CN101279244B - 一种疏水性电荷诱导型亲硫扩张吸附床介质及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种疏水性电荷诱导型亲硫扩张吸附床介质及其制备方法。介质组成中基质为纤维素/无机增重剂复合微球，配基为砜基和巯基甲基咪唑。采用反相悬浮热再生法，得到纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；混合二乙烯基砜、碳酸钠缓冲液和二甲基亚砜进行活化；混合抽干的活化基质、巯基甲基咪唑和含有过硫酸铵的氢氧化钠进行偶联，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质。本发明所研制的扩张床吸附介质，结合了疏水性电荷诱导层析、亲硫层析和扩张床吸附等三种蛋白质分离原理，具有配基密度高、蛋白吸附量大、特异性强、吸附洗脱条件温和等优点，并显示出技术和过程集成化的特点，可以用于抗体等蛋白质的高效分离纯化。
Description
技术领域
本发明涉及一种疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质及其制备方法，属于层析分离中扩张床吸附分离蛋白质技术。
背景技术
随着基因工程、蛋白质工程、发酵工程和细胞工程的迅速发展，越来越多的生物产品需要高效的生物下游技术进行分离和纯化，对生物分离方法也提出了新的要求。
抗体是一种重要的生物技术产品，广泛用于免疫治疗、疾病预防和医学诊断。通过细胞工程和免疫方法制备多克隆抗体和单克隆抗体的技术已经越来越成熟，抗体种类不断增多，制备规模也不断扩大，这就要求有高效的抗体分离技术与之相适应。抗体产品往往纯度要求较高，同时还要尽可能保持生物活性，因此传统的分离过程难以满足要求。常规的离子交换层析和疏水相互作用层析能够结合抗体，但是特异性和选择性较差，分离步骤多，影响抗体的活性收率。Protein A亲和层析介质能够选择性吸附抗体，但是介质价格昂贵，且配基易被料液中蛋白酶降解，重复使用次数低，操作成本极高，限制其大规模应用。
1985年Porath等提出了含有砜基和巯基乙醇的亲硫色谱(Porath et al.FEBSletters，1985，185：306)用于抗体的分离，但是需要在一定的盐浓度下进行吸附。1998年Burton和Harding提出了疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic chargeinduction chromatography，HCIC)(Burton SC and Harding DRK.J Chromatogr A，1998，814：71)，利用杂环配基与抗体的疏水作用进行吸附，结合静电排斥进行洗脱，其专利(US Patent 5,652,348)描述了HCIC介质的制备方法。专利(USPatent 5,719,269；US Patent 7,144,743)也报导了HCIC介质的制备工艺。但是这些HCIC介质均没有明确结合亲硫作用，是一种密度接近1的介质，只能用于常规的填充式层析，不能用于新近出现的扩张床吸附过程。因此，结合疏水性电荷诱导层析的高吸附容量和温和的洗脱条件，以及亲硫层析的抗体选择性，并引入扩张床吸附的初分离功能，将形成抗体分离的新方法。
扩张床吸附(Expanded Bed Adsorption，EBA)技术形成于20世纪90年代，是一种集固液分离、浓缩和初期纯化于一个操作单元之中的新型蛋白质分离纯化技术。EBA能直接从发酵液、细胞匀浆或者组织提取液中捕获目标产物，减少了操作单元数，缩短了处理时间，节约了生产成本，被誉为近十几年来出现的一个新的单元操作。
本发明以巯基甲基咪唑作为疏水性电荷诱导配基，砜基为亲硫基团，偶联到扩张床吸附基质上，制备新型的疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，可以充分地把疏水性电荷诱导层析、亲硫层析和扩张床吸附三种蛋白质分离原理结合在一起，形成一种高效集成化的新型生物活性物质分离方法，有效促进抗体等蛋白质分离工艺的改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种疏水性电荷诱导型亲硫扩张吸附床介质及其制备方法。
疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质：介质的组成中基质为纤维素/无机增重剂复合微球，延长臂为二乙烯基砜活化后引入的亲硫性二乙基砜基，配基为偶联后的巯基甲基咪唑，其结构组成为：
所述的纤维素/无机增重剂复合微球的骨架为纤维素，增重剂为钛白粉、不锈钢粉、镍粉或碳化钨粉，增重剂占湿球的质量百分比含量为16％～61％；纤维素/无机增重剂复合微球的粒径为50～250μm。配基为巯基甲基咪唑，巯基甲基咪唑包括2-巯基-1-甲基咪唑、4-巯基-1-甲基咪唑或5-巯基-1-甲基咪唑。配基密度为30～65μmol/ml介质。
疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质的制备方法：首先将纤维素粘胶和无机增重剂充分混合，无机增重剂在混合物中的质量百分含量为16％～61％，加入5倍纤维素粘胶质量的泵油，控制转速500～800rpm，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，筛选50～250μm粒径的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；其次将纤维素/无机增重剂复合微球、二乙烯基砜、0.1～0.4M pH12的碳酸钠缓冲液和二甲基亚砜混合，二乙烯基砜添加的体积量为纤维素/无机增重剂复合微球体积的18％～36％，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化后的基质、3倍双键摩尔量的巯基甲基咪唑和含25mg/ml过硫酸铵的0.4～0.6M氢氧化钠溶液混合，60℃下180rpm摇床中偶联8小时，抽滤，用去离子水洗涤，加入到含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质。反应过程示意图为：
本发明充分结合了疏水性电荷诱导层析、亲硫层析和扩张床吸附等三种蛋白质分离原理，将亲硫基团、疏水性电荷诱导配基巯基甲基咪唑偶联到了以纤维素/无机增重剂复合微球为骨架的扩张床基质上，形成了新型疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质。制备工艺的关键在于：首先，制成的纤维素/无机增重剂复合微球作为扩张床基质，具有合理的密度和粒径分布，适合于高流速、大规模的初级分离处理过程；其次，选用的活化试剂二乙烯基砜，提供了缺电子的亲硫基团，可以在弱碱性的环境中进行活化，加入了亲水性有机溶剂二甲亚砜，可显著提高活化效率；其三，优化了巯基甲基咪唑的偶联反应，减少了反应步骤，确保了偶联效率，使配基密度达到65μmol/ml，保证了介质具有较高的蛋白质吸附容量。
附图说明
附图是本发明的介质(配基密度为65μmol/ml)吸附卵黄抗体和牛血清白蛋白的静态吸附等温线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
