MMC介质。这些MMC介质主要以疏水相互作用与抗体结合，配基含量不高，吸附性能有限，一般需要结合传统的离子交换层析才能对抗体达到分离的目的，纯化效率并没有得到明显的改善。此外，这些MMC介质不能很好地去除纯化过程中在抗体中脱落的蛋白A。另外，常规抗体纯化方法需要蛋白A纯化后再由离子交换层析和疏水作用层析依次纯化，需要三步才能实现纯化。该常规方法耗时、步骤多，导致纯化成本比较高。因此，非常需要开发能够结合蛋白A的两步纯化抗体、提高纯化效率、降低分离成本，同时提高对抗体中脱落蛋白A的去除的MMC新型介质。
发明内容
为了满足上述需求，简化抗体纯化步骤，节约纯化成本，本发明提供了一种多模式混合层析介质。
根据本发明的一个实施方式中，提供了一种层析介质，其包括层析基质和所述层析基质表面上的功能配基，所述功能配基为经烯丙基缩水甘油醚活化后偶联的N-苄基-N-甲基乙醇胺，
所述层析介质的结构组成为：
本发明的层析介质利用了静电、疏水、氢键和亲硫等多种相互作用，提高了抗体纯化的效率。具体而言，本发明通过上述层析介质结构的功能配基中的基团与抗体相互作用而实现抗体的纯化。其能够很好地去除在利用蛋白A纯化抗体的纯化过程中因脱落而混入抗体中的蛋白A杂质，从而实现两步法抗体纯化，节省了纯化步骤，从而节约了大规模生产的成本。
在一个优选的实施方式中，所述层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性多孔琼脂糖凝胶微球。更优选所述层析基质选自琼脂糖凝胶微球、纤维素微球、葡聚糖凝胶、聚丙烯酸酯和聚苯乙烯/二乙烯基苯，进一步优选为琼脂糖凝胶微球。琼脂糖凝胶微球是美国FDA、欧盟EMA和中国CFDA共同认可的基质材料，当用于制药等健康相关过程中时，不会带来有害残留等风险。
在一个优选的实施方式中，所述层析介质中的所述功能配基的密度为64.5-141μmol/ml介质，优选90-138.5μmol/ml介质。
配基密度在64.5μmol/ml介质及以上，能够保证其对于抗体具有足够大的吸附容量；配基密度在141μmol/ml介质以下能够保证以更优的效率和结合力结合抗体，在保证抗体纯化效率最大化的同时，兼顾层析介质制备的成本。
本发明的层析介质既保留了传统疏水性电荷诱导层析的优点，又延续了传统离子交换层析介质的分离吸附特性，简化了抗体纯化步骤，提高了抗体的吸附容量和吸附速率，从而能够降低抗体纯化的成本。
另一方面，本发明提供了一种层析介质的制备方法，所述方法包括下述步骤：
1)将层析基质用烯丙基缩水甘油醚活化，以形成活化的层析基质；
2)将步骤1)中所述活化的层析基质用溴水进行溴化，以形成溴化的层析基质；
3)将步骤2)中所述溴化的层析基质与N-苄基-N-甲基乙醇胺反应，以形成层析介质。
在优选的实施方式中，所述步骤1)包括用去离子水清洗所述层析基质，抽干，在所述抽干的层析基质中添加硼氢化钠、无水硫酸钠、优选浓度为50％的氢氧化钠溶液，在45-55℃(优选50℃)下反应0.5-2小时(优选1)小时，随后添加烯丙基缩水甘油醚，在45-55℃(优选50℃)下活化8-24小时，得到活化的层析基质；
其中所述步骤2)包括将所述步骤1)中得到的所述活化的层析基质与醋酸钠和去离子水混合，得到混合液，在室温下搅拌所述混合液，同时滴加溴水直至所述混合液变为淡黄色，然后添加甲酸钠直至变为无色，过滤清洗，得到溴化的层析基质；并且
其中所述步骤3)包括将所述步骤2)中得到的所述溴化的层析基质与N-苄基-N-甲基乙醇胺、0.1M氢氧化钠溶液和蒸馏水混合，将pH保持为10-12，在45-55℃(优选50℃)下以100-200rpm(优选150rpm)振荡反应8-24小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到层析介质。
优选地，其中在所述步骤1)中，硼氢化钠的量，按质量计，为所述层析基质的0.15％-0.5％，无水硫酸钠的量，按质量计，为所述层析基质的5％-15％，50％氢氧化钠溶液的量，按体积(以ml计)质量(以g计)比，为所述层析基质的20％-40％(v/m)，添加的烯丙基缩水甘油醚的量，按体积(以ml计)质量(以g计)比，为所述层析基质的50％-100％(v/m)；
其中在所述步骤2)中，醋酸钠的量，按质量计，为所述活化的层析基质的2％-5％，去离子水的量，按体积(以ml计)质量(以g计)比，为所述活化的层析基质的20％-50％(v/m)；并且
