CN101260145B - 一种重组人血清白蛋白及其融合蛋白的分离纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分离纯化目标蛋白重组人血清白蛋白及其融合蛋白的具通用性、高效性工艺流程。该方法包括将用无机盐培养基获得的含目标蛋白的基因工程酵母菌发酵上清液和使用无血清培养基获得的重组脊椎动物细胞培养液直接用一种耐高盐、高载量离子交换型亲和柱层析介质Capto MMC填料来分离纯化。这一纯化程序步骤简单、具独特性、低成本和易于产业化等特点。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质分离纯化技术领域，特别是重组的人血清白蛋白及人血清白蛋白融合蛋白的纯化。本发明使用了特定的柱层析步骤，尤其是Capto-MMC填料应用于处于各种盐浓度(特别是高盐浓度)下的重组蛋白质纯化，并适用于试验室、中试规模及工业化大规模生产中的与人血清白蛋白相关重组蛋白质的有效分离和纯化工作。特别是经酵母菌或传代脊椎动物细胞分泌表达的重组人血清白蛋白和人血清白蛋白融合蛋白的规模化生产应用。本发明的纯化步骤简单、并具有独特性、普遍性和意想不到的效果。
背景技术
人血清白蛋白(HSA)是人血液中最丰富的蛋白质，构成血液中蛋白总量的一半，其作用为维持渗透压，结合并运输营养物和代谢物，HSA作为一种基本载体，携带传递蛋白质、脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要组成部分。血清白蛋白是一个球状非糖基化，分子量为66kd的血清蛋白质。人血清白蛋白基因位于4号染色体上有16961碱基对，分为15个间隔区。经RNA加工拼接后形成的mRNA可以编码的一个具有585个氨基酸的蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)在通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，分泌到细胞外。人血清白蛋白有很大的应用及临床应用价值。例如：作为药物可用于治疗因血清白蛋白丢失、合成障碍和创伤失血造成的白蛋白含量下降引起的低蛋白血症；可以作为细胞培养基的添加成分、可以作为药物的辅剂、赋型剂等等。现在人类获得人血白蛋白的方法是从人血液中分离纯化获得的。然而这一方法存在巨大的问题，例如：血源的短缺，不经济，以及受乙肝病毒、AIDS病毒、疯牛病等病原微生物的污染。为避免这些问题，基于重组DNA技术方法生产重组人血清白蛋白(rHSA)的多种方法获得研发。利用微生物体重组表达人血清白蛋白的大规模生产工艺和技术已在本发明人的中国授权专利ZL200410057313.7，以及专利申请EP330451和EP361991中公开。表明白蛋白的重组技术和纯化方法可行。但如何有效地从这些宿主生产细胞获得的发酵液、细胞培养液中提取rHSA仍是至关紧要的且随时有待提高的关键步骤。因为发酵液尤其是来自酵母菌的发酵液含高盐、高菌密度、高粘稠度、高色素含量、目标蛋白的蛋白降解物(这些降解物的蛋白序列与目标蛋白的序列相同而具有相似的特性，在分离纯化时更难于分开)等不利因素。
EP0612761公开了一种生产高纯度重组人血清白蛋白的方法，其中产品中不含自由的非抗原性杂质。这一方法在特定环境下运用了疏水层析色谱(HIC)及其它步骤如：离子交换色谱，硼酸或硼酸盐处理，超滤及加热处理。然而，这一方法因步骤多而变得太复杂，从而难于满足大规模工业生产的经济要求。
EP0570916也公开了用基因操作技术生产rHSA的方法，该方法包括超滤发酵液上清、加热处理、酸处理和再次超滤，随后使用阳离子交换、疏水层析和阴离子交换以及盐析等一系列步骤。然而，与上述专利存在相似的问题，纯化过程太复杂，因周期长成本高而不能成为大规模生产的有效办法。
EP0699687公开的rHSA纯化方法为：加热细胞培养液以灭活蛋白酶，再经阳离子交换微粒的流化床(Streamline)处理，洗脱液再经超滤、HIC和阴离子交换层析而得到纯rHSA。然而，流化床对设备的要求与常规装填的层析设备不同。特别是完全不适合用于毕氏酵母菌表达生产系统。因为在毕氏酵母菌发酵液中，菌体占40％以上，含糖量高、粘稠度大的发酵工艺。因而，需要有更经济有效的方法从发酵液中直接分离rHSA和它的融合蛋白。
