CN116262774A - 一种重组蛋白纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组蛋白纯化方法。所述重组蛋白纯化方法包括如下步骤:获得表达重组蛋白的宿主细胞的培养上清液;将获得的培养上清液依次经过阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水相互作用层析,得到纯化的重组蛋白。本发明提供的纯化方法无需使用蛋白A柱,可以制备出高纯度、高质量的重组蛋白。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种重组蛋白纯化方法。
背景技术
在许多用于生产重组蛋白的纯化方法中常用到蛋白A柱进行亲和层析。利用蛋白A柱的优势在于在工艺初期就能获得高纯度产品。然而,蛋白A树脂的成本比其他常用的离子交换树脂高约30倍,从而导致重组蛋白的生产成本较高,蛋白A树脂在重组蛋白生产相关原料成本中高达35%。
而且,重组蛋白产品中残留的微量蛋白A会在施用于人体时导致免疫或其他生理反应。因此,需要对采用蛋白A柱的纯化方法进行持续监测,并需要在每个纯化步骤中去除残余的蛋白A。
此外,由于蛋白A基于其与靶标的生物亲和性而起作用,其化学稳定性较差。为了维持蛋白A的活性,不得使用1M的NaOH对层析柱进行清洗。但不使用1M的NaOH,就很难完全去除层析柱上的杂质,这会导致层析柱在后续使用中的再利用次数显著低于以化学树脂为填料的层析柱。鉴于蛋白A具有上述的缺点,仍需要开发更有效、更经济的重组蛋白纯化方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明的目的在于提供一种重组蛋白纯化方法。该方法无需使用蛋白A柱,可以制备出高纯度、高质量的重组蛋白。
为达此目的,本发明提供了一种重组蛋白纯化方法,所述方法包括如下步骤:获得表达重组蛋白的宿主细胞的培养上清液;将获得的培养上清液依次经过阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水相互作用层析,得到纯化的所述重组蛋白。
本文的“重组蛋白”是指能够利用Protein A作为配基的纯化树脂进行纯化的重组蛋白,比如包含IgG的抗体或Fc融合蛋白。
宿主细胞经过培养后,培养液中除含有活性重组蛋白外,还含有宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞来源的核酸分子、细胞生长因子等,需要进行纯化。
在本发明一些实施方式中,在所述经过阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水相互作用层析的步骤之前,部分去除所述培养上清液中的所述宿主细胞的蛋白等。在本发明一些实施方式中,所述“部分去除”是指对所述上清液进行初步纯化以去除部分宿主细胞蛋白。经过该步骤后,仍需通过后续的层析步骤以进一步降低宿主细胞蛋白含量。
在本发明一些实施方式中,部分去除宿主细胞蛋白的方法包括:将所述培养上清液的pH调节至≤所述重组蛋白等电点-1,使所述宿主细胞的蛋白沉淀,固液分离。
在本发明一些实施方式中,使用柠檬酸溶液、醋酸和/或盐酸调节所述培养上清液的pH。
在本发明一些实施方式中,所述阳离子交换层析采用的阳离子交换材料包含磺酸官能团或羧酸官能团。在本发明一些实施方式中,所述阳离子交换材料是膜、整料或树脂。在本发明一些实施方式中,所述阳离子交换材料是Poros XS树脂。
在本发明一些实施方式中,所述阴离子交换层析采用的阴离子交换材料包含叔胺离子官能团、季铵离子官能团、多胺官能团或二乙基氨基乙基官能团。在本发明一些实施方式中,所述阴离子交换材料是膜、整料或树脂。在本发明一些实施方式中,所述阴离子交换材料为Capto adhere树脂。
在本发明一些实施方式中,所述疏水相互作用层析采用的疏水相互作用交换材料包含丁基、苯基、辛基或聚丙二醇基团。在本发明一些实施方式中,所述疏水相互作用交换材料是膜、整料或树脂。在本发明一些实施方式中,所述疏水相互作用交换材料为CaptoPhenyl ImpRes树脂。
在本发明一些实施方式中,所述重组蛋白纯化方法还包括:在所述阳离子交换层析和阴离子交换层析之间进行病毒灭活。
在本发明一些实施方式中,所述重组蛋白纯化方法还包括:在所述疏水相互作用层析之后进行病毒纳滤。
在本发明一些实施方式中,所述重组蛋白纯化方法还包括:在所述病毒纳滤之后进行超滤浓缩。
在本发明一些实施方式中,所述重组蛋白为曲妥珠单抗或利妥昔单抗。
