KR20200128108A

KR20200128108A - 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법, 생산 모듈 및 생산에서의 응용

Info

Publication number: KR20200128108A
Application number: KR1020207028058A
Authority: KR
Inventors: 조이 저우; 즈차이 리; 수이칭 쉬; 스티븐 지 칸; 쥔 린; 지옌칭 왕; 칭탕 돤; 밍옌 안; 민주 리
Original assignee: 제노 바이오파마 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2020-11-11
Also published as: WO2019170145A1; JP2021516971A; US20200332248A1; RU2769767C1; CN110241012B; CN110241012A; EP3722408A4; EP3722408A1

Abstract

본 발명은 생체거대분자의 업스트림 생산 과정에서 단계별 차단 생산 방법, 상기 방법을 결합하여 사용하는 생산 모듈 및 폴리펩티드, 융합 단백질 및 면역 글로불린 분자의 공업 생산에서의 상기 방법/모듈의 응용을 제공한다. 본 발명의 방법은 대규모 재조합 단백질 업스트림 공정의 효율, 생산량 및 순도의 향상을 효과적으로 실현할 수 있다.

Description

생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법, 생산 모듈 및 생산에서의 응용

본 발명은 생물 제품 생산 분야에 속하고, 더 구체적으로 생체거대분자의 공업화 생산에 관한 것으로 특히 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 면역 글로불린의 업스트림 공정 제조에 관한 것이다.

생물 대분자, 특히 융합 단백질과 면역 글로불린 단백질 분자는 오늘날 바이오 제약 분야의 핫 이슈이다. 그 생산은 세포 배양의 업스트림 공정 제조, 세포 배양액에서 추출, 정화, 정제, 농축된 다운스트림 공정의 제조 과정 및 인체에 적합한 제제용액에 항체 분자를 넣는 제제 공정 제조 등 세가지 주요 절차가 있다.

업스트림 공정에서 재조합 단백질을 생산하는데 사용되는 발현 체계는 주로 포유 동물의 세포 배양 체계에 형성되어 있다. 일반적으로 작업용 세포은행에 있는 하나의 축적관에서 세포 활성화가 시작되면, 삼각 플라스크, 2L, 10L, 50L, 이어 500L의 세포 반응기를 통해 생산된다. 세포 배양 과정에서 관련된 배지 성분이 많게는 70-80여종에 달하고, 세포 배양 과정에서 세포 반응 중 분비된 단백질 분해 효소, 작은 세포 조각 및 숙주 세포 단백질, DNA, RNA분자 등 여러 불순물이 누적될 수 있다. 동시에 불완전한 항체 분자 또는 산화환원으로 인한 전하분포가 다른 항체 분자 등이 더 포함될 수 있으므로 다운스트림 공정에서는 원심분리법과 심층 여과를 통해 세포를 제거한 후 다시 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용해 항체를 추출한다. 해당 절차에서의 제품 수율은 95%보다 크나, 이때 절대다수의 Fc 프래그먼트를 지닌 완전 항체 분자를 추출할 뿐만아니라, 동시에 불완전한 항체 분자 등 제품 성질과 관련된 불순물도 함께 추출되어 그 후의 정화와 정제 단계에서 조작의 어려움을 겪는다. 그러므로 이러한 경우 제품의 높은 품질 또는 서로 다른 생산 루트의 유사성을 보장하기 위해 다운스트림 공정의 정화와 정제 절차에서는 종종 희생 생산율을 결과로 삼는다.

종래의 생물 대분자의 대규모 공업 생산 업스트림 세포 배양 단계에서는 관류 배양(perfusion culture)과 유가 배양(fed-batch culture)의 두 가지 방식을 주로 사용하고, 다시 각기 다른 세포 차단 공정과 결합하여 고밀도의 세포 배양을 가능케 하고 동시에 세포 배양액 속의 불순물을 여과시킨다. ATF (교체 접선 플러우 필터링)란, 가장 선진적인 차단 공정 중 하나로 세포에 대한 낮은 전단 응력, 높은 필터링 면적과 강한 항폐쇄능력을 보장하는 필터링 시스템으로 고밀도의 세포 필터링 배양을 가능하도록 한다. 그러나 실제 작업 과정에서는 세포가 끊임없이 성장하기 때문에 세포 대규모 배양 과정에서 단백질 발현을 제외하고, 세포 배양의 초기에 주로 배지 중에 세포 대사 산물을 누적하는 것과 같은 각기 다른 성질의 대사 산물 또는 제품 관련 불순물을 누적 생산하고, 동시에 세포를 대량으로 확장하는 초기의 배양 조건에서 배지 중에 소량의 항체 산물이 생성될 수 있다. 이러한 항체 산물은 초기 배지 온도가 비교적 높다는 등 조건의 영향을 쉽게 받아 탈 아미노화 또는 분해 등의 변화가 발생하여 제품 관련 물질 또는 불순물이 된다. 이러한 대사 산물과 제품 관련 불순물은 세포와 기대 단백질의 농도 상승에 따라, 최종 단백질 산물의 생산량과 순도에 직접적인 영향을 미치고, 나아가 단백질 산물의 천연 구조에도 영향을 미쳐 고농도 단백질이 함께 모이고 기업에게 있어 후처리 시 중대한 자본과 시간이 투입되어야 할 수 있으므로 여전히 그 손실을 피할 수 없다.

그러므로 업스트림 생산 공정에서의 현재 생물 대분자의 국한은 기업이 단시간 내에 시간표에 따른 고품질 실현과, 높은 속도와 생산품이 제품으로 전환되기 어렵게 한다. 이러한 이유로 하루 빨리 생산솔루션을 찾아보아 업스트림 생산 단계의 세포 배양 과정에서의 대사 산물과 제품 관련 불순물이 생산에 미치는 영향을 극복하는데 사용해야 한다.

본 발명은 생물 대분자 업스트림 생산 과정에서 단계별 차단의 생산방법, 상기 방법을 결합하여 사용한 생산 모듈 및 폴리펩티드, 융합 단백질 및 면역 글로불린 분자의 공업적 생산에서의 상기 방법/모듈의 응용을 제공하고, 상기 방법으로 대규모 재조합 단백질 업스트림 공정의 효율, 생산량 및 순도의 향상을 효과적으로 실현할 수 있다.

제1 방면에서, 본 발명은 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법을 제공하였고, 생물 반응기를 차단 시스템에 결합한 생산 방식을 포함하고, 상기 방법은 적어도 2개의 생산 단계를 포함하고, 제1 생산 단계에서 제1 필터링 모듈을 포함하는 차단 시스템을 사용하고 상기 제1 필터링 모듈은 필터링 홀이 0.05μm-1μm인 필터링 어셈블리를 포함하고, 제2 생산 단계에서, 제2 필터링 모듈을 포함하는 차단 시스템을 사용하고, 상기 제2 필터링 모듈은 필터링 홀의 차단 분자량이 산물 분자량에 비해 1/15~1/3인 필터링 어셈블리를 포함한다.

바람직한 실시예에서, 상기 제1 필터링 모듈은 필터링 홀이 0.1μm-0.5μm인, 바람직하게는 0.2μm-0.3μm인 필터링 어셈블리를 포함한다.

바람직한 실시예에서 상기 제2 필터링 모듈은 필터링 홀의 차단 분자량이 산물 분자량에 비해 2/15~7/15인, 바람직하게는 1/5~1/3인 필터링 어셈블리를 포함한다.

바람직한 실시예에서 상기 산물의 분자량은 50~300KD이고 바람직하게는 상기 산물의 분자량은 100~250KD이고 더욱 바람직하게는 상기 산물의 분자량은 150~200KD이다.

상기 제1 생산 단계는 세포의 초기 증식 단계이거나 또는 산물 합성 최적화 단계로 칭할 수 있다. 초기 환경에서 배양 온도가 비교적 높고(37^oC), 세포가 고속 증식 단계에 있고 대량의 세포 대사 폐물, 유산 산물 및 소량의 탈 아미노화 또는 분해된 항체 불순물이 쉽게 누적된다. 상기 제2 생산 단계는 산물 합성 및 수집 단계이고, 본 발명자는 제1 생산 단계에서 발생한 대산 산물 및 불순물을 제거 후 제2 생산 단계 고품질 산물의 합성 및 수집에 더욱 유리하다는 것을 뜻밖에 발견하였다. 따라서 후기 산물의 품질과 수율을 향상할 것을 기대하기 위하여 창조적으로 단계별 차단 체계를 인입한다.