于在林等为此在中国发明专利ZL021428816、ZL2004100428148和CN2007100575719中，公开了一种利用Blue-Gel(蓝色亲和柱层析)介质填料用于分离纯化人血清白蛋白及与其形成的融合蛋白的具有通用性的纯化方法。但蓝色凝胶与白蛋白有较强的结合度极高、不易回收目的蛋白、条件剧烈、得率低、不能使用高盐上柱，需要大体积稀释样品等不足。
中国专利申请CN031235026给出了一个十分有效的从毕氏酵母菌发酵液中获得重组人血清白蛋白的纯化方法。但其采用的、十分重要关键的一种可耐高盐的弱阳离子介质是专有的，不能从商业途经购买和试用。同时该公开的申请中也没有提及这种介质是否可用于人血清白蛋白融合蛋白的纯化工作。从分子的结构上看，本发明中发现和采用的这种层析介质填料与中国专利申请CN031235026所公开的介质填料具有明显不同的配基分子结构。
人血清白蛋白具有极大的优势使之可抵御生物体内酶的作用，将其与治疗性蛋白质融合，可使治疗性蛋白质具有长效性而有更好的临床效果。利用基因工程技术将人血清白蛋白与人的治疗性蛋白质基因融合在酵母中表达为融合蛋白，增加了人治疗性蛋白质在血清中和储存时的稳定性。在本发明人已获得授权的中国发明专利ZL021428816、ZL2004100428148、ZL2004100573137、美国授权发明专利US7,244,833B2和在已提交的中国发明专利申请(200710059770.3和200710057571.9)，美国发明专利申请(公开号US20060051859A1)中分别公开了人血清白蛋白和不同的治疗性蛋白质基因相融合所获得的人血清白蛋白与各种血细胞增生刺激因子(CPSF)、各种人干扰素及各种皮肤细胞生长因子，利用基因工程方法重组形成几十种人血清白蛋白融合蛋白的技术，且获得的融合蛋白可在体内具有缓慢释放，与治疗性蛋白质单体相比，在体内给药后在血液中至少有3-10倍长的半衰期。如果获得一种具有简便高效的、具公用性、广谱性和具特异性的能直接从发酵液、培养液中获得人血清白蛋白及它的融合蛋白的方法就可将几十种具有临床治疗意义的蛋白药物纯化技术简易化、通用化和高性能，这具有真正的实用性和明显的必要性。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种适合大规模操作的从发酵液或组织细胞重组表达的人血清白蛋白及与其形成的融合蛋白的分离方法，这可通过以下步骤达到：
(1)利用无机盐培养基获得的含高盐、高密度酵母菌发酵液经板框机过滤获得含目标蛋白的上清液加入适量活性炭；或利用无血清培养基获得的含目标蛋白的脊椎动物细胞培养液，经连续流离心机，去除活性炭或细胞和细胞碎片从而获得含目标蛋白的上清液；
(2)从步骤(1)中获得的含目标蛋白上清液，直接上经平衡液-A平衡的含Capto-MMC(GE Healthcare公司)介质的层析柱，上样后用平衡液再平衡。使用缓冲液-B将杂蛋白洗脱，缓冲液-C将目标蛋白洗脱，获得纯度达80％以上的目标蛋白；
(3)由步骤(2)获得的目标蛋白可进一步经疏水层析填料(HIC)，优选地是丁基或苯基作为配基的疏水性介质的使用，可获得纯度达90％-95％的目标蛋白；
(4)由步骤(2)获得的目标蛋白可进一步经离子交换层析填料，优选地是Q或DEAE Sepharose Fast Flow离子交换介质的进一步使用可保证获得纯度达95％以上的目标蛋白，而可作为蛋白药物原料。
本发明所指的含目标蛋白的上清液可以是各种类型不含菌体的发酵液或培养液。菌体的去除可采用常规的板框过滤或/和离心的方法。本发明所指的目标蛋白是指人血清白蛋白及与其形成的融合蛋白。因而，本发明方法适用于任何宿主系统所生产的rHSA和它的融合蛋白。例如微生物细胞系统如各种细菌、酵母菌系统如啤酒酵母(Saccharomyces)、汉森酵母(Hanson)、毕氏酵母(Pichia)等；或动物细胞系统，如CHO细胞等。
本发明步骤(2)的高盐耐受型弱阳离子交换介质的使用，可允许含盐量高的发酵上清液不经稀释直接上样，蛋白结合率高等优点因可有效减少上样总体积、捕获更高的蛋白量从而比前述方法相比成本低、速度快、高效，尤其适合于使用无机盐作为培养基的吨级发酵液的快速处理。而且，这一单一填料可适用于多种不同的分泌型重组蛋白质的快速捕获。