本发明中,当所述重组蛋白为曲妥珠单抗时,所述阳离子交换层析优选包括如下步骤:
(1)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,pH为4.0-6.0,电导率为5.0-15.0ms/cm的缓冲液对阳离子交换层析柱进行平衡,然后上样;优选地,pH为4.4-4.6,电导率为9.3-13.3ms/cm;
(2)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,pH为4.0-6.0,电导率为5.0-15.0ms/cm的缓冲液对所述阳离子交换层析柱进行洗涤;优选地,pH为4.4-4.6,电导率为9.3-13.3ms/cm;
(3)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,pH为4.5-5.3,电导率为10.0-15.0ms/cm的缓冲液进行预洗脱;优选地,pH为4.92-5.03,电导率为13.16-13.30ms/cm;
(4)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,pH为5.5-8.0,电导率为10.0-15.0ms/cm的缓冲液进行洗脱,收集洗脱液;优选地,pH为5.55-5.73,电导率为13.16-13.30ms/cm。
优选地,所述阳离子交换层析中,进行平衡的缓冲液用量为5-10倍柱体积。
优选地,所述阳离子交换层析中,进行洗涤的缓冲液用量为5-10倍柱体积。
优选地,所述阳离子交换层析中,进行预洗脱的缓冲液用量为5-10倍柱体积。
优选地,所述阳离子交换层析中,进行洗脱的缓冲液用量为8-12倍柱体积。
当所述重组蛋白为曲妥珠单抗时,所述阴离子交换层析优选包括如下步骤:
(1)调节所述阳离子交换层析得到的样品的电导率为3.0-15.0ms/cm,pH为6.0-8.0;优选地,电导率为4.0-10.0ms/cm,pH为6.0-6.6;
(2)采用含有20-100mM磷酸盐-柠檬酸,pH为6.0-8.0,电导率为3.0-15.0ms/cm的缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡;优选地,pH为6.0-6.5,电导率为4.0-10.0ms/cm;
(3)上样,收集流穿样,上样量优选为50.0-150.0mg样品/mL阴离子交换材料。
优选地,所述阴离子交换层析中,进行平衡的缓冲液用量为5-10倍柱体积。
当所述重组蛋白为曲妥珠单抗时,所述疏水相互作用层析优选包括如下步骤:
(1)向所述阴离子交换层析得到的样品中添加硫酸铵至硫酸铵的浓度为0.5-1.5M,并调节pH为6.0-8.0;优选地,硫酸铵的浓度为0.8M,pH为6.0-6.6;
(2)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,0.5-1.5M硫酸铵,pH为6.0-8.0的缓冲液对疏水相互作用层析柱进行平衡,然后上样;优选地,硫酸铵的浓度为0.8M,pH为6.0-6.6;
(3)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,0.5-1.5M硫酸铵,pH为6.0-8.0的缓冲液对所述疏水相互作用层析柱进行洗涤;优选地,硫酸铵的浓度为0.8M,pH为6.0-6.6;
(4)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,硫酸铵,pH=6.0-8.0的洗脱缓冲液进行线性洗脱,洗脱过程中所述洗脱缓冲液中硫酸铵的浓度从0.5-1.5M逐渐降低至0,收集洗脱液。
优选地,所述疏水相互作用层析中,进行平衡的缓冲液用量为5-10倍柱体积。
优选地,所述疏水相互作用层析中,进行洗涤的缓冲液用量为3-5倍柱体积。
优选地,所述疏水相互作用层析中,进行线性洗脱的缓冲液用量为10-20倍柱体积。
本发明中,当所述重组蛋白为利妥昔单抗时,所述阳离子交换层析优选包括如下步骤:
(1)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,电导率为5.0-15.0ms/cm,pH为4.0-6.0的缓冲液对阳离子交换层析柱进行平衡,然后上样;优选地,电导率为9.3-13.3ms/cm,pH为4.4-4.6;
(2)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,电导率为5.0-15.0ms/cm,pH为4.0-6.0的缓冲液对所述阳离子交换层析柱进行洗涤;优选地,电导率为9.3-13.3ms/cm,pH为4.4-4.6;