将50g纤维素粘胶和40g碳化钨粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基-1-甲基咪唑和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.81g/ml，配基密度为65μmol/ml。
实施例2
将50g纤维素粘胶和40g碳化钨粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、0.9ml二乙烯基砜、9ml 0.1M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基-1-甲基咪唑和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.4M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.81g/ml，配基密度为30μmol/ml。
实施例3
将50g纤维素粘胶和80g碳化钨粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入310g泵油，800rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、1.8ml二乙烯基砜、9ml 0.4M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基-1-甲基咪唑和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.6M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为2.40g/ml，配基密度为48μmol/ml。
实施例4
将50g纤维素粘胶和60g碳化钨粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，800rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基-1-甲基咪唑和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为2.11g/ml，配基密度为56μmol/ml。
实施例5
将50g纤维素粘胶和12g镍粉在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基-1-甲基咪唑和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.42g/ml，配基密度为63μmol/ml。
实施例6
将50g纤维素粘胶和20g不锈钢粉在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基-1-甲基咪唑和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.71g/ml，配基密度为61μmol/ml。
实施例7
将50g纤维素粘胶和15g钛白粉在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基-1-甲基咪唑和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.39g/ml，配基密度为57μmol/ml。
实施例8
将50g纤维素粘胶和40g碳化钨粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的4-巯基-1-甲基咪唑和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.81g/ml，配基密度为61μmol/ml。
实施例9
将50g纤维素粘胶和40g碳化钨粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3～5次，筛选50～250μm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的5-巯基-1-甲基咪唑和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60℃下180rpm摇床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.81g/ml，配基密度为54μmol/ml。
实施例10
疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质(配基密度为65μmol/ml)吸附卵黄抗体的静态吸附实验，首先将介质用pH7的柠檬酸缓冲液进行平衡；抽滤后分别准确称取0.4g介质于25ml带塞锥形瓶中，加入8ml不同IgY浓度的缓冲溶液；将锥形瓶置于水浴摇床中，25℃下180rpm振荡8h；平衡后取出上清液测定IgY的浓度；根据物料横算求得吸附蛋白的量和平衡溶液IgY浓度，绘制静态吸附等温线，并根据Langmuir吸附方程拟合得到介质的饱和吸附量为137.6mg/ml。
Claims (3)
1.一种疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，其特征在于介质的组成中基质为纤维素/无机增重剂复合微球，延长臂为二乙烯基砜活化后引入的亲硫性二乙基砜基，配基为偶联后的巯基甲基咪唑，其结构组成为：
具体制备方法为：首先将纤维素粘胶和无机增重剂充分混合，无机增重剂在混合物中的质量百分含量为16％～61％，加入5倍纤维素粘胶质量的泵油，控制转速500～800rpm，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，筛选50～250μm粒径的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；其次将纤维素/无机增重剂复合微球、二乙烯基砜、0.1～0.4M pH12的碳酸钠缓冲液和二甲基亚砜混合，二乙烯基砜添加的体积量为纤维素/无机增重剂复合微球体积的18％～36％，25℃下180rpm摇床中活化4小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化后的基质、3倍双键摩尔量的巯基甲基咪唑和含25mg/ml过硫酸铵的0.4～0.6M氢氧化钠溶液混合，60℃下180rpm摇床中偶联8小时，抽滤，用去离子水洗涤，加入到含有1％H2O2和1％甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质。
2.根据权利要求1所述的一种疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，其特征在于所述纤维素/无机增重剂复合微球的骨架为纤维素，增重剂为钛白粉、不锈钢粉、镍粉或碳化钨粉，增重剂占湿球的质量百分比含量为16％～61％；纤维素/无机增重剂复合微球的粒径为50～250μm。
3.根据权利要求1所述的一种疏水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，其特征在于配基密度为30～65μmol/ml介质。
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