CN112457377B - 美洲大蠊多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术和医药领域，特别涉及美洲大蠊多肽及其应用。具体地，本发明涉及一种分离的多肽，所述多肽选自下组：(a)具有KPEMDSSGFHGDTFR氨基酸序列的多肽；或(b)将KPEMDSSGFHGDTFR氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加形成的，且具有与(a)相同功能的由(a)衍生的多肽。本发明首次采用质谱分析与基因组数据相结合的方式对美洲大蠊脱脂提取物进行分离和鉴定，并成功发现一个具有有效活性成分的美洲大蠊多肽，该多肽能够快速高效的促进创伤的愈合，具有巨大的应用前景。

Description

美洲大蠊多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和医药领域，特别涉及美洲大蠊多肽及其应用。

背景技术

美洲大蠊(Periplaneta americana)属昆虫纲，蜚蠊目，蜚蠊科，俗称蟑螂、偷油郎等，是一种十分古老的昆虫。蜚蠊为非血食性卫生害虫，同时也是传统的药用昆虫，常以干燥或鲜成虫入药，其性寒味咸，有毒，有辛辣味、有散瘀、消积、解毒、利水、消肿等功能，主治儿童疳积、扁桃腺炎、痈疮肿痛等。

近年来，对美洲大蠊的药用作用研究越来越多，研究证明美洲大蠊提取物可以通过其抗菌、抗病毒、抗肿瘤和增强免疫等功能，在治疗疾病中发挥重要作用。通过虫体活性成分分离及研究发现，美洲大蠊虫体含有丰富的氨基酸和多糖，并且含有多种矿物元素、维生素、脂肪与脂肪酸等，其含有的粘糖氨酸、腺苷多元醇类及肽类等成分，具有抗炎、消肿、促进细胞增殖和新生肉芽组织增长，可加速病损组织修复、加快坏死组织脱落，并且提高机体的免疫功能，还能通过调控血管内皮细胞功能，改善皮肤血管功能等作用，但具体的有效成分尚不明确。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。本发明提供从美洲大蠊中分离出的多肽，并且发现其具有非常好的促愈合作用。

本发明的技术方案如下文所示：

本发明的一方面提供了一种分离的多肽，所述多肽选自下组：

(a)具有KPEMDSSGFHGDTFR氨基酸序列的多肽；或

(b)将KPEMDSSGFHGDTFR氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加形成的，且具有与(a)相同功能的由(a)衍生的多肽。

根据本发明的一些实施方式，所述多肽具有KPEMDSSGFHGDTFR所示的氨基酸序列。

其中，所述取代、缺失或添加的具体方法可以采用现有技术中已知的任意方法。

大蠊提取物的成分复杂，其油脂成分不仅无防治消化性溃疡作用，还能加重溃疡程度，而且所得提取物色泽深、腥臭味重。本发明人经过大量的科学研究，首次从美洲大蠊的脱脂提取物中发现了一种可以高效促进创伤愈合的多肽。

本发明的多肽(蛋白)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，植物、细菌、酵母、昆虫细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

根据本发明的另一方面提供了一种分离的核酸，所述核酸序列选自下组：

(a)编码如上所述的多肽的核酸；或

(b)与核酸序列(a)互补的核酸。

根据本发明的一些实施方式，所述核酸编码具有KPEMDSSGFHGDTFR所示氨基酸序列的多肽。

根据本发明的一些实施方式，所述核酸可以是对编码所述多肽的核酸进行人工定点突变后获得的基因突变体的DNA核苷酸序列。

本发明还包括多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“多肽”指KPEMDSSGFHGDTFR序列的多肽或其变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或减少一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括多肽的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与多肽DNA杂交的DNA所编码的蛋白等。本发明还提供了其他多肽，如包含本发明多肽或其片段的融合蛋白。

本发明的核酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放读码框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的多肽序列中。

本发明的核酸可以是DNA形式或RNA形式，其中DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的，可以是编码链或非编码链。

