CN110343170B - 纤溶酶抑制剂rPI-T1的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纤溶酶抑制剂rPI‑T1的分离纯化方法，其包括发酵分泌表达rPI‑T1的毕赤酵母，将包含rPI‑T1的发酵液的上清液经Capto‑MMC层析柱洗脱，收集得到包含rPI‑T1的洗脱液I；将获得的洗脱液I经Qhp层析柱洗脱，收集得到包含rPI‑T1的洗脱液II。该方法是一种毕赤酵母分泌表达蛋白rPI‑T1的简单、快速、稳定、高效的分离纯化方法。涉及以毕赤酵母菌无机盐培养基发酵高效表达目标蛋白rPI‑T1，并将发酵液上清经离心、微滤、层析等步骤进行纯化的方法。本方法纯化收率高，热原检测批间稳定合格，活性蛋白收率达到90％以上，C₁₈HPLC分析纯度达到97％以上；具有对以重组毕赤酵母菌分泌表达蛋白的通用性，整体步骤少、效率高、收率高、工艺过程时间短、蛋白纯度高及易于产业化放大等显著特点。

Description

纤溶酶抑制剂rPI-T1的分离纯化方法

技术领域

本发明属于蛋白质的分离纯化领域，尤其涉及一种纯化分离经毕赤酵母菌分泌表达的rPI-T1的方法。

背景技术

临床上，外科手术中如何减少血液的流失是需要密切关注的重要事件，尤其是对手术时间较长的心肺旁路手术，需要采取一定的措施，避免和减少患者的大量出血。减少外科手术中血液的用量能有效地降低因输血产生的大量问题和避免经血液传播疾病的感染，如乙型肝炎病毒、人免疫缺陷型病毒(HIV)和变型的克罗伊茨费尔特-雅各布病等。

在国外，止血药aprotinin(抑酞酶)常被用于心脏外科手术中，主要用于体外循环下实施冠状动脉旁路移植术(CABG)的病人，以减少手术过程中的出血，并相应降低输血需求。但aprotinin有明显的副作用，可产生严重的不良反应，主要包括过敏性休克、心肌缺血、血栓形成、心力衰竭、肾功能异常、急性肾衰竭等，目前已经停止使用。

rPI-T1(textilinin-1，Txln-1)是一种Kunitz-型蛋白酶抑制剂，是从澳大利亚棕蛇Pseudonaja textilis textilis中提取的，具有59个氨基酸，分子量为6.7kDa。这个蛋白分子被建议作为在外科手术中aprotinin的替代药物。虽然rPI-T1与aprotinin在蛋白序列上相似度只有47％，但在这两种多肽中，六对二硫键是高度保守的。因此，它们的分子空间折叠是相似的，只是分子表面特性有些不同。

rPI-T1和aprotinin均具有强烈地抑制纤溶酶(plasmin)、弹性蛋白酶(elastase)和胰蛋白酶(trypsin)活性的作用。研究发现aprotinin对尿激酶(urokinase)、凝血酶(thrombin)和激肽释放酶(kallikrein)的作用比rPI-T1强。但被rPI-T1抑制的plasmin将很快地被逆转，并比aprotinin易于控制，这有助于控制血浆和损伤部位的抗纤维蛋白溶解活性。rPI-T1的这一特点降低了由于强烈抑制纤溶酶而导致的血栓风险，使它成为减少手术中血液损失的安全治疗性药物。并且，由于rPI-T1相对于aprotinin有更强的专一性，可以以较高的剂量使用，而没有由于酶特异性差导致的安全风险。与主要用于心脏外科手术中的aprotinin相比，rPI-T1可作为更可靠和更安全的止血用药。

rPI-T1可引起预期的血块溶解抑制作用。在同样的摩尔浓度下，aprotinin的抑制作用显著低于rPI-T1。这也是早期用血浆凝块溶解实验所证明的。rPI-T1可抑制纤溶酶活性，并在小动物模型中能减少出血。rPI-T1同aprotinin一样，在5μM的浓度下就能产生几乎完全抑制组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，tPA)诱导产生的全血凝块纤维蛋白的溶解。aprotinin能显著增加血浆aPTT，而血浆aPTT却不受rPI-T1的影响。在小鼠尾静脉出血动物模型中，静脉给药，rPI-T1和aprotinin都能起到相同的减少血液损失的作用。但rPI-T1可使小鼠止血时间更短。说明rPI-T1值得进一步研究，有望开发成为替代aprotinin的药物。

