CN113121637A - 一种重组蛋白的分离纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于蛋白质化学领域，具体涉及一种重组蛋白的分离纯化方法，所述方法包括如下步骤：将含目的重组蛋白的发酵液，离心得湿菌体，经破菌、洗涤和复性等初级纯化处理，通过至少一个切向流膜过滤，酶切，再进行至少两次反相层析、除热原、超滤和装瓶步骤，获得纯度99.7％的甘精胰岛素，该方法适可有效去除内毒素、降低聚体等杂质，适合于规模化工业生产甘精胰岛素。

Description

一种重组蛋白的分离纯化方法
技术领域
本发明属于蛋白质化学领域，具体涉及一种重组蛋白的分离纯化方法。
背景技术
重组蛋白是利用重组DNA或RNA技术，在大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等系统获得的蛋白质，具有疗效显著、特异性强、毒性低和副作用小等优势。目前，生物医药领域的大多数产品均为重组蛋白类产品，例如酶、重组细胞因子、Fc融合蛋白、嵌合蛋白、单克隆抗体及其衍生产品等。
大肠杆菌表达系统是目前最常用外源蛋白表达系统，具有周期短、培养成本低、代谢调控较为成熟、操作方便等优点，成为重组蛋白的首选表达系统，但大肠杆菌胞内缺乏合适的氧化还原环境，且表达速度快使得外源蛋白聚集，这些蛋白不能及时折叠，从而极易形成不可溶的包涵体。据报道，只有10％左右的哺乳动物细胞来源的蛋白在大肠杆菌系统能够获得可溶性表达，其余大部分蛋白都以包涵体形式表达。现已上市的生物药物中以大肠杆菌系统生产的产品仍主要以包涵体形式表达，包涵体的纯化及其变性、复性过程直接关系到大规模生产的效率及生产成本。
目前，重组蛋白的分离纯化主要有如下几种：a)一步法，即通过一步凝胶筛分(CN1432578A，CN 1524957A等)、一步镍离子螯合层析(CN 101050464A、CN101298476A)或一步亲和层析(CN 101921818A)获得目的产物；b)两步法，包括采用亲和层析-亲和层析法(CN109055416A)、亲和层析—阴离子交换层析两步法(US 5075423A)、亲和层析-阳离子交换层析(CN103695508B)、阴离子交换层析-疏水层析、阴离子交换层析-分子筛层析(CN101220082B)、阴离子交换层析-镍离子螯合层析法(CN1663960A)、反相层析-镍离子螯合层析法(CN1663960A)、疏水层析-羟基磷灰石柱层析、疏水层析—阳离子交换层析(US6555661B1)、阴离子交换层析-阳离子交换层析等；c)多步法，热处理—离子交换层析—乙醇沉淀三步法(US 5314993 A)、羟基磷灰石柱层析-羟基磷灰石柱层析-反相层析、热处理-活性炭吸附-二次活性炭吸附、疏水层析-离子交换层析-分子筛层析(CN 105884859A)、阴离子层析柱-氨基苯硼酸柱层析或苯基交联琼脂糖凝胶层析柱-陶瓷羟基磷灰石层析柱-阳离子层析柱(CN101970650B、CN106148302A)等。
一步分子筛纯化法，处理量小，产品纯度不高，不适宜大规模生产；利用组氨酸标签构建重组基因，并采用镍离子螯合层析纯化重组蛋白，需要在纯化过程中加入特定的酶来切除组氨酸标签，所得产品纯度低。早在1972年，Hjelm等人就提出采用IgG亲和层析的方法纯化重组蛋白：以交联琼脂糖凝胶为载体，采用溴化氰活化工艺，以IgG为功能基制成亲和层析柱纯化重组蛋白。该方法操作简单，且一步层析操作即可使纯化的重组蛋白纯度达到95％，然而，由于IgG属生物大分子，分子量大，因此为减少空间位阻，单位体积载体上只能偶联少量的IgG，造成亲和层析柱动态载量低，难以大规模生产，多用于实验室规模纯化；且偶联IgG时利用的是IgG表面大量的氨基，属于多点偶联工艺，必然导致固定化的蛋白空间取向不均一，增大了空间位阻。
发明CN1663960A公开了一种高效表达重组人胰岛素原及其类似物的新型C肽，分别使用阴离子交换层析-镍离子螯合层析法、反相层析-镍离子螯合层析法纯化甘精胰岛素，虽纯度较高，但工艺复杂。发明WO 2007/035341A1，公开了一种纯化蛋白的方法，使用过滤、渗滤、以及两步连续的层析操作，其中第一步为阴离子交换层析、疏水作用层析或陶瓷羟基磷灰石层析，第二步为阳离子交换层析，该方法同样存在操作步骤多、效率低等问题。
发明CN105294854A公开了一种提高胰岛素及其类似物制备效率的方法，使用羟基磷灰石柱层析-羟基磷灰石柱层析-反相层析纯化甘精胰岛素，方法涉及酶切和反复复性，影响蛋白的活性，工艺步骤多。Hammond等人发表了一种使用加热处理、除盐柱除盐、DEAE弱阴离子交换层析以及苯基疏水作用层析，进行大规模纯化重组蛋白A的方法，该方法操作复杂，总回收率低。CN 105884859A公开了一种分离纯化重组蛋白的方法，用PEG沉淀法对变性包涵体进行纯化后，再进行变性、复性过程，使用疏水层析-离子交换层析-分子筛层析纯化重组蛋白，仍涉及反复变性、复性等问题。
发明CN102015762A公开了一种获得纯化的生物活性异源蛋白的方法，采用毕赤酵母发酵并使用结晶、阳离子交换层析、结晶、胰蛋白酶消化、PR-HPLC制备等获得甘精胰岛素，方法复杂、成本较高，总收率较低。发明CN102471367A公开了一种制备非线性梯度色谱法及其纯化的产物，纯化方法使用离子交换或反相制备色谱法，可得到纯度90～95％的甘精胰岛素，但批处理量较小，不适合大规模生产。发明CN102471368A公开了一种色谱方法及其纯化的化合物，具体使用离子对试剂和RP制备线性色谱，获得包含甘精胰岛素在内的胰岛素类似物，纯度较高，但载样量不高。
发明CN101970650B、CN106148302A公开了一种重组蛋白质的纯化方法，纯化步骤为微滤澄清、超滤浓缩换液后，依次经过高流速季铵琼脂糖凝胶阴离子层析柱、氨基苯硼酸柱层析或高效苯基交联琼脂糖凝胶层析柱、陶瓷羟基磷灰石I型层析柱和高效磺酸基琼脂糖凝胶阳离子层析柱，分别存在使用昂贵填料、处理量小、难以实现规模化工业生产等问题。
国内专利申请的重组蛋白的纯化方法很少涉及内毒素去除，对凝胶筛分法而言，由于处理量小、速度慢，而且无法去除内毒素，因而根本无法用于蛋白的工业化生产。而对于亲和层析、金属离子螯合层析等的纯化方法，为去除内毒素，必须使用大量的含表面活性剂的缓冲液(体积为层析介质体积的十几倍至几十倍)冲洗层析介质，在环保和蛋白回收上很不利。此外，镍离子螯合层析介质、亲和层析介质等层析介质一般价格昂贵、稳定性不高；蛋白A亲和层析在反复使用过程中会产生一定程度的脱落，残留在产品中的Protein A会引起不良免疫应答反应，其和抗体的复合物在体内可激活携带Fc的白细胞和补体系统的免疫应答，产生氧化和过敏反应。
重组蛋白生产中，由于在发酵、纯化以及制剂过程中因一些物理的和化学的因素，比如培养的温度和时间、低pH值、剪切力以及表面吸附等，聚集体会经常产生，聚集体不但会使病人产生免疫反应，甚至会使人对药物产生免疫耐受性，从而大大降低了药物的药效，还会影响蛋白质药物的生物活性、稳定性以及保存期等。
综上，从培养细胞的化合物的混合物中以及从细胞自身的副产物中分离期望的蛋白质达到足够用作为人类治疗剂的纯度仍是一种艰难的挑战。重组蛋白在表达和纯化工艺上还存在相当大的技术困难，远未达到满足人们需求的程度，发展新型的表达和纯化技术，提高包涵体的纯化效率具有重要意义。
本发明提供了一种重组蛋白的分离纯化方法，可有效去除内毒素、降低聚体等杂质，获得较高纯度的重组蛋白。
发明内容