바람직한 실시예에서 제1 생산 단계에서 상기 차단 시스템은 주로 세포를 차단하고 대사 산물 및 불순물을 제거하고, 제2 생산 단계에서 상기 차단 시스템은 주로 세포를 차단하고 단백질 산물을 농축하고 소분자 대사 산물을 제거한다.

실시예에서 생물 대분자 업스트림 생산에서 제1 생산 단계는 세포를 생물 반응기에 접종 후 시작된다.

다른 한 실시예에서 생물 대분자 업스트림 생산에서 세포 배양 밀도가 6±5×10⁶세포수/ml에 달한 경우 제1 생산 단계를 시작한다.

다른 한 실시예에서 생물 대분자 업스트림 생산에서 세포 배양 밀도가 10±5×10⁶세포수/ml에 달한 경우 제1 생산 단계를 시작한다.

실시예에서 상기 제2 생산 단계의 세포 배양 밀도는 15±5×10⁶세포수/ml보다 작지 않고, 바람직하게는 상기 제2 생산 단계의 세포 배양 밀도는 35±5×10⁶세포수/ml보다 작지 않다.

다른 한 바람직한 예에서 상기 “배양 밀도는 15±5×10⁶세포수/ml보다 작지 않은”은 배양 밀도가 10×10⁶～30×10⁶세포수/ml이다.

다른 한 바람직한 예에서 상기 “배양 밀도는 35±5×10⁶세포수/ml보다 작지 않은”은 배양 밀도가 30×10⁶～50×10⁶세포수/ml이다.

다른 한 바람직한 예에서 상기 “배양 밀도는 15±5×10⁶세포수/ml보다 작지 않은”은 배양 밀도가 10×10⁶세포수/ml～300×10⁶세포수/ml이고, 세포 운동성이 50%로 하강 시까지 배양하면 세포 발효액을 얻고, 제2 생산 단계를 완성하고, 바람직하게는 배양 세포의 운동성이 70%로 하강하면 세포 발효액을 얻고, 더욱 바람직하게는 배양 세포의 활력이 80%로 하강하면 세포 발효액을 얻고, 가장 바람직하게는 배양 세포의 활력이 90%로 하강하면 세포 발효액을 얻는다.

다른 한 바람직한 예에서 상기 “배양 밀도는 35±5×10⁶세포수/ml보다 작지 않은”은 배양 밀도가 30×10⁶세포수/ml～100 ×10⁶세포수/ml이다.

실시예에서 상기 제2 생산 단계의 세포 배양 밀도는 상대적으로 안정적인 추세를 나타내고 세포 배양 밀도의 파동 범위는 10×10⁶세포수/ml보다 크지 않다.

다른 한 실시예에서 상기 제2 생산 단계의 세포 배양 밀도는 점진적 증가 추세를 나타내고 세포 배양 밀도의 파동 범위는 10×10⁶세포수/ml보다 크다.

다른 한 실시예에서 상기 “파동 범위는 10×10⁶세포수/ml보다 크고”는 파동 범위가 10×10⁶세포수/ml~290×10⁶세포수/ml이다.

다른 한 실시예에서 상기 “파동 범위는 10×10⁶세포수/ml보다 크고”는 파동 범위가 10×10⁶세포수/ml~90×10⁶세포수/ml이다.

실시예에서 상기 차단 시스템은 교체식 접선 플러우 시스템, 접선 플러우 필터링 시스템, 회전 필터링 시스템, 심층 필터링 시스템, 원심분리기 시스템 또는 침전 시스템을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

실시예에서 상기 생물 반응기는 에어리프트 생물 반응기, 기계 교반식 반응기, 기포탑 생물 반응기, 막 생물 반응기 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다른 한 실시예에서, 상기 생물 반응기는 부화 쉐이크 타입, 마이크로 생물 반응기, 벤치 타입 생물 반응기, 스테인리스 생물 반응기, 유리 생물 반응기, 1차성 생물 반응기, 스윙 타입 생물 반응기 또는 다수의 병렬 연결 탱크를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

실시예에서, 상기 배양 세포는 포유 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 미생물 세포 등 산업화 발효 배양에 적용되는 발현된 체계를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 상기 포유 동물 세포는 CHO세포, NSO세포, Sp2/0세포, HEK세포, BHK세포 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

실시예에서 상기 생산 공정은 관류 배양, 농축 관류 배양, 유가 배양 및 농축 유가 배양을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

실시예에서 세포 업스트림의 생산과정은 이하 S1~S4단계를 포함한다.

S1단계, 확충 대기 세포를 활성화하고 급에 따라 설정 규모의 생물 반응기에 확대 배양한다.

S2단계, 제1 필터링 모듈을 함유하는 차단 시스템을 생물 반응기에 결합하여 세포에 대해 제1 생산 단계의 배양 생산을 진행한다.

S3단계, 세포 밀도가 15±5×10⁶세포수/ml에 달하면, 제2 필터링 모듈을 함유하는 차단 시스템으로 변경하고 제2 생산 단계의 배양 생산에 진입한다.

바람직한 실시예에서 세포 밀도가 35±5×10⁶세포수/ml에 달하면 제2 필터링 모듈을 함유하는 차단 시스템으로 변경하고, 제2 생산 단계의 배양 생산으로 진입한다.

다른 한 바람직한 실시예에서, 세포 밀도가 55±5×10⁶세포수/ml에 달하면 제2 필터링 모듈을 함유하는 차단 시스템으로 변경하고, 제2 생산 단계의 배양 생산으로 진입한다.

S4단계, 세포 성장 활성 모니터링을 실시하고 배양 세포의 운동성이 50%로 하강 시, 세포 발효액을 얻고, 다운스트림의 생산 공정에 진입한다. 바람직하게는 배양 세포의 활력이 70%로 하강 시, 세포 발효액을 얻고, 더욱 바람직하게는 배양 세포의 활력이 80%로 하강 시, 세포 발효액을 얻고, 가장 바람직하게는 배양 세포의 활력이 90%로 하강 시, 세포 발효액을 얻는다.

다운스트림의 생산 정화 공정은 서로 다른 생물 분자 산물의 특성에 의해 설계된 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 허셉틴의 생물 유사물의 생산을 예로 단계별 차단 체계 생산의 수율 및 제품 품질의 장점을 설명한다.

본 발명의 다른 한 바람직한 실시예에서 아바스틴의 생물 유사물의 생산을 예로 단계별 차단 체계 생산의 수율 및 제품의 품질의 장점을 설명한다.

제2 방면에서, 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 모듈을 제공하고, 상기 생산 모듈은 차단 시스템에 결합되고 생물 반응기에 결합되어 사용 가능하고, 적어도 2개의 필터링 모듈을 포함하고, 그중, 제1 필터링 모듈은 필터링 홀의 직경이 0.05μm-1μm의 범위 내에 있는 필터링 어셈블리를 포함하고 세포 배양액 중의 대사 산물과 제품 불순물 제거에 사용된다. 상기 제2 필터링 모듈은 필터링 홀의 차단 분자량이 산물 분자량에 비해 1/15~2/3범위 내에 있는 필터링 어셈블리를 포함하고, 생물 대분자 산물을 얻고 농축하는데 사용된다.

바람직한 실시예에서 상기 제1 필터링 모듈은 필터링 홀이 0.1μm-0.5μm인, 바람직하게는 0.2μm-0.3μm인 필터링 어셈블리를 포함하고, 상기 제2 필터링 모듈은 필터링 홀의 차단 분자량이 산물 분자량에 비해 2/15～7/15인, 비교적 바람직하게는 1/5～1/3인 필터링 어셈블리를 포함한다.

일 실시예에서 상기 불순물 필터링 모듈의 필터링 홀 직경은 20-50KD분자의 직경이고, 더욱 바람직하게는 상기 불순물의 필터링 모듈의 필터링 홀 직경은 50KD분자의 직경이다.