Capto-MMC(GE Healthcare BioSciences AB出品)被发现和实践表明其是可以满足从发酵液、培养液中高效分离纯化人血清白蛋白和其融合蛋白层析材质的目的。Capto-MMC可以在高达30mS/cm电导下吸附目标蛋白的弱阳离子交换填料。多重作用的弱阳离子交换凝胶：离子作用，疏水作用，氢键。可直接上粗样，样品无需再经过脱盐或稀释降低电导，简化流程，节省成本。一般填料载重会随样品电导增加而下降，但Capto-MMC明显稳定很多，载量不受样品不断增加的电导影响。Capto-MMC对不同蛋白质的载量也不受样品不断增加的电导影响，即使超过40mS/cm也影响轻微。传统阳离子交换凝胶超过5mS/cm电导载量便急剧下降，Capto-MMC仍可保持载量，不受样品中盐浓度的影响。
本发明的另一个目的是为了提高rHSA及其融合蛋白的回收量。如果在步骤(2)中使用的是普通阳离子交换介质或是Blue-Gel，目标蛋白的回收率仅达30％左右。而Capto-MMC是多重作用的弱阳离子交换凝胶：离子作用，疏水作用，氢键，它至少包含了与目的物作用的两个位点，一个提供电荷相互作用，一个提供基于氢键和/或疏水的相互作用。目标蛋白的回收率可达80％以上。
本发明的另一个目标是进一步降低终产品的色素含量，以便进一步提高终产品纯度。这一目标可以由前述方法中使用Capto-MMC交换介质来实现。
本发明内容之一是从一种溶液中分离纯化重组人血清白蛋白及其融合蛋白的方法，该方法包括将发酵液上清中所含的重组人血清白蛋白及其融合蛋白通过层析步骤：具有耐高盐材料为基质的弱阳离子交换层析(Capto-MMC)；疏水层析(HIC)和离子交换层析的方法获得纯化，而成为适合制作重组蛋白药物的原料药。
本发明的一个具体的例子：当进行步骤(2)时，发酵液上清电导可高于10mS/cm，多数情况在25-30mS/cm之间，这是因为所用的特殊阳离子交换填料是耐高盐的，这是完全可行的。因此，本发明一个最重要的优势在于避免对发酵液上清的高比例稀释。与前述rHSA纯化各种办法相比，Capto-MMC耐高盐、又可以有更大的上样量、经测定其与人血清白蛋白融合蛋白在高盐状态下，有大于50mg/ml的载量能力。
步骤(2)的主要目的是消除小分子有色物质如带负电的杂质等。因此，步骤(2)使用了阳离子交换剂，其有耐高盐作用，这里，“高盐”是指高盐浓度下的耐受性，这是这类离子交换剂的特性。这一特性是由配基的性质决定的。Capto-MMC可以通过几种不同的方式结合目标分子。它包含有羧基团，因而可以起弱阳离子交换作用。此外它还有离子交换作用，包括氢键作用和疏水作用。Capto-MMC的多形式配基图见附图1。
在大规模生产时，Capto-MMC有高流速和低反作用力的特性。例如直径为1m的纯化柱，20cm柱高，流速至少可以达到600cm/h，而反压力低于3bar。与传统阳离子交换介质相比较，随着上样液电导率的增大，其结合力没有下降。见附图2。
如上述，步骤(3)使用了疏水作用层析填料(HIC)。这一步的主要目的是除去rHSA和融合蛋白产品中的蛋白降解物，这些降解物分子量通常在10-50Kda。HIC是众所周知的层析技术，其分离基于蛋白表面疏水性差异。许多被认为是亲水性的生物大分子，仍然有足够多的疏水基团暴露在外面，使其与连接于填料基质的疏水基团相互作用。例如在专利ZL021428816、ZL2004100428148、ZL2004100573137中介绍使用疏水层析填料用于纯化人血清白蛋白和其融合蛋白。在EP0699687、CN031235026中，HIC被建议用于rHSA的纯化。与其他已知的分离原理疏水作用层析如反相层析相比，HIC使用的配基浓度低得多。这一特点提高了选择性，并可使用温和的洗脱条件以助于保持目标蛋白的生物活性。在本发明中，HIC即可设计为用于吸附上述rHSA和它的融合蛋白的降解片断，而全长的rHSA和它融合蛋白在未结合部分被洗脱。也可被设计为将目标蛋白rHSA和它的融合蛋白与HIC相结合。方法是通过调节上样的盐浓度和pH值。目标蛋白与介质疏水基团的疏水作用强度可通过小幅度提高所使用的缓冲液的离子强度而得以加强。目前有许多市售可得的HIC介质，本发明不限定任何特定的基质和/或配基。