JP5948343B2 - トランスジェニックイネの子実からヒト血清アルブミンを精製する方法 - Google Patents
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Description
トランスジェニックイネの子実から組換えヒト血清アルブミンを分離及び精製する方法であって、順に、
(1)組換えヒト血清アルブミンの粗抽出物を陽イオン交換クロマトグラフィーにて精製し、一次産物Iを得るステップと、
(2)一次産物Iを陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製し、二次産物IIを得るステップと、
(3)二次産物IIを疎水性クロマトグラフィーにて精製し、精製された組換えヒト血清アルブミンを得るステップとを備える。
(i)粉砕済みのrHSA含有トランスジェニックイネを抽出用緩衝液と、1:5の重量体積比(kg/l)で混合し、55〜60℃にて1〜1.5時間抽出を行って混合物Iを得るステップであって、抽出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液10〜30mMに、酢酸ナトリウム10〜20mMと、硫酸アンモニウム15〜30mMと、オクタン酸ナトリウム5〜20mMとを含み、そのpHが6.5〜8であるステップと、
(ii)ステップ(i)で得られる混合物IのpHを4.0〜4.5に調整し、更に3〜12時間かけて沈降させて混合物IIを得るステップと、
(iii)ステップ(ii)で得られる混合物IIをろ過して澱粉や非標的蛋白質を取り除いた後、ろ液を回収して高濃度のrHSAを含む粗抽出液を得るステップとを含む。
本発明において、クロマトグラフィー担体をBio−Rad社製のUNO Sphere S、Nuvia S、Capto MMCなどを含む高い作業流速(working flow rate)を有する陽イオン交換樹脂とした。
陽イオン交換樹脂と同様に、陰イオン交換樹脂もrHSAの精製に用いることができる。本発明において、クロマトグラフィー担体をUNO Sphere Q、Q Sepharose FF及びDEAE Sepharose FFなどを含む、高い流速と高い許容注入量を有する陰イオン交換樹脂とした。
陰イオン交換クロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーは、何れもrHSAの一次精製に用いることができるが、実験から分かるように、Q Sepharose FF陰イオン交換樹脂を一次精製ステップに用いた時は、その許容注入量が理論上の許容量より遥かに低い。これはイネの子実に大量に存在する可溶性多糖類と核酸の関与によるものと考えられる。その理由して、可溶性多糖類と核酸は負電荷を持っており、よって、Q Sepharose FFに結合してその許容注入量を低下させることが考えられる。実験により証明されたように、透析によってrHSA抽出液に含まれる可溶性多糖類の含有量を減らすことが出来るため、Q Sepharose FFの許容注入量を高めることができる。
本発明において、幾つかの疎水性クロマトグラフィー担体を当該精製ステップに用いた。疎水性クロマトグラフィー担体として、例えば、Phenyl Sepharose HP、Phenyl Sepharose FF(LS)、Macro−prep t−butyl及びMacro−prep methylが挙げられ、これらは類似した性質を持っている。
ろ布式のプレートフレーム加圧ろ過器は、型番がXMS4/500−UBであり、メーカーが上海天立加圧ろ過器技術有限公司(中国)である。0.20μmの中空糸セルロースカラムは、湖州科濾膜技術有限公司(中国)により購入する。
Q Sepharose、Phenyl Sepharose HP、Phenyl Sepharose FF及びDEAE−Sepharose FFの各担体は、GE Healthcare社(米国)により購入する。
C10/10とXK16/20の各クロマトグラフィーカラムは、GE Healthcare社(米国)により購入する。
Biological 15/200クロマトグラフィーカラムは、Bio−Rad社(米国)により購入する。
本発明の発明者による中国特許出願200510019084号に開示された方法に従い、トランスジェニックイネが作製された。水稲栽培されたトランスジェニックイネの外皮を除去して半精米を得、その後、粒度が80〜100メッシュの米粉となるように砕いた。砕いた米粉を抽出用緩衝液と1:5(重量/体積、kg/L)の割合で混合し、60℃にて1.5時間抽出した。抽出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液25mMに、酢酸ナトリウム20mMと、硫酸アンモニウム10mMと、オクタン酸ナトリウム10mMとを含み、pHが7.5であった。上記のようにして得られた混合物を酢酸でpH 4.5に調整し、更に少なくとも3時間置いて非標的蛋白質を沈降させた。その後、得られた混合物を、順に(ろ布式の)プレートフレーム加圧ろ過器で加圧ろ過してから孔径が0.22μmの中空糸セルロースカラムで精密ろ過し、透明なrHSA抽出液を得た。rHSAの濃度は、約0.66mg/mlであった。