澳大利亚研究的rPI-T1仍处于实验室研究阶段。初步试验结果证明：rPI-T1与aprotinin相比，在相同用量的情况下，其止血过程更安全可靠。

目前，王宏英在《蛇志》2014年第26卷第3期发表的《纤溶酶抑制剂textilinin-1在毕赤酵母的表达及应用》(下称文献1)、杨宇在《蛇志》2014年第26卷第4期《毕赤酵母表达Q8008发酵条件的优化研究》(下称文献2)中公开了rPI-T1的小规模的发酵及分离纯化工艺。

根据文献1及文献2，结合最优发酵条件计算出在文献1及文献2公开的工艺中，发酵工艺基于30L发酵罐发酵周期为15天，蛋白表达量也只有1g/Kg(即每Kg菌体表达1g目的蛋白)，此工艺发酵生产周期长，从而导致物料消耗大、成本高，而且易染菌，最终蛋白表达量也较低。

rPI-T1作为注射剂型药物，热原检测是最重要的检测项目之一，文献1公开的分离纯化工艺中的第二步层析中使用的再平衡缓冲液50mM Tris-HClpH8.0电导为3.9～4.0ms/cm，由于电导较低导致需平衡很长时间，不能确保最终作为药物的纯化蛋白的热原合格。而且，洗脱缓冲液为50mM的Tris-HCl和30mM NaCl组成的pH7.5、电导7.0～7.2ms/cm的缓冲液，由于电导较低导致洗脱时间过长、收集体积过大、蛋白浓度过低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改进的rPI-T1的分离纯化方法，所述方法可以从表达rPI-T1的毕赤酵母的发酵液简单、快速地分离纯化出高纯度的热原合格rPI-T1，从而获得符合药物生产需求的蛋白。

此外，本发明利用毕赤酵母作为表达菌株，用300L发酵罐进行发酵表达，各种发酵参数都是针对毕赤酵母所做的改进。毕赤酵母菌表达rPI-T1相对于其他菌株(如酿酒酵母、汉逊酵母)表达量具有明显优势。

本发明的上述目的是通过采用以下技术方案来实现的：

一种纤溶酶抑制剂rPI-T1的分离纯化方法，所述方法包括以下步骤：

(1)发酵分泌表达的重组蛋白rPI-T1的毕赤酵母，将包含rPI-T1的发酵液上清液经Capto-MMC层析柱洗脱，收集得到包含rPI-T1的洗脱液I；

(2)将步骤(1)获得的洗脱液I经Qhp层析柱洗脱，收集得到包含rPI-T1的洗脱液II。

优选地，在步骤(1)中，所述包含rPI-T1的发酵液的上清液为分泌表达rPI-T1的毕赤酵母发酵液经固液分离(例如碟片式离心机离心或板框式过滤)所获得的上清液。更优选地，所述包含rPI-T1的发酵液的上清液经Capto-MMC层析柱洗脱之前被微滤。所述微滤可以去除其中残留的菌体、大部分色素及一些大颗粒物质，从而获得更清澈的含有rPI-T1的毕赤酵母发酵液的上清液。进一步优选地，所述微滤为经过中空纤维柱的微滤；更优选地，中空纤维柱的孔径为0.1μm。

优选地，在步骤(1)中，将包含rPI-T1的发酵液的上清液上样至装有Capto-MMC层析介质并经缓冲液平衡的层析柱，先用缓冲液平衡，再用缓冲液进行洗脱，收集得到洗脱液I。洗脱液I中的rPI-T1纯度可达90％以上。

更优选地，在步骤(1)中，将包含rPI-T1的毕赤酵母发酵液的上清液上样至装有Capto-MMC层析介质并经平衡缓冲液平衡的层析柱，先用平衡缓冲液平衡，并用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集得到洗脱液I。