总之，步骤(3)所用基质可为有机和无机材料，有机材料例如可为天然聚合物如琼脂糖、葡萄糖、纤维素、淀粉等或合成聚合物，如二乙烯苯、苯乙烯。无机材料中硅胶是众所周知的广泛使用的一种。较优的基质是交联琼脂糖，有多家公司在出售这种基质，如GE Healthcare的Sepharose。在实施例中，步骤(3)所使用的与rHSA及其融合蛋白相结合的HIC有一个或多个作用位点的疏水介质，优选地是含有苯基、丁基、如正丁基、辛基、如正辛基等的基团，优选地支撑介质的材质以琼脂糖为基质的。另外，以二乙烯苯为基质的疏水性配基有：醚、异丙基、丁基或苯基，如GE Healthcare的Source。步骤(3)最优选地是应用交联琼脂糖连接丁基或苯基配基，介质最好为中空微球，其含水量可达90％以上，最好可到94％左右，湿球的平均粒度例如可在10-150μm之间，优选地是小于100μm如90μm左右。介质的配基浓度例如在20-60之间，例如40μmol/ml胶左右为好。在实施例中，介质为Phenyl Sepharose6FF和Phenyl Sepharose HP(GE Healthcare生产)获得应用。在本领域的熟练技术人员可根据操作范围调整运行参数。这步纯化可以在pH4-8如6.5-7，盐浓度0.01-2M，优选地是在0.05-0.5之间进行。
例如在本发明的实施例中，在步骤(3)中使用了高配基的ButylSepharose，能够有效去除未结合部分的小分子杂质，同时也能更好地降低目标蛋白中的A350/A280的比值(降低色素含量)。
也如上所述，方法步骤(4)使用阴离子交换介质，去除步骤(3)中痕量的杂质，尤其是如小分子片断类的多余杂质。本发明可以使用任何具有专一性的阴离子介质，只要它有足够量的配基，能够结合rHSA及其融合蛋白终产品中多余的负电荷组份。阴离子层析交换步骤可在例如pH5-8，盐浓度0.01-2M条件下去除杂质。至于介质的材料，可为有机或无机材料。例如，介质由琼脂糖交联成的中空的小球组成，如GEHealthcare的Sepharose产品。所连的配基是弱阴离子交换(如DEAE)，配基上的结合基团例如可为一级和二级胺。这样的结合基团可以和最靠近基质的醚，例如通过烷基链连在基质上。还有强阴离子交换介质，如Q Sepharose Fast Flow。如上所述，本发明不受任何特别结构的限制。如来自于GE Healthcare公司的DEAE Sepharose FF或Q Sepharose FF等均可以使用，在具体使用层析柱时目标蛋白rHSA及其融合蛋白可与介质结合或不结合均可。Q柱在某些方面的使用中，是令人满意的。在本发明中，步骤(4)使用了不同的离子交换介质填料，用于获得更高纯度的目标蛋白。
本发明建立的分离纯化方法均是建立在间歇(step)洗脱基础上，不需要昂贵的大型设备，因此适于大规模分离纯化操作。
本发明的纯化技术和步骤简化了可用于各种不同的人血清白蛋白融合蛋白和人血清白蛋白的纯化方法，适用于包括，但不局限于，重组人血清白蛋白和各种人血清白蛋白与治疗性蛋白质的融合蛋白的直接有效分离工作。本发明可适用的融合蛋白有人血清白蛋白与造血细胞增生刺激因子形成的融合蛋白(于在林，中国专利ZL02142881.6；US7,244,833B2)，包括，但不局限于：血红细胞增生素(EPO)、白细胞增生介素(ILs)、干细胞因子(SCF)、血小板增生素(TPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和巨噬粒细胞集落刺激因子(GM-GSF)等；有人血清白蛋白与人干扰素形成的融合蛋白(富岩、于在林ZL200410042814.8)，包括：干扰素-α(-2a、-2b或-1b)、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-ω等；还有人血清白蛋白与皮肤细胞生长因子形成的融合蛋白(于在林、富岩中国专利申请200710059770.3)，包括表皮细胞生长因子(EGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、IGF、KGF、PDGF等。