其中在所述步骤3)中，N-苄基-N-甲基乙醇胺的量，按体积(以ml计)质量(以g计)比，为所述溴化的层析基质的50％-75％(v/m)，0.1M氢氧化钠溶液的量，按体积(以ml计)质量(以g计)比，为所述溴化的层析基质的30％-50％(v/m)，蒸馏水的量，按体积(以ml计)质量(以g计)比，为所述溴化的层析基质的20％-40％(v/m)。
综上所述，本发明提供的层析介质，既保留了传统疏水性电荷诱导层析的优点，又延续了传统离子交换层析介质的分离吸附特性，简化了抗体纯化步骤，提高了抗体的吸附容量和吸附效率，有利于层析介质实现抗体的高效分离纯化。具体而言，本发明的层析介质主要具有以下优点：(1)配基偶联条件温和，催化剂及配基使用量较低，制备成本较低；(2)配基偶联效率高，配基密度可控，制备过程中质量控制更加容易，产品标准化程度更高；(3)抗体吸附容量大，亲和力强，饱和吸附容量可达120mg/ml湿介质，从而能够提高纯化效率；(4)具有非盐依赖的吸附特征，在较宽的电导率范围(0-100mS/cm)内，吸附容量基本保持不变，对于使用环境要求宽松，适用范围更广；(5)洗脱方便，通过调节溶液pH至4附近，可实现完全洗脱，避免过酸、过碱或高盐等对蛋白结构产生不良影响或活性损失；(6)介质的配基稳定，清洗再生方便，重复利用率高。本发明的关键在于将N-苄基-N-甲基乙醇胺与烯丙基缩水甘油醚活化后的琼脂糖微球偶联，实现了层析介质对抗体的两步纯化，显示出良好的抗体规模化分离纯化的应用前景。
附图说明
下面通过实施例结合附图的方式阐释本发明的具体实施方式，其中：
图1是不同pH对制备实施例6制备的层析介质(本文称为Adhere NUPharose FF)吸附牛IgG测定的吸附等温线(25℃)，其中Qm表示饱和吸附容量，C表示吸附后上清液中抗体的浓度。
图2是在pH7时不同NaCl浓度下对制备实施例6制备的层析介质吸附牛IgG测定的吸附等温线(25℃)，其中Qm表示饱和吸附容量，C表示吸附后上清液中抗体的浓度。
图3(a)和3(b)是由蛋白A捕获后的组份通过本发明制备实施例6制备的层析介质Adhere NUPharose FF、传统的离子交换结合疏水作用层析与Capto adhere进行纯化后的电泳图谱。图3(a)是由蛋白A捕获兔血清后的电泳图谱，其中泳道1为兔血清上样料液；泳道2为穿透组份；泳道3为空白(未点样)；泳道4为洗脱组份；泳道5为原位清洗(clean inplace，CIP)；M为蛋白分子量标记(Marker)。图3(b)由蛋白A捕获后的组份通过本发明制备实施例6制备的层析介质Adhere NUPharose FF、离子交换结合疏水作用层析和Captoadhere进行纯化后的电泳图谱，其中泳道1为蛋白A的捕获组份；泳道2为阴离子交换介质QNUPharose Fast Flow(货号：20160326B221，杭州纽龙生物科技有限公司)对蛋白A捕获组份纯化的穿透组份；泳道3为阴离子交换介质QNUPharose Fast Flow对蛋白A捕获组份纯化的洗脱组份；泳道4为Capto adhere对蛋白A捕获组份纯化的穿透组份；泳道5为Captoadhere对蛋白A捕获组份纯化的第一洗脱组份；泳道6为Capto adhere对蛋白A捕获组份纯化的第二洗脱组份；泳道7为Adhere NUPharose FF对蛋白A捕获组份纯化的穿透组份；泳道8为Adhere NUPharose FF对蛋白A捕获组份纯化的第一洗脱组份；泳道9为AdhereNUPharose FF对蛋白A捕获组份纯化的第二洗脱组份；M为蛋白分子量标记(Marker)。
图4为阴离子交换介质Q NUPharose Fast Flow(货号：20160326B221，杭州纽龙生物科技有限公司)结合疏水层析介质Phenyl NUPharose Fast Flow(货号：20160215B311，杭州纽龙生物科技有限公司)对蛋白A捕获组份的分离纯化结果。泳道1为蛋白A的捕获组份；泳道2为阴离子交换介质Q NUPharose Fast Flow对蛋白A捕获组份纯化的穿透组份；泳道3为阴离子交换介质Q NUPharose Fast Flow对蛋白A捕获组份纯化的洗脱组份；泳道4为疏水层析介质Phenyl NUPharose Fast Flow对阴离子交换介质Q NUPharose Fast Flow的穿透组份纯化过程中的穿透组份；泳道5为疏水层析介质Phenyl NUPharose Fast Flow对Q的穿透组份纯化过程中的洗脱组份；泳道6为CIP；M为蛋白分子量标记(Marker)。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明作进一步的阐释，但是本发明并不限于以下的实施例，所提供的实施例仅为示例性实施例，不代表对本发明范围的限定，本发明的范围由所附的权利要求书限定。所述反应物如果没有特别说明，均可商购获得。