(1)UNO Sphere Sクロマトグラフィー担体を用いる陽イオン交換クロマトグラフィー
XK16/100カラムに約8.7mlのUNO Sphere Sを充填し、流出液のpH値が安定するまで200mlの平衡用緩衝液(無水酢酸ナトリウム2g/L、酢酸を加えてpHが4.5となるように調整したもの)を使って300cm/h(cm/時)の流速で平衡化した。実施例1で得られたrHSA抽出液サンプル250mlを、600cm/hの流速でカラムに注入した。サンプルの導電率が6.1mS/cmであり、pHが4.53であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液(酢酸ナトリウム2g/L、酢酸、pH5.2、塩化ナトリウム14.61g/L)を使って300cm/hの流速でサンプルを溶出した。溶出液を集めてSDS−PAGEで観察し、rHSAを含む画分を得た。電気泳動図は、図1Aに示した。
XK16/100カラムに約9.3mlのNuvia S担体を充填し、流出液のpH値が安定するまで200mlの平衡用緩衝液(無水酢酸ナトリウム2g/L、酢酸を加えてpHが4.5となるように調整したもの)を使って300cm/hの流速で平衡化した。実施例1で得られたrHSA抽出液サンプル250mlを、300cm/hの流速でカラムに注入した。サンプルの導電率が6.3mS/cmであり、pHが4.56であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液(酢酸ナトリウム2g/L、酢酸、pH5.0、塩化ナトリウム14.61g/L)を使って300cm/hの流速でサンプルを溶出した。溶出液を集めてSDS−PAGEで観察し、rHSAを含む画分を得た。電気泳動図は、図1Bに示した。
XK16/100カラムに約15.1mlのCapto MMC担体を充填し、流出液のpH値が4.5で安定するまで200mlの平衡用緩衝液(無水酢酸ナトリウム2g/L、酢酸を加えてpHが4.5となるように調整したもの)を使って300cm/hの流速で平衡化した。実施例1で得られたrHSA抽出液サンプル250mlを、600cm/hの流速でカラムに注入した。サンプルの導電率が6.3mS/cmであり、pHが4.56であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液(酢酸ナトリウム2g/L、酢酸、pH4.7、塩化ナトリウム58.44g/L)を使って300cm/hの流速で不純物を除去し、その後、溶出用緩衝液(リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/L、塩化ナトリウム58.44g/L、pH 6.7)でサンプルを溶出してrHSAを含む画分を得た。電気泳動図は、図1Cに示した。
XK16/100カラムに約10mlのMacroPrep−CM担体を充填し、流出液のpH値が4.5で安定するまで300mlの平衡用緩衝液(無水酢酸ナトリウム2g/L、酢酸を加えてpHが4.5となるように調整したもの)を使って200cm/hの流速で平衡化した。250mlの実施例1で得られたrHSA抽出液サンプルを、300cm/hの流速でカラムに注入した。サンプルの導電率が6.3mS/cmであり、pHが4.56であった。サンプルを添加した後、洗浄用緩衝液(酢酸ナトリウム2g/L、酢酸、pH 4.7、塩化ナトリウム58.44g/L)を使って200cm/hの流速で不純物を除去し、その後、溶出用緩衝液(リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/L、塩化ナトリウム5.84g/L、pH 6.5)でサンプルを溶出してrHSAを含む画分を得た。電気泳動図は、図1Dに示した。
XK16/100カラムに、それぞれ約5mlのNuvia SとUNO Sphere S担体を充填し、流出液のpH値が4.5となるまで200mlの平衡用緩衝液(無水酢酸ナトリウム2g/L、酢酸を加えてpHが4.5となるように調整したもの)を使って300cm/hの流速で平衡化した。実施例1で得られたrHSA抽出液サンプルを、300cm/hの流速でNuvia SカラムとUNO Sphere Sカラムにそれぞれ添加した。サンプル添加過程におけるUV280の吸収値を記録し、当該吸収値が水平域を10%分超えるまで記録を続けた。サンプルの添加体積をそれぞれ記録し、300cm/hの流速における1ミリリットル当たりのNuvia SまたはUNO Sphere Sの実際の許容注入量を算出した。