鉴于现有技术中不能有效去除内毒素、聚体含量高、工艺路线长、操作复杂、生产成本较高、不能实现规模化工业生产重组蛋白等不足，本申请提供一种可有效去除内毒素、降低聚体含量、工艺路线短并有望实现工业生产纯度较高的重组蛋白的方法。
本发明的技术方案为：通过基因克隆构建大肠杆菌表达菌株，获得重组蛋白工程菌，发酵获得重组表达的目的蛋白，然后将发酵液经初级纯化处理后，通过一步或多步切向流膜过滤，酶切，然后进行至少两次反相层析、除热原、超滤和装瓶步骤得到纯度较高的目的重组蛋白。
一种重组蛋白的分离纯化方法，包括如下步骤：将含目的重组蛋白的发酵液，离心得湿菌体，然后经破菌、洗涤和复性等初级纯化处理后，通过至少一个切向流膜过滤，酶切，再进行至少两次反相层析、除热原、超滤和装瓶步骤得到纯度较高的目的重组蛋白。
一种重组蛋白的分离纯化方法，具体包括如下步骤：
A.超滤：将含有目的重组蛋白的初级纯化样品，经装有切向流膜的过滤器超滤，得滤液，即为含目的蛋白的过滤样品；
B.酶切：使用胰蛋白酶对步骤A所得的含目的蛋白的过滤样品进行酶切，得酶切液；
C.反相层析：稀释步骤B所得的酶切液，过滤，并装载至反相层析柱上，用平衡液冲洗层析柱至基线吸光度，梯度洗脱液洗脱，收集含目的重组蛋白的流出液；
D.反相层析：反相层析树脂柱装柱平衡后，装载步骤C所得的含目的重组蛋白的流出液，用平衡缓冲液洗涤层析柱至基线吸光度，洗脱液洗脱，收集含目的重组蛋白的流出液；
E.除热原：反相层析树脂装柱平衡后，装载步骤D所得的含目的重组蛋白的流出液，用平衡液平衡至基线吸光度，洗脱液洗脱，收集含目的重组蛋白的流出液；
F.超滤和装瓶：将步骤E所得的含目的重组蛋白的流出液，经装有切向流膜过滤器超滤浓缩，收集滤液，即为目的重组蛋白。
优选地，步骤A中所述的切向流滤膜为再生纤维素膜或聚醚砜膜，截留分子量为10～300KD，进一步优选截留分子量为100～300KD。
优选地，步骤B中所述的胰蛋白酶为牛胰蛋白酶或猪胰蛋白酶。
进一步优选地，步骤B中所述的胰蛋白酶与胰岛素前体的质量比为1∶400～900，mg/mg。
更为优选地，步骤B中所述的胰蛋白酶与胰岛素前体的质量比为1∶700～900，mg/mg。
优选地，步骤C中所述的反相层析的填料为Source RPC。
进一步优选地，步骤C中所述的反相层析的填料为Source 15RPC或Source 30RPC。
优选地，步骤C中所述的梯度洗脱液为A相和B相组成，其中A相为10～40mM柠檬酸三钠或乙酸钠、80～350mM氯化钠或氯化钾与10～20％异丙醇(V/V)的混合溶液，B相为10～40mM柠檬酸三钠或乙酸钠、40～180mM氯化钠或氯化钾与40～50％异丙醇(V/V)的混合溶液。
进一步优选地，步骤C中所述的梯度洗脱液为A相和B相组成，其中A相为20～30mM柠檬酸三钠或乙酸钠、100～300mM氯化钠或氯化钾与10～20％异丙醇(V/V)的混合溶液，B相为20～30mM柠檬酸三钠或乙酸钠、50～150mM氯化钠或氯化钾40～50％异丙醇(V/V)的混合溶液。
优选地，步骤C中所述的梯度洗脱液按30％～90％B相洗脱15CV。
优选地，步骤C中所述的层析柱的装载极限为每升树脂6～15g样品。
进一步优选地，步骤C中所述的层析柱的装载极限为每升树脂8～12g样品。
优选地，步骤D中所述的反相层析的填料为C8。
进一步优选地，步骤D中所述的反相层析的填料为Uni Insulin C8 type B、Unisil 10-120 C8Ultra或Daiso SP-200-C8-10-BIO。
优选地，步骤D中所述的梯度洗脱液为A相和B相组成，其中A相为5～20mM柠檬酸三钠、90～200mM硫酸铵和5～20％乙腈(V/V)的混合溶液，B相为5～20mM柠檬酸三钠、20～80mM硫酸铵和30～80％乙腈(V/V)的混合溶液。
进一步优选地，步骤D中所述的梯度洗脱液为A相和B相组成，其中A相为5～20mM柠檬酸三钠、90～120mM硫酸铵、和8～15％乙腈(V/V)的混合溶液，B相为5～20mM柠檬酸三钠、40～50mM硫酸铵和40～65％乙腈(V/V)的混合溶液。
优选地，步骤D中所述的梯度洗脱液按40％～80％B相洗脱10CV。
优选地，步骤D中所述的层析柱的装载极限为每升层析树脂4～15g样品。
进一步优选地，步骤D中所述的层析柱的装载极限为每升层析树脂8～12g样品。
优选地，步骤E中所述的反相层析的填料为Source RPC。
进一步优选地，步骤E中所述的反相层析的填料为Source 30RPC或Source 15RPC。
优选地，步骤E中所述的洗脱液为含氯化钠或氯化钾、柠檬酸三钠或乙酸铵的乙腈或异丙醇溶液。
进一步优选地，步骤E中所述的洗脱液为0.1～0.5M氯化钠或氯化钾、20～30mM的柠檬酸三钠或乙酸铵溶液和35％-80％的乙腈或异丙醇(V/V)溶液。
更为优选地，步骤E中所述的洗脱液为0.2～0.4M氯化钠或氯化钾、20～30mM的柠檬酸三钠或乙酸铵溶液和40％-60％的乙腈或异丙醇(V/V)溶液。
优选地，步骤E中所述的层析柱的装载极限为每升树脂10～20g样品。
进一步优选地，步骤E中所述的层析柱的装载极限为每升树脂12～17g样品。
优选地，步骤F中所述的切向流滤膜的型号为PLC6C-C或PLCGC-C，截留分子量为5～50KD。
进一步优选地，步骤F中所述的切向流滤膜的型号为PLC6C-C或PLCGC-C，截留分子量为10～30KD。
在一个实施方式中，包括如下内容：
A.超滤：将含目的重组蛋白的初级纯化样品，经再生纤维素P2100-C01 100KD、PLC-100-C01 200KD或聚醚砜P2B-100-A05 300KD切向流膜过滤澄清过滤，浓缩20～50倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和硫酸铵缓冲液按体积比1∶3～5置换至少3～5次，合并滤液，即为重组蛋白的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中；
B.酶切：使用牛胰蛋白酶或猪胰蛋白酶对步骤B所得的含目的蛋白的过滤样品进行酶切，胰蛋白酶与胰岛素前体的量为1∶700～900(mg/mg)，调pH为8.0～9.5，控制温度4～15℃，酶切7～13h，调pH3.0终止酶切，得酶切液，酶切液存放于2～8℃；
C.反相层析：使用Source 15RPC或Source 30RPC装柱，并用A相(pH为3.0～4.0的20～30mM柠檬酸三钠或乙酸钠、100～300mM氯化钠或氯化钾和10～20％异丙醇的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠或乙酸钠、3M氯化钠或氯化钾和100％异丙醇的溶液稀释步骤B所得的酶切液，以包含20～30mM柠檬酸三钠或乙酸钠、100～300mM氯化钠或氯化钾和10～20％异丙醇的目标浓度，调节pH为3.0～4.0，过滤后装载至反相层析柱上，层析柱的装载极限为每升树脂8～12g样品，然后用A相(pH为3.0～4.0的20～30mM柠檬酸三钠或乙酸钠、100～300mM氯化钠或氯化钾和10～20％异丙醇的溶液)冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为3.0～4.0的20～30mM柠檬酸三钠或乙酸钠、100～300mM氯化钠或氯化钾和10～20％异丙醇的溶液)，与B相(pH为3.0～4.0的20～30mM柠檬酸三钠或乙酸钠、50～150mM氯化钠或氯化钾和40～50％异丙醇的溶液)，进行梯度洗脱(30％～90％B相洗脱15CV)，收集含重组蛋白的流出液；