为了步骤(1)和步骤(2)最优的衔接，优选在步骤(1)中，所述平衡缓冲液为50-1000mM、pH3.5-4.5的醋酸钠-醋酸缓冲液；更优选地，所述平衡缓冲液为50mM，pH为4.0，电导为2.3～2.4ms/cm的醋酸钠-醋酸缓冲液。

优选地，在步骤(1)中，所述洗脱缓冲液为80-150mM、pH7.5-8.5的Tris-HCl缓冲液；更优选地，所述洗脱缓冲液为100mM的pH8.0、电导为4.90～5.00ms/cm的Tris-HCl缓冲液。

为了确保最终蛋白的热原合格及缩短生产周期，优选地，在步骤(2)中，将步骤(1)获得的洗脱液I上样至装有Qhp层析介质并经缓冲液平衡的层析柱，先用缓冲液平衡，再用缓冲液进行洗脱，收集包含rPI-T1的洗脱液II。洗脱液II中的rPI-T1纯度可达97％以上。

更优选地，在步骤(2)中，将步骤(1)获得的洗脱液I上样至装有Qhp层析介质并经平衡缓冲液平衡的层析柱，先用平衡缓冲液平衡，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集得到包含rPI-T1的洗脱液II。

优选地，在步骤(2)中，所述平衡缓冲液为80-150mM、pH7.5-8.5的Tris-HCl缓冲液；更优选地，所述平衡缓冲液为100mM的pH8.0、电导为4.9～5.00ms/cm的Tris-HCl缓冲液。

优选地，在步骤(2)中，所述洗脱缓冲液为80-150mM的Tris-HCl和50-100mM的NaCl组成的pH8.0-8.5的缓冲液；更优选地，所述洗脱缓冲液为100mM的Tris-HCl和50mM的NaCl组成的pH8.0、电导为9.0-9.2ms/cm的缓冲液。

本发明所述的包含rPI-T1的发酵液的上清液是不含菌体的发酵液，由毕赤酵母发酵生产的rPI-T1发酵液经分离纯化获得。

其中，优选地，步骤(1)中的发酵使用无机盐培养基。更优选地，所述无机盐培养基以甲醇作为碳源，并且包括以下以g/ml计的组分：1％磷酸、0.8％硫酸钾、0.05％硫酸钙、0.65％硫酸镁、0.18％氢氧化钾、1％酵母浸出粉。进一步优选地，步骤(1)中的发酵采用流加甲醇的方式。本发明相比于文献1中发酵工艺做的改进如下表1：

表1：本发明与文献1发酵工艺对照表

本发明通过上述工艺的改进使得整个发酵周期从15天缩短到了7天，平均蛋白表达量从1g/Kg(即每Kg菌体表达1g目标蛋白)提高到1.5g/Kg，很大程度上缩短了周期降低了成本，并提高了表达量。

生物处理媒介因为生产规模的色谱层析的发展而得到发展。所有的生物处理媒介均经验证方可进行生产，并且经过测试以满足生产的需求。安全的订购和交付模式能够为规模生产需要的媒介提供可靠的供应。法规支持文件(RSF)可用来协助工艺验证和提交给监管机构。生物处理媒介可以覆盖从捕获到精纯的所有纯化步骤。

Capto-MMC是一种耐盐的多模式的生物处理媒介，其由GE Healthcare公司生产，在使用填充床色谱法从大量的培养液中纯化蛋白质时可以作为捕获介质和中间纯化介质。Capto-MMC在提高生产力的同时降低了生产成本；在高电导率下具有很高的动态载量、高容量的吞吐量、新的选择性以及更小的操作单元。

Capto-MMC的特性包括：(1)Capto-MMC具有多种官能团的配体，多种作用方式的官能团使配体具有不同于传统离子交换剂的选择性，且在高盐条件下仍具有结合蛋白质的活性；(2)Capto-MMC与大分子间存在多种作用方式，其中最显著的就是离子作用、氢键和疏水作用；(3)Capto-MMC是为了提高介质在捕获和中间纯化步骤中的速度和通量而设计的。通过提高高盐浓度下的容量和低反压条件下的流速，减短生产周期和提供生产力。高交联度的琼脂糖基质提供了很高的物理和化学稳定性。容量、洗脱行为和压力/流速等特性不受层析过程常用溶液的影响。Capto-MMC的基粒与官能团的结合如图1所示。