(1)UNO Sphere Q担体を用いる陰イオン交換クロマトグラフィー
Biological 15/200カラムに約10mlのUNO Sphere Q担体を充填し、流出液のpH値が7.5となるまで200mlの平衡用緩衝液(リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/Lに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてpH7.5に調整したもの)を使って流速300cm/hでカラムを平衡化した。実施例1で得られたrHSAの抽出液サンプル250mlをpH7.5に調整し、且つ当該緩衝液で導電率が10.0mS以下となるように希釈した後、300cm/hの流速でUNO Sphere Qカラムに添加した。当該サンプルを洗浄用緩衝液(リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/L、塩化ナトリウム11.68g/L)で洗浄して不純物を除去した後、溶出用緩衝液(リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/L、塩化ナトリウム23.36g/L)で溶出し、rHSA含有画分を集めた。電気泳動図は、図3Aに示した。
Biological 15/200カラムに約10mlのQ Sepharose FF担体を充填し、流出液のpH値が7.0となるまで200mlの平衡用緩衝液(リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/Lに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてpH7.0に調整したもの)を使って流速300cm/hでカラムを平衡化した。実施例1で得られたrHSAの抽出液サンプル250mlをpH6.8に調整し、且つ当該緩衝液で導電率が10.0mS以下となるように希釈した後、300cm/hの流速でQ Sepharose FFカラムに添加した。当該サンプルを溶出用緩衝液(リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/L、塩化ナトリウム5.84g/L)で溶出し、rHSA含有画分を集めた。電気泳動図は、図3Bに示した。
10/100カラムに約5mlのQ Sepharose FF担体を充填し、流出液のpH値が7.0に安定するまで200mlの平衡用緩衝液(リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/Lに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてpHが7.0となるように調整したもの)を使って流速300cm/hでカラムを平衡化した。実施例1で得られたrHSAの抽出液サンプル250mlをpH7.5に調整し、当該緩衝液で導電率が10.0mS以下に、かつ総体積が1000mlになるまで希釈した。得られたサンプルを300cm/hの流速でQ Sepharose FFカラムに添加した。サンプル添加過程におけるUV280の吸収値を計測し、当該吸収値が水平域を10%分超えるまで計測を続けた。サンプルの添加体積を記録し、300cm/hの流速におけるQ Sepharose FF1ミリリットル当たりの実際の許容注入量を算出した。その後、樹脂を再生した。
実施例2で得られたrHSA含有画分を均一に2等分し、以下の実験に用いた。
15/200カラムに約7mlのQ Sepharose FF担体を充填し、流出液のpH値が7.0となるまで200mlの平衡用緩衝液(リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/Lに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてpHが7.0となるように調整したもの)を使って流速300cm/hでカラムを平衡化した。上記画分の一方をpHが7.0になるように調整し、且つ当該緩衝液で導電率が10.0mS以下となるように希釈した。当該サンプルを300cm/hの流速でQ Sepharose FFカラムに添加した後、溶出用緩衝液(リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/L、塩化ナトリウム11.68g/L)で溶出し、rHSA含有画分を集めた。電気泳動図は、図5Aに示した。