本发明中编码多肽的核酸可以是包括编码此多肽的核酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的核酸。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。

根据本发明的另一方面提供了一种载体，包含如上所述的核酸。

根据本发明的一些实施方式，所述载体包括但不限于细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒、逆转录病毒或其他载体；优选地，所述载体为细菌质粒。

本发明中含有编码所述多肽的核酸序列的载体可以采用本领域技术人员熟知的方法构建，这些方法包括但不限于体外重组DNA技术、DNA合成技术、体外重组技术等。所述核酸序列可以有效的连接到载体中的适当的启动子上，以指导基因合成。

根据本发明的另一方面提供了一种宿主细胞，包含如上所述的载体，或其基因组中整合有所述的核酸。

根据本发明的一些实施方式，所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。

根据本发明的一些实施方式，所述宿主细胞可以为大肠杆菌、酵母、来源于昆虫及哺乳动物的真核细胞株。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞等。

本发明中重组载体转化入宿主细胞可采用本领域技术人员熟知的常规技术进行。获得的转化子可以用常规的方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白质。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白质沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

根据本发明的另一方面提供了一种上述多肽的制备方法，包括如下步骤：

1)培养如上所述的宿主细胞；

2)从培养物中分离出如上所述的多肽。

根据本发明的另一方面提供了如上所述多肽在制备创伤愈合、抗溃疡药物中的应用。

本发明的分离的多肽有多方面的用途，这些用途包括但不限于：直接作为药物加速创伤愈合；直接作为药物治疗因类似所述多肽功能低下或丧失所致的疾病；用于筛选促进或对抗所述多肽功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激所多肽功能的多肽分子。

本发明还包括对所述多肽的DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于所述多肽基因产物或片段。

本发明的又一方面还提供了一种组合物，包括如上所述的多肽。

本发明人通过研究发现，从美洲大蠊中分离得到的多肽可以安全有效的促进伤口的愈合，本发明分离的多肽可以单独作为活性组分使用，也可以与其他活性组分配合使用。使用本发明组合物时，具体的剂量可以根据给药途径、个体差异等因素进行适当调整。

根据本发明的一些实施方式，所述组合物还包括药用辅料。

本发明所述药用辅料为本领域常规药用载体，可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料；优选地，包括药学上可接受的崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、表面活性剂或防腐剂。

本文所用的术语，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸、多肽或蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸、多肽或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多肽是从美洲大蠊的脱脂提取物中发现的，其中脱脂提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫经灭活、粉碎、过筛，制得美洲大蠊粗粉；

(2)脱脂：将步骤(1)的美洲大蠊粗粉，经有机萃取剂进行提取，超声辅助提取，得脱脂美洲大蠊；

(3)提取：将步骤(2)的脱脂美洲大蠊用醇类溶剂超声提取，再水浴旋转提取，离心过滤，得醇提取液；

(4)减压浓缩：将步骤(3)的醇提取液减压浓缩，得浸膏；即得美洲大蠊的脱脂提取物。

根据本发明的一些实施方式，步骤(2)中的有机萃取剂为正己烷。

根据本发明的一些实施方式，步骤(2)中，提取的温度为50℃～60℃；优选地，所述提取的次数为1～3次；优选地，提取时加入粗粉重量6～10倍量的正己烷；优选地，脱脂过程中使用超声波辅助；优选地功率设置为100～500W，优选300W；时间为1～3h，优选2h。过滤分离滤液和滤渣，其中滤液经减压回收后可重复利用；其中滤渣经烘干去除残余的萃取剂后即为脱脂美洲大蠊。

在已有的研究中，主要使用有机溶剂石油醚对美洲大蠊虫粉进行提前脱脂处理，石油醚的气味较大，且每次所需要的用量更大，脱脂的效率也较低。而本发明使用正己烷脱脂克服了上述问题，并且效率更高。