D.反相层析：使用Uni Insulin C8 type B、Unisil 10-120 C8Ultra或Daiso SP-200-C8-10-BIO装柱，用A相(pH为3.0～4.0的10mM柠檬酸三钠溶液、100mM硫酸铵和10％乙腈的溶液)平衡后，用1M柠檬酸三钠、3M硫酸铵与100％乙腈的溶液稀释步骤C所得的流出液，以包含10mM柠檬酸三钠溶液、100mM硫酸铵和10％乙腈的目标浓度，调节pH为3.0～4.0，过滤后装载至反相层析柱上，层析柱的装载极限为每升层析树脂8～12g样品，上样完毕后，用A相(pH为3.0～4.0的10mM柠檬酸三钠、100mM硫酸铵和10％乙腈的溶液)洗涤层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为3.0～4.0的5～20mM柠檬酸三钠、90～120mM硫酸铵、8～15％乙腈的溶液)和B相(5～20mM柠檬酸三钠、40～50mM硫酸铵、65～80％乙腈的溶液)，进行梯度洗脱(40％～80％B相洗脱10CV)，收集含重组蛋白的流出液；
E.除热原：使用Source 30RPC或Source15RPC装柱，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为3.0～4.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液和5～10％乙腈或异丙醇溶液平衡，用1M柠檬酸三钠与100％乙腈或异丙醇的溶液稀释步骤D所得的流出液，以包含25mM柠檬酸三钠缓冲液和5～10％乙腈或异丙醇的目标浓度，调节pH为3.0～4.0，过滤后装载至层析柱上，反相层析柱的装载极限为每升树脂12～17g样品，然后用pH为3.0～4.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为3.0～4.0的0.2～0.4M氯化钠或氯化钾溶液、20～30mM的柠檬酸三钠或乙酸铵缓冲液和40％-60％的乙腈或异丙醇溶液，洗脱，收集含重组蛋白的流出液；
F.超滤和装瓶：将步骤E所得的含重组蛋白的流出液，经PLC6C-C 10KD、PLCGC-C-15KD或PLCGC-C-20KD切向流膜过滤澄清过滤，浓缩3～5倍后，调节pH6.0-7.0，2-8℃缓慢搅拌结晶12小时，所得沉淀用pH6.0-7.0洗涤缓冲液洗涤后收集沉淀，-40～-20℃真空冷冻干燥10小时以上，2–8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻，所得产品即为目的重组蛋白。
所述的重组蛋白为本领域公知的重组蛋白、融合蛋白或氨基酸片段等。
在一个优选的技术方案中，所述重组蛋白为甘精胰岛素。
本发明与现有技术相比具有如下突出优点：
1、本发明所公开的一种纯化重组蛋白的方法，可有效去除内毒素、降低聚体等杂质，该方法所得到纯度为99.7％的甘精胰岛素，收率也较高；
2、切向流膜过滤器可有效收集目的蛋白，去除宿主细胞碎片和部分杂蛋白，用于提高纯化效率，简化操作，且蛋白吸附量较低；
3、本发明使用反相层析可在富集蛋白的同时去除C肽、酶切片段等杂质，二次反相层析可进一步去除有关杂质等，热原去除步骤可去除痕量的蛋白、多聚体及热原等；
4、本发明的纯化方法适用于本领域公知的重组蛋白、融合蛋白或氨基酸片段等；
5、所采用的层析方法容易线性比例放大至大规模生产条件下使用，满足工业生产的需要。
具体实施方式
下面列举实施例予以进一步说明：所述的蛋白可以是本领域公知的重组蛋白、融合蛋白或氨基酸片段，本发明要保护的技术方案不仅仅限于以下实施例，以重组甘精胰岛素为例，对于地特胰岛素、德谷胰岛素等其它胰岛素也适用。
实施例中重组蛋白的最终产物纯度检测可参考公知的甘精胰岛素公示稿检测。
重组甘精胰岛素的表达：参照Novagen公司《pET系统操作手册》(第10版)，按照常规分子克隆技术构建甘精胰岛素质粒，转入pET30a BL-21(DE3)大肠杆菌表达菌株，获得甘精胰岛素工程菌，发酵获得重组表达的甘精胰岛素前体，在100L发酵体积下，OD600达到120，目的蛋白表达率可达到42％。
将发酵所得湿菌体用pH9.0的0.1MTris、50mM氯化铵缓冲液悬浮，90MPa均质三次离心后收集包涵体，所得的包涵体分别使用缓冲液A(4M尿素、0.1MTris、1％曲拉通、1M氯化铵，pH9.0)，缓冲液B(0.1MTris，pH9.0)和缓冲液C(5M尿素、1％巯基乙醇)三次洗涤溶解，所得包涵体用缓冲液D(20mMTris、1mMEDTA、pH9.0)稀释复性得到初级纯化样品。
实施例1
A.超滤：将含有甘精胰岛素前体的初级纯化样品(120.5L，0.25g/L)，经纤维素膜再生纤维素P2C-100-C01 100KD切向流膜过滤澄清过滤，浓缩30倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和0.1M硫酸铵缓冲液按体积比1:4置换至少3次，合并滤液，即为甘精胰岛素前体的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，收率95.2％；
B.酶切：使用牛胰蛋白酶对步骤A所得的含甘精胰岛素前体的过滤样品进行酶切，加入牛胰蛋白酶35.85mg，调pH为9.0，控制温度4℃，酶切12h，调pH3.0终止酶切，得酶切液，酶切液存放于2～8℃环境中，收率60.4％；
C.反相层析：使用Source 15RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为4.0的A相(25mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠和15％异丙醇的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠、3M氯化钠与100％异丙醇的溶液稀释步骤B所得的酶切液，以包含25mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠和15％异丙醇的目标浓度，调节pH为4.0，过滤后装载至反相层析柱上，然后用pH为4.0的A相(25mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠和15％异丙醇的溶液)冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为4.0的A相(25mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠和15％异丙醇的溶液)和B相(25mM柠檬酸三钠、75mM氯化钠和45％异丙醇的溶液)，进行梯度洗脱(30％～90％B相洗脱15CV)，收集含甘精胰岛素的流出液，收率89.6％；
D.反相层析：使用Uni Insulin C8 type B装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，用A相(pH为4.0的10mM柠檬酸三钠、100mM硫酸铵和10％乙腈的混合溶液)平衡后，用1M柠檬酸三钠、3M硫酸铵与100％乙腈的溶液稀释步骤C所得的流出液，以包含10mM柠檬酸三钠、100mM硫酸铵和10％乙腈的目标浓度，调节pH为4.0，过滤后装载至层析柱上，上样完毕后，用A相(pH为4.0的10mM柠檬酸三钠、100mM硫酸铵和10％乙腈的溶液)洗涤层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为4.0的10mM柠檬酸三钠、100mM硫酸铵和10％乙腈的溶液)，与B相(pH为4.0的10mM柠檬酸三钠、50mM硫酸铵和75％乙腈的溶液)，进行梯度洗脱(40％～80％B相洗脱10CV)，收集含甘精胰岛素的流出液，在每一次循环之间，用90％乙腈再生层析柱，收率89.9％；