Biological 15/200カラムに約8mlのDEAE Sepharose FF担体を充填し、流出液のpH値が7.0となるまで200mlの平衡用緩衝液(リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/Lに、水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えてpHが7.0となるように調整したもの)を使って流速300cm/hでカラムを平衡化した。上記画分の他の一方をpHが7.5になるように調整し、且つ当該緩衝液で導電率が10.0mS以下となるように希釈した。当該サンプルを300cm/hの流速でDEAE Sepharose FFカラムに添加した後、溶出用緩衝液(リン酸二水素ナトリウム0.3g/L、リン酸水素二ナトリウム3.5g/L、塩化ナトリウム11.68g/L)で溶出し、rHSA含有画分を集めた。電気泳動図は、図5Bに示した。
(1)Phenyl Sepharose HP担体を用いる疎水性クロマトグラフィー
XK16/100カラムに約8mlのPhenyl Sepharose HP充填し、200mlの平衡用緩衝液(無水酢酸ナトリウム2.32g/L、リン酸二水素ナトリウム2.81g/L、硫酸アンモニウム66g/L)を使って流速100cm/hでカラムを平衡化した。実施例4(Q Sepharose FF)で得られたrHSA含有画分20mlに硫酸アンモニウム(0.4M)を加え、導電率が80.0mSとなるようにした。その後、当該サンプルを100cm/hの流速でカラムに添加した。浸透液を集めてrHSA含有画分を得た。電気泳動図は、図6Aに示した。
XK16/100カラムに約10mlのPhenyl Sepharose FFを充填し、200mlの平衡用緩衝液(無水酢酸ナトリウム2.32g/L、リン酸二水素ナトリウム2.81g/L、硫酸アンモニウム13.2g/L)を使って流速150cm/hでカラムを平衡化した。実施例4(Q Sepharose FF)で得られたrHSA含有画分20mlに硫酸アンモニウム(0.1M)を加え、導電率が80.0mSとなるようにした。その後、当該サンプルを150cm/hの流速でカラムに添加した。浸透液を集めてrHSA含有画分を得た。電気泳動図は、図6Bに示した。
15/200カラムに約6mlのMacroPrep−t−butyl担体を充填し、200mlの平衡用緩衝液(無水酢酸ナトリウム2.32g/L、リン酸二水素ナトリウム2.81g/L、硫酸アンモニウム13.2g/L)を使って流速150cm/hでカラムを平衡化した。実施例3(Q Sepharose FF)で得られたrHSA含有画分20mlに硫酸アンモニウム(それぞれ1.0 M、0.8 M、0.6M)を加え、導電率がそれぞれ130.0 mS、90.0 mS、70.0 mSとなるようにした。その後、当該サンプルを150cm/hの流速でカラムに添加した。浸透液を集めてrHSA含有画分を得た。電気泳動図は、図6Cに示した。
ステップ(1):UNO Sphere Sを用いる陽イオン交換クロマトグラフィーによる一次精製
XK16/20カラムに約12mlのUNO Sphere S担体を充填し、500mlの平衡用緩衝液(無水酢酸ナトリウム2g/L、酢酸、pH4.5)を使って流速300cm/hでカラムを平衡化した。実施例1で得られたrHSA含有抽出液のサンプル300mlを600cm/hの流速でカラムに添加した。サンプルの導電率が6.5mS/cmであり、pHが4.5であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液(酢酸ナトリウム2g/L、酢酸、pH5.0、塩化ナトリウム14.61g/L)を使って200cm/hの流速でサンプルを溶出した。溶出液を集めてSDS−PAGEで観察を行い、rHSA含有画分を得た。電気泳動図は、図7Aに示した。
XK16/100カラムに約13mlのQ Sepharose FF担体を充填し、400mlの平衡用緩衝液(無水酢酸ナトリウム6.51g/L、リン酸二水素ナトリウム0.72g/L、pH 6.8)を使って流速300cm/hでカラムを平衡化した。上記ステップで得られたrHSA含有画分を約200mlに希釈し、導電率が10.0mS未満となるようにした後、300cm/hの流速でカラムに添加した。サンプルの導電率が8.3mS/cmであり、pHが6.8であった。サンプルを添加した後、溶出用緩衝液(リン酸水素二ナトリウム6.51g/L、リン酸二水素ナトリウム0.72g/L、塩化ナトリウム11.69g/L)を使って100cm/hの流速でサンプルを溶出した。溶出液を集めてSDS−PAGEで観察を行い、rHSA含有画分を集めた。電気泳動図は、図7Bに示した。