상기 필터링 어셈블리는 형태에 있어 중공 섬유 타입, 튜브 타입, 롤 타입, 플레이트 타입 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 필터링 어셈블리의 재료는 섬유소 에스테르류 또는 비섬유소 에스테르류이고, 상기 섬유소 에스테르류 재료는 초산 섬유소, 질산 섬유소, 에틸기 섬유소 등을 포함하나 이에 한정되지 않고; 상기 비섬유소 에스테르류는 폴리 술폰(PS), 폴리프로필렌(PP), 폴리에틸렌(PE), 폴리염화비닐(PVC), 폴리에테르술폰(PES) 및 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF) 등 재료를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 생물 반응기는 에어리프트 생물 반응기, 기계 교반식 반응기, 기포탑 생물 반응기, 막 생물 반응기 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

일 실시예에서, 상기 차단 시스템은 교체식 접선 플러우 시스템, 접선 플러우 필터링 시스템, 회전 필터링 시스템, 심층 필터링 시스템, 원심분리기 시스템 또는 침전 시스템을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 배양 세포는 포유 동물 세포, 식물 세포, 미생물 세포, 곤충 세포 등을 포함하나 이에 한정되지 않고 대규모 발효 배양의 발현 체계에 적용된다. 바람직하게는 상기 포유 동물 세포는 CHO세포, NSO세포, Sp2/0세포, HEK세포, BHK세포 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

제3 방면에서, 본 발명은 생물 대분자 업스트림 생산 단계별 필터링의 생산 모듈/생산 방법의 응용을 제공하고, 상기 생물 대분자 단계별 필터링 생산 모듈/생산 방법은 생물 대분자의 공업화 생산에 응용될 수 있다.

상기 생물 대분자는 폴리펩티드 또는 재조합 단백질을 포함하나 한정되지 않는다.

바람직하게는, 상기 재조합 단백질은 면역 글로불린 또는 유전자 공정 항체이고, 휴먼 마우스 키메라 항체, 인간화 항체, 전인 항체, Fab 프래그먼트, F(ab')2, Fv, ScFv, 단일 영역 항체, 2중/다특이성 항체 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다른 한 바람직한 예에서, 상기 재조합 단백질은 생물학적 활성을 갖는 기능 단백질과 Fc프래그먼트가 융합되어 형성된 신형 단백질이다.

상기 응용은 미생물 배양, 배지, 클론 또는 발현 캐리어의 선별, 소규모 단백질 공급, 공정 개발, 최적화와 특성 검증, 종자 확대, 생산 등 각 단계에 적용된다.

도 1은 세포 업스트림 제1 생산 단계의 개략도이다.
도 2는 세포 업스트림 제2 생산 단계의 개략도이다.

종래기술 중 생물 대분자의 업스트림 생산 공정에 대한 효율이 낮고, 생산량이 낮으며 정화가 낮은 문제에 대해, 본 발명인은 심도 깊은 연구를 통해 업스트림 생산과정에서 단계별 차단 공정을 선택하여 발현된 단백질 다운스트림의 생산 품질을 크게 최적화하고, 고품질 단백질 수율을 최대한으로 높여 주었음을 뜻밖에 발견하였다.

본 발명에 대한 이해를 높이기 위해 본 발명의 키 파라미터에 대해 다음과 같이 정의한다.

SEC-HPLC：분자 배제 고성능 액상 크로마토그래피, 제품 순도 측정 방법 중 하나로 면적 정규화법에 따라 계산하고, 단량체와 중합체(고분자량 그룹) 및 세그먼트(저분자량 그룹)으로 구분된다. 그 중에서 단량체의 백분율이 클 수록 제품의 순도도 더욱 높다.

CEX-HPLC：음이온 교환 고성능 액상 크로마토그래피, 제품 전하 순도 측정 방법 중 하나로 제품의 균일성 문제를 반응하는데 사용된다. 제품의 전하에 따라 산성 피크 그룹, 메인 피크 및 알칼리성 피크로 구분된다. 그 중 산성 피크 또는 알칼리성 피크의 비율이 높을 수록 제품의 전하 이질화 정도가 더 높고 제품의 균일성도 더 떨어진다는 것을 의미한다.

rCE-SDS：환원 모세관 겔 전기영동법, 환원 모세관 겔 전기영동법을 사용하여 고압 전기장을 구동력으로 제품이 환원을 거친 후 분자량의 크기에 따라 미세관 내에서의 이동속도가 다름으로 인해 분리를 진행한다. 그 중, 헤비 체인+라이트 체인의 총합 비율이 높을 수록 제품의 순도도 높음을 의미한다.

nrCE-SDS：비환원 모세관 겔 전기영동법, 비환원 모세관 겔 전기영동을 사용하여 고압 전기장을 구동력으로 제품 분자량의 크기에 따라 모세관 내에서 이동속도가 다름으로 인해 분리를 진행한다. 그 중 단량체의 비율이 높을 수록 제품의 순도도 높음을 의미한다.

세포 활력/세포 운동성 비율: 단위체적 내 활성 세포가 총 세포 수에서 차지하는 비율이다.

발효 과정에서 항체는 배양 온도, 시간, 교반 속도, pH 등 조건의 영향을 쉽게 받기 때문에 탈 아미노화, 산화, N-단피롤리돈카복실산 고리화 등의 각종 전환 후 수식 변화가 발생한다. 이러한 변화는 모두 항체의 전하 분포에 영향을 미치는 것이다. 전환 후 수식은 발생한 위치가 주요 부분(예를 들면 CDR구역에 발생하여 기능에 영향을 미치는지 여부, FcRn결합 위치점에 발생하여 PK에 영향을 미치는지 등)에 발생했는지 여부에 따라 주요 품질 속성인지 여부를 판단한다. 이와 동시에 전하 분포/전하 순도는 매우 민감한 품질 속성이므로 공정 일치성 평가에 있어 아주 좋은 지표가 될 수 있다. 지금까지 전하 이질체에 대한 규제는 모두 항체 약물 생산의 중점이자 난점이었다. 본 발명의 장점은 제품의 높은 전하 순도(전하에 영향을 미칠 수 있는 기타 전환 후 형식 또는 분해형식을 줄인다.)를 유지하고, 제품이 여러 차례에 걸쳐 대규모로 생산될 경우의 전하 분포 유사성을 동시에 보장한다는데 있다. 또한, 세포 확장 단계에서 발생하는 물질은 암모늄 이온, 단백질 분해효소, 기타 숙주 단백질, DNA 등인데, 이러한 산물은 세포 성장에 영향을 미칠 수 있고, 제품 품질 특성에 영향을 미칠 수 있다. (일부 효소가 제품 분해를 일으키는 등) 동시에 대량의 불순물이 제품 추출액에 대입되어 하위 정화 비율에 큰 영향을 미칠 수 있으며 완전히 제거하지 못할 있어 제품의 생산량과 품질 모두에 영향을 미칠 수 있게 된다.

그 밖에 본 발명의 시스템과 방법은 종래의 유가 배양 시스템에 존재하는 제품 품질과 균일성 문제를 해결할 수 있다. 대규모 항체 생산 영역에서 횟수별 유가배양 모델에 따른 제품의 불순물 규제가 안정적이지 않아 종종 관류 배양으로 변경되어 이로 인해 공정이 매우 복잡해진다. 본 발명은 유가배양 모델이 안정적이지 않고, 제품 관련 불순물 함량이 높은 문제를 해결할 수 있고 공정 전환 없이도 고품질의 생산물을 얻을 수 있어 대규모 항체 생산 영역에 있어 매우 참신하고 진보적인 발명이다.

그러므로 본 발명을 현존하는 기술과 비교하면, 세포배양 과정에서 순서대로 불순물 및 세포 대사 산물의 배출에 적합한 제1 필터링 어셈블리와 제품 수집과 농축에 적합한 제2 필터링 어셈블리를 사용하여 제품의 차단 단계를 보장하고, 상대적으로 고정된 세포의 대차, 밀도, 활력조건에서 비교적 단시간에 구역 내에서 대규모와 고산출로 항체 제품을 생산하여 수확한다. 주요한 기술적 장점으로는 다음을 포함한다.

1) 항체 생산 중 전하 이질의 난제를 포함한 제품의 균일성을 향상시킨다.

2) 세포 확장단계에서 발생하는 대사물, 특히 고분자량 단백효소체 등을 제거한다. 이러한 대사물이 차단 단계에서 제품에 야기하는 영향을 줄이고, 제품의 순도와 품질을 향상시킨다.

