CN106397552A - 一种去除重组蛋白a溶液中内毒素的方法 - Google Patents

一种去除重组蛋白a溶液中内毒素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种去除重组蛋白A溶液中内毒素的方法,内毒素去除效果好,重组蛋白A回收率高,并可有效降低成本。所述方法包括以下步骤:(1)将含带有组氨酸标签重组蛋白A的菌体悬浮液加热处理,充分破碎菌体;(2)加入聚乙烯亚胺,混合均匀后离心,得到含重组蛋白A的上清液,所述含重组蛋白A的菌体悬浮液与所述聚乙烯亚胺的重量比为10000:1‑100:1;(3)过金属离子螯合层析柱,用PBS缓冲液冲洗介质后洗脱重组蛋白A,得预处理后的重组蛋白A溶液;(4)除盐,得到除盐后的重组蛋白A溶液;(5)经亲和层析填料提纯,得到去除了内毒素的重组蛋白A溶液,所述亲和层析填料可特异性结合内毒素。

Description

一种去除重组蛋白A溶液中内毒素的方法
技术领域
本发明涉及一种去除重组蛋白A溶液中内毒素的方法,属于生物工程技术领域。
背景技术
金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal aureus Protein A,SPA)简称蛋白A,是金黄色葡萄球菌的一种细胞壁蛋白。在1959年被确定能够与免疫球蛋白(Ig)类物质结合,随后证实它能与人及多种哺乳动物血清中IgG的Fc片段发生可逆的特异性结合,而且不影响IgG对抗原的结合活性,被广泛应用于科研、生物试剂、制药企业的抗体纯化及医疗领域。
天然蛋白A只占菌体总蛋白的1.7%,纯化步骤繁琐,产量低,难以满足大规模生产的需要,并且金黄色葡萄球菌为致病菌,可引起人体各种组织器官和组织的病变,包括菌血症、败血症、外毒素休克甚至致命,大规模生产危险很大。为了满足蛋白A市场日益增长的需求,现在人们开始采用基因工程的方法来生产重组蛋白A,但在使用基因工程重组大肠杆菌生产蛋白A时,内毒素残留量很大,由于其特殊的理化性质,极难去除。内毒素是一种强热源物质,极少量进入人体后就会导致内毒素血症,内毒素血症进一步的发展可能引起脓毒性休克、弥散性血管内凝血、急性呼吸窘迫综合症、全身炎症反应综合症或多功能衰竭的发生而导致死亡;因此在利用重组蛋白A进行生物制药领域的单克隆抗体纯化及临床用作抗体吸附剂,首先要去除内毒素的污染。
内毒素去除方法有很多,例如超滤法、活性炭吸附法、相分离法、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、亲和吸附法(即在填料表面偶联如多粘菌素B、组胺、组氨酸以及一些聚阳离子等具有特异性结合作用的配位基,从而可以选择性吸附与其可发生特异性结合的物质),此外还包括金属离子鳌合层析和氢氧化铝吸附法。在用金属离子鳌合层析(常见的如镍柱)和离子交换层析纯化重组蛋白A时,须先使用大量含离子或非离子表面活性剂的缓冲溶液冲洗介质以去除内毒素,然后通过梯度洗脱,得到提纯的重组蛋白A溶液。由于表面活性剂在介质中很难清洗干净,并严重影响介质对重组蛋白A的吸附性,因此在生产的两个批次之间,需使用氢氧化钠等对介质进行在位清洗,极大降低介质使用寿命,几个批次使用后,介质吸附性能下降明显,重组蛋白A的损失明显。通过凝胶过滤层析去内毒素时,由于内毒素在水溶液中以不同分子量的高分子聚合物存在,分子量几万到几百万不等,无法去除,并且速度慢、处理量小。专利文献CN103145813A《一种分离纯化重组蛋白A的方法》中,采用对工程重组大肠杆菌热裂解,活性炭吸附结合分离纯化重组蛋白A,重组蛋白A纯度可达95%以上,回收率60%以上,回收的重组蛋白A溶液中内毒素含量<10EU/mg,需要再用疏水亲和介质再次纯化,内毒素含量才可达<1EU/mg;由于活性炭是非特异性吸附,吸附内毒素的同时,也吸附重组蛋白A,导致重组蛋白A回收率低。世界最大蛋白A生产企业美国Repligen公司,其蛋白A产品内毒素含量都能处理到1EU/mg以下,占据蛋白蛋白A市场主导地位。