根据本发明的一些实施方式，步骤(3)中的醇类溶剂为乙醇。

根据本发明的一些实施方式，步骤(3)中，提取的温度为50℃～60℃；优选所述提取的次数为1～5次；所述乙醇的浓度为60％～90％的乙醇水溶液，优选90％乙醇水溶液。

根据本发明的一些实施方式，步骤(3)中，所述醇类溶剂的用量可为本领域内的常规用量；当提取次数为3次时，第一次提取时，加脱脂美洲大蠊重量8～10倍量溶剂；第二次提取时，加脱脂美洲大蠊重量6～8倍量溶剂；第三次提取时，加脱脂美洲大蠊重量4～6倍量溶剂；所述提取的时间为，第一次的提取时间为8～12小时；第二次的提取时间为6～8小时；第三次的提取时间为4～6小时；每次提取到的液相组分合并，得到提取液。优选地，超声功率设置为100～500W，优选300W。使用乙醇进行提取，相比于其他溶剂，效率高，成本低，而且安全。

根据本发明的一些实施方式，步骤(4)中所述减压浓缩可为本领域中常规减压浓缩方法。本发明中，减压浓缩的真空度优选小于-0.06MPa，浓缩的温度优选50℃～60℃，进行减压浓缩得浓缩液；优选将所述的提取液浓缩至相对密度为1.05～1.10时停止浓缩。减压浓缩可快速回收溶剂，减少浓缩时间，同时又不影响提取液中有效成分活性。

本发明人对美洲大蠊的脱脂提取物进行了进一步处理，并通过质谱分析，鉴定和收集成熟肽的肽段，结合对美洲大蠊基因组数据库检索分析，得到本发明的多肽。

其中，进一步处理包括：

(5)脱色：步骤(4)的脱脂美洲大蠊提取物溶解，加入药用活性炭微粉中脱色，自然滤过，过滤除菌后浓缩，冷冻干燥，得到冻干粉；

(6)超滤：将步骤(5)的冻干粉复溶，将溶液超滤后，收集滤液，滤液经过冷冻干燥即得复合多肽粉；

(7)脱盐：将步骤(6)的复合多肽粉溶解，用多肽脱盐柱进行脱盐处理。

根据本发明的一些实施方式，步骤(5)所用的药用活性炭为200目，粉末状，不影响药物活性。

根据本发明的一些实施方式，步骤(7)脱盐，是将复合多肽粉溶解后用C18小柱进行脱盐处理，采用0.1％的三氟乙酸水溶液洗脱样本中的盐等杂质，最后用含有50％乙腈和0.1％的三氟乙酸水溶液将多肽从小柱上少量多次的洗脱下来，冻干备用。

根据本发明的一些实施方式，质谱分析是将步骤(7)脱盐后的复合多肽冻干粉溶解，然后使用SCIEX公司的Triple TOF 5600+进行分析，与质谱仪相结合的液相系统为NANOACQuity(Waters)，包括Symmetry C18柱(规格5μm，180μm×20mm)和BEH130 C18柱(规格1.7μm，100μm×100mm)两部分；使用PEAK软件对进行数据处理和谱图解析。

本发明相比于前期使用的石油醚等有机溶剂，使用正己烷脱脂的效率更高。相比于回流提取等方式，本发明采用了水浴旋转提取的方式，提取温度恒定，溶剂与虫粉的比表接触面积更大，提取效率更高；通过所述的方法制备的脱脂美洲大蠊提取物，有效去除了美洲大蠊提取物中的油脂、多糖、大分子蛋白质等无效成分，富集了美洲大蠊提取物中具有良好抗溃疡、促愈合活性有效成分，所得到的提取物色泽浅、无腥臭味。使用质谱鉴定出的肽段在美洲大蠊基因组能找到对应的基因，合成相应的肽段具有活性成分。

本发明的有益效果：

本发明首次采用质谱分析与基因组数据相结合的方式对美洲大蠊脱脂提取物进行分离和鉴定，并成功发现一个具有有效活性成分的美洲大蠊多肽。该多肽能够快速高效的促进创伤的愈合，具有巨大的应用前景。