3) 세포 확장 전 단계에서 상대적으로 고온인 배양환경에서 발생하는 소량의 항체 산물을 제거한다. 이러한 조기 산물이 상대적으로 높은 온도의 조건에서 쉽게 분해가 발생하므로 제품 관련 불순물이 되어 제품에 들어간다. 그러므로 본 발명은 제품과 관련된 불순물 제거에 용이하여 최종적으로 높은 생산량의 고순도 제품을 생산할 수 있도록 보장한다.

4) 생산 주기를 줄여주고, 다운스트림 생산공정을 간략화하여 기업의 원가 절감에 도움이 된다.

아래에 구체적인 실시예를 결합하여 본 발명을 추가로 진술한다. 이런 실시예는 단지 본 발명을 설명할 뿐 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 아래 실시예에서 구체적인 조건을 명확히 표기하지 않은 실험 방법은 일반 조건 또는 《분자 클론 실험 지침》 제3판의 기본 실험 방법에 따르거나 또는 제조업체에서 제안한 조건을 따른다.

실시예 1. 단계별 차단에 기초한 200L 생물 반응기의 배양

항체

본 실시예의 생산용 항체는 시중에 판매되는 치료성 항체 허셉틴에 대해 개발한 바이오 시밀러의 생산 공정이고, 발현된 세포계는 중국 햄스터 난소세포(CHO), 모노 클론 항체는 IgG1/kappa타입이고, 그것의 아미노산 서열은 신약 허셉틴(Herceptin^®)과 동일하고(INN:trastuzumab, IMGT 번호:7637); 그 분자량은 145kDa이다.

세포 업스트림 제1 생산 단계의 흐름 개략도는 도 1과 같고 세포 업스트림 제2 생산 단계의 흐름 개략은 도 2와 같다.

세포 재생

세포 냉동 보관 튜브를 취출하여 직접 손에 잡고 37℃ 항온 수욕에 침지하고 가끔 흔들어 빨리 용해되게 한다. 37℃ 수욕에서 냉동 보관 튜브를 취출하여 75% 알코올로 표면을 소독 후 슈퍼 클린 벤치에서 냉동 보관 튜브를 오픈하고 무균 피펫으로 세포 현탁액을 흡출하여 1mL의 전보온 CD FortiCHO^TM Medium 기초 배지가 담겨 있는 15mL의 원심 분리관에 넣고 흔들어 균일하게 한다. 30～60초 후에 2mL의 전보온 기초 배지를 추가로 넣고 흔들어 균일하게 하고; 또 30～60초 지나면 4mL의 전보온 기초 배지를 추가로 넣어 흔들어 균일하게 한다. 30～60초 대기하고 원심 분리관을 700rpm으로 5min 원심 분리시키고 상청을 버리고, 2mL의 전보온 기초 배지를 취하여 원심 분리관에 넣어 용해시켜 세포를 침전하고 8mL의 기초 배지가 담겨 있는 세포 배양 병에 다시 이전시키고 흔들어 균일하게 한다.

확충 배양

2일마다 샘플을 취하여 계수하여 한 차례의 확충 배양을 진행하고 배지는 CD OptiCHOβ 배지를 선택하고(생산업체: ThermoFisher), 확충 후 초기 세포 밀도가 6～10x10⁵cells/mL로 다시 돌아가게 한다. 확충 체적이 10L의 반응기 접종 요구에 도달할 때까지 세포 밀도는 2.5～4.5 x10⁶cells/mL이고 생존율≥90%로, 구체적인 제어 파라미터는 표1과 같다.

쉐이킹 속도	온도	이산화탄소농도
120rpm	37^oC	5%

10L WAVE 생물 반응기에 접종하고 매일 샘플링을 수행하며 구체적인 제어 파라미터는 표 2와 같다.

온도	pH	용존 산소	스윙 속도	스윙 각도	통기량
37^oC	7	50%	25rpm	8°	0.2L/분

3일 배양 후 생물 반응기 용적을 50L까지 추가로 확대하고 구체적인 제어 파라미터는 표 3과 같다.

온도	pH	용존 산소	회전 속도	배양 시간
37^oC	7	50%	90rpm	3일

ATF에 200L 생물 반응기를 결합한 관류 배양

본 실시예는 Refine Technology에서 유래되는 200L-교대식 접선 플러우 시스템을 사용한다. 우선, ATF장치 중의 중공 섬유 컬럼과 베이스 상단의 격막을 조립하고, 계속하여 진공 펌프와 제어기에 연결하고 0.2μm 및 50KD인 차단 분자량의 진공 섬유 막을 ATF시스템에 조립하고 25%에틸알코올로 10min세척 후 탈이온수로 반복하여 세척하고 잔류 에틸알코올을 제거하고 나아가 고온 습열 살균 캐비닛에서 45min 살균 후 대기한다.

0.2μm인 필터링 어셈블리를 함유하는 ATF시스템을 200L의 생물 반응기에 접속하고 세포를 50L의 생물 반응기에서 3일 배양 후, 200L의 생물 반응기에 접종하면 초기의 세포 밀도는 1 x 10⁶cells/mL이고, 구체적인 제어 파라미터는 표 4와 같다.

배양 온도	pH	용존 산소	회전 속도
37^oC	7	50%	90 rpm

세포 밀도가 10 x 10⁶cells/mL까지 성장하면 ATF시스템에 연통시켜 ATF장치 중의 제어기와 진공 펌프를 스타트하고 세포 성장 량과 세포 성장 속도에 따라 매일 배지 교환의 체적을 계산하고 신선한 배지 진입 속도와 배양 폐액 배출 속도를 조절한다. 세포 밀도가 40～50x 10⁶cells/mL까지 성장하면 0.2μm인 필터링 어셈블리의 ATF시스템을 50KD 차단 분자량 필터링 어셈블리를 함유하는 ATF시스템으로 교체하고 계속하여 ATF장치 중의 제어기와 진공 펌프를 운행하여 제2 생산 단계로 진입한다. 바람직한 실시예에서 세포 성장 밀도가 40～50x10⁶cells/mL에 도달하기 전에 생물 반응기의 배양 온도를 미리 34℃로, pH값은 6.9로 조절하고 50%의 용존 산소를 유지하고 배양 회전 속도를 125rpm(그 결과는 표 6에 나타남)으로 조절한다. 다른 한 바람직한 실시예에서 생물 반응기의 온도와 배양 조건의 조절은 50KD인 차단 분자량 필터링 어셈블리를 함유하는 ATF시스템 교체와 동시에 진행할 수 있다. 성장하여 세포 성장 밀도가 약 100x10⁶cells/mL일 때, 상청을 수집한다.

세포 침전

세포 배양액 침전은 대부분 원심 분리 또는 마이크로 필터링에 심층 필터링을 결합하여 배양액 중의 세포와 세포 조각의 제거를 완성한다. 본 실시예에서 200L 생물 반응기로부터 세포 현탁액을 얻고 저온 4^oC에서 6000g을 15min 원심 분리 후 세포를 제거하고 세포 발효액을 차단한다. 나아가 현재에 보편적으로 세포 배양액 침전에 운용되는 심층 필터링 방식을 사용하고 그것은 밀도가 낮은 다공의 섬유소 프레임 구조를 사용하고 규조토 성분을 충진하고 샘플 진입단의 표면 홀 직경은 깔때기 모양이고 이런 구조는 전통적인 마이크로 필터링 표면 차단 구조가 쉽게 초래하는 블록킹, 필터링 효율이 낮은 결함을 극복함과 동시에 원심분리기에 없는 작은 체적의 세포 조각을 차단하는 장점을 구비하였고, 또한 규조토의 흡착 작용에 의지하여 DNA와 HCP를 차단할 수 있다. 본 실시예는 MILLIPORE회사의 MX0HC10FS1 심층 필터를 사용하고 원심 분리액을 연동 펌프에 연결 후(연동 펌프 선택에 있어 유속 필요에 부합하면 된다), 초순수로 심층 필터링 막을 세척하고 세척 체적은 10CV이다. 다음 심층 필터링 환충액 25mM Tris-HCl + 100mM NaCl, pH 7.4±0.2로 심층 필터링 막을 세척하고 세척 체적은 1CV이고, 세척 유속은 100-300LMH이다. 세포 배양액을 필터링하고 여과액을 즉시 수집하기 시작하고 필터링 유속은 100-300LMH이다. 샘플 로딩이 완료된 후 심층 필터링 환충액 25mM Tris-HCl+100mM NaCl，pH 7.4±0.2로 필터링 막을 세척하고 여과액을 수집하고, 세척 체적은 2CV이고 과정 중에서 막의 프란트 압력이 2bar를 초과하지 않게 제어한다.