综上所述,目前去除重组蛋白A溶液中内毒素的方法主要存在内毒素去除效果差、重组蛋白A回收率低、成本高的问题。
发明内容
发明目的
本发明的目的是提供一种去除重组蛋白A溶液中内毒素的方法,内毒素去除效果好,重组蛋白A回收率高,并可有效降低成本。
发明概述
本发明所述的重组蛋白A是指全长或通过基因工程改造后的含某个或某些结构域或点突变的经基因克隆、转化、并通过微生物工程菌(大肠杆菌、酵母等)表达的重组蛋白A。
本发明实施方式提供了一种去除重组蛋白A溶液中内毒素的方法,包括以下步骤:
(1)将含重组蛋白A的菌体悬浮液加热处理,充分破碎菌体,所述重组蛋白A带有组氨酸标签;
(2)加入聚乙烯亚胺,混合均匀后离心,得到含重组蛋白A的上清液,所述含重组蛋白A的菌体悬浮液与所述聚乙烯亚胺的重量比为10000:1-100:1,优选为10000:1-10000:5,更优选为10000:3;
(3)过金属离子螯合层析柱,用PBS缓冲液冲洗介质后洗脱重组蛋白A,得预处理后的重组蛋白A溶液;
(4)除盐,得到除盐后的重组蛋白A溶液;
(5)经亲和层析填料提纯,得到去除了内毒素的重组蛋白A溶液,所述亲和层析填料可特异性结合内毒素。
带有组氨酸标签的重组蛋白A可以与金属离子相互作用,从而可以经金属离子螯合层析进行亲和纯化。优选的,所述重组蛋白A带有多聚组氨酸标签,例如6聚组氨酸标签。优选的,所述金属离子螯合层析柱为镍柱,例如镍柱介质为螯合高流速琼脂糖微球,所述介质可商购,例如可从西安恒成生物科技有限公司购得。
优选的,所述PBS缓冲液为含10mmol/L磷酸氢二钠、2mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠的混合溶液,pH值=8。PBS缓冲液的配置为本领域常规技术,通常先根据组分浓度配制溶液,最后根据情况加入少量NaOH调整pH值,由于加入的NaOH的量很少,基本不会影响组分浓度。
具体的,步骤(1)中加热处理,充分破碎菌体的具体步骤可以是:
取含重组蛋白A的菌体,加入PBS缓冲液混匀菌体,得到含重组蛋白A的菌体悬浮液,水浴加热搅拌0.5~1h,以充分破碎菌体,
所述含重组蛋白A的菌体与PBS缓冲液的重量比为1:20-1:5,优选为1:10;
所述水浴温度为50-100℃,优选为80℃。
所述含重组蛋白A的菌体可以自制或商购,常见的重组蛋白A工程菌株例如大肠杆菌B21(DE3)。
步骤(2)中,所述聚乙烯亚胺又称聚氮杂环丙烷,一种可溶于水的阳离子聚合物,可与酸性大分子发生静电相互作用而形成不溶性复合物,从而可以通过离心去除绝大部分的核酸和强酸性蛋白;同时,作为附带的技术效果,还能去除部分内毒素,只是上清液中残留的内毒素含量较高,需进一步处理。
优选的,步骤(2)中,所述聚乙烯亚胺为分枝状聚乙烯亚胺,重均分子量为3000-4000,更优选为3000;
所述离心优选在5000~15000r/min转速下进行,更优选在12000r/min转速下进行。
步骤(3)中所述过金属离子螯合层析柱为本领域常规分离提纯方法,具体步骤一般如下:
缓冲液及保存液配制:平衡缓冲液(通常称之为Buffer A),为含甘油的PBS缓冲液(甘油浓度一般为10%(v/v)(指100ml平衡缓冲液中含10ml甘油));洗脱缓冲液(通常称之为Buffer B),为含有不同浓度咪唑的一系列PBS缓冲液,用于梯度洗脱;保存液:一般为20%(v/v)乙醇水溶液。作为本领域公知常识,用于配制缓冲液和保存液的水和化学试剂必须是高纯度的,并建议使用前用0.45μm滤膜过滤一遍。
柱子制备:(a)轻轻颠倒翻转保存有介质的瓶子几次,使介质混合均匀;(b)吸取一定量的介质加入到柱子中,让介质自由沉降;(c)加入4倍柱体积的Buffer A洗去保存液并平衡层析介质,直到流出液的紫外吸光度A280值达到最低且稳定。
柱子纯化:(a)将带有组氨酸标签的蛋白(本发明中为重组蛋白A)澄清样品上样至柱中,流速控制为0.5-3ml/分钟,收集流出液以待后续分析;(b)冲洗;(c)梯度洗脱,得到含目的蛋白的洗脱液;
保存:以流速为1ml/分钟的保存液洗涤柱子,一般用量为3~5倍柱体积,或者直到流出液的A280值达到最低且稳定。
优选的,步骤(3)中,用Buf B洗脱重组蛋白A,所述Buf B中含100-250mmol/L的咪唑;优选含150mmol/L的咪唑;更优选还含10mmol/L的磷酸氢二钠、2mmol/L的磷酸二氢钾和150mmol/L的NaCl,pH值=8。
步骤(4)除盐步骤的目的是去除过金属离子螯合层析柱过程中引入的咪唑,为本领域常规步骤,具体的步骤可以是:采用透过分子量为5~20KDa的透析袋,将Buffer B洗脱的重组蛋白A溶液装入透析袋,放入透析液过夜透析,透析液与重组蛋白A溶液体积比为50~200,优选为100;所述透析液为Tris-HCl水溶液,pH值为8.0(根据情况加入NaOH调节pH值),优选所述Tris-HCl水溶液的浓度为15-25mM,更优选所述Tris-HCl水溶液的浓度为20mM。
优选的,步骤(5)中,所述除盐后的重组蛋白A溶液与所述亲和层析填料的体积比为1:1-5:1,优选为1:1。
步骤(5)中可采用如下两种具体方法提纯:
将除盐后的重组蛋白A溶液加入装有亲和层析填料的层析柱,收集穿流峰;
或者,向除盐后的重组蛋白A溶液中直接加入亲和层析填料,摇匀,离心,取上清,
得到去除了内毒素的重组蛋白A溶液。
其中,“向除盐后的重组蛋白A溶液中直接加入亲和层析填料,摇匀,离心,取上清”的具体步骤为:直接加入亲和层析填料,4℃、160r/min条件下摇动16h,5000r/min转速下离心,倒出上清。
优选的,所述亲和层析填料为表面结合有多聚赖氨酸作为配位基的亲和层析填料,所述多聚赖氨酸是由25~30个L-赖氨酸残基的组成的ε-型阳离子聚合多肽。更优选的,所述亲和层析填料为表面结合有多聚赖氨酸作为配位基的琼脂糖凝胶,如Sepharose 6FF琼脂糖凝胶。具体的,所述亲和层析填料可采用如下的制备方法得到:
(a)量取5~10mL Sepharose 6FF琼脂糖凝胶,用水充分洗涤、抽干(一般置于玻璃砂芯漏斗上实施该步骤);
(b)活化Sepharose 6FF琼脂糖凝胶:加入6~15ml 2.0mol/L的NaOH溶液和2~5mL环氧氯丙烷以及10~50mg NaBH4,震荡并滴加DMSO至完全混溶;室温下,100~200r/min振荡1~4h;洗涤产物,以除去残留的环氧氯丙烷,具体的洗涤程序可以如下所示:产物用5-50倍体积95%乙醇溶液洗涤3次,5-50倍体积去离子水洗涤5次,洗涤液通过1.3mol/L硫代硫酸钠溶液和酚酞滴定检测不变红,说明不再残留环氧氯丙烷;