Q Sepharose^TMHigh Performance(简称Qhp)是一种非常著名的琼脂糖树脂阴离子层析介质，其由GE Healthcare公司生产。广泛应用于生物分子的分离纯化。Qhp具有一系列的操作特性：高分辨率、高载量、可靠地可再生性、易于放大等特性。Qhp是一种具有34nm平均粒径的高交联度珠状的强阴离子交换介质，离子交换组是季胺，通过基矩阵与醚键结合以确保化学稳定。Qhp的基粒与官能团的结合如图2所示。

本发明人基于毕赤酵母分泌表达的重组蛋白rPI-T1的发酵液的特性进行了大量研究和实验，发现Capto-MMC层析介质属于高盐耐受型的弱阳离子交换介质，可允许含盐量高的发酵上清液不经稀释直接上样，还具有蛋白结合率高等优点。因此，本发明的方法可以有效地减少上样总体积、捕获更高的蛋白量。本发明的方法具有成本低、速度快、效率高的优点，尤其适合于使用无机盐的培养基的吨级发酵液的快速处理。而且，这单一填料可适用于多种不同的分泌型重组蛋白质的快速捕获，相比于文献1所用的纯化工艺用时缩短了约40％、纯度也有所提高，蛋白活性、收率基本没有下降，最为重要的是文献1提到的纯化工艺所得的终产品热原检测不能保证每批次都合格，而经过本发明工艺的改进，再平衡的缓冲液电导增高使得不能完全结合在层析介质上的热原会随着平衡液穿透，最终保证每个批次的洗脱液中的蛋白原液热原合格。

本发明的实践表明Capto-MMC(GE Healthcare公司)可以实现从发酵液、培养液中高效分离纯化rPI-T1的目的。Capto-MMC是可以在高达30mS/cm电导下吸附rPI-T1的弱阳离子交换填料。Capto-MMC具有多重作用的弱阳离子交换凝胶，包括离子作用，疏水作用和氢键。本发明经研究发现，Capto-MMC可用于直接上rPI-T1粗样，样品无需再经过脱盐或稀释降低电导，简化流程，节省成本。一般填料载量会随样品电导增加而下降，但Capto-MMC明显稳定很多，载量不受样品不断增加的电导影响。Capto-MMC对不同rPI-T1的载量也不受样品不断增加的电导影响，即使超过40mS/cm也影响轻微。传统阳离子交换凝胶超过5mS/cm电导载量便急剧下降，而Capto-MMC仍可保持载量，不受样品中盐浓度的影响。

本发明的另一个目的是为了提高rPI-T1蛋白的回收量。如果在步骤(1)中使用的是普通阳离子交换介质SP sepharose Fast Flow或SP sepharose High Performance，目标蛋白的活性回收率仅有30％和55％，如果在步骤(1)中使用文献1的纯化工艺提到的20mM醋酸钠缓冲液(pH4.00、电导为1.6～1.7ms/cm)，步骤(1)的活性收率为65％。而本发明采用的Capto-MMC层析介质平衡缓冲液为50mM的NaAC-HAC(pH4.00、电导为2.3～2.4ms/cm)，洗脱缓冲液为100mM的Tris-HCl(pH8.0、电导为4.90～5.00ms/cm)，也因此使得rPI-T1的活性回收率可达90％以上。

根据本发明的一个具体例子：当进行步骤(1)时，发酵液上清液的电导高于30mS/cm，多数情况在30-35mS/cm之间，这是因为所用的特殊阳离子交换填料是耐高盐的，这是完全可行的。因此，本发明一个最重要的优势在于避免对发酵液上清的高比例稀释。与其他阳离子层析介质(例如SP-Sepharose FF或SP-Sepharose HP)相比，Capto-MMC耐高盐、又可以拥有更大的上样量，经测定其针对rPI-T1在高盐状态下，有大于47mg/ml的载量能力；文献1的纯化工艺步骤(1)与本发明的工艺步骤(1)上样同体积、同蛋白活性的发酵上清微滤液，本发明的活性收率较之前提高了20％左右。