E.除热原：使用Source 30RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为4.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液和8％乙腈的溶液平衡，用1M柠檬酸三钠与100％乙腈的溶液稀释步骤D所得的流出液，以包含25mM柠檬酸三钠缓冲液和8％乙腈的目标浓度，调节pH为4.0，过滤后装载至层析柱上，然后用pH为4.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液和8％乙腈的溶液冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为4.0的0.3M氯化钠、25mM柠檬酸三钠和50％的乙腈的溶液洗脱，收集含甘精胰岛素的流出液，收率90.6％；
F.超滤和装瓶：将步骤E所得的含甘精胰岛素的流出液，经PLC6C-C 10KD切向流膜过滤澄清过滤，浓缩3倍后，调节pH7.0，2-8℃缓慢搅拌结晶12小时，所得沉淀用pH7.0洗涤缓冲液洗涤后收集沉淀，-40～-20℃真空冷冻干燥10小时以上，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻，所得产品即为甘精胰岛素，收率89.0％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
实施例2
A.超滤：将含有胰岛素前体的初级纯化样品(120.9L，0.25g/L)，经PLC-100-C01200KD切向流膜过滤澄清过滤，浓缩20倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和0.1M硫酸铵缓冲液按体积比1:3置换至少4次，合并滤液，即为甘精胰岛素前体的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，收率94.8％；
B.酶切：使用牛胰蛋白酶对步骤A所得的过滤样品进行酶切，加入牛胰蛋白酶40.94mg，调pH为9.5，控制温度8℃，酶切10h，调pH3.0终止酶切，得酶切液，酶切液存放于2～8℃环境中，收率60.1％；
C.反相层析：使用Source 30RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用A相(pH为3.0的20mM柠檬酸三钠、100mM氯化钾和10％异丙醇的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠、3M氯化钾与100％异丙醇的溶液稀释步骤B所得的酶切液，以包含20mM柠檬酸三钠、100mM氯化钾和10％异丙醇的目标浓度，调节pH为3.0，过滤后装载至层析柱上，然后用A相(pH为3.0的20mM柠檬酸三钠、100mM氯化钾和10％异丙醇的溶液)冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为3.0的20mM柠檬酸三钠、100mM氯化钾和10％异丙醇的溶液)和B相(pH3.0的20mM柠檬酸三钠、50mM氯化钾和40％异丙醇的溶液)，进行梯度洗脱(30％～90％B相洗脱15CV)，收集含甘精胰岛素的流出液，收率88.1％；
D.反相层析：使用Unisil 10-120C8Ultra装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，用A相(pH为3.0的5mM柠檬酸三钠、90mM硫酸铵和8％乙腈的溶液)平衡后，用纯化水将步骤C所得的流出液稀释一倍，调节pH为3.0，过滤后装载至层析柱上，再用A相(pH为3.0的5mM柠檬酸三钠、90mM硫酸铵和8％乙腈的溶液)，冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为3.0的5mM柠檬酸三钠、90mM硫酸铵和8％乙腈的溶液)与B相(pH为3.0的5mM柠檬酸三钠、40mM硫酸铵和65％乙腈的溶液)，进行梯度洗脱(50％～80％B相洗脱10CV)，收集含甘精胰岛素的流出液，收率88.5％；
E.除热原：使用Source 15RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为3.0的25mM柠檬酸三钠和5％乙腈的溶液平衡，用1M柠檬酸三钠与100％乙腈的溶液稀释步骤D所得的流出液，以包含25mM柠檬酸三钠与5％乙腈的目标浓度，调节pH为3.0，过滤后装载至层析柱上，然后用pH为3.0的25mM柠檬酸三钠和5％乙腈的溶液冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为3.0的0.2M氯化钾、20mM的柠檬酸三钠和40％的乙腈的溶液洗脱，收集含甘精胰岛素的流出液，收率90.2％；
F.超滤和装瓶：将步骤E所得的含甘精胰岛素的流出液，经PLCGC-C-20KD切向流膜过滤澄清过滤，浓缩3倍后，调节pH6.0，2-8℃缓慢搅拌结晶12小时，所得沉淀用pH6.0洗涤缓冲液洗涤后收集沉淀，-40～-20℃真空冷冻干燥10小时以上，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻，所得产品即为甘精胰岛素，收率87.8％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
实施例3
A.超滤：将含甘精胰岛素前体的初级纯化样品(120.4L，0.25g/L)，经聚醚砜P2B-100-A05 300KD，切向流膜过滤澄清过滤，浓缩50倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和0.1M硫酸铵缓冲液按体积比1:5置换至少3次，合并滤液，收集存放于2～8℃环境中，收率94.8％；
B.酶切：使用猪胰蛋白酶对步骤B所得的过滤样品进行酶切，加入猪胰蛋白酶31.70mg，调pH为8.0，控制温度6℃，酶切13h，调pH3.0终止酶切，得酶切液，酶切液存放于2～8℃环境中，收率60.3％；
C.反相层析：使用Source 30RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，并用A相(pH为3.5的30mM乙酸钠、300mM氯化钠和20％异丙醇的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M乙酸钠、3M氯化钠与100％异丙醇的溶液稀释步骤B所得的酶切液，以包含30mM乙酸钠、300mM氯化钠和20％异丙醇的目标浓度，调节pH为3.5，过滤后装载至层析柱上，然后用A相(pH为3.5的30mM乙酸铵、300mM氯化钠和20％异丙醇的溶液)冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为3.5的30mM乙酸钠、300mM氯化钠和20％异丙醇的溶液)和B相(30mM乙酸铵、150mM氯化钠和50％异丙醇的溶液)，进行梯度洗脱(35％～90％B相洗脱15CV)，收集含甘精胰岛素的流出液，收率88.2％；