(c)取0.5g多聚赖氨酸,用15~50ml的1~3mol/L碳酸钠溶液溶解,调节pH值至7~12,然后将活化好的Sepharose 6FF琼脂糖凝胶置于此溶液中,封口,于室温振荡反应16-48h;最后用去离子水洗至中性。
更优选的,所述亲和层析填料可采用如下的制备方法得到:
(a)量取6mL Sepharose 6FF琼脂糖凝胶,用水充分洗涤、抽干;
(b)活化Sepharose 6FF琼脂糖凝胶:加入9ml 2mol/L的NaOH溶液和2.4mL环氧氯丙烷以及22mg NaBH4,震荡并滴加DMSO至完全混溶;室温下转速200r/min振荡2h;洗涤产物,以除去残留的环氧氯丙烷;
(c)取0.5g多聚赖氨酸,用25ml的1.5mol/L碳酸钠溶液溶解,调节pH值至7-12,然后将活化好的Sepharose 6FF琼脂糖凝胶置于此溶液中,封口,于室温振荡反应16h;最后用去离子水洗至中性。
所述多聚赖氨酸是由25~30个L-赖氨酸残基的组成的ε-型阳离子聚合多肽,能够与酸性内毒素结合,并破坏其多聚体结构;相对以组氨酸、组胺、赖氨酸、精氨酸为配基的内毒素吸附剂,其吸附载量更大;ε-聚赖氨酸吸附内毒素作用原理与多粘菌素B相似,但无神经毒性和肾毒性,并且ε-型聚赖氨酸价格仅为1500-3000元/kg,相对于多粘菌素B的25000-35000元/kg,价格便宜,更适于大规模使用。
所述装入层析柱的亲和层析填料在提纯后可按照下述步骤进行冲洗,以去除结合在所述亲和层析填料上的内毒素:
(a)用2M NaCl作为洗涤液,5~10倍柱体积冲洗去除杂蛋白。
(b)用1M NaOH作为洗脱液,5~10倍柱体积冲洗去除内毒素、沉淀蛋白、以疏水性结合的蛋白或脂蛋白类物质。
(c)用至少50~100倍柱体积PBS缓冲液平衡柱子。
(d)用至少5~10倍柱体积20%(v/v)乙醇水溶液冲洗保存。
本发明除非特别指明,所述PBS缓冲液指单纯的PBS缓冲液,不含甘油、咪唑等功能性物质。而各种功能性缓冲液,如Buf A、Buf B,是在单纯PBS缓冲液中加入相应的功能性物质(如甘油、咪唑)得到的。作为优选方案,本发明所有单纯PBS缓冲液均采用同一的配方,即“含10mmol/L磷酸氢二钠、2mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠的混合溶液,pH值=8”,各种功能性缓冲液也只需在此基础上直接加入相应的功能性物质而制得。实验证明,这种方式不仅高效、低误差,同时提纯效果也很好。
现有技术采用活性炭提纯重组蛋白A,内毒素需要多次去除,操作繁琐,重组蛋白A回收率低。本发明所述方法先采用聚乙烯亚胺和金属离子螯合层析柱对破碎后的菌体悬浮液进行预处理,利用聚乙烯亚胺去除大部分的杂蛋白、核酸和部分内毒素,利用金属离子螯合层析柱收集初步提纯的重组蛋白A溶液,使重组蛋白A纯度达到90%以上;然后再利用经可特异性结合内毒素的亲和层析填料提纯,内毒素因特异性吸附作用被有效去除,无需洗脱步骤,直接得到去除了内毒素的重组蛋白A溶液,提纯的重组蛋白A溶液中的内毒素含量极低。由于金属离子螯合层析柱只用于收集初步提纯的重组蛋白A溶液,并不去除内毒素,因此无需使用表面活性剂冲洗介质,介质使用寿命大大延长、并有效解决了重组蛋白A的损失问题。显然,采用本发明所述方法,不仅可有效去除内毒素,而且重组蛋白A回收率高,同时大大降低生产成本。