(3)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,电导率为5.0-15.0ms/cm,pH为4.5-5.5的缓冲液进行预洗脱;优选地,电导率为9.3-13.3ms/cm,pH为5.0-5.3;
(4)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,电导率为5.0-15.0ms/cm,pH为5.5-8.0的缓冲液进行洗脱,收集洗脱液;优选地,电导率为9.3-13.3ms/cm,pH为6.6-7.0。
优选地,所述阳离子交换层析中,进行平衡的缓冲液用量为5-10倍柱体积。
优选地,所述阳离子交换层析中,进行洗涤的缓冲液用量为5-10倍柱体积。
优选地,所述阳离子交换层析中,进行预洗脱的缓冲液用量为5-10倍柱体积。
优选地,所述阳离子交换层析中,进行洗脱的缓冲液用量为10-20倍柱体积。
当所述重组蛋白为利妥昔单抗时,所述阴离子交换层析优选包括如下步骤:
(1)调节所述阳离子交换层析得到的样品pH为6.0-8.0,电导率为3.0-15.0ms/cm;优选地,pH为6.0-7.0,电导率为4.0-15.0ms/cm;
(2)采用含有30-50mM磷酸盐-柠檬酸,pH为6.0-8.0,电导率为3.0-15.0ms/cm的缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡;优选地,pH为6.0-7.0,电导率为4.0-15.0ms/cm;
(3)上样,收集流穿样;上样量优选为100.0-300.0mg样品/mL阴离子交换材料。
优选地,所述阴离子交换层析中,进行平衡的缓冲液用量为10-20倍柱体积。
当所述重组蛋白为利妥昔单抗时,所述疏水相互作用层析优选包括如下步骤:
(1)向所述阴离子交换层析得到的样品中添加硫酸铵至硫酸铵的浓度为0.25-0.8M,并调节pH至pH为6.0-8.0;优选地,硫酸铵的浓度为0.5M,pH为6.0-6.5;
(2)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,0.25-0.8M硫酸铵,pH为6.0-8.0的缓冲液对疏水相互作用层析柱进行平衡,然后上样;优选地,硫酸铵的浓度为0.5M,pH为6.0-6.6;
(3)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,0.25-0.8M硫酸铵,pH为6.0-8.0的缓冲液对所述疏水相互作用层析柱进行洗涤;优选地,硫酸铵的浓度为0.5M,pH为6.0-6.6;
(4)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,硫酸铵,乙醇,pH=6.0-8.0的洗脱缓冲液进行线性洗脱,洗脱过程中所述洗脱缓冲液中硫酸铵的浓度从0.25-0.8M逐渐降低至0,乙醇的浓度从0逐渐增加至5-20wt%,收集洗脱液。
优选地,所述疏水相互作用层析中,进行平衡的缓冲液用量为5-10倍柱体积;
优选地,所述疏水相互作用层析中,进行洗涤的缓冲液用量为3-5倍柱体积。
优选地,所述疏水相互作用层析中,进行线性洗脱的缓冲液用量为10-20倍柱体积。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供的纯化方法将阳离子交换层析与阴离子交换层析、疏水相互作用层析相结合,对细胞培养上清液进行纯化,能够有效降低宿主细胞蛋白等杂质含量,制备出高纯度、高质量的重组蛋白,避免了使用蛋白A亲和层析残留微量蛋白A所导致的免疫或其他生理反应的问题。
附图说明
图1为实施例1阳离子交换层析实验组8的层析图谱。
图2为实施例1阳离子交换层析实验组8的洗脱液的SDS-PAGE电泳图。其中,1对应上清液,2对应流穿液,3对应图1所示峰1处的洗脱液,4对应图1所示峰2处的洗脱液,M为蛋白大小标记。
图3为实施例1阴离子交换层析中的HCP含量等高线图。
图4为实施例1阴离子交换层析中的抗体纯度等高线图。
图5为实施例1阴离子交换层析中的抗体回收率等高线图。
图6为实施例1阴离子交换层析的层析图谱。
图7为实施例1阴离子交换层析的流穿样的SDS-PAGE电泳图。其中,1对应上样样品,2对应流穿收集样品,M为蛋白大小标记。
图8为实施例1疏水相互作用层析的层析图谱。
图9为实施例1疏水相互作用层析的洗脱液的SDS-PAGE电泳图。其中,1对应洗脱收集样品,2对应上样样品,M为蛋白大小标记。