本发明的层析介质包括层析基质和配基，所述配基为N-苄基-N-甲基乙醇胺，
所述层析介质的结构组成为：
所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性多孔微球，所述的层析基质优选为琼脂糖凝胶微球。
所述的配基为经烯丙基缩水甘油醚活化后偶联的N-苄基-N-甲基乙醇胺。
所述的层析介质的配基密度为64.5-141μmol/ml介质。
制备实施例1-7具体描述了制备本发明的层析介质的方法。
制备实施例1
通过下述步骤制备层析介质：
步骤1)、用去离子水清洗10g的琼脂糖凝胶微球，抽干，添加0.015g的硼氢化钠和0.5g的无水硫酸钠，然后添加1.5mL的50％氢氧化钠溶液，50℃反应1小时。随后添加3.5mL烯丙基缩水甘油醚，在50℃下活化8小时，抽滤，分别用50ml的去离子水、50ml无水乙醇、50ml 0.2M乙酸和100ml去离子水洗涤得到活化的层析基质；
步骤2)、将10g活化的层析基质、0.1g醋酸钠和1.5ml去离子水混合，得到混合液，在室温下搅拌混合液的同时逐滴添加溴水，直至混合液变为淡黄色并且1分钟内颜色不再改变，然后逐滴添加甲酸钠直至变为无色，最后过滤清洗，得到溴化的层析介质；
步骤3)、将10g溴化的层析基质、4ml N-苄基-N-甲基乙醇胺、0.5ml 0.1M的氢氧化钠溶液和1.5ml去离子水混合，维持反应体系pH为10，在50℃下150rpm振荡下反应8小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到层析介质。制备的层析介质的配基密度为64.5μmol/ml介质。
制备实施例2-7
制备实施例2-7按照实施例1的方法制备层析介质，不同之处是实施例2-7中反应物的用量与反应时间与实施例1中的有些不同，所制备的层析介质的配基密度不同。详见下面表1。
实施例1
使用制备实施例6中制备的层析介质Adhere NUPharose FF，在25℃，不同pH下测定对牛IgG的饱和吸附容量Qm，测定其吸附等温线，结果示于图1中。
实施例2
使用制备实施例6中制备的层析介质Adhere NUPharose FF，在pH7.0的条件下，对不同NaCl浓度下Adhere NUPharose FF吸附牛IgG的饱和吸附容量Qm进行测定，结果示于图2中。
实施例3
将待纯化的抗体样品经蛋白A捕获后，通过本发明制备实施例6制备的层析介质Adhere NUPharose FF进行纯化。其纯化结果的电泳图谱参见图3(a)、3(b)和图4。
对比例1
将实施例3使用的相同的抗体样品，经蛋白A捕获后，使用传统的离子交换结合疏水作用层析进行纯化。其纯化结果的电泳图谱参见图3(a)和图4。
对比例2
将实施例3使用的相同的抗体样品，经蛋白A捕获后，使用Capto adhere(购于GEHealthcare公司)进行纯化。其纯化结果的电泳图谱参见图3(a)和3(b)。
结果分析
结合图1，可见制备实施例6中所制备的配基密度为138.5μmol/ml介质的多混合模式层析介质的最大吸附容量在pH 8附近达到120mg/ml，随着pH值的下降，其最大吸附容量逐步降低，在pH3-4时吸附量很小，在此pH下基本可以将其洗脱下来。从而可以确定本发明的层析介质纯化时的洗脱液的pH可以为4左右。洗脱条件温和，不会对蛋白质结构产生不良影响或活性损失。
参见图2，可见本申请的层析介质具有非盐依赖的吸附特征，在高达1M的NaCl浓度下，依然具有较高的吸附容量。因此，本发明的层析介质对于使用环境的要求宽松，能够适用于各种纯化要求，甚至是严苛的缓冲液环境，也基本不会影响其纯化活性。