现有技术中一般采用亲和吸附法去内毒素时以组氨酸、组胺、多粘菌素B作为配位基与内毒素产生特异性吸附,由于组氨酸、组胺作为配位基对内毒素吸附载量低,需多次吸附;多粘菌素B价格昂贵,有很强神经毒性和肾毒性,若从载体上脱落会产生严重的毒副作用,不适宜大规模使用。采用本发明优选方案,使用表面结合有多聚赖氨酸作为配位基的Sepharose 6FF琼脂糖凝胶去除内毒素时,内毒素吸附载量高,重组蛋白A回收率也更高,每ml凝胶可一次去除内毒素>10000EU,提纯的重组蛋白A溶液中的内毒素含量可达到<5EU/mg重组蛋白A(优化条件下甚至可达到<1EU/mg重组蛋白A),重组蛋白A回收率在95%以上,并且这种凝胶可以通过氢氧化钠再生,可重复使用50次以上。
综上所述,与现有技术相比,本发明的有益效果是:提供了一种新的去除重组蛋白A溶液中内毒素的方法,在有效纯化蛋白A的同时去除内毒素,并且蛋白回收率较高、成本低,适合于工业化生产去除重组蛋白A内毒素。
具体实施方式
下面对本发明做进一步阐述。
以下实施例中,磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、乙醇、NaCl、咪唑、环氧氯丙烷、NaBH4、二甲亚砜(DMSO)、Tris-HCl均为从国药集团化学试剂有限公司购得的分析纯级试剂;聚乙烯亚胺购自攻碧克新材料科技(上海)有限公司,GBK-PEI3K033,重均分子量3000;Sepharose6FF琼脂糖凝胶、镍柱介质为螯合高流速琼脂糖微球,从西安恒成生物科技有限公司购得;多聚赖氨酸为分析纯级ε-聚赖氨酸,从上海源叶生物购得;蛋白浓度检测试剂盒为碧云天P0012BCA蛋白浓度检测试剂盒,重组蛋白A工程菌株采用大肠杆菌B21DE3,从上海生物工程有限公司购得;透析袋为美国联合碳化物公司Viskase透析袋,透过分子量规格为8K-14KDa。
实施例1
一种去除重组蛋白A溶液中内毒素的方法,包括以下步骤:
(1)取含重组蛋白A的菌体10g,加入PBS缓冲液混匀菌体,得到含重组蛋白A的菌体悬浮液,于80℃水浴加热搅拌0.5h,以充分破碎菌体,所述重组蛋白A带有1个六聚组氨酸标签。
所述PBS缓冲液为含浓度为10mmol/L磷酸氢二钠、2mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠的混合溶液,NaOH调节pH值=8;
所述含重组蛋白A的菌体与PBS缓冲液的重量比为1:10;
(2)加入聚乙烯亚胺,混合均匀后,12000r/min转速下离心,取上清,得到含重组蛋白A的上清液,含重组蛋白A的菌体悬浮液与聚乙烯亚胺的重量比为10000:3;
(3)过镍柱,用Buf B洗脱重组蛋白A,得预处理后的重组蛋白A溶液,所述Buf B为含150mmol/L咪唑、10mmol/L磷酸氢二钠、2mmol/L磷酸二氢钠、150mmol/L氯化钠的混合溶液,pH值=8,具体操作步骤如下:
柱子制备:(a)轻轻颠倒翻转瓶子几次,使介质混合均匀;(b)吸取10ml的介质加入到柱子中,让介质自由沉降;(c)加入4倍柱体积的Buffer A(10%(v/v)甘油,10mmol/L的磷酸氢二钠、2mmol/L的磷酸二氢钾和150mmol/L的NaCl,用NaOH调pH值为8.0)洗去保存液并平衡层析介质,直到流出液的紫外吸光度A280值达到最低且稳定。