图10为实施例2阳离子交换层析的层析图谱。
图11为实施例2阳离子交换层析的洗脱液的SDS-PAGE电泳图。其中,1对应上清液,2对应流穿液,3对应图10所示峰1处的洗脱液,4对应图10所示峰2处的洗脱液,M为蛋白大小标记。
图12为实施例2阴离子交换层析的层析图谱。
图13为实施例2阴离子交换层析的流穿样的SDS-PAGE电泳图。其中,1对应上样样品,2对应流穿收集样品,M为蛋白大小标记。
图14为实施例2疏水相互作用层析的层析图谱。
图15为实施例2疏水相互作用层析的洗脱液的SDS-PAGE电泳图。其中,1对应上样样品,2对应洗脱液,M为蛋白大小标记。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
亲和层析在GE的AKTA Avant 25层析系统上完成,涉及的各项检测包括有:
蛋白质浓度:通过UV280的吸收值检测;
抗体纯度:通过分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)检测;
HCP含量:通过酶联免疫检测。
阳离子交换树脂POROS XS购自Thermo Scientific,Capto MMC购自Cytiva;阴离子交换树脂Capto adhere购自Cytiva;Capto Phenyl ImpRes购自Cytiva。
实施例1曲妥珠单抗的纯化
对表达曲妥珠单抗的CHO-K1细胞进行培养,收集细胞培养液,4000rpm离心20min,上清液留存备用。
1、阳离子交换层析
样品制备:
样品1:取上清液,用2M柠檬酸溶液调至pH=4.51,用孔径为0.22μm的过滤器进行过滤,收集滤液;
样品2:取上清液,用1M柠檬酸溶液调至pH=6.48,用孔径为0.22μm的过滤器进行过滤,收集滤液;
样品3:取上清液,用1M柠檬酸溶液调至pH=5.55,用孔径为0.22μm的过滤器进行过滤,收集滤液。
样品4:取上清液,用1M柠檬酸溶液调至pH=4.52,用孔径为0.22μm的过滤器进行过滤,收集滤液。
缓冲液配制:
缓冲液1:50mM磷酸氢二钠-柠檬酸+50mM氯化钠,pH=6.48,电导率:9.842mS/cm;
缓冲液2:50mM磷酸氢二钠-柠檬酸+500mM氯化钠,pH=6.53,电导率:50.67mS/cm;
缓冲液3:50mM磷酸氢二钠-柠檬酸+50mM氯化钠,pH=5.49,电导率:9.781mS/cm;
缓冲液4:50mM磷酸氢二钠-柠檬酸+500mM氯化钠,pH=5.52,电导率:48.49mS/cm;
缓冲液5:50mM柠檬酸钠+50mM氯化钠,pH=4.5,电导率:10.51mS/cm;
缓冲液6:50mM柠檬酸钠+1M氯化钠,pH=4.5,电导率:86.79mS/cm;
缓冲液7:50mM柠檬酸钠+50mM氯化钠,pH=7.75,电导率14.41mS/cm;
缓冲液A:50mM磷酸氢二钠-柠檬酸+100mM氯化钠,pH=4.54,电导率:13.16mS/cm;
缓冲液B:50mM磷酸氢二钠-柠檬酸+100mM氯化钠,pH=8,电导率:13.30mS/cm。
1.1阳离子交换树脂的选择
本实施例选择了两种阳离子交换树脂Poros XS、Capto MMC对曲妥珠单抗进行纯化并研究其纯化效果。
对阳离子交换层析柱依次进行平衡、上样、洗涤和洗脱,收集洗脱液,具体的层析条件如下表1所示:
表1
其中,“CV”表示柱体积。
线性洗脱时,洗脱缓冲液的成分随着洗脱的进行而逐渐变化,以实验组1为例,“缓冲液5+缓冲液6,0-100%缓冲液6”是指洗脱缓冲液由缓冲液5和缓冲液6组成,随着洗脱的进行,缓冲液6的体积百分比由0%逐渐增加至100%,缓冲液5的体积百分比由100%逐渐减少至0%。
采用紫外分光光度计对上述阳离子交换层析收集的洗脱液中曲妥珠单抗的收率进行测定,结果如下表2所示:
表2
测试项目 | 抗体收率(%) |
实验组1 | 96.26 |
实验组2 | 93.74 |
实验组3 | 0(无法洗脱) |
实验组4 | 88.22 |
从表2的实验结果可以看出,在相同实验条件下,实验组3无法洗脱,实验组1、2效果优于实验组4,表明使用Poros XS树脂对曲妥珠单抗的纯化收率优于Capto MMC树脂。
1.2阳离子交换层析条件的选择
本实验采用Poros XS树脂进行阳离子交换层析,研究了不同层析条件下曲妥珠单抗的纯化效果。
对Poros XS阳离子交换层析柱依次进行平衡、上样、洗涤和洗脱,收集洗脱液,具体的层析条件如下表3所示:
表3