D.反相层析：使用Daiso SP-200-C8-10-BIO装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，用A相(pH为3.5的20mM柠檬酸三钠、120mM硫酸铵和15％乙腈的溶液)平衡后，用纯化水将步骤C所得的流出液稀释一倍，调节pH为3.5，过滤后装载至层析柱上，上样完毕后，用A相(pH为3.5的20mM柠檬酸三钠、120mM硫酸铵和15％乙腈的溶液)洗涤层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为3.5的20mM柠檬酸三钠、120mM硫酸铵和15％乙腈的溶液)，与B相(pH为3.5的20mM柠檬酸三钠、60mM硫酸铵和80％乙腈的溶液)，进行梯度洗脱(30％～80％B相洗脱10CV)，收集含甘精胰岛素的流出液，收率89.1％；
E.除热原：使用Source 15RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为3.5的25mM柠檬酸三钠缓冲液和10％异丙醇溶液平衡，用1M柠檬酸三钠与100％异丙醇的溶液稀释步骤D所得的流出液，以包含25mM柠檬酸三钠缓冲液和10％异丙醇的目标浓度，调节pH为3.5，过滤后装载至层析柱上，然后用pH为3.5的25mM柠檬酸三钠缓冲液和10％异丙醇溶液冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为3.5的0.4M氯化钠、30mM的柠檬酸三钠和60％的异丙醇溶液洗脱，收集含甘精胰岛素的流出液，收率90.0％
F.超滤和装瓶：将步骤E所得的含甘精胰岛素的流出液，经PLCGC-C-30KD切向流膜过滤澄清过滤，浓缩3倍后，调节pH7.0，2-8℃缓慢搅拌结晶12小时，所得沉淀用pH7.0洗涤缓冲液洗涤后收集沉淀，-40～-20℃真空冷冻干燥10小时以上，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻，所得产品即为甘精胰岛素，收率87.2％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
实施例4
A.超滤：将含有甘精胰岛素前体的初级纯化样品(120.5L，0.25g/L)，经再生纤维素P2C-100-C01 50KD向流膜过滤澄清过滤，浓缩35倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和0.1M硫酸铵缓冲液按体积比1:6置换至少3次，合并滤液，即为甘精胰岛素融合蛋白前体的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，收率93.7％；
B.酶切：使用牛胰蛋白酶对步骤A所得的含甘精胰岛素前体的过滤样品进行酶切，加入牛胰蛋白酶70.58mg，调pH为8.5，控制温度10℃，酶切9h，调pH3.0终止酶切，得酶切液，酶切液存放于2～8℃环境中，收率58.6％；
C.反相层析：使用Source 15RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用A相(pH3.0的10mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和10％异丙醇的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠、3M氯化钠与100％异丙醇的溶液稀释步骤B所得的酶切液，以包含10mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和10％异丙醇的目标浓度，调节pH为3.0，过滤后装载至层析柱上，过滤后装载至反相层析柱上，然后用A相(pH3.0的10mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和10％异丙醇的溶液)冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH3.0的10mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和10％异丙醇的溶液)和B相(pH3.0的10mM柠檬酸三钠、40mM氯化钠和50％异丙醇的溶液)，进行梯度洗脱(30％～80％B相洗脱15CV)，收集甘精胰岛素的流出液，收率87.1％；
D.反相层析：使用Uni Insulin C8 type B装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，用A相(pH为3.0的15mM柠檬酸三钠、150mM硫酸铵和20％乙腈的溶液)平衡后，用纯化水将步骤C所得的流出液稀释一倍，，调节pH为3.0，过滤后装载至层析柱上，装载步骤C所得的含甘精胰岛素的流出液，上样完毕后，用A相(pH为3.0的15mM柠檬酸三钠、150mM硫酸铵和20％乙腈的溶液)洗涤层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为3.0的15mM柠檬酸三钠、150mM硫酸铵和20％乙腈的溶液)，与B相(pH为3.0的的15mM柠檬酸三钠、80mM硫酸铵、80％乙腈的溶液)，进行梯度洗脱(30％～80％B相洗脱10CV)，收集含甘精胰岛素的流出液，收率86.4％；
E.除热原：使用Source 30RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为3.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液和15％乙腈的溶液平衡，用1M柠檬酸三钠与100％乙腈的溶液稀释步骤D所得的流出液，以包含25mM柠檬酸三钠缓冲液和15％乙腈的目标浓度，调节pH为3.0，过滤后装载至层析柱上，然后用pH为3.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液和15％乙腈的溶液冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为3.0的0.5M氯化钠、25mM的柠檬酸三钠和80％的乙腈的溶液洗脱，收集含甘精胰岛素的流出液，收率87.6％；
F.超滤和装瓶：将步骤E所得的含甘精胰岛素的流出液，经PLC6C-C 5KD切向流膜过滤澄清过滤，浓缩3倍后，调节pH6.0，2-8℃缓慢搅拌结晶12小时，所得沉淀用pH6.0洗涤缓冲液洗涤后收集沉淀，-40～-20℃真空冷冻干燥10小时以上，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻，所得产品即为甘精胰岛素，收率87.7％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
实施例5
A.超滤：将含甘精胰岛素前体的初级纯化样品(132.0L，0.25g/L)，经聚醚砜P2B-100-A05 10KD，切向流膜过滤澄清过滤，浓缩40倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和0.1M硫酸铵缓冲液按体积比1:7置换至少4次，合并滤液，即为含甘精胰岛素前体的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，收率93.1％；