根据不同的重组蛋白分子特性，其它的一些可用于蛋白分离纯化的介质填料，包括，但不局限于，亲和柱层析介质如Chelating，NiSepharsoe HP、Heparin Sepharose 6 FF等，也可以在上述3个步骤的三种介质外，作为额外的纯化程序，以获得符合试验者要求的样品纯度或达到其他目的，包括，但不局限于，去除热源(细菌内毒素)、样品脱盐(使用GE Healthcare公司的G25填料)等额外程序。
附图说明
附图1、GE Healthcare公司生产的Capto-MMC填料的配基示意图。
附图2、GE Healthcare公司的Capto-MMC填料与其他传统的Cationexchanger填料的进行比较，吸附蛋白量和电导强度比值的测定结果。结果显示Capto-MMC在电导值增加情况下仍然具有很好的与蛋白质相结合的能力。
附图3、典型的利用Capto-MMC分离纯化不同的rHSA融合蛋白的层析位图图谱。(A)rHSA/EGF来自毕氏酵母菌；(B)rHSA/GCSF融合蛋白来自毕氏酵母菌；(C)rHSA来自毕氏酵母菌；(D)rHSA/EPO来自无血清培养的CHO细胞。图A标示出上样流穿峰；50mM PB洗脱峰；50mMPB+0.6M NH4Cl洗脱峰、水洗脱峰、1M NaOH碱清洗峰。
附图4、典型的Butyl配基Sepharose4Fast Flow填料用于纯化人rHSA/GCSF(A)、rHSA/EGF(B)融合蛋白图谱。图A标示出上样流穿峰；20mM PB洗脱峰；水洗脱峰、和1M NaOH碱清洗峰。
附图5、SDS-PAGE胶图分别显示了经步骤(1)-(3)分离纯化目标蛋白rHSA/GCSF融合蛋白的一个试验结果。泳道1：标准分子量；2：经步骤(1)处理的发酵上清液；3：步骤(2)的上样流穿峰；4：步骤(2)的50mM PB洗脱峰；5：步骤(2)的50mM PB+0.6M NH4Cl洗脱峰；6：步骤(3)的上样流穿峰；7：步骤(3)的20mM PB洗脱峰；8：步骤(3)的水洗脱峰。
附图6、经步骤1-4纯化的目标蛋白电泳SDS-PAGE示意图。结果显示了待纯化的目标蛋白(85Kd融合蛋白)中所含有的聚合体，利用Q介质层析技术得到了有效的分离。A)标准分子量；B)待纯化目标蛋白样品；C)20mM PB，pH7.0+18％NaCl，盐浓度洗脱，获得的不含聚合体的目标蛋白(得率在60％以上)峰；D)20mM NaAc，pH5.5洗脱峰，含低分子量的聚合体；E)20mM NaAc，pH4.0缓冲液洗脱峰，含高分子量的聚合体。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不限制于本发明的范围。
实施例1：表达rHSA及其融合蛋白毕赤酵母工程菌的高密度发酵
本发明所使用的重组人血清白蛋白工程表达菌、各种人血清白蛋白与治疗性蛋白质直接与或通过连接肽所具有形成的融合蛋白工程表达菌的构建均分别来自中国授权发明专利ZL02、ZL2004100、ZL2007100和美国授权发明专利US7244和美国发明专利申请US2006。
在其中所涉及的rHSA/治疗性蛋白质融合蛋白菌种菌可利用相同的生产工艺来获得表达产物。一般描述为，毕氏酵母高效表达工程菌冷冻菌种1ml接种于100ml无机盐培养基中，在30℃下，以300rpm培养20小时，达到OD600＝～11。平均接种于5个200ml无机盐培养基中进行9小时的培养。然后接入30L种子罐含有10L无机盐培养基。在维持通气压、pH5.0和30℃的条件下种子培养12-20小时。按菌种密度为OD600＝1的条件接种于200L发酵生产罐。其中含有100-120L灭菌的无机盐培养基(使用常规的无机盐培养基可参见Invitrogen公司的发酵工艺手册说明。为获得更好的生产产量，发明人使用自有的(Know-how)、优化的无机盐培养基配方)中进行培养。这时的溶氧电极设置为100。当发酵罐中发酵液溶氧下降为0，并在溶氧重新上升达60％时，开始进行4升甘油的流加(每L甘油添加12mlPTM1和适量的生物素等)，此时溶氧下降。在流加结束后，让甘油耗尽(溶氧重新回升)时，启动甲醇诱导程序。整个诱导生产阶段维持甲醇浓度在0.1-1％。目标蛋白人血清白蛋白或它的融合蛋白产物随时间的延长而积累。一般诱导时间在24-96小时或更长(在低温20-26℃下，可达600小时)。不同酵母菌重组克隆株诱导时的溶氧、温度和pH可有所不同。本发明试验了诱导期溶氧控制在0-50％的不同范围，温度控制在20-30℃之间，采用不同的温度，表达产量会有所不同。不同的目标蛋白在诱导期间需要采用不同的pH条件。试验确定了在pH4.5-7条件下，不同菌种具有其各自最佳生产能力。每个重组工程菌种均有其最佳生产条件。诱导结束后在无机盐培养基中获得的发酵液，其菌密度可达OD600＝350以上；菌体湿重达～400g/L，电导值在10-50ms/cm。本发明的发酵工艺，在使用2吨发酵罐时，200L发酵罐所适用的条件均可直接线形放大，无需大的改动。采用酵母菌有机培养基也获得了相同的表达产物。仅是在产量上则有所不同。