其中,实验组8的层析图谱如图1所示。取上清液(1)、流穿液(2)、实验组8峰1处的洗脱液(3)、实验组8峰2处的洗脱液(4)进行SDS-PAGE电泳实验,结果如图2所示。从图2可以看出,曲妥珠单抗集中在峰2处的洗脱液中。
对上述阳离子交换层析收集的峰2处的洗脱液中曲妥珠单抗的纯度和收率、宿主细胞蛋白(HCP)的含量进行测定,结果如下表4所示:
表4
测试项目 | 抗体纯度(%) | 抗体收率(%) | HCP含量(ppm) |
实验组5 | N/A | 96.26 | N/A |
实验组6 | N/A | 0(无法有效结合) | N/A |
实验组7 | N/A | 0(无法有效结合) | N/A |
实验组8 | 95.96 | 81.76 | 16137 |
从表4的实验组5、实验组6和实验组7的结果可以看出,实验组5的纯化效果最好,对实验组5的条件进行进一步优化,条件如实验组8,此时经一步阳离子层析捕获后,抗体纯度大于95%,目标抗体收率大于80%,HCP为16137ppm。
2、阴离子交换层析
采用CCF模型,考察上样pH、电导率(Cond)、上样量(Load mass)对产品质量HCP、纯度(SEC)、回收率的影响。
阴离子交换树脂:Capto adhere,柱体积10μL,装于96孔板中。
样品制备:使用实验组8条件制备的样品,用超滤离心管(孔径30KD)浓缩至蛋白浓度为39.00mg/mL。
缓冲液配制:
使用20mM磷酸氢二钠,20mM柠檬酸和氯化钠,按下表5配制相应的溶液(其中氯化钠用来调节溶液电导率)。
表5
溶液编号 | 电导率(mS/cm) | pH |
溶液1 | 3 | 6 |
溶液2 | 15 | 6 |
溶液3 | 3 | 8 |
溶液4 | 15 | 8 |
溶液5 | 3 | 7 |
溶液6 | 15 | 7 |
溶液7 | 9 | 6 |
溶液8 | 9 | 8 |
溶液9 | 9 | 7 |
上样量及对应溶液按如下表6进行。
表6
按照下表7所示条件进行实验并记录对相应实验结果,如下表7所示:
表7
对上述结果的HCP、纯度和收率作进一步分析,如图3-5所示。
由上表实验结果分析,在确保收率大于80%,HCP小于2500ppm的最优实验条件是上样pH为6.0-6.5,电导率4.0-10.0mS/cm,上样量为50-100mg样品/mL树脂。
通过下述实验对上述条件进一步确认。
阴离子交换树脂:Capto adhere,柱体积4.2mL。
样品制备:使用实验组8条件制备的样品,用去离子水稀释至电导率为4.905mS/cm,并用1M Tris调至pH=6.55。
层析:对Capto adhere阴离子交换层析柱依次进行平衡、上样,收集流穿样,具体的层析条件如下表8所示:
表8
阴离子交换层析的层析图谱如图6所示。取上样样品和流穿收集样品进行SDS-PAGE电泳实验,结果如图7所示。
对上述阴离子交换层析收集的流穿样中曲妥珠单抗的纯度和收率、宿主细胞蛋白(HCP)的含量进行测定,结果如下表9所示:
表9
测试项目 | 抗体纯度(%) | 抗体收率(%) | HCP含量(ppm) |
流穿样 | 96.37 | 81.73 | 1472 |
3、疏水相互作用层析
疏水相互作用树脂:Capto Phenyl ImpRes,柱体积4.2mL。
样品制备:将上述阴离子交换层析收集的流穿样与1.6M(NH4)2SO4溶液混合至(NH4)2SO4浓度为0.8M,并用2M Tris调至pH=6.45。
缓冲液配制:
缓冲液A:50mM磷酸氢二钠-柠檬酸+0.8M(NH4)2SO4,pH=6.53,电导率:106.7mS/cm;
缓冲液B:50mM磷酸氢二钠-柠檬酸,pH=6.51,电导率:5.8mS/cm。
层析:对Capto Phenyl ImpRes疏水相互作用层析柱依次进行平衡、上样、洗涤和洗脱,收集洗脱液,具体的层析条件如下表10所示:
表10
步骤 | 层析条件 |
平衡 | 缓冲液A,5CV,流速0.7mL/min |
上样 | 10mg样品/mL树脂,流速0.7mL/min |
洗涤 | 缓冲液A,3CV,流速0.7mL/min |
洗脱 | 缓冲液A+缓冲液B,0-100%缓冲液B线性洗脱,10CV,流速0.7mL/min |
收集峰参数 | 50-50mAU |
疏水相互作用层析的层析图谱如图8所示。取上样和洗脱收集样品进行SDS-PAGE电泳实验,结果如图9所示。
对上述疏水相互作用层析收集的洗脱液中曲妥珠单抗的纯度和收率、宿主细胞蛋白(HCP)的含量进行测定,结果如下表11所示:
表11
测试项目 | 抗体纯度(%) | 抗体收率(%) | HCP含量(ppm) |
洗脱液 | 97.7 | 92.3 | 78 |
实施例2利妥昔单抗的纯化