步骤(1)的主要目的是消除小分子有色物质，如带负电的杂质等。

在大规模生产时，Capto-MMC有高流速和低反作用力的特性。例如直径为1m的纯化柱，20cm柱高，流速至少可以达到600cm/h，而反压力低于3bar。与传统阳离子交换介质相比较，上样液电导率增大，其结合力没有下降(参见图3)。

如上所述，本发明人基于毕赤酵母分泌表达的重组蛋白rPI-T1的发酵液的特性进行了大量研究和实验，并在步骤(2)中使用了阴离子层析材料Qhp。这一步的主要目的是除去rPI-T1蛋白产品中的一些杂蛋白及细菌内毒素。而文献1的纯化工艺中，步骤(2)所用的平衡液为50mM的Tris-HCl(pH7.5、电导3.90～4.00ms/cm)，由于电导较低不能结合牢固小分子内毒素，需要大量平衡液平衡，而且还不能完全保证洗脱下来，所以导致不是每一批次的最终蛋白原液热原检测都合格。本发明采用平衡液为100mM的Tris-HCl(pH8.0、电导为4.90～5.00ms/cm)，其可以保证很短时间内将不能结合牢固的小分子内毒素洗脱下来，从而确保每个批次的最终蛋白原液热原检测合格，而洗脱液采用的为50mM NaCl+100mMTris-HCl(pH8.0、电导9.0～9.2ms/cm)，较文献1采用的30mM NaCl+50mM Tris-HCl(pH7.5、电导7.2～7.4ms/cm)，洗脱时间缩短、体积减少及蛋白原液的浓度增高，减少了后期浓缩时间长带来的染菌风险。

本发明具有操作成本低、速度快、步骤少、简单、高效、分离纯化后的目标蛋白纯度高、蛋白原液热原检测合格及易于产业化放大等优点。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1：GE Healthcare公司生产的Capto-MMC层析介质的配基示意图。

图2：GE Healthcare公司生产的Q Sepharose^TMHigh Performance层析介质的配基示意图。

图3：GE Healthcare公司的Capto-MMC层析介质与其他传统的SP sepharose FastFlow及SP sepharose High Performance层析介质在不同盐浓度下对rPI-T1载量比较。

图4：典型的利用Capto-MMC分离纯化rPI-T1层析位图图谱。rPI-T1来自毕赤酵母菌；图中标示出上样穿透峰；50mM NaAC-HAC开始冲洗；100mM Tris-HCl开始洗脱、100mMTris-HCl洗脱峰、0.5M NaOH碱清洗峰。

图5A：文献1的纯化工艺步骤(2)层析图谱。图5B：本发明工艺步骤(2)层析图谱。典型的本发明工艺与文献1的纯化工艺步骤(2)利用Qhp对rPI-T1进一步分离纯化的层析位图对比图谱。上样液来自步骤(1)中的洗脱峰；图5B中标示出上样穿透峰；100mM Tris-HCl开始冲洗；50mM NaCl+100mM Tris-HCl开始洗脱；50mM NaCL+100m MTris-HCl洗脱峰；2MNaCl盐清洗峰。

图6：典型的利用HPLC高效液相C18反相色谱柱对步骤(2)中的洗脱峰进行纯度检测图谱。图标中标识峰#2为样品检测峰；峰面积即代表样品纯度。

具体实施方式

以下参照具体的实施例对本发明进行进一步的详细描述。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1：表达rPI-T1毕赤酵母工程菌的高密度发酵

本实施例所使用的重组rPI-T1工程表达菌的构建参照中国授权发明专利CN201110178605.6。

其中人工合成rPI-T1结构基因序列为：

AAGGATAGACCAGATTTTTGTGAATTGCCAGCTGATACTGGTCCATGTAGAGTTAGATTTCCATCTTTTTACTACAACCCAGATGAAAAGAAGTGTTTGGAATTTATTTACGGTGGTTGTGAAGGTAACGCTAACAACTTTATTACTAAGGAAGAATGTGAATCTACTTGTGCTGCTTAA。