实施例2：脊椎动物细胞用于表达人血清白蛋白/EPO融合蛋白
将使用含pCMV-HSA或pCMV-HSA/EPO质粒转染贴壁型CHO细胞(CHO-H)或CHO悬浮细胞(Invitrogen公司CHO-S细胞系)，以Neomycin作为选择压力而获得的重组细胞克隆子，以无血清培养基(市售产品即可)培养和扩增。生产阶段为，细胞接种3天后，开始进行连续培养，收集含有人血清白蛋白或人血清白蛋白EPO细胞培养无血清培养上清液。这时的细胞培养液中的重组蛋白产物含量在90mg/L以上，pH＝7.0、电导值在5-20ms/cm之间。
实施例3：酵母菌高密度发酵后处理
酵母菌高密度发酵液经泵打入板框过滤系统，除去菌体获得澄清的上清液。上清液可以在通过0.45uM的管式滤心抽滤后直接用于分离纯化程序。发酵液也可以在完成板框过滤后，加入活性炭至0.4-5％。混合均匀后，通过连续流高速管状离心机去除活性炭，以减少发酵液中的色素含量。活性炭处理后的发酵上清液通过0.45uM的滤心过滤后再进入纯化程序。由无血清培养基培养CHO细胞而获得的含目标蛋白的培养液，则在连续流高速管状离心机处理后，过0.45uM膜除菌后，直接用于纯化程序。
考虑到人血清白蛋白与人血清白蛋白融合蛋白在临床上的使用量有着巨大的不同(rHSA产品终浓度可达200mg/ml；rHSA/治疗性蛋白知道融合产品终浓度仅在：0.5-5mg/ml)。含有人血清白蛋白的发酵液在完成板框过滤后，就需要有额外的加热处理程序，目的是要去除发酵液中的酵母蛋白酶、酵母色素。例如，在5mM的辛酸钠，5mM的EDTA和1％的活性炭作用下，将发酵液加热至68℃，30mins或72℃，20mins，然后快速冷却。用醋酸调至pH5.0。上清液过膜后进入纯化程序。由酵母菌发酵获得的人血清白蛋白融合蛋白则一般仅需要经0.4-1％的活性炭处理，色素含量、蛋白质生物活性在最终产品中均能符合临床药品的制备要求。
实施例3：步骤(2)：使用高盐弱阳离子交换介质捕获样品
1L的Capto-MMC介质填料购自GE Healthcare公司装填于华美公司(上海)制作的直径10cm，柱高40cm的层析柱中，填料柱高约15cm。使用平衡液-A(25mMNaAc，pH5.0)平衡，然后在蛋白核酸检测仪(北京或上海产品)的监控下，将处理后的发酵液或细胞培养上清液以50-100ml/min的速度上样，收集流穿峰。上样结束后，继续使用平衡液-A平衡至基点。缓冲液-B(50mMPB，pH7.0)用于杂蛋白的去除(收集为峰1)，缓冲液-C(50mMPB，pH7.0，0.6MNH4Cl)将目标蛋白人血清白蛋白或它的融合蛋白洗脱(收集为峰2)。然后进行用水(H2O)洗(收集为水洗峰)。CaptoMMC的典型位图图谱见附图3，典型的利用Capto-MMC分离纯化不同的rHSA融合蛋白的层析位图图谱。其中(A)rHSA/EGF来自毕氏酵母菌；(B)rHSA/GCSF融合蛋白来自毕氏酵母菌；(C)rHSA来自毕氏酵母菌；(D)rHSA/EPO来自无血清培养的CHO细胞。图A标示出上样流穿峰；50mM PB洗脱峰；50mM PB+0.6M NH4Cl洗脱峰、水洗脱峰、1M NaOH碱清洗峰。
对由毕氏酵母工程菌表达的人rHSA、HSA/EGF、HSA/GCSF、HSA/EGF、HSA/IFN-a2a、HSA/IFN-a2b、HSA/bFGF、HSA/IGF、HSA/IL-11、和由CHO细胞表达的rHSA/EPO等融合蛋白试验结果显示，均具有极相似的位图图谱。最后，Capto-MMC介质填料经1M NaOH处理(含变性蛋白质，可直接弃之)后，再用30％异丙醇处理3个柱体积。以便清洗结合更为牢固的物质(蛋白质、脂类、糖类、色素和其它小分子等)以恢复介质的功能。介质可以在该溶液中过夜，然后用5倍柱体积的去离子水洗去大部分氢氧化钠和异丙醇。再生后的柱子在下一次进行上样/洗脱过程前用5倍柱体积的缓冲液-A平衡。所有收集峰进行采样后，目标蛋白的定位需要经过SDS-PAGE胶(见附图-5)来决定。所收集的含目标蛋白的样品峰体积总和只有发酵液上样量的1/20-1/100左右，从而起到对目标蛋白的富集作用。实施例中的所提出的Capto-MMC应用程序，具有通用性和高效性。