对表达利妥昔单抗的CHO-K1细胞进行培养,收集细胞培养液,4000rpm离心20min,上清液留存备用。
1、阳离子交换层析
阳离子交换树脂:Poros XS,柱体积19mL。
样品制备:取上清液,用1M柠檬酸溶液调至pH=4.51,2500rpm离心5min,用孔径为0.22μm的过滤器进行过滤,收集滤液。
缓冲液配制:
缓冲液A:50mM磷酸氢二钠-柠檬酸+50mM氯化钠,pH=4.55,电导率:9.376mS/cm;
缓冲液B:50mM磷酸氢二钠-柠檬酸+50mM氯化钠,pH=8.04,电导率:11.97mS/cm。
层析:对Poros XS阳离子交换层析柱依次进行平衡、上样、洗涤和洗脱,收集洗脱液,具体的层析条件如下表12所示:
表12
阳离子交换层析图谱如图10所示。取上清液(1)、流穿液、峰1处的洗脱液(3)、峰2处的洗脱液(4)进行SDS-PAGE电泳实验,结果如图11所示。从图11可以看出,利妥昔单抗集中在峰2处的洗脱液中。
对上述阳离子交换层析收集的峰2处的洗脱液中利妥昔单抗的纯度和收率、宿主细胞蛋白(HCP)的含量进行测定,结果如下表13所示:
表13
测试项目 | 抗体纯度(%) | 抗体收率(%) | HCP含量(ppm) |
洗脱液 | 91.33 | 91.2 | 12854 |
从表13的实验结果可以看出,经过实验组3条件纯化后的利妥昔单抗纯度大于91%,收率大于91%,HCP为12854ppm。
2、阴离子交换层析
阴离子交换树脂:Capto adhere,柱体积4.7mL。
样品制备:
样品1:将实验组3收集的洗脱液用50mM磷酸氢二钠溶液调至pH=6.79,电导率10.41mS/cm。
缓冲液配制:
缓冲液C:50mM磷酸氢二钠-柠檬酸+50mM氯化钠,pH=6.79,电导率:10.81mS/cm。
层析:对Capto adhere阴离子交换层析柱依次进行平衡、上样,收集流穿样,具体的层析条件如下表14所示:
表14
平衡 | 缓冲液C,10CV,流速0.78mL/min |
上样 | 102mg样品1/mL树脂,流速0.78mL/min,收集流穿样 |
洗涤 | 缓冲液C,13CV,流速0.78mL/min |
收集峰参数 | 100-100mAU |
阴离子交换层析的层析图谱如图12所示。取上样样品和流穿收集样品进行SDS-PAGE电泳实验,结果如图13所示。
对上述阴离子交换层析收集的流穿样中利妥昔单抗的纯度和收率、宿主细胞蛋白(HCP)的含量进行测定,结果如下表15所示:
表15
测试项目 | 抗体纯度(%) | 抗体收率(%) | HCP含量(ppm) |
流穿样 | 97.9 | 84.6 | 412 |
3、疏水相互作用层析
疏水相互作用树脂:Capto Phenyl ImpRes,柱体积4.2mL。
样品制备:
样品1:将上述阴离子交换层析收集的流穿样与1.6M(NH4)2SO4溶液混合至(NH4)2SO4浓度为0.5M,并用2M Tris溶液调至pH=6.46,电导率为76.9mS/cm;
缓冲液配制:
缓冲液A:50mM磷酸氢二钠-柠檬酸+0.5M(NH4)2SO4,pH=6.56;
缓冲液B:50mM磷酸氢二钠-柠檬酸+10wt%乙醇,pH=6.51;
层析:对疏水相互作用层析柱依次进行平衡、上样、洗涤和洗脱,收集洗脱液,具体的层析条件如下表16所示:
表16
疏水相互作用层析的层析图谱如图14所示。取上样液和洗脱液进行SDS-PAGE电泳实验,结果如图15所示。
对上述疏水相互作用层析收集的洗脱液中利妥昔单抗的纯度和收率、宿主细胞蛋白(HCP)的含量进行测定,结果如下表17所示:
表17
测试项目 | 抗体纯度(%) | 抗体收率(%) | HCP含量(ppm) |
洗脱液 | 98.7 | 92.4 | 33 |
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (12)
1.一种重组蛋白纯化方法,其特征在于,包括如下步骤:
获得表达重组蛋白的宿主细胞的培养上清液;
将获得的培养上清液依次经过阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水相互作用层析,得到纯化的所述重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白纯化方法,其特征在于,在所述经过阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水相互作用层析的步骤之前,部分去除所述培养上清液中的所述宿主细胞的蛋白;