Protein A 친화성 크로마토그래피

Protein A 친화성 크로마토그래피는 항체 정화에서 포획 단계로 숙주 단백, 내독소, DNA에 대해 모두 제거 효과를 갖는다. 본 실시예에서 Protein A친화성 크로마토그래피 충진 재료는 Mabselect Sure(생산업체, GE)이다. 심층 필터링으로 얻은 상청액 샘플을 로딩하고 유속은 300cm/h이고 크로마토그래피 컬럼 적재량은 35mg/mL 충진 재료보다 작도록 보장한다. 샘플 로딩이 완성된 후 용리액 25mM Tris-HCl，50mM NaCl, pH7.4로 전환 후 300cm/h 유속으로 크로마토그래피 컬럼 5CV를 세척한다. 다음 용리 조작을 진행하고 용리액은 100mM 초산-초산 나트륨(PH3.6±0.2, 도전율 0.9±0.2mS/cm)이고 유속은 300cm/h이다. UV280으로 검측을 진행하고 UV280이 읽은 수치가 0.1AU까지 상승되면 용리 피크를 수집하고 재차 0.5AU까지 하강하면 수집을 정지한다. 3개의 순환하는 Protein A 친화성 크로마토그래피를 진행한다.

바이러스 불활성화와 불활성화 후의 심층 필터링

본 실시예의 바이러스 불활성화는 저PH부화 친화성 크로마토그래피 후의 용리 피크를 사용하여 역전사 바이러스와 포막이 있는 바이러스가 활성을 잃게 하는 것이다. 10% 초산으로 친화성 크로마토그래피의 용리액을 pH3.6-3.8로 조절하고 60-120min 불활성화된다.

바이러스 불활성화 후의 샘플은 MILLIPORE회사의 MX0HC10FS1 심층 필터를 사용하여 심층 필터링을 진행하고, 사용 전에 초순수로 10CV를 세척하고, 환충액 50mM의 초산-초산 나트륨, PH5.2로 1CV의 심측 필터링 막을 세척하고 세척 완료 후 파이프에 연결하여 샘플 필터링을 진행하고 유속은 100-300LMH이고, 필터링 압력은 2bar보다 작고, 샘플 로딩 완료 후, 환충액 50mM의 초산-초산 나트륨, PH5.2로 1CV세척하고 심층 필터링 막 2CV를 계속하여 세척하고, 세척 여과액을 회수한다.

양이온 교환 크로마토그래피

제품 중의 불순물 및 DNA, 내독소를 추가로 제거하기 위하여, 본 실시예는 바이러스 불활성화 및 심층 필터링에서 3개 순환의 양이온 교환 크로마토그래피를 진행하였고 양이온 교환 크로마토그래피는 Fractogel EMD COO-(M)(생산업체: Merk)을 선택한다. 평형액(50mM의 초산-초산 나트륨, PH5.2)으로 크로마토그래피 컬럼 3CV를 평형하고 샘플을 로딩하고 유속은 120cm/h이고, 크로마토그래피 컬럼 적재량은 45mg/ml의 충진 재료보다 작도록 보장한다. 샘플 로딩 완료 후 평형액으로 180cm/h 유속으로 크로마토그래피 컬럼 5CV를 세척하는 것으로 전환한다. 다음 용리 조작을 진행하고 용리액은 50mM의 초산-초산 나트륨 및 300mM 염화나트륨, pH 5.2이고 평형액과 용리액 0-100% 경도로 10CV를 용리하고 유속은 180cm/h이고 용리 과정에서 용리 샘플을 수집한다.

음이온 교환 크로마토그래피

음이온 교환 크로마토그래피로 샘플 중의 각종 바이러스, DNA, 내독소와 같은 미량의 불순물을 효과적으로 제거한다. 단클론 항체의 높은 등전점으로 인해, 일반적인 음이온 교환 크로마토그래피는 불순물을 충진재료와 결합하나 목표 단백질은 크로마토그래피 컬럼을 통해 유출되어 충진재료와 결합되지 않는 플러우 스루 모드를 사용한다. 본 실시예의 음이온 교환 크로마토그래피는 Capto Q(생산업체: GE), 예비 평형액(50mM Tris-HCl+ 1M NaCl，PH8.0)을 선택하여 크로마토그래피 컬럼 2CV를 평형한 다음 평형액(50mM Tris-HCl，PH8.0)으로 크로마토그래피 컬럼 3CV를 평형한다. 샘플이 로?壅품?, 유속은 180cm/h이고, 플러우 스루를 수집하되 UV280이 읽은 수치가 0.1AU까지 상승하면 용리 피크를 수집하고, 크로마토그래피 컬럼 적재량은 40mg/ml의 충진 재료보다 작게 보장한다. 샘플 로딩 완료 후 평형액으로 180cm/h 유속으로 크로마토그래피 컬럼 3CV를 세척하도록 전환하고 UV280이 0.1AU까지 하강하면 샘플 수집을 정지한다.

바이러스 필터링

바이러스 필터링은 포막이 없는 바이러스 제거에 사용될 수 있고 생산 과정에서 1.02m²/횟수의 바이러스 필터링 막을 사용하여 필터링을 진행한다. 사용한 것은 압력 탱크이고 0.5M NaOH로 처리하고 주사용 물로 세척 후 압축 공기에 연결하여 필터링을 진행한다. 본 실시예에서 VPMG201NB1(생산 업체: Merck Millipore)을 사용하여 심층 필터링을 진행하고 사용 전에 초순수로 10CV를 세척하고 환충액 50mM의 초산-초산 나트륨, PH5.2로 2CV의 심층 필터링 막을 세척하고 세척 완료 후 파이프에 연결하여 샘플 필터링을 진행하고 유속은 100-300LMH이고 필터링 압력은 1.9-2.0bar이고, 샘플 로딩 완료 후 환충액 50mM의 초산-초산 나트륨, PH5.2로 1CV를 세척하고 계속하여 심층 필터링 막 2CV를 세척하고 세척 여과액을 회수한다.

초 필터링 액체 교환

모델 번호가 P2C030C25(생산업체: MerckMillipore)이고, 홀 직경이 30KD인 초 필터링 막 패키지를 세척하고 20Mm의 인산 나트륨 PH6.0인 환충액으로 막 후단 PH6.0이 되게 세척한다. 연동 펌프를 초여과막에 펌핑하고 진입 단 유속을 200LMH로 막 관통 압력을 0.35bar로 제어하고 20mM의 PH6.0인 인산나트륨 환충액으로 액체 교환을 진행하여 항체 산물을 얻는다.

대조예 1, 단일 차단법에 기초한 200L 생물 반응기 배양

기본적인 실시방식은 실시예 1과 동일하고 구별점은, 세포 밀도가 10x10⁶cells/ml까지 성장하면 ATF시스템에 연통하고 ATF장치 중의 제어기와 진공 펌프를 스타트한다. 사용한 ATF시스템은 50KD 차단 분자량의 진공 섬유 막 어셈블리를 포함하고 세포 성장 밀도가 약 100 x 10⁶cells/ml까지 배양되면 발효 단계를 완성한다. 후속 정화 단계는 실시예 1과 동일하다.

Protein A 친화성 크로마토그래피를 완성 후, 실시예 1 및 대조예 1에서 얻은 샘플에 대해 각각 양이온 고효율 액상 크로마토그래피를 진행하여 전하 이성체의 함량을 확인하고 그중 핵산 피크의 분포 결과는 표 5와 같다.

CEX-HPLC
횟수	산성 피크	중성 피크	염기성 피크
단계별 차단법(실시예1)	24.9	67.8	7.3
단일 차단법(대조예 1)	30.7	61.8	7.5

표 5에서 분명하게 볼 수 있듯이, 단계별 차단법으로 얻은 항체 산물은 단일 차단법의 항체 산물에 비해 더 우수한 전하 순도를 구비하고 중성 피크의 함량이 더 높고 산성 피크의 함량이 더 낮다.

제품 정화를 완성 후, 이 두 가지 업스트림 생산 공정의 최종 제품에 대해 비교를 진행하면 단일 차단법으로 생산한 최종 산물의 산성 피크의 비율이 일정한 개선이 있으나 개선 정도가 좋지 않고 생물학 활성에 있어 단계별 차단법은 단일 차단법의 생물학적 활성보다 현저하게 우수하고, 동시에 단계별 차단법으로 얻은 합격된 최종 산물의 생산량이 높다는 것도 발견할 수 있다. 그러나 표 6과 같이 단일 차단법으로 얻은 합격된 최종 제품의 수율은 현저하게 낮다.