参见图3(b)和图4，可见利用本发明的层析介质能够在两步内纯化抗体，即蛋白A捕获+本发明的层析介质纯化，并且得到了很好的纯化效率，参见图3(b)中的泳道8，而且一次洗脱基本上就可以洗脱干净，泳道9几乎没有蛋白成分。洗脱纯化收率和效率甚至高于商购的Capto adhere(参见图3(b)的泳道5和6，其第二次洗脱还有残存的目的蛋白组分(泳道6))，而生产成本低于Capto adhere。这些结果进一步说明，本发明的层析介质具有更高的纯化效率，更低的纯化成本，更加适用于大规模生产。
参见图4，采用常规的三步法，即蛋白A捕获+离子交换+疏水层析，不但步骤更多，生产线延长，而且其收率也远低于本发明的层析介质。
综上所述，本发明的层析介质，简化了抗体的纯化步骤，提高了抗体的吸附容量和吸附速率，有利于实现抗体的高效分离纯化。
以上仅以实施例6为例说明了本发明的层析介质的效果，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。

Claims (7)

1.一种层析介质，其包括层析基质和所述层析基质表面上的功能配基，所述功能配基为经烯丙基缩水甘油醚活化后偶联的N-苄基-N-甲基乙醇胺，
所述层析介质的结构组成为：
其中表示层析基质。
2.如权利要求1所述的层析介质，其中所述层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性多孔微球。
3.如权利要求1或2所述的层析介质，其中所述层析基质选自琼脂糖凝胶微球、纤维素微球、葡聚糖微球、聚丙烯酸酯和聚苯乙烯/二乙烯基苯，优选为琼脂糖凝胶微球。
4.如权利要求1所述的层析介质，其中所述层析介质中的所述功能配基的密度为64.5-141μmol/ml介质，优选90-138.5μmol/ml介质。
5.一种制备如权利要求1至4中任一项所述的层析介质的方法，所述方法包括下述步骤：
1)将层析基质用烯丙基缩水甘油醚活化，以得到活化的层析基质；
2)将步骤1)中所述活化的层析基质用溴水进行溴化，以得到溴化的层析基质；
3)将步骤2)中所述溴化的层析基质与N-苄基-N-甲基乙醇胺反应，以得到所述层析介质。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述步骤1)包括用去离子水清洗所述层析基质，抽干，在所述抽干的层析基质中添加硼氢化钠、无水硫酸钠、优选浓度为50％的氢氧化钠溶液，在45-55℃(优选50℃)下反应0.5-2小时(优选1小时)，随后添加烯丙基缩水甘油醚，在45-55℃(优选50℃)下活化8-24小时，得到活化的层析基质；
其中所述步骤2)包括将所述步骤1)中得到的所述活化的层析基质与醋酸钠和去离子水混合，得到混合液，在室温下搅拌所述混合液，同时滴加溴水直至所述混合液变为淡黄色并且1分钟内颜色不再改变，然后添加甲酸钠直至变为无色，过滤清洗，得到溴化的层析基质；并且
其中所述步骤3)包括将所述步骤2)中得到的所述溴化的层析基质与N-苄基-N-甲基乙醇胺、0.1M氢氧化钠溶液和蒸馏水混合，将pH保持为10-12，在45-55℃(优选50℃)下以100-200rpm(优选150rpm)振荡反应8-24小时，抽滤，用去离子水洗涤，得到所述层析介质。
7.如权利要求6所述的方法，其中在所述步骤1)中，硼氢化钠的量，按质量计，为所述层析基质的0.15％-0.5％，无水硫酸钠的量，按质量计，为所述层析基质的5％-15％，50％氢氧化钠溶液的量，按体积(以ml计)质量(以g计)比，为所述层析基质质量的20％-40％，添加的烯丙基缩水甘油醚的量，按体积(以ml计)质量(以g计)比，为所述层析基质的50％-100％；
其中在所述步骤2)中，醋酸钠的量，按质量计，为所述活化的层析基质的2％-5％，去离子水的量，按体积(以ml计)质量(以g计)比，为所述活化的层析基质的20％-50％；并且
其中在所述步骤3)中，N-苄基-N-甲基乙醇胺的量，按体积(以ml计)质量(以g计)比，为所述溴化的层析基质的50％-75％，0.1M氢氧化钠溶液的量，按体积(以ml计)质量(以g计)比，为所述溴化的层析基质的30％-50％，蒸馏水的量，按体积(以ml计)质量(以g计)比，为所述溴化的层析基质的20％-40％。
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