附图说明

图1为美洲大蠊脱脂提取物中活性多肽的质谱分析图；

图2为多肽对NIH-3T3细胞划痕修复效果图；

图3为多肽对NIH-3T3细胞划痕愈合效果统计图。

具体实施方式

以下结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；美洲大蠊来自于本实验室所饲养的；细胞购买自美国标准菌库(ATCC)，编号为CRL-1658；正己烷购买自上海生工；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1美洲大蠊脱脂提取物的制备

(1)灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫采用60℃高温杀死，控温在60℃±5℃范围内烘干，粉碎，过12目筛，制得美洲大蠊粗粉；

(2)脱脂：将步骤(1)所得美洲大蠊粗粉，加入8倍体积的正己烷(分析纯)，常温下放入超声装置，设定功率为300W，超声辅助提取约2h，3500rmp/min离心30min，分离上清液和滤渣，上清液转移至旋转蒸发仪中，在真空度小于-0.06MPa，温度60℃的条件下减压浓缩，回收溶剂。滤渣在烘箱中60℃烘干过夜。按以上操作重复提取脱脂3次，沉淀烘干后即得脱脂美洲大蠊；

(3)提取：将步骤(2)所得的脱脂美洲大蠊放入提取罐中，加入90％乙醇提取，第一次提取时，加粗粉重量8倍量溶剂；第二次提取时，加粗粉重量8倍量溶剂；第三次提取时，加粗粉重量4倍量溶剂；所述提取的时间为，第一次的提取时间为8小时；第二次的提取时间为8小时；第三次的提取时间为6小时；其中每次提取时，先用超声提取1h-2h，然后再水浴提取，功率设置为300W，时间为2h，提取方式为60℃水浴旋转提取，旋转速率为200rmp/min；离心过滤去除杂质，合并三次的提取液；

(4)减压浓缩：将步骤(3)所得乙醇提取液在温度50℃，真空度小于-0.06MPa的条件下减压浓缩至相对密度1.05～1.10(60℃测)时，即得脱脂美洲大蠊提取物；

(5)活性炭脱色：将步骤(4)的脱脂美洲大蠊提取物加入超纯水溶解，加入药用活性炭微粉中脱色2h，自然滤过，使用0.22μm滤膜过滤除菌后浓缩，冷冻干燥；

(6)超滤：将步骤(5)的冻干粉复溶，使用移液枪将溶液吸至10kd的超滤管(MF-Millipore)中，12000rpm/min的转速高速离心30min，收集滤液；滤液经过冷冻干燥后即得复合多肽粉。

(7)脱盐：将步骤(6)的复合多肽粉，用含有0.1％三氟乙酸水溶液进行溶解，得到的多肽溶液用C18小柱进行脱盐处理，采用0.1％的三氟乙酸水溶液洗脱样本中的盐等杂质，最后用含有50％乙腈和0.1％的三氟乙酸水溶液将多肽从小柱上少量多次的洗脱下来。

收集溶液并过夜冻干，再用50微升的含有0.1％的甲酸重新溶解以备后续的质谱分析：将上一步溶解好的多肽样本使用SCIEX公司的Triple TOF 5600+进行分析，与质谱仪相结合的液相系统为NANO ACQuity(Waters)，包括Symmetry C18柱(规格5μm,180μm×20mm)和BEH130 C18柱(规格1.7μm，100μm×100mm)两部分。

液-质联用质谱仪对每个样本进行三次重复质谱分析，每次质谱采集时间为2小时。得到的数据采用PEAKS Studio软件并结合生物信息学方法进行分析。经过液质联用质谱分析后，使用PEAK软件对进行数据处理和谱图解析，并将de novo sequencing检测到的肽段序列和数据库搜索得到序列进行比较，可以很好地评估搜库的结果是否理想。鉴定和收集成熟肽的肽段，并结合对美洲大蠊基因组数据库检索，将这些肽段匹配和定位至相应的基因中。每个PSM都可以指示具有生物学活性的唯一肽段，或者它们可以匹配到基因的片段；如图1所示，该质谱图中包含了各种碎片离子信息的质荷比及丰度，根据两碎片离子间的数值差异可以推断其氨基酸的组成。该肽段与美洲大蠊基因组数据库中的理论肽段最匹配，结果可信。