所述结构基因表达的蛋白序列为：

KDRPDFCELPADTGPCRVRFPSFYYNPDEKKCLEFIYGGCEGNANNFITKEECESTCAA。

其中所涉及rPI-T1的菌种均可利用相同的生产方法来获得表达产物。一般描述为将毕赤酵母高效表达菌种划线接种于加抗生素的YPD固体平板培养基，30℃培养72小时左右；挑取单菌落接种于50ml液体YPD培养基中，30℃、250r/min条件下培养14小时左右，菌体OD达到约40～50时，将上述液体种子分别接入6个装有250ml液体YPD培养基的摇瓶中，每个摇瓶接入1ml，30℃、250r/min条件下培养14小时左右，菌体OD达到约40～50，并瓶后加到装有15L液体YPD培养基的30L种子罐，维持0.07MPa的通气罐压、200r/min的搅拌速度，并在30℃下培养15小时。上述30L种子罐中的液体种子达到菌种密度为OD＝1时接种于200L发酵生产罐，所述发酵生产罐含有120-130L灭菌的无机盐培养基。

为获得更好的产量和缩短周期，本发明人使用自有的、优化的无机盐培养基配方(1％磷酸、0.8％硫酸钾、0.05％硫酸钙、0.65％硫酸镁、0.18％氢氧化钾、1％酵母浸出粉，上述各组分以g/ml计)，并流加甲醇进行培养，该无机盐培养基以甲醇作为碳源，并诱导表达。此时的溶氧电极设置为100。当发酵罐中发酵液溶氧下降为0，并在溶氧重新上升达60％时，开始进行8升50％甘油的流加，每L甘油添加12ml PTM1(PTM1成分以g/ml计：五水硫酸铜0.6％、碘化钠0.008％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸亚铁6.5％、生物素0.02％、硫酸0.5％)，此时溶氧下降。在流加结束后，当甘油耗尽(溶氧重新回升)时，启动甲醇诱导程序。整个诱导生产阶段维持甲醇浓度在0.1-1％。目标蛋白rPI-T1产物随时间的延长而积累。一般诱导表达时间在72-96小时。不同酵母菌重组克隆株诱导时的溶氧、温度和pH可有所不同。本发明试验了诱导期溶氧控制在10-50％的不同范围，温度控制在20-30℃之间，采用不同的温度，发现表达产量会有所不同。不同的目标蛋白在诱导期间需要采用不同的pH条件。试验确定了在pH4.5-7条件下，不同菌种具有其各自最佳生产能力。每个重组工程菌种均有其最佳生产条件。具体结果为：酿酒酵母最适培养条件为25℃、30％的溶氧、pH7.0，目的蛋白rPI-T1的表达量为0.7g/Kg(即每公斤菌体表达0.7g的目标蛋白)；汉逊酵母最适培养条件为30℃、35％溶氧、pH5.0，表达量为0.9g/Kg；本发明最优选的毕赤酵母最适培养条件为25℃、20％溶氧、pH5.0、500rpm/min搅拌转速、500L/min的压缩空气通量，使得目标蛋白表达量为1.5g/Kg，比文献1、文献2中发酵工艺提高了30％左右。诱导结束后以无机盐培养基获得的发酵液菌体湿重达450g/L以上，电导率值在20-50ms/cm。本发明的发酵工艺在使用1吨发酵罐时，300L发酵罐所适用的条件均可直接线性放大，无需大的改动。

实施例2：酵母菌高密度发酵后处理

酵母菌高密度发酵液经泵打入碟片式离心机，除去菌体获得澄清的上清液，上清液经过0.1μm中空纤维柱微滤去除残留菌体、部分色素及大分子物质后，直接用于分离纯化程序。发酵液也可以在经过板框过滤后，加入活性炭浓度至0.4-5％，混合均匀后，通过连续流高速管状离心机去除活性炭，以减少发酵液中的色素含量；活性炭处理后的发酵上清液通过0.45μm的滤心过滤后再进入纯化程序。