XK16/100カラムに約12mlのPhenyl Sepharose HPを充填し、200mlの平衡用緩衝液(無水酢酸ナトリウム2.32g/L、リン酸二水素ナトリウム2.81g/L、硫酸アンモニウム66g/L)を使って流速100cm/hでカラムを平衡化した。上記ステップで得られた20mlのrHSA含有画分に硫酸アンモニウムを加え、導電率が90.0mSとなるようにした。その後、サンプルを100cm/hの流速でカラムに添加した。浸透液を集めてrHSA含有画分を得た。電気泳動図は、図7Cに示した。精製されたrHSA産物のHPLCクロマトグラムは、図8に示した。HPLC解析により、rHSAが(モノマーに、二量体と多量体を合わせて)99%を超える純度を有することが確認できる。
本実施例において、4ステップを有する精製法にてrHSAを分離、精製するため、実施例1で得られたrHSAの粗抽出液を、それぞれUNO Sphere S、Q Sepharose FF、Macro−prepセラミックヒドロキシアパタイトI型及びPhenyl Sepharose HPをクロマトグラフィー担体とする陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーで順に処理した。陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラフィーは、実施例6と同様に行われる。
本実施例において、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとしてMacro−prepセラミックヒドロキシアパタイトII型のクロマトグラフィー担体を用いる以外、実施例7と同様の方法で精製を行った。
FT 浸透液(通過画分、flow through、transmission fluid)
Elu rHSAを含む溶出液
Elu1 非標的蛋白質の溶出液
Elu2 rHSAの溶出液
CIP 定置洗浄画分
Claims (20)
- 組換えヒト血清アルブミンの粗抽出物を陽イオン交換クロマトグラフィーにて精製し、一次産物Iを得るステップ(1)と、
前記一次産物Iを陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製し、二次産物IIを得るステップ(2)と、
前記二次産物IIに更に硫酸アンモニウムを加えて硫酸アンモニウムの濃度が0.1M〜1.0Mとなるようにした後、疎水性クロマトグラフィーにて精製し、精製された組換えヒト血清アルブミンを得るステップ(3)とを順に備え、
前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、UNO Sphere S(商標)、Capto(登録商標) MMC、Nuvia S(商標)及びMacroPrep−CM(商標)からなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行われ、
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、Q Sepharose(登録商標) FF、UNO Sphere Q(商標)及びDEAE Sepharose(登録商標) FFからなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行われ、
前記疎水性クロマトグラフィーが、Phenyl Sepharose(登録商標) HP、Phenyl Sepharose(登録商標) FF、Macro−prep t−butyl(商標)及びMacro−prep methyl(商標)からなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行われる、
トランスジェニックイネの子実から組換えヒト血清アルブミンを分離及び精製する方法。 - 前記ステップ(3)の疎水性クロマトグラフィーの前に、前記二次産物IIをセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにて精製するステップを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーが、UNO Sphere S(商標)またはCapto(登録商標) MMCを用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、Q Sepharose(登録商標) FFを用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記疎水性クロマトグラフィーが、Phenyl Sepharose(登録商標) HPを用いて行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、Macro−prepセラミックヒドロキシアパタイトI型及びII型からなる群より選択されるクロマトグラフィー担体を用いて行われる、請求項2に記載の方法。
- 前記組換えヒト血清アルブミンの粗抽出物が、