使用Capto-MMC介质由脊椎动物细胞的培养液中获得人血清白蛋白与EPO形成的融合蛋白(rHSA/EPO)的分离方法与从酵母菌发酵液中获得融合蛋白的位图图谱和结果相似。
实施例4：步骤(3)：利用疏水性介质层析纯化步骤
以rHSA/GCSF为例说明利用疏水性介质来纯化目标蛋白。丁基(ButylSepharose FF，GE Healthcare产品)疏水性介质填料1000ml装入直径7.5cm的柱床中进行用于疏水性分离。苯基(Phenyl Sepharose FF，GEHealthcare产品)疏水性介质也具有相同的分离效果，但疏水性与丁基的疏水性有所不同，试验者可根据所分离的目标蛋白的疏水性来选择。本发明人在试验中分别测试了同一样品在两种介质中的表现。介质在使用前需用3倍柱体积的缓冲液-D(50mM PB，pH7.0，0.5M NH4Cl)平衡将由Capto-MMC介质处理得到的包含目标蛋白的溶液部分用4M NH4Cl调电导至55ms/cm(与缓冲液D电导值相同)。上样结束后，用2倍柱体积的缓冲液-D继续洗涤。收集流穿峰。用缓冲液-E(20mM PB，pH7.0)来洗脱含有了rHSA/GCSF融合蛋白的部分，未结合部分(主要含有rHSA/GCSF融合蛋白发酵中产生的45Kda杂蛋白)通入2倍柱体积的去离子水洗脱下来。介质填料的再生处理与实施例3相同。附图4显示的是一个典型的Butyl配基Sepharose4Fast Flow填料用于纯化人rHSA/GCSF(A)、rHSA/EGF(B)融合蛋白图谱。图A标示出上样流穿峰；20mM PB洗脱峰；水洗脱峰、和1M NaOH碱清洗峰。附图3中的泳道6、7、8显示的是由丁基介质来纯化HSA/GCSF融合蛋白。泳道6是上样流穿峰，其显示出分子量66Kd的蛋白质处于流穿液中，其他分子量的蛋白质结合到丁基介质上，包括HSA/GCSF融合蛋白。这表现出丁基介质对不同蛋白的分离作用。
苯基(Phenyl Sepharose FF，GE Healthcare产品)疏水性介质也具有相同的分离效果，但疏水性与丁基的疏水性有所不同，试验者可根据所分离的目标蛋白的疏水性来选择。本发明人在试验中分别测试了同一样品在两种介质中的表现，以及同一介质对不同的目标蛋白的分离效果和进行不同盐浓度和pH值改变，而获得相似的分离结果，从而证明本领域的技术人员可以通过体积的优化而获得好的试验结果。疏水性介质可以有进一步纯化目标蛋白的功能。
为什么在Capto-MMC分离纯化步骤之后是使用疏水性介质而不是离子交换介质，主要是因为，Capto-MMC是高盐弱阳离子的介质，获得的分离目标蛋白峰是高盐溶液(电导为55ms/cm)。丁基和苯基均是高盐上样，低盐洗脱(目标蛋白峰所在)。而离子交换介质是低盐上样，高盐洗脱。这样设计获得一个连续的纯化程序，而省略了每个纯化程序之间的脱盐程序，简化分离纯化步骤。具有很好的应用效果。
为得了有目的地让目标蛋白处于某一缓冲液洗脱峰中，本领域的技术人员可以根据经验，目标蛋白的特性来选定缓冲液之pH值、盐浓度、盐的不同种类(例如Na+、NH4 +、Cl-、SO4 -)等。尤其是要以目标蛋白其在pH7.0时所带电荷(Charge)数量来定缓冲液中的pH值、盐浓度，以及盐的种类，有着明显的不同。例如：rHSA：Charge＝-13.40；rHSA/EGF：Charge＝-17.2；rHSA/GCSF：Charge＝17.70；rHSA/EPO：Charge＝-11.18；rHSA/IFNa-2a(-2b)：Charge＝-15.99；rHSA/IL-11：Charge＝-5.72。在处理不同的融合蛋白时，可以据此进行必要的优化，以获得最佳的分离结果。
实施例5：步骤(4)：使用离子交换介质精制样品