B.酶切：使用猪胰蛋白酶对步骤B所得的过滤样品进行酶切，加入猪胰蛋白酶55.85mg，调pH为9.5，控制温度15℃，酶切7h，调pH3.0终止酶切，得酶切液，酶切液存放于2～8℃环境中，收率58.8％；
C.反相层析：使用Source 15RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用A相(pH为3.5的40mM乙酸钠、350mM氯化钾和20％异丙醇的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M乙酸钠、3M氯化钠与100％异丙醇的溶液稀释步骤B所得的酶切液，以包含40mM乙酸钠、350mM氯化钾和20％异丙醇的目标浓度，调节pH为3.5，过滤后装载至层析柱上，然后用A相(pH为3.5的40mM乙酸钠、350mM氯化钾和20％异丙醇的溶液)冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为3.5的40mM乙酸钠、350mM氯化钾和20％异丙醇的溶液)和B相(pH3.5的40mM乙酸钠、180mM氯化钾和40％异丙醇的溶液)，进行梯度洗脱(20％～70％B相洗脱15CV)，收集含甘精胰岛素的流出液，收率87.5％；
D.反相层析：使用Daiso SP-200-C8-10-BIO装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，用A相(pH为4.0的5mM柠檬酸三钠、200mM乙酸钠和5％乙腈的溶液)平衡后，用纯化水将步骤C所得的流出液稀释一倍，调节pH为4.0，过滤后装载至层析柱上，上样完毕后，用A相(pH为4.0的5mM柠檬酸三钠、200mM乙酸钠和5％乙腈的溶液)洗涤层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为4.0的5mM氯化钠、200mM乙酸钠和5％乙腈的溶液)，与B相(pH为4.0的5mM氯化钠、20mM乙酸钠和70％乙腈的溶液)，进行梯度洗脱(40％～80％B相洗脱10CV)，收集含甘精胰岛素的流出液，收率85.8％；
E.除热原：使用Source 15RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为5.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液和7％异丙醇的溶液平衡，用1M柠檬酸三钠与100％异丙醇的溶液稀释步骤D所得的流出液，以包含25mM柠檬酸三钠缓冲液和7％乙腈的目标浓度，调节pH为5.0，过滤后装载至层析柱上，然后用pH为5.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液和7％异丙醇溶液冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为5.0的0.1M氯化钾、30mM的乙酸铵和35％的异丙醇溶液洗脱，收率88.1％；
F.超滤和装瓶：将步骤E所得的含甘精胰岛素的流出液，经PLCGC-C-50KD切向流膜过滤澄清过滤，浓缩3倍后，调节pH6.0，2-8℃缓慢搅拌结晶12小时，所得沉淀用pH6.0洗涤缓冲液洗涤后收集沉淀，-40～-20℃真空冷冻干燥10小时以上，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻，所得产品即为甘精胰岛素，收率87.9％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
实施例6
A.超滤：将含有甘精胰岛素前体的初级纯化样品(122.3L，0.25g/L)，经再生纤维素P2C-100-C01 400KD向流膜过滤澄清过滤，浓缩40倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和0.1M硫酸铵缓冲液按体积比1:3置换至少4次，合并滤液，即为甘精胰岛素融合蛋白前体的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，收率91.8％；
B.酶切：使用牛胰蛋白酶对步骤A所得的含甘精胰岛素前体的过滤样品进行酶切，加入牛胰蛋白酶93.57mg，调pH为8.5，控制温度10℃，酶切9h，调pH3.0终止酶切，得酶切液，酶切液存放于2～8℃环境中，收率56.9％；
C.疏水层析：使用Source15 Phe装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用A相(pH3.5的40mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠和12％异丙醇的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠、2M氯化钠与100％异丙醇的溶液稀释步骤B所得的酶切液，以包含40mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠和12％异丙醇目标浓度，调节pH为3.5，过滤后装载至层析柱上，然后用A相(pH3.5的40mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠和12％异丙醇的溶液)冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH3.5的40mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠和12％异丙醇的溶液)和B相(pH3.5的40mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和46％异丙醇的溶液)，进行梯度洗脱(30％～90％B相洗脱15CV)，收集含甘精胰岛素的流出液，收率84.4％；
D.反相层析：使用Uni Insulin C8 type A装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，用A相(pH为4.0的10mM柠檬酸三钠、100mM氯化钠和10％乙腈的溶液)平衡后，用纯化水将步骤C所得的流出液稀释一倍，调节pH为4.0，过滤后装载至层析柱上，上样完毕后，用A相(pH为4.0的10mM柠檬酸三钠、100mM氯化钠和10％乙腈的溶液)洗涤层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为4.0的10mM柠檬酸三钠、100mM氯化钠和10％乙腈的溶液)，与B相(pH为4.0的10mM柠檬酸三钠、50mM氯化钠和50％乙腈的溶液)，进行梯度洗脱(50％～80％B相洗脱10CV)，收集含甘精胰岛素的流出液，收率81.6％；
E.除热原：使用Source 5RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，用纯化水预洗树脂柱，并用pH为4.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液和15％乙腈平衡，用1M柠檬酸三钠与100％乙腈的溶液稀释步骤D所得的流出液，以包含25mM柠檬酸三钠缓冲液和15％乙腈的目标浓度，调节pH为4.0，过滤后装载至层析柱上，然后用pH为4.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液和15％乙腈冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为4.0的0.3M氯化钠、25mM的柠檬酸三钠和40％的乙腈的溶液洗脱，收集含甘精胰岛素的流出液，收率85.5％；