柱子纯化:(a)将含重组蛋白A的上清液上样至柱中,流速控制为0.5‐3ml/分钟,收集流出液以待后续分析;(b)PBS缓冲液冲洗,一般用量为3-5倍柱体积,直到流出液的A280值达到最低且稳定;(c)洗脱杂蛋白,以流速为1ml/分钟的含25mM咪唑的Buffer B(10mmol/L的磷酸氢二钠、2mmol/L的磷酸二氢钾和150mmol/L的NaCl,25mM咪唑,用NaOH调pH为8.0)洗涤柱子以去除杂蛋白,一般用量为8倍柱体积,或者直到流出液的A280值达到最低且稳定;(d)洗脱重组蛋白A,得到预处理后的重组蛋白A溶液,用3-10倍柱体积的含150mM咪唑的Buffer B(10mmol/L的磷酸氢二钠、2mmol/L的磷酸二氢钾和150mmol/L的NaCl,150mM咪唑,用NaOH调pH为8.0)以0.5-1ml/分钟的流速洗脱,收集洗脱液;或者根据流出液A280值判断,当数值陡然上升时开始接收洗脱液,直到A280数值降至最低且稳定停止收集。收集液体积为48ml;(e)洗脱杂蛋白,以流速为1ml/分钟的含500mM咪唑的Buffer B(10mmol/L的磷酸氢二钠、2mmol/L的磷酸二氢钾和150mmol/L的NaCl,500mM咪唑,用NaOH调pH为8.0)洗涤柱子以去除杂蛋白,一般用量为8倍柱体积,或者直到流出液的A280值达到最低且稳定;
保存:以流速为1ml/分钟的20%(v/v)乙醇水溶液(保存液)洗涤柱子,一般用量为3-5倍柱体积,或者直到流出液的A280值达到最低且稳定;
(4)除盐:采用透过分子量为8~14KDa的透析袋,将预处理后的重组蛋白A溶液装入透析袋,放入透析液过夜透析,透析液与预处理后的重组蛋白A溶液体积比为100,所述透析液20mM Tris-HCl水溶液,pH值为8.0。
(5)
制备可特异性结合内毒素的亲和层析填料:
(a)量取6mL Sepharose 6FF琼脂糖凝胶,置于玻璃砂芯漏斗上,用水充分洗涤、抽干;
(b)活化Sepharose 6FF琼脂糖凝胶:加入9ml 2mol/L的NaOH溶液和2.4mL环氧氯丙烷以及22mg NaBH4,震荡并滴加DMSO至完全混溶;室温下转速200振荡2h;产物用30ml95%乙醇溶液洗涤3次,5倍体积去离子水洗涤5次,洗涤液通过1.3mol/L硫代硫酸钠溶液和酚酞滴定检测不变红,说明不再残留环氧氯丙烷;
(c)取0.50g多聚赖氨酸,用25ml的1.5mol/L碳酸钠溶液溶解,调节pH值至7-12,然后将活化好的Sepharose 6FF琼脂糖凝胶置于此溶液中,封口,于室温振荡反应16h;最后用去离子水洗至中性。
向除盐后的重组蛋白A溶液中直接加入亲和层析填料,4℃、160r/min条件下摇动16h,5000r/min转速下离心5min,倒出上清,即得到去除了内毒素的重组蛋白A溶液,其中,预处理后的重组蛋白A溶液与亲和层析填料的体积比为1:1。
预处理后的重组蛋白A溶液中,重组蛋白A纯度通过HPLC检测纯度为92.6%,经BCA检测,去除了内毒素的重组蛋白A溶液中,重组蛋白A的浓度是2.62mg/mL,回收率为95.2%,通过鲎试剂检测,内毒素含量<0.5EU/mg重组蛋白A。
在其余条件完全相同情况下,当除盐后的重组蛋白A溶液与亲和层析填料的体积比分别为2:1;3:1;4:1时,提纯后的重组蛋白A溶液中的内毒素含量及重组蛋白A回收率如下表所示。
表1:亲和层析填料添加量对内毒素含量和蛋白质回收率的影响

Claims (10)

1.一种去除重组蛋白A溶液中内毒素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将含重组蛋白A的菌体悬浮液加热处理,充分破碎菌体,所述重组蛋白A带有组氨酸标签;
(2)加入聚乙烯亚胺,混合均匀后离心,得到含重组蛋白A的上清液,所述含重组蛋白A的菌体悬浮液与所述聚乙烯亚胺的重量比为10000:1-100:1,优选为10000:1-10000:5;
(3)过金属离子螯合层析柱,用PBS缓冲液冲洗介质后洗脱重组蛋白A,得到预处理后的重组蛋白A溶液;