优选地,所述部分去除包括:将所述培养上清液的pH调节至≤所述重组蛋白等电点-1,使所述宿主细胞的蛋白沉淀,然后进行固液分离;
优选地,使用柠檬酸、醋酸和/或盐酸调节所述培养上清液的pH。
3.根据权利要求1或2所述的重组蛋白纯化方法,其特征在于,所述阳离子交换层析采用的阳离子交换材料包含磺酸官能团或羧酸官能团;
所述阴离子交换层析采用的阴离子交换材料包含叔胺离子官能团、季铵离子官能团、多胺官能团或二乙基氨基乙基官能团;和/或
所述疏水相互作用层析采用的疏水相互作用交换材料包含丁基、苯基、辛基或聚丙二醇基团。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组蛋白纯化方法,其特征在于,所述重组蛋白纯化方法还包括:在所述阳离子交换层析和阴离子交换层析之间进行病毒灭活;
优选地,所述重组蛋白纯化方法还包括:在所述疏水相互作用层析之后进行病毒纳滤;
更优选地,在所述病毒纳滤之后进行超滤浓缩。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组蛋白纯化方法,其特征在于,所述重组蛋白为曲妥珠单抗。
6.根据权利要求5所述的重组蛋白纯化方法,其特征在于,所述阳离子交换层析包括如下步骤:
(1)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,pH为4.0-6.0,电导率为5.0-15.0ms/cm的缓冲液对阳离子交换层析柱进行平衡,然后上样;优选地,pH为4.4-4.6,电导率为9.3-13.3ms/cm;
(2)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,pH为4.0-6.0,电导率为5.0-15.0ms/cm的缓冲液对所述阳离子交换层析柱进行洗涤;优选地,pH为4.4-4.6,电导率为9.3-13.3ms/cm;
(3)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,pH为4.5-5.3,电导率为10.0-15.0ms/cm的缓冲液进行预洗脱;优选地,pH为4.92-5.03,电导率为13.16-13.30ms/cm;
(4)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,pH为5.5-8.0,电导率为10.0-15.0ms/cm的缓冲液进行洗脱,收集洗脱液;优选地,pH为5.55-5.73,电导率为13.16-13.30ms/cm;
优选地,所述平衡的缓冲液用量为5-10倍柱体积;
优选地,所述洗涤的缓冲液用量为5-10倍柱体积;
优选地,所述预洗脱的缓冲液用量为5-10倍柱体积;
优选地,所述洗脱的缓冲液用量为8-12倍柱体积。
7.根据权利要求5或6所述的重组蛋白纯化方法,其特征在于,所述阴离子交换层析包括如下步骤:
(1)调节所述阳离子交换层析得到的样品的电导率为3.0-15.0ms/cm,pH为6.0-8.0;优选地,电导率为4.0-10.0ms/cm,pH为6.0-6.6;
(2)采用含有20-100mM磷酸盐-柠檬酸,pH为6.0-8.0,电导率为3.0-15.0ms/cm的缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡;优选地,pH为6.0-6.5,电导率为4.0-10.0ms/cm;
(3)上样,收集流穿样,上样量为50.0-150.0mg样品/mL阴离子交换材料;
优选地,所述平衡的缓冲液用量为5-10倍柱体积。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的重组蛋白纯化方法,其特征在于,所述疏水相互作用层析包括如下步骤:
(1)向所述阴离子交换层析得到的样品中添加硫酸铵至硫酸铵的浓度为0.5-1.5M,并调节pH为6.0-8.0;优选地,硫酸铵的浓度为0.8M,pH为6.0-6.6;
(2)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,0.5-1.5M硫酸铵,pH为6.0-8.0的缓冲液对疏水相互作用层析柱进行平衡,然后上样;优选地,硫酸铵的浓度为0.8M,pH为6.0-6.6;
(3)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,0.5-1.5M硫酸铵,pH为6.0-8.0的缓冲液对所述疏水相互作用层析柱进行洗涤;优选地,硫酸铵的浓度为0.8M,pH为6.0-6.6;