F.超滤和装瓶：将步骤E所得的含甘精胰岛素的流出液，经PLC6C-C 60KD切向流膜过滤澄清过滤，浓缩3倍后，调节pH6.0，2-8℃缓慢搅拌结晶12小时，所得沉淀用pH6.0洗涤缓冲液洗涤后收集沉淀，-40～-20℃真空冷冻干燥10小时以上，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻，所得产品即为甘精胰岛素，收率87.1％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
实施例7
A.超滤：将含有胰岛素前体的初级纯化样品(122.2L，0.25g/L)，经PLC-100-C01500KD，切向流膜过滤澄清过滤，浓缩30倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和0.1M硫酸铵缓冲液按体积比1:4置换至少3次，合并滤液，即为甘精胰岛素融合蛋白前体的过滤样品，收集存放于2～8℃环境中，收率91.6％；
B.酶切：使用牛胰蛋白酶对步骤A所得的过滤样品进行酶切，加入牛胰蛋白酶39.97mg，调pH为8.5，控制温度15℃，酶切7h，调pH3.0终止酶切，得酶切液，酶切液存放于2～8℃环境中，收率57.1％；
C.疏水层析：使用Phenyl sepharose 6FF装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，并用A相(pH为4.0的20mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和18％异丙醇的溶液)平衡，在该精制步骤前，用1M柠檬酸三钠、2M氯化钠与100％异丙醇的溶液稀释步骤B所得的酶切液，以包含20mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和18％异丙醇的目标浓度，调节pH为4.0，过滤后装载至层析柱上，然后用A相(pH为4.0的20mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和18％异丙醇的溶液)冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为4.0的20mM柠檬酸三钠、80mM氯化钠和18％异丙醇的溶液)和B相(20mM柠檬酸三钠、40mM氯化钠和42％异丙醇的溶液)进行梯度洗脱(30％～80％B相洗脱15CV)，收集含甘精胰岛素的流出液，收率84.1％；
D.反相层析：使用YMC-Triart Prep C8-S装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，用A相(pH为3.0的5mM柠檬酸三钠、150mM硫酸铵和5％乙腈的溶液)平衡后，用纯化水将步骤C所得的流出液稀释一倍，调节pH为3.0，过滤后装载至层析柱上，然后用A相(pH3.0的150mM硫酸铵和5％乙腈的溶液)洗涤层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用A相(pH为3.0的5mM柠檬酸三钠、150mM硫酸铵和5％乙腈的溶液)，与B相(pH为3.0的5mM柠檬酸三钠、20mM硫酸铵和80％乙腈的溶液)，进行梯度洗脱(30％～80％B相洗脱10CV)，收集含甘精胰岛素的流出液，收率80.9％；
E.除热原：使用Source 5RPC装柱，层析柱直径为10cm、高度为10cm(柱床体积0.78L)，并用pH为4.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液和15％乙醇平衡，用1M柠檬酸三钠与100％乙醇的溶液稀释步骤D所得的流出液，以包含25mM柠檬酸三钠缓冲液和15％乙醇的目标浓度，调节pH为4.0，过滤后装载至层析柱上，然后用pH为4.0的25mM柠檬酸三钠缓冲液和15％乙醇冲洗层析柱，至流出液吸光度检测值为基线吸光度值(A280)，再用pH为4.0的0.7M氯化钾、50mM的柠檬酸三钠和70％的乙醇的溶液洗脱，收集含甘精胰岛素的流出液，收率84.9％；
F.超滤和装瓶：将步骤E所得的含甘精胰岛素的流出液，经PLCGC-C-70KD切向流膜过滤澄清过滤，浓缩3倍后，调节pH6.0，2-8℃缓慢搅拌结晶12小时，所得沉淀用pH6.0洗涤缓冲液洗涤后收集沉淀，-40～-20℃真空冷冻干燥10小时以上，2～8℃下进行装瓶，然后在-80℃下冷冻，所得产品即为甘精胰岛素，收率87.5％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
对比实施例1
A.超滤：将含有胰岛素前体的初级纯化样品(85.44L，0.25g/L)经3KD超滤浓缩，浓缩20倍后，用超滤膜包将浓缩的蛋白溶液和缓冲液置换，合并滤液，收率87.5％；
B.离子交换层析：使用S.P.Sepharose FF装柱，层析柱直径为10cm、高度为15cm(柱床体积1.18L)，用纯化水预洗树脂柱，10mM乙酸-乙酸钠pH3.0平衡S.P.Sepharose FF层析柱，乙酸调样品pH3.0后上样，10mM乙酸-乙酸钠pH6.0洗脱，50mM Tris pH10.0洗脱，收集合并含甘精胰岛素的流出液，收率59.4％；
C.Ni+层析：使用Ni-Chelating Sepharose装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，25mM Tris pH9.0和0.3MNaCl平衡后，向步骤B所得的含甘精胰岛素的流出液，加入终浓度0.3M NaCl，调pH9.0，上样至平衡后的Ni-Chelating Sepharose层析柱上，25mM Tris pH9.0/0.5M NaCl/50mM咪唑洗脱，25mM Tris pH9.0/200mM咪唑洗脱得甘精胰岛素原，收率49.9％；
D.酶切：向步骤C所得甘精胰岛素原中加入牛胰蛋白酶5.54mg，pH为3.0，控制温度25℃，酶切液存放于2～8℃环境中，收率55.6％；
E.反相层析：C18装柱后，缓冲液A(5％乙氰/0.1％THF)平衡后，将步骤D所得的酶切液上样，35％缓冲液B(70％乙氰/0.2％THF)洗脱，35％～40％缓冲液B梯度洗脱，收集合并洗脱液，收率59.7％；
F.Ni+层析：使用Ni-Chelating Sepharose装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，25mM Tris pH9.0和0.3M NaCl平衡后，将步骤E所得的洗脱液过滤后调成含50mM Tris pH9.0的溶液，上样，收集合并洗脱液，1MHCl调pH7.0，10000rpm离心30min后收集沉淀，所得沉淀用pH6.0洗涤缓冲液洗涤后收集沉淀，-40～-20℃真空冷冻干燥10小时以上，即得甘精胰岛素，收率47.9％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
对比实施例2
A.羟基磷灰石层析：羟基磷灰石介质装柱，调节层析pH为8.0，装载含有胰岛素前体的初级纯化样品(81.5L，0.25g/L)，依次用含有500mM NaCl、5mM NaH2PO4、20mM NaH2PO4和200mM NaH2PO4的层析液进行盐浓度洗脱，收集含甘精胰岛素的流出液，收率54.9％；