(4)除盐,得到除盐后的重组蛋白A溶液;
(5)经亲和层析填料提纯,得到去除了内毒素的重组蛋白A溶液,所述亲和层析填料可特异性结合内毒素。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述亲和层析填料为表面结合有多聚赖氨酸作为配位基的亲和层析填料,所述多聚赖氨酸是由25~30个L-赖氨酸残基的组成的ε-型阳离子聚合多肽。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述亲和层析填料为表面结合有多聚赖氨酸作为配位基的琼脂糖凝胶,所述琼脂糖凝胶优选为Sepharose 6FF琼脂糖凝胶。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述亲和层析填料的制备方法为:
(a)量取5~10mL Sepharose 6FF琼脂糖凝胶,用水充分洗涤、抽干;
(b)活化Sepharose 6FF琼脂糖凝胶:加入6~15ml 2.0mol/L的NaOH溶液和2~5mL环氧氯丙烷以及10~50mg NaBH4,震荡并滴加DMSO至完全混溶;室温下,100~200r/min振荡1~4h;洗涤产物,以除去残留的环氧氯丙烷;
(c)取0.5g多聚赖氨酸,用15~50ml的1~3mol/L碳酸钠溶液溶解,调节pH值至7~12,然后将活化好的Sepharose 6FF琼脂糖凝胶置于此溶液中,封口,于室温振荡反应16-48h;最后用去离子水洗至中性。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,所述除盐后的重组蛋白A溶液与所述亲和层析填料的体积比为1:1-5:1,优选为1:1。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,
步骤(1)中,取含重组蛋白A的菌体,加入PBS缓冲液混匀菌体,得到含重组蛋白A的菌体悬浮液,水浴加热搅拌0.5~1h,以充分破碎菌体;
所述含重组蛋白A的菌体与PBS缓冲液的重量比为1:20-1:5,优选为1:10;
所述水浴温度为50-100℃,优选为80℃。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,
步骤(2)中,所述聚乙烯亚胺为分枝状聚乙烯亚胺,重均分子量为3000-4000,优选为3000;
所述离心优选在5000~15000r/min转速下进行,更优选在12000r/min转速下进行。
8.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,
步骤(3)中,用Buf B洗脱重组蛋白A,所述Buf B中含100-250mmol/L的咪唑;优选含150mmol/L的咪唑。
9.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,
所述PBS缓冲液为含10mmol/L的磷酸氢二钠、2mmol/L的磷酸二氢钾和150mmol/L的NaCl的混合溶液,pH值=8。
10.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(4)中,
将除盐后的重组蛋白A溶液加入装有所述亲和层析填料的层析柱,收集穿流峰;
或者,向除盐后的重组蛋白A溶液中直接加入所述亲和层析填料,摇匀,离心,取上清,
得到去除了内毒素的重组蛋白A溶液。
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