i)組換えヒト血清アルブミンを含むトランスジェニックイネの子実を砕いたものを抽出用緩衝液と1:5の重量体積比(kg/l)で混合し、55〜60℃にて1〜1.5時間抽出して混合物Iを得るステップであって、その内、抽出用緩衝液は、リン酸塩緩衝液10〜30mMに、酢酸ナトリウム10〜20mMと、硫酸アンモニウム15〜30mMと、オクタン酸ナトリウム5〜20mMとを含み、そのpHが6.5〜8であるステップと、
ii)ステップi)で得られる混合物IのpHを4.0〜4.5に調整し、更に3〜12時間沈降させて混合物IIを得るステップと、
iii)ステップii)で得られる混合物IIを、ろ布式のプレートフレームフィルターで加圧ろ過し、その後、孔径が0.20μm〜0.45μmのポリエーテルスルホン中空糸膜で精密ろ過した後、ろ液を集めて高濃度の組換えヒト血清アルブミンを含む粗抽出液を得るステップとを含む方法により製造される、請求項1に記載の方法。 - 前記陽イオン交換クロマトグラフィーに使われる注入用緩衝液は、酢酸塩緩衝液で構成され、pHが5.0未満である、請求項1に記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーに使われる溶出用緩衝液は、酢酸塩緩衝液に塩化ナトリウムを含み、またはリン酸塩緩衝液に塩化ナトリウムを含み、pHが5.0〜6.7である、請求項1に記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーは、UNO Sphere S(商標)を用いて行い、かつ酢酸塩緩衝液に0.25M 塩化ナトリウムを含み、pHが5.2である溶出用緩衝液が使われる、請求項1に記載の方法。
- 陽イオン交換クロマトグラフィーは、Nuvia S(商標)を用いて行い、かつ酢酸塩緩衝液に0.25M 塩化ナトリウムを含み、pHが5.0である溶出用緩衝液が使われる、請求項1に記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーは、Capto(登録商標) MMCを用いて行い、かつ非標的蛋白質の除去のため、酢酸塩緩衝液に1M 塩化ナトリウムを含み、pHが4.7である洗浄用緩衝液が使われ、かつ組換えヒト血清アルブミンの溶出のため、リン酸塩緩衝液に1M 塩化ナトリウムを含み、pHが6.7である溶出用緩衝液が使われる、請求項1に記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーは、MacroPrep−CM(商標)を用いて行い、かつ非標的蛋白質の除去のため、酢酸塩緩衝液に1M 塩化ナトリウムを含み、pHが4.7である洗浄用緩衝液が使われ、かつ組換えヒト血清アルブミンの溶出のため、リン酸塩緩衝液に0.1M 塩化ナトリウムを含み、pHが6.5である溶出用緩衝液が使われる、請求項1に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、Q Sepharose(登録商標) FFを用いて行い、かつリン酸塩緩衝液に0.25M 塩化ナトリウムを含み、pHが6.0〜7.0である溶出用緩衝液が使われる、請求項1に記載の方法。
- 前記陰イオン交換クロマトグラフィーは、DEAE Sepharose(登録商標) FFを用いて行い、かつ非標的蛋白質の除去のため、リン酸塩緩衝液に0.1M 塩化ナトリウムを含み、pHが6.0〜7.0である洗浄用緩衝液が使われ、かつ組換えヒト血清アルブミンの溶出のため、リン酸塩緩衝液に0.25M 塩化ナトリウムを含み、pHが6.0〜7.0である溶出用緩衝液が使われる、請求項1に記載の方法。
- 前記疎水性クロマトグラフィーにおいて、精製すべき前記二次産物IIには、更に濃度が0.1M〜1Mの硫酸アンモニウムを含ませる、請求項1に記載の方法。
- 前記疎水性クロマトグラフィーは、Phenyl Sepharose(登録商標) HPを用いて行い、かつ精製すべき前記二次産物IIには、更に濃度が0.4Mの硫酸アンモニウムを含ませる、請求項1に記載の方法。
- 前記疎水性クロマトグラフィーは、Phenyl Sepharose(登録商標) FFを用いて行い、かつ精製すべき組換えヒト血清アルブミンを含む二次産物IIには、更に濃度が0.1Mの硫酸アンモニウムを含ませる、請求項1に記載の方法。
- 前記疎水性クロマトグラフィーは、MacroPrep−t− Butyl(商標)を用いて行い、かつ精製すべき組換えヒト血清アルブミンを含む二次産物IIには、更に濃度が0.6〜1.0Mの硫酸アンモニウムを含ませる、請求項1に記載の方法。
- 前記セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、リン酸塩緩衝液で構成され、pH が7.0〜7.5の溶出用緩衝液が使われる、請求項6に記載の方法。
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