업스트림 생산 방법		단일 차단법 (대조예1)	단계별 차단법 (실시예 1)
세포 배양 단계		12g/L	12g/L
최종 제품 수율		6g/L	9.2g/L
성상/색		옅은 황색 액체 (색 Y5)	옅은 황색 액체 (색 Y5)
pH		6.0	5.9
삼투압		63	63
SEC-HPLC	티아졸 폴리머	0.8	0.6
	메인 피크	99.2	99.4
	프래그먼트	0	0
환원CE-SDS순도(라이트 체인+헤비 체인)		99.3	99.1
비환원CE-SDS순도(단량체)		97.1	97.3
CEX-HPLC	산성 피크		29.3	22.7
	메인 피크		63.2	67.8
	염기성 피크		7.5	9.5
생물학적 활성		94%	103%

실시예 2, 단계별 차단에 기초한 2L 생물 반응기 배양

항체

본 실시예에서 생산에 사용되는 항체는 재조합 항혈관 내피성장인자(VEGF) 인간화 단일 클론 항체이고, 체외 포유 동물 세포에서 발효가 표현되어 얻어진 것이고 동물 세포는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)이고, 단일 클론 항체는 IgG1/kappa 유형이고 그것의 아미노산 서열은 신약 아바스틴(Avastin^®)과 동일하고(INN: bevacizumab，IMGT번호：8017，http://www.imgt.org/mAb-DB/), 그 분자량은 149kDa이다.

세포 재생과 2L 생물 반응기 ATF 관류 배양

세포 재생의 단계는 실시예 1과 동일하다.

일반적인 세포 배양 공정을 사용하여 종자 세포 배양을 진행한다. 세포 밀도 4.0～6.5 x 10⁶ cells/mL, 운동성≥90%에 도달 시 접종 요구를 만족하고, 종자 세포를 CD FortiCHO™ Medium기초 배지를 함유하는 2L생물 반응기에 무균 접종시켜 배양한다. 접종 후 세포 밀도는 1.0 x 10⁶cells/mL이고，운동성≥90%이다. 초기 세포 배양 조건은 배양 온도가 37℃이고 교반 속도는 95rpm이고, PH는 7.20±0.05이고 용존 산소는 50%이다.

정제 기술(Refine Technology)에서 유래되는 ATF시스템을 사용하고, 우선 ATF장치 중의 중공 섬유 컬럼과 베이스 상단의 격막을 조립하고, 계속하여 진공 펌프와 제어기를 연결한다. 먼저 홀 직경이 0.2μm인 중공 섬유 상단과 반응기가 연결되는 파이프를 설치하고 세포가 생물 반응기에서 세포 밀도 4.5～5.5 x 10⁶ cells/mL 로 배양되면 ATF장치의 제어기와 진공 펌프를 스타트하고, 세포 성장량과 세포 성장 속도에 따라, 매일 배지 교환의 체적을 계산하여 신선한 배지 진입 속도와 배양 폐액 배출 속도를 조절한다.매일 관류(灌流) 체적이 예기 설정에 도달한 경우, 만약 포도당이 부족하면 30% 포도당 용액을 적당히 별도로 보충한다. 세포 밀도가 65±5×10⁶cells/mL에 도달한 경우, 배양 온도는 32℃로, PH는 7.00±0.05로 낮춘다. 세포 밀도가 95±5×10⁶cells/mL로 추가로 증가된 경우, 처리된 무균의 50 KD 진공 섬유막으로 오리지널 0.2μm의 중공 섬유막으로 교체하고 제2 생산 단계로 진입하고 세포 밀도는 10×≠10⁶cells/mL 범위 내로 유지하고 세포 활력이 90%로 하강하기 시작하면 생물 반응기의 배양을 중지하고 세포 배양액을 수집한다.

일 실시예에서 세포 배양액을 수집하는 시기는 세포 활력이 80%까지 하강될 시로 제어하고, 다른 한 실시예에서 세포 배양액을 수집하는 시기는 세포 활력이 70%까지 하강될 시로 제어하고, 다른 한 실시예에서 세포 배양액을 수집하는 시기는 세포 활력이 50%까지 하강될 시로 제어한다.

세포 침전

본 실시예는 심층 필터링 막(DOHC(제품번호 MD0HC10FS1, 제조업자: Merk)을 연동 펌프에 연결하고(연동 펌프의 선택은 유속 필요에 부합되면 된다), 초순수로 심층 필터링 막을 세척하고 세척 체적은 10CV이다. 다음 심층 필터링 환충액 25mM Tris-HCl+100mM NaCl, pH 7.4±0.2로 심층 필터링 막을 세척하고 세척 체적은 1CV이고, 세척 유속은 100-300LMH이다. 세포 배양액을 필터링하고 여과액을 즉시 수집하기 시작하고 필터링 유속은 100-300LMH이다. 샘플 로딩이 완료된 후 심층 필터링 환충액 25mM Tris-HCl + 100mM NaCl，pH 7.4±0.2로 필터링 막을 세척하고 여과액을 수집하고, 세척 체적은 2CV이고 과정 중에서 막의 프란트 압력이 2bar를 초과하지 않게 제어한다.

Protein A 친화성 크로마토그래피

Protein A친화성 크로마토그래피 충진 재료는 JWT 203 (생산업체:JSR)이다. 심층 필터링으로 얻은 상청액 샘플을 로딩하고 유속은 300cm/h이고 크로마토그래피 컬럼 적재량은 35mg/mL의 충진 재료보다 작도록 보장한다. 샘플 로딩이 완성된 후 용리액 25mM Tris-HCl，50mM NaCl, pH7.4로 전환 후 300cm/h 유속으로 크로마토그래피 컬럼 5CV를 세척한다. 다음 용리 조작을 진행하고 용리액은 100mM 초산-초산 나트륨(PH3.6±0.2, 도전율 0.9±0.2 mS/cm)이고 유속은 300cm/h이다. UV280으로 검측을 진행하고 UV280이 읽은 수치가 0.5AU까지 상승되면 용리 피크를 수집하고 재차 0.5AU까지 하강하면 수집을 정지한다. 샘플은 실온에서 pH값을 3.5-3.7로 조절하고 저pH바이러스 불활성화 공정을 1-2시간 진행한다.

음이온 교환 크로마토그래피

낮은 순도의 샘플은 정밀 정화 크로마토그래피를 거쳐 원액이 된다. 음이온 교환 크로마토그래피는 Capto Q 충진 재료를 선택한다(생산업체: GE healthcare). 예비 평형액(50mM Tris-HCl+ 1M NaCl，PH8.0)으로 크로마토그래피 컬럼 2CV를 평형하고, 다음 평형액(50mM Tris-HCl，PH8.0)으로 크로마토그래피 컬럼 3CV를 평형하고 샘플을 로?完構?, 유속은 240cm/h이다. 플러우 스루를 수집하되 UV280이 읽은 수치가 0.1AU까지 상승하면 용리 피크를 수집한다. 크로마토그래피 컬럼 적재량은 40mg/ml의 충진 재료보다 작게 보장한다. 샘플 로딩 완료 후 평형액 240cm/h 유속으로 전환 후 크로마토그래피 컬럼 3CV를 세척하고 UV280이 0.1AU까지 하강하면 수집을 정지한다.

양이온 교환 크로마토그래피

샘플을 수집하여 다음 단계 양이온 교환 크로마토그래피로 진입하고, 양이온 교환 크로마토그래피는 Fractogel EMD COO-(M)(생산업체: Merk)을 선택한다. 평형액(50mM의 초산-초산 나트륨, PH5.2)으로 크로마토그래피 컬럼 3CV를 평형하고 GB222 샘플을 로딩하고 유속은 180cm/h이고, 크로마토그래피 컬럼 적재량은 45mg/ml의 충진 재료보다 작도록 보장한다. 샘플 로딩 완료 후 평형액으로 180cm/h 유속으로 전환하여 크로마토그래피 컬럼 5CV를 세척한다. 다음 용리 조작을 진행하고 용리액은 50mM의 초산-초산 나트륨 및 300mM의 염화나트륨, pH 5.2이고 평형액과 용리액의 0-100% 경도로 10CV를 용리하고 유속은 180cm/h이고 용리 과정에서 용리 샘플을 수집한다.