在离心过程中考虑到rPI-T1的稳定性，在碟片式离心机固液分离过程中高转速会致使转鼓内温度升高，所以在离心过程中需要用到冷水机组对碟片离心机的转鼓降温。同理，使用连续流管式离心机离心时也需要配备冷却系统。

实施例3：使用耐高盐的弱阳离子交换介质捕获样品

该层析步骤平衡液为：50mM NaAC-HAC，pH4.0，电导2.3～2.4ms/cm；洗脱液为：100mM Tris-HCL，pH8.0，电导4.90～5.00ms/cm。

将5L的Capto-MMC介质填料(购自GE Healthcare公司)装填于GE Healthcare公司制作的直径20cm、柱高50cm的层析柱中，填料柱高约15cm。使用平衡液50mM NaAC-HAC(pH4.0，电导2.3～2.4ms/cm)平衡，然后在紫外检测仪的监控下，将处理后的发酵上清液以400～600ml/min的速度上样，收集流穿峰。上样结束后，继续使用平衡液50mM NaAC-HAC(pH4.0，电导2.3～2.4ms/cm)平衡至基点。用缓冲液100mM Tris-HCl(pH8.0，电导4.90～5.00ms/cm)将目标蛋白rPI-T1洗脱(收集为洗脱峰)。然后进行用0.5M NaOH清洗(出现碱洗峰)。本发明选用Capto-MMC层析介质，相比传统的SP-Sepharose FF或SP-Sepharose HP，在高盐浓度下的蛋白载量有明显的优势(如图3所示)。而且蛋白活性收率大于90％，比SP-Sepharose FF提高了60％左右，比SP-Sepharose HP提高了40％左右。图3是典型的利用Capto-MMC分离纯化rPI-T1的层析位图图谱。图4标示出上样流穿峰；100mM Tris-HCl洗脱峰；0.5M NaOH碱清洗峰。经Capto-MMC层析后的纯度也有所提高。具体如下表2：

表2：不同层析柱洗脱效果对比

由上表分析得出结论：本发明所选用Capto-MMC分离纯化条件对比传统的SP-Sepharose FF或SP-Sepharose HP具有耐高盐、高载量、高回收率、分离彻底等优势，相对于SP-Sepharose FF或SP-Sepharose HP两种介质，Capto-MMC可以从20cm直径的层析规模直接放大到1m直径的纯化规模。

实施例4：使用离子交换介质精制样品

该层析步骤平衡液为：100mM Tris-HCl，pH8.0，电导4.90～5.00ms/cm。

洗脱液为：50mM NaCl+100mM Tris-HClpH8.0，电导9.0～9.2ms/cm。

经上述Capto-MMC介质分离的各部分分别收集。装5L Qhp(GE Healthcare公司生产的一款阴离子层析介质)层析介质于一根GE Healthcare生产的直径20cm高50cm的层析柱内，柱高15cm。用5倍柱体积的去离子水洗涤，然后用5倍柱体积的100Tris-HCl(pH8.0电导4.90～5.00ms/cm)上样，结束后使用5个柱体积的100mM Tris-HCl(pH 8.0电导4.90～5.00ms/cm)洗涤。目标蛋白结合部分用50mM NaCl+100mM Tris-HCl(pH8.0电导9.0～9.2ms/cm)的洗脱液进行洗脱，收集的洗脱峰所含目标蛋白含量在3-5mg/ml，蛋白活性收率在95％以上。得到的样品进行HPLC(高效液相)C18反相色谱柱层析，检测波长214nm(如图6)，rPI-T1的纯度达到了97％以上，可作为蛋白药物的原料。rPI-T1在经过实施例3后，再经过Qhp离子交换介质分离，可获得进一步的纯化。Qhp介质除了具有去除杂蛋白的功能，还起到去除蛋白样品中聚合体的功能。

此步骤使用100mM Tris-HCl(pH 8.0电导4.9～5.0ms/cm)的平衡液只需要平衡3个柱体积就能使得穿透液体热源完全合格，相比于文献1纯化工艺平衡15～20柱体积还不能保证热源完全合格，不但大大的缩短了生产周期及节约了成本，最重要的保证了终产品批间热源合格的稳定性。此步骤使用50mM NaCl+100mM Tris-HCl(pH8.0电导9.0～9.2ms/cm)的洗脱液使得终产品原液的蛋白含量提高，收集的洗脱液体积减少，浓缩时间缩短，减少了染菌的风险。