(4)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,硫酸铵,pH=6.0-8.0的洗脱缓冲液进行线性洗脱,洗脱过程中所述洗脱缓冲液中硫酸铵的浓度从0.5-1.5M逐渐降低至0,收集洗脱液;
优选地,所述平衡的缓冲液用量为5-10倍柱体积;
优选地,所述洗涤的缓冲液用量为3-5倍柱体积;
优选地,所述线性洗脱的缓冲液用量为10-20倍柱体积。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的重组蛋白纯化方法,其特征在于,所述重组蛋白为利妥昔单抗。
10.根据权利要求9所述的重组蛋白纯化方法,其特征在于,所述阳离子交换层析包括如下步骤:
(1)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,电导率为5.0-15.0ms/cm,pH为4.0-6.0的缓冲液对阳离子交换层析柱进行平衡,然后上样;优选地,电导率为9.3-13.3ms/cm,pH为4.4-4.6;
(2)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,电导率为5.0-15.0ms/cm,pH为4.0-6.0的缓冲液对所述阳离子交换层析柱进行洗涤;优选地,电导率为9.3-13.3ms/cm,pH为4.4-4.6;
(3)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,电导率为5.0-15.0ms/cm,pH为4.5-5.5的缓冲液进行预洗脱;优选地,电导率为9.3-13.3ms/cm,pH为5.0-5.3;
(4)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,50-100mM氯化钠,电导率为5.0-15.0ms/cm,pH为5.5-8.0的缓冲液进行洗脱,收集洗脱液;优选地,电导率为9.3-13.3ms/cm,pH为6.6-7.0;
优选地,所述平衡的缓冲液用量为5-10倍柱体积;
优选地,所述洗涤的缓冲液用量为5-10倍柱体积;
优选地,所述预洗脱的缓冲液用量为5-10倍柱体积;
优选地,所述洗脱的缓冲液用量为10-20倍柱体积。
11.根据权利要求9或10所述的重组蛋白纯化方法,其特征在于,所述阴离子交换层析包括如下步骤:
(1)调节所述阳离子交换层析得到的样品pH为6.0-8.0,电导率为3.0-15.0ms/cm;优选地,pH为6.0-7.0,电导率为4.0-15.0ms/cm;
(2)采用含有30-50mM磷酸盐-柠檬酸,pH为6.0-8.0,电导率为3.0-15.0ms/cm的缓冲液对阴离子交换层析柱进行平衡;优选地,pH为6.0-7.0,电导率为4.0-15.0ms/cm;
(3)上样,收集流穿样,上样量为100.0-300.0mg样品/mL阴离子交换材料;
优选地,所述平衡的缓冲液用量为10-20倍柱体积。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的重组蛋白纯化方法,其特征在于,所述疏水相互作用层析包括如下步骤:
(1)向所述阴离子交换层析得到的样品中添加硫酸铵至硫酸铵的浓度为0.25-0.8M,并调节pH至pH为6.0-8.0;优选地,硫酸铵的浓度为0.5M,pH为6.0-6.5;
(2)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,0.25-0.8M硫酸铵,pH为6.0-8.0的缓冲液对疏水相互作用层析柱进行平衡,然后上样;优选地,硫酸铵的浓度为0.5M,pH为6.0-6.6;
(3)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,0.25-0.8M硫酸铵,pH为6.0-8.0的缓冲液对所述疏水相互作用层析柱进行洗涤;优选地,硫酸铵的浓度为0.5M,pH为6.0-6.6;
(4)采用含有50-100mM磷酸盐-柠檬酸,硫酸铵,乙醇,pH=6.0-8.0的洗脱缓冲液进行线性洗脱,洗脱过程中所述洗脱缓冲液中硫酸铵的浓度从0.25-0.8M逐渐降低至0,乙醇的浓度从0逐渐增加至5-20wt%,收集洗脱液;
优选地,所述平衡的缓冲液用量为5-10倍柱体积;
优选地,所述洗涤的缓冲液用量为3-5倍柱体积;
优选地,所述线性洗脱的缓冲液用量为10-20倍柱体积。
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