초 필터링 액체 교환

순도를 높게 한 후의 샘플은 초 필터링 액체 교환을 거치는 단계는, 모델 번호가 P3C030C05이고, 홀 직경이 30KD(생산업체: MerckMillipore)인 초 필터링 막 패키지를 세척하고 20Mm의 PH6.0인 인산 나트륨 환충액으로 막 후단의 PH6.0이 되게 세척한다. 연동 펌프로 양이온 크로마토그래피 샘플을 초 필터링 막에 펌핑하여 초 필터링 농축을 진행하고, 진입단 유속을 300LMH로 제어하고 막 관통 압력은 0.3~0.7bar이고 처음은 약 20mg/ml로 농축하고 다음 20mM의 PH6.0인 인산나트륨 환충액으로 10배 등체적 액체 교환을 진행하고, 완료 후 초 필터링 막을 배출하고 단백질, 즉 원액을 회수한다.

대조예 2, 단일 차단법에 기초한 2L-ATF시스템의 항체의 생산

동일하게 Refine Technology에서 유래되는 ATF시스템을 사용하고, 우선 ATF장치 중의 중공 섬유 컬럼과 베이스 상단의 격막을 조립하고, 계속하여 진공 펌프와 제어기를 연결한다. 홀 직경이 50KD인 중공 섬유 상단과 반응기가 연결되는 파이프를 25%의 에틸알코올에 배치하고 실시예 1의 방법에 따라 멸균 소독을 진행한다.

세포 배양 기본 조건은 실시예 2와 같고, 주요 구별점은, 세포 밀도가 4.5～7.5 x 10⁶ cells/ml로 성장한 경우, ATP시스템을 연통하고 ATF장치의 제어기와 진공 펌프를 스타트한다. 사용한 ATF시스템은 50KD 차단 분자량을 함유하는 진공 섬유 막 세트 어셈블리이고 세포 활성이 90%로 하강될 때까지 배양하고 반응을 중지한다. 후속 정화 단계는 실시예 2와 동일하다.

단일 차단법으로 세포 배양 제10일째 세포 배양액을 취하여 초기 분석을 진행하고 그것의 산성 피크 함량은 약 26%dl나, 단계별 차단법으로 배양 제10일째 산성 피크는 단지 약 10%이다. 후속 정화 단계를 완성 시, 단계별 차단법 생산 공정으로 얻은 최종 산물의 산성 피크 함량도 단일 차단법보다 낮다. 초 필터링 액체 교환을 거친 후 SEC-HPLC에 대한 요구는 항체 단량체의 순도> 95%이나, 3개 단일 차단법으로 생산 횟수에서 검측된 항체 단량체의 수치는 단지 93%, 92.8%와 93%이고 실시예2에서 사용한 단계별 차단법의 수율보다 훨씬 낮다. 따라서 수율이 우월한 것을 제외하고 단계별 차단 공정에서 생산해낸 샘플은 전하 순도 및 분자 크기 순도에서 모두 단일 차단법의 산물보다 우수하다. 샘플에 대한 파라미터에 대한 추가 분석 비교 결과는 이하 표 7과 같다.

업스트림 공정		단일 차단법	단계별 차단법
성상/색		라이트 브라운 액체 (색 B6)	라이트 브라운 액체 (색 B6)
pH		6.1	6.2
삼투압		280	272
SEC-HPLC	티아졸 폴리머	6.2	3.5
	메인 피크	93.7	96.5
	프래그먼트	0	0
환원CE-SDS순도		97.3	98.2
비환원CE-SDS순도		96.7	97.8
CEX-HPLC	산성 피크	31.7	21.9
	메인 피크	57.2	68.8
	염기성 피크	11.2	9.3
생물학적 활성		99%	104%

실시예 3 상이한 세포 성장 밀도에서 단계별 차단의 업스트림 생산을 수행

추가 연구 결과, 단계별 차단 공정dl 적용 가능한 세포 밀도는 15±5×10⁶세포수/ml까지 낮아질 수 있고, 예를 들면 저밀도 세포 배양 조건에서 세포 밀도가 15±5×10⁶세포수/ml에 달한 경우, 제2 생산 단계에 진입할 수 있고, 세포 밀도가 35±5×10⁶세포수/ml에 달한 경우 효과가 더욱 바람직하다. 상기 세포 밀도에서, 제2 생산 단계로 진입하고 최종 제품의 생산량 및 제품 전하 순도에서 여전히 전통적인 단일 차단 공정에 비해 현저하게 우수함을 나타낸다. 실시예 2의 항체를 예로 들면, 표 8은, 세포 밀도 15±5×10⁶세포수/ml이고, 그 파동 범위가 10×10⁶세포수/ml~20×10⁶세포수/ml인 경우, 또는 세포 밀도 35± 5×10⁶세포수/ml이고, 그 파동 범위가 30×10⁶세포수/ml~40×10⁶세포수/ml인 경우의 세포 밀도별 단일 차단법 및 단계별 차단법의 대비이다.

세포 밀도	15±5×10⁶ 세포수/ml		35±5×10⁶ 세포수/ml
생산 조건	단일 차단법	단계별 차단법	단일 차단법	단계별 차단법
SEC-HPLC 메인 피크	91%	95%	93%	96%
CEX-HPLC산성 피크	31%	20%	26%	17%

실시예 4 상이한 분자량의 산물의 적용성

본 발명의 단계별 차단의 생산 공정은 상이한 분자량의 단백질 제품의 생산에 적용된다. 재조합 유전자 공정 항체를 예로 들면, 항체 Fab구, 평균 분자량은 약 50KD이다. 2중/다특이성 항체, 그것의 분자량은 300KD에 도달할 수 있고 모두 단계별 차단 공정에 잘 적용될 수 있다. 특히 2중/다특이성 항체는 구조가 복잡하고 흔히 특별 설계된 돌연변이가 수반되고 제품 관련 불순물이 나타날 가능성이 아주 높다. 그러므로 단계별 차단법의 업스트림 생산 공정을 이용하여 제1 생산 단계에서, 관련 불순물을 비교적 큰 필터링 홀을 통해 제거하고 후기의 정화와 개발에 더욱 유리하다. 단백질 산물의 분자량의 차이가 비교적 크므로 본 발명에서 본 발명인은 2개의 생산 단계에서 사용한 필터링 어셈블리의 필터링 홀의 범위를 탐색하였고 제1 생산 단계에서 0.05μm-1μm인 범위 내의 필터링 어셈블리는 소분자 대사 산물 및 거대분자 제품 관련 불순물을 제거하는 것을 만족할 수 있다. 일 바람직한 실시예에서, 0.1μm-0.5μm의 필터링 어셈블리를 사용하여 제거 효율 및 제품 수율을 효과적으로 향상할 수 있다. 제2 생산 단계에서, 본 발명자는 산물의 분자량 크기를 참조로 하고, 차단 홀 직경을 산물 분자량에 비해 1/15~1/3 범위 내로 설정 시, 비교적 좋은 산물 농축의 효과를 실현할 수 있고, 차단 홀 직경을 산물 분자량에 비해 2/15~7/15 범위 내로 설정 시, 수율이 더 높고 차단 홀 직경을 산물 분자량에 비해 1/5~1/3 범위 내로 설정 시, 농축 항체의 수율이 가장 높다.

본 실시예에서 발명자는 단일 차단법과 단계별 차단법의 방법으로 실시예 1의 허셉틴 항체 서열의 Fab영역(~50KD) 단백질 프래그먼트에 대해 각각 표현과 정화를 진행하고, 단계별 차단법에서 정제 기술(Refine Techology)의 ATF-2L시스템으로, 먼저 홀 직경이 0.1μm인 중공 섬유 컬럼을 설치하여 제1 단계의 배양을 실현하고, 세포 밀도가 10~15×10⁶에 달하면 처리된 무균 10KD인 진공 섬유막으로 오리지널 0.1μm의 중공 섬유막을 대체하고 제2 생산 단계로 진입한다. 단일 차단법은 처음부터 ATF시스템에 10KD의 진공 섬유막을 설치하였다. 두 가지 배양 방식이 모두 사용한, 동일한 배양 조건에서, 단일 차단법에 비해, 단계별 차단법은 허셉틴 항체 서열의 Fab영역 생산량을 4%, 순도는 2% 향상하는 것을 효과적으로 실현할 수 있다. 본 발명자는 기타 분자량이 50KD인 단백질 프래그먼트에 대해 비교를 시도한 결과, 단계별 차단법은 전통적인 단일 차단법에 비해 50KD인 단백질 프래그먼트 제조에서 효과적으로 산량을 평균 2-4%, 순도는 평균 1-2% 향상할 수 있음을 발견하였다.