Q Sepharose Fast Flow介质也可以对实施例3中所收集的洗脱峰进行分离纯化，但目标蛋白的活性收率仅为本发明最优选的Qhp介质的80％左右。

当然，在制备rPI-T1-高浓度样品时，还是必须要经过截留分子量为3000的浓缩包进行浓缩以达到100mg/ml以上的原液。

尽管通过公开的实施方案描述了本发明，本领域技术人员应当容易理解，具体的实施例和上文详述的研究只是对本发明的举例说明。应当理解在不脱离本发明精神的情况下，可作出各种修改。因此，本发明只受所附权利要求的限制。

序列表

<110> 辽宁远大诺康生物制药有限公司

<120> 纤溶酶抑制剂rPI-T1的分离纯化方法

<130> DIC17110076

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 180

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaggatagac cagatttttg tgaattgcca gctgatactg gtccatgtag agttagattt 60

ccatcttttt actacaaccc agatgaaaag aagtgtttgg aatttattta cggtggttgt 120

gaaggtaacg ctaacaactt tattactaag gaagaatgtg aatctacttg tgctgcttaa 180

<210> 2

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Lys Asp Arg Pro Asp Phe Cys Glu Leu Pro Ala Asp Thr Gly Pro Cys

1 5 10 15

Arg Val Arg Phe Pro Ser Phe Tyr Tyr Asn Pro Asp Glu Lys Lys Cys

20 25 30

Leu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Ala Asn Asn Phe Ile

35 40 45

Thr Lys Glu Glu Cys Glu Ser Thr Cys Ala Ala

50 55

Claims (8)

1.一种纤溶酶抑制剂rPI-T1的分离纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）发酵分泌表达重组蛋白rPI-T1的毕赤酵母，将包含rPI-T1的毕赤酵母发酵液的上清液上样至装有Capto-MMC层析介质并经平衡缓冲液平衡的层析柱，先用平衡缓冲液平衡，并用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集得到洗脱液I；

其中，所述发酵使用无机盐培养基，所述无机盐培养基以甲醇作为碳源，并且包括以下以g/ml计的组分：1%磷酸、0.8%硫酸钾、0.05%硫酸钙、0.65%硫酸镁、0.18%氢氧化钾、1%酵母浸出粉；

所述步骤（1）的平衡缓冲液为50mM、pH4.0、电导为2.3-2.4ms/cm的醋酸钠-醋酸缓冲液；所述洗脱缓冲液为100mM、pH8.0、电导为4.9~5.0ms/cm的Tris-HCl缓冲液；

（2）将步骤（1）获得的洗脱液I上样至装有Qhp层析介质并经平衡缓冲液平衡的层析柱，先用平衡缓冲液平衡，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集得到包含rPI-T1的洗脱液II;

其中，所述步骤（2）的平衡缓冲液为100mM、pH8.0，电导为4.9~5.0ms/cm的Tris-HCl缓冲液；所述洗脱缓冲液为100mM的Tris-HCl和50mM的NaCl组成的pH8.0、电导为9.0-9.2ms/cm的缓冲液。

2.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述包含rPI-T1的发酵液的上清液为分泌表达rPI-T1的毕赤酵母发酵液经固液分离所获得的上清液。

3.如权利要求2所述的分离纯化方法，其特征在于，所述固液分离为碟片式离心机离心或板框式过滤。

4.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述包含rPI-T1的发酵液的上清液经Capto-MMC层析柱洗脱之前经过微滤。

5.如权利要求4所述的分离纯化方法，其特征在于，所述微滤为经过中空纤维柱的微滤。

6.如权利要求5所述的分离纯化方法，其特征在于，所述中空纤维柱的孔径为0.1μm。

7.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述洗脱液II中rPI-T1的纯度达97%以上。

8.如权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，步骤（1）中的发酵采用流加甲醇的方式。

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