经上述提到的Butyl Sepharose6Fast Flow介质分离的各部分分别收集。装40ml Q(或DEAE)Sepharose Fast Flow介质于一根直径2.6/高20的层析柱子。用2倍柱体积的去离子水洗涤，然后用5倍柱体积的50m M PB，pH7.0)平衡。将丁基50mM PB洗脱峰泵入柱床中进行分离。上样后使用3个柱体积的PB缓冲液洗涤。然后用20mMNaAc，pH5.5和20mM NaAc，pH4.0洗脱杂蛋白。目标蛋白结合部分用20mMNaAc，180mMNaCl洗脱。此时的目标蛋白浓度在0.5-3mg/ml可以用于制剂的配制。附图6的SDS-PAGE示意图显示中经步骤1-3获得目标蛋白，再通过Q离子交换介质的使用，将样品中的聚合体与目标蛋白分离获得纯化的结果。目标蛋白(85Kd融合蛋白)中所含的聚合体，与目标蛋白获得有效的分离。图中A)标准分子量；B)待纯化目标蛋白样品；C)20mM NaAc，pH4.0+18％NaCl，盐浓度洗脱，获得的不含聚合体的目标蛋白(得率在60％以上)峰；D)20mM NaAc，pH5.5洗脱峰，含低分子量的聚合体；E)20mM NaAc，pH4.0缓冲液洗脱峰，含不同高分子量的聚合体。人血清白蛋白和各种不同的人血清白蛋白融合蛋白在经过步骤(2)和(3)后，再经过离子交换介质分离，均可获得进一步的纯化。
Q介质除了具有去除杂蛋白的功能，还具有去除融合蛋白样品中聚合体和浓缩样品的功能。当然，在制备rHSA高浓度样品时，还是必须要经过截留分子量为30000的浓缩包进行浓缩以达到200mg/ml的超高浓度的20％rHSA制剂。但是使用Q柱获得的目标蛋白浓度是基本可以满足所有治疗性融合蛋白药物对制剂浓度要求。
除上述的一个上清液制备步骤和3个目标蛋白分离纯化步骤外，根据不同的重组蛋白分子特性，其它的一些可用于蛋白分离纯化的介质填料，包括，但不局限于，亲和柱层析介质如Chelating，Ni Sepharsoe HP、Heparin Sepharose6FF等，也可以在上述3个步骤的三种介质外，增加使用，以达到符合试验者要求的样品纯度或达到其他目的，包括，但不局限于，去除热源(细菌内毒素)、样品脱盐(使用GE Healthcare公司的G25填料)、浓缩等额外程序。
Claims (1)
1.一种分离纯化重组人血清白蛋白或与其形成的融合蛋白的工艺，其特征在于，通过4个步骤来完成：
(1)利用无机盐培养基获得的含高盐、高密度酵母菌发酵液经板框机过滤获得含重组人血清白蛋白或与其形成的融合蛋白的上清液加入适量活性炭，经连续流离心机，去除活性炭，从而获得含重组人血清白蛋白或与其形成的融合蛋白的上清液；或利用无血清培养基获得的含重组人血清白蛋白或与其形成的融合蛋白的脊椎动物细胞培养液，经连续流离心机，去除细胞和细胞碎片，从而获得含重组人血清白蛋白或与其形成的融合蛋白的上清液；
(2)从步骤(1)中获得的含重组人血清白蛋白或与其形成的融合蛋白上清液，直接上经25mM NaAc，pH5.0平衡液平衡的含Capto-MMC介质的层析柱，上样后用平衡液再平衡，使用50mM PB，pH7.0缓冲液将杂蛋白洗脱，用50mM PB，pH7.0，0.6M NH4Cl缓冲液将重组人血清白蛋白或与其形成的融合蛋白洗脱；
(3)由步骤(2)获得的重组人血清白蛋白或与其形成的融合蛋白可进一步经50mM PB，pH7.0，0.5M NH4Cl缓冲液平衡的丁基或苯基作为配基的疏水性介质纯化，使用20mM PB，pH7.0缓冲液，获得重组人血清白蛋白或与其形成的融合蛋白；
(4)由步骤(3)获得的重组人血清白蛋白或与其形成的融合蛋白，进一步经50mM PB，pH7.0缓冲液平衡的Q Sepharose FastFlow介质的使用，20mM NaAc，pH5.5和20mM NaAc，pH4.0缓冲液分别洗脱杂蛋白，20mM NaAc，180mM NaCl缓冲液洗脱获得的重组人血清白蛋白或与其形成的融合蛋白，而可作为蛋白药物原料。
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Addressee: Yu Zailin Document name: Notification of Passing Examination on Formalities |
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