본 실시예에서 발명자는 단일 차단법과 단계별 차단법 방법을 사용하여 2중 특이성 항체의 표현과 정화를 진행하였다. 즉 실시예 1에서 허셉틴 항체 서열의 Fab영역(~50KD)의 C단은 실시예 2 신약 아바스틴 항체 가변 영역의 N단에 연결되어 대칭 구조인 분자량이 약 250KD인 2중 특이성 항체를 형성하였다. 단계별 차단법에서 여전히 정제 기술(Refine Techology)의 ATF-2L시스템을 사용하고 우선 홀 직경이 0.5μm인 중공 섬유 컬럼을 설치하여 제1 단계의 배양을 실현하였고, 세포 밀도가 30~40×10⁶에 달하면 처리된 무균 50KD의 진공 섬유막으로 오리지널 0.5μm인 중공 섬유막으로 대체하고 제2 생산 단계에 진입한다. 단일 차단법은 처음부터 ATF시스템에서 50KD의 진공 섬유막을 설치하였다. 두 가지 배양 방식이 모두 사용한, 동일한 배양 조건에서, 단일 차단법에 비해, 쌍 저항 분자의 복잡성으로 인해 제1 생산 단계에서 세포 배양 초기에 대사 산물, 중합체, 및 초기 품질이 좋지 않은 항체 분자를 제거한다. 따라서 단계별 차단법은 2중 특이성 항체 서열의 산량을 10%, 순도는 5% 향상하는 것을 효과적으로 실현하였다. 본 발명자는 기타 분자량이 250KD인 단백질 프래그먼트의 비교를 진행 결과, 단계별 차단법은 전통적인 단일 차단법에 비해 2중 특이성 또는 트리 특이성 항체의 제조에서 산량은 평균 5-10%, 순도는 3-5% 효과적으로 향상하는 것을 발견하였다.

이상은 본 발명의 바람직한 생산 형태에 따라 실시예를 통해 본 발명에 대해 한정적이지 않게 서술하였으나 본 발명의 상기 단계별 차단의 업스트림 생산 공정은 다양한 형태의 생물 반응기의 배양에 결합할 수 있거나 또는 종래의 각종 차단 체계, 예를 들면 접선흐름필터 시스템(TFF，tangential flow filtration), 회전 필터 시스템, 심층 필터 시스템, 원심분리기 시스템 또는 침전 시스템 등에 응용할 수 있다. 청구범위 내에서 임의의 변화 및 변형은 모두 본 발명의 보호 범위 내에 있다.

Claims

생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법에 있어서,
생물 반응기를 차단 시스템에 결합한 생산 방식을 사용하는 것을 포함하고,
상기 방법은,
제1 필터링 모듈을 포함하는 차단 시스템을 사용하는 제1 생산 단계,
제2 필터링 모듈을 포함하는 차단 시스템을 사용하는 제2 생산 단계를 포함하고,
상기 제1 필터링 모듈은 필터링 홀이 0.05μm～1μm인 필터링 어셈블리를 포함하고, 상기 제2 필터링 모듈은 필터링 홀의 차단 분자량이 산물 분자량에 비해 1/15~2/3인 필터링 어셈블리를 포함하는, 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 제1 필터링 모듈이 포함하는 필터링 홀은 0.1μm～0.5μm이고;
상기 제2 필터링 모듈이 포함하는 필터링 홀의 차단 분자량은 산물 분자량에 비해 2/15~7/15인, 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법.
제2항에 있어서,
상기 제1 필터링 모듈은 필터링 홀이 0.2μm～0.3μm인 필터링 어셈블리를 포함하고, 상기 제2 필터링 모듈은 필터링 홀의 차단 분자량이 산물 분자량의 1/5~1/3인 필터링 어셈블리를 포함하는, 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법.
제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서,
상기 산물의 분자량은 50~300KD인, 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법.
제4항에 있어서,
상기 산물의 분자량이 100~250KD 또는 150~200KD인, 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 제2 생산 단계의 세포 배양 밀도는 15±5×10⁶세포수/ml보다 작지 않은, 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법.
제6항에 있어서,
상기 제2 생산 단계의 세포 배양 밀도는 35±5×10⁶세포수/ml보다 작지 않은, 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법.
제6항에 있어서,
상기 제2 생산 단계의 세포 배양 밀도의 파동 범위는 10×10⁶세포수/ml보다 크지 않거나 또는 상기 제2 생산 단계의 세포 배양 밀도는 점진적인 증가 추세를 나타내고 세포 배양 밀도의 파동 범위는 10×10⁶세포수/ml보다 큰, 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 차단 시스템은 교체식 접선 플러우 시스템, 접선 플러우 필터링 시스템, 회전 필터링 시스템, 심층 필터링 시스템, 원심분리기 시스템 또는 침전 시스템을 포함하고;
상기 생물 반응기는 에어리프트 생물 반응기, 기계 교반식 생물 반응기, 기포탑 생물 반응기, 막 생물 반응기를 포함하고;
상기 배양 세포는 포유 동물 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 미생물 세포를 포함하는, 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법.
제1항에 있어서,
생물 대분자 업스트림 생산의 생산 공정은 관류 배양, 농축 관류 배양, 유가 배양(fed-batch culture) 및 농축 유가 배양을 포함하는, 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 생물 대분자는 폴리펩티드 또는 재조합 단백질을 포함하는, 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법.
제11항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 유전자 공정 항체, 생물학적 활성을 갖는 기능 단백질 또는 Fc 세그먼트가 융합하여 형성된 신형 단백질을 포함하는, 생물 대분자 업스트림 단계별 차단의 생산 방법.
제1항의 방법에서 사용한 생산 모듈에 있어서,
차단 시스템에 설치되어 생물 반응기에 결합되어 사용 가능하고,
상기 생산 모듈은 제1 필터링 모듈과 제2 필터링 모듈을 포함하고,
상기 제1 필터링 모듈은 필터링 홀이 0.05μm～1μm의 범위 내에 있는 차단 어셈블리를 포함하고,
상기 제2 필터링 모듈은 필터링 홀의 차단 분자량이 산물 분자량에 비해 1/15~2/3 범위 내의 필터링 어셈블리를 포함하고,
상기 제1 필터링 모듈과 제2 필터링 모듈은 각각 2개 차단 시스템에 배치되거나 또는 교체하는 방법을 통해 동일한 차단 시스템에 응용되는, 생산 모듈.
제13항에 있어서,
상기 제1 필터링 모듈은 필터링 홀이 0.2μm～0.3μm인 필터링 어셈블리를 포함하고,
상기 제2 필터링 모듈은 필터링 홀의 차단 분자량이 산물 분자량에 비해 1/5~1/3인 필터링 어셈블리를 포함하는, 생산 모듈.
제14항에 있어서,
상기 제1 필터링 모듈은 필터링 홀이 0.2μm～0.3μm인 필터링 어셈블리를 포함하고,
상기 제2 필터링 모듈은 필터링 홀의 차단 분자량이 산물 분자량에 비해 1/5~1/3인 필터링 어셈블리를 포함하는, 생산 모듈.
제1항 내지 제12항의 어느 한 방법 또는 제13항 내지 제15항의 어느 한 생산 모듈의 응용에 있어서,
상기 방법 또는 모듈은 생물 대분자 업스트림 생산의 과정에 응용될 수 있고, 그중 상기 생물 대분자는 단백질 산물인, 방법 또는 생산 모듈의 응용.
제16항에 있어서,
상기 생물 대분자는 폴리펩티드 또는 재조합 단백질을 포함하는, 방법 또는 생산 모듈의 응용.
제17항에 있어서,
상기 재조합 단백질은 유전자 공정 항체, 생물학적 활성을 갖는 기능 단백질 또는 Fc 세그먼트가 융합하여 형성된 신형 단백질을 포함하는, 방법 또는 생산 모듈의 응용.