B.酶切：用蛋白内肽酶Kex-2p(EC3.4.21.61)进行对步骤A所得的甘精胰岛素流出液进行连接肽和前肽的切除，加入Kex-2p酶3.73mg，4℃反应48小时，加5mM EDTA终止酶切，得酶切液，收率51.8％；
C.反相层析：将步骤E所得酶切产物调节pH值至2.5～4.0，使用C8反相柱进行纯化。Buffer A含有0.2M Na2SO4，50mM H3PO4，pH 2.5，Buffer B包含50％ACN、0.2M Na2SO4，50mM H3PO4，pH 2.5，线性梯度洗脱，得到的甘精胰岛素蛋白透析至30mM HAc溶液中去除有机溶剂，调节pH6.0，2-8℃缓慢搅拌结晶12小时，-40～-20℃真空冷冻干燥10小时以上，得到甘精胰岛素产品，收率68.3％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
对比实施例3
A.蛋白A俘获层析：使用
Figure BDA0002368437290000182
Ultra Plus树脂和Quickscale层析柱进行处理初级处理后的重组蛋白(81.6L，0.25g/L)，用25mM Tris、100mM氯化钠、pH 7.2平衡并用澄清后的收集物装载上样，用平衡缓冲液洗涤柱子至基线吸光度(A280)，用20mM柠檬酸三钠/柠檬酸、0.5M氯化钠、pH 6.0进行第二次洗涤，用0.1M乙酸、pH3.5将产物从柱子上洗脱下来，在280nm处1cm光程长度下从1OD开始至1OD结束收集洗脱物，收率90.0％；
B.酶切：使用猪胰蛋白酶对步骤A所得的过滤样品进行酶切，加入猪胰蛋白酶33.38mg，调pH为9.5，控制温度15℃，酶切3h，调pH3.0终止酶切，得酶切液，酶切液存放于2～8℃环境中，收率49.9％；
C.病毒灭活、深层过滤和Q膜层析：室温下，灭活，深层过滤后，再经过Q膜处理，收率86.2％；
D.疏水层析：使用Phenyl
Figure BDA0002368437290000183
HP装柱，层析柱直径为10cm、高度为20cm(柱床体积1.57L)，用水预洗柱子并用1.0M硫酸铵和18mM磷酸钠、pH 7.0进行平衡，在该精制步骤前，用2.2M硫酸铵和40mM磷酸钠、pH7.0来稀释Q膜流出物，以包含1.0M硫酸铵和18mM磷酸钠的目标浓度，上样完毕后，分别用1.1M硫酸铵和2mM磷酸钠、pH7.0和随后0.95M硫酸铵和17mM磷酸钠、pH7.0洗柱子至基线吸光度(A280)，用0.55M硫酸铵和10mM磷酸钠、pH7.0的洗脱液洗脱，在280nm处1cm光程长度下从5OD开始至1OD结束收集洗脱物，在每一循环之间，用注射用水再生柱子，收率86.4％；
E.纳滤：将步骤D所得洗脱物进行纳滤，滤膜孔径为0.1μm，收集滤液，收率94.6％；
F.超滤和渗滤：将步骤E所得滤液经截留分子量为30KD的超滤膜，浓缩至70g/L，随后，用最小8体积的19mM组氨酸、pH 5.6进行连续渗滤，渗滤后，产品进一步浓缩至195g/L，并19mM组氨酸、pH5.6的缓冲液洗涤超滤系统，合并浓缩物和洗涤物，收率93.1％；
G.冷冻和装瓶：调节pH6.0，2-8℃缓慢搅拌结晶12小时，所得沉淀用pH6.0洗涤缓冲液洗涤后收集沉淀，-40～-20℃真空冷冻干燥10小时以上，装填后在-80℃下冷冻即得甘精胰岛素，收率84.6％，纯化的最终产物的纯度检测结果见表1。
表1重组蛋白的最终产物纯度检测
Figure BDA0002368437290000181
Figure BDA0002368437290000191

Claims (10)

1.一种重组蛋白的分离纯化方法，其特征在于，它包括如下内容：将含目的重组蛋白的发酵液，离心得湿菌体，经破菌、洗涤和复性等初级纯化处理，通过至少一个切向流膜过滤，酶切，再进行至少两次反相层析、除热原、超滤和装瓶步骤得到纯度较高的目的重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
A.超滤：将初级纯化样品，经装有切向流膜的过滤器过滤，得滤液，即为含目的蛋白的过滤样品；
B.使用胰蛋白酶对步骤A所得的含目的蛋白的过滤样品进行酶切，得酶切液；
C.反相层析：稀释步骤B所得的酶切液，过滤，并装载至反相层析柱上，用平衡液冲洗层析柱至基线吸光度，梯度洗脱，收集含目的重组蛋白的流出液；
D.反相层析：反相层析树脂柱装柱平衡后，装载步骤C所得的含目的重组蛋白的流出液，用平衡缓冲液洗涤层析柱至基线吸光度，洗脱液洗脱，收集含目的重组蛋白的流出液；
E.除热原：反相层析树脂装柱平衡后，装载步骤D所得的含目的重组蛋白的流出液，用平衡液平衡至基线吸光度，洗脱液洗脱，收集含目的重组蛋白的的流出液；
F.超滤和装瓶：将步骤E所得的含重组蛋白的流出液，经装有切向流膜的过滤器超滤浓缩，收集滤液，即为目的重组蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤A中所述的切向流滤膜为再生纤维素膜或聚醚砜膜，所述的切向流滤膜的截留分子量为10～300KD。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤B中所述的胰蛋白酶为牛胰蛋白酶或猪胰蛋白酶，胰蛋白酶与胰岛素前体的质量比为1∶400～900，mg/mg。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤C中所述的反相层析的填料为SourceRPC，优选为Source 15RPC或Source 30RPC。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤C中所述的梯度洗脱液为A相和B相组成，其中A相为10～40mM柠檬酸三钠或乙酸钠、30～70mM氯化钠或氯化钾与10～20％异丙醇(V/V)的混合溶液，B相为10～40mM柠檬酸三钠或乙酸钠、400～900mM氯化钠或氯化钾与40～50％异丙醇(V/V)的混合溶液。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤D中所述的反相层析的填料为C8，优选为Uni Insulin C8 type B、Unisil 10-120C8Ultra或Daiso SP-200-C8-10-BIO。
8.根据权利要求2所述重组蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤D中所述的梯度洗脱液为A相和B相组成，其中A相为5～20mM柠檬酸三钠、90～200mM硫酸铵和5～20％乙腈(V/V)的混合溶液，B相为5～20mM柠檬酸三钠、20～80mM硫酸铵和30～80％乙腈(V/V)的混合溶液。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤E中所述的反相层析填料为SourceRPC，优选为Source 30RPC或Source 15RPC，所述的洗脱液为氯化钠、氯化钾、柠檬酸三钠或乙酸铵溶液。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤F中所述的切向流滤膜为PLC6C-C或PLCGC-C，所述的切向流滤膜的截留分子量为5～50KD。
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