实施例2美洲大蠊脱脂提取物的制备

(1)灭活粉碎：美洲大蠊鲜虫采用60℃高温杀死，控温在60℃±5℃范围内烘干，粉碎，过12目筛，制得美洲大蠊粗粉；

(2)脱脂：将步骤(1)所得美洲大蠊粗粉，加入10倍体积的正己烷(分析纯)，常温下放入超声装置，设定功率为300W，超声辅助提取约2h，3500rmp/min离心30min，分离上清液和滤渣，上清液转移至旋转蒸发仪中，在真空度小于-0.06MPa，温度60℃的条件下减压浓缩，回收溶剂。滤渣在烘箱中60℃烘干过夜。按以上操作重复提取脱脂3次，沉淀烘干后即得脱脂美洲大蠊；

(3)提取：将步骤(2)所得的脱脂美洲大蠊放入提取罐中，加入80％乙醇提取，第一次提取时，加粗粉重量8倍量溶剂；第二次提取时，加粗粉重量8倍量溶剂；第三次提取时，加粗粉重量4倍量溶剂；所述提取的时间为，第一次的提取时间为8小时；第二次的提取时间为8小时；第三次的提取时间为4小时；其中每次提取时，先用超声提取2h，功率设置为300W，然后再60℃水浴旋转提取，旋转速率为200rmp/min；离心过滤去除杂质，合并三次的提取液；

(4)减压浓缩：将步骤(3)所得乙醇提取液在温度50℃，真空度小于-0.06MPa的条件下减压浓缩至相对密度1.05～1.10(60℃测)时，即得脱脂美洲大蠊提取物。

(5)活性炭脱色：将步骤(4)的脱脂美洲大蠊提取物加入超纯水溶解，加入药用活性炭微粉中脱色2h，自然滤过，使用0.22μm滤膜过滤除菌后浓缩，冷冻干燥；

(6)超滤：将步骤(5)的冻干粉复溶，使用移液枪将溶液吸至10kd的超滤管(MF-Millipore)中，12000rpm/min的转速高速离心30min，收集滤液；滤液经过冷冻干燥后即得复合多肽粉。

(7)脱盐：将步骤(6)的复合多肽粉，用含有0.1％三氟乙酸水溶液进行溶解，得到的多肽溶液用C18小柱进行脱盐处理，采用0.1％的三氟乙酸水溶液洗脱样本中的盐等杂质，最后用含有50％乙腈和0.1％的三氟乙酸水溶液将多肽从小柱上少量多次的洗脱下来。

收集溶液并过夜冻干，再用50微升的含有0.1％的甲酸重新溶解以备后续的质谱分析：将上一步溶解好的多肽样本使用SCIEX公司的Triple TOF 5600+进行分析，与质谱仪相结合的液相系统为NANO ACQuity(Waters)，包括Symmetry C18柱(规格5μm,180μmx20mm)和BEH130 C18柱(规格1.7μm，100μmx100mm)两部分。

液-质联用质谱仪对每个样本进行三次重复质谱分析，每次质谱采集时间为2小时。得到的数据采用PEAKS Studio软件并结合生物信息学方法进行分析。经过液质联用质谱分析后，使用PEAK软件对进行数据处理和谱图解析，并将de novo sequencing检测到的肽段序列和数据库搜索得到序列进行比较，可以很好地评估搜库的结果是否理想。鉴定和收集成熟肽的肽段，并结合对美洲大蠊基因组数据库检索，将这些肽段匹配和定位至相应的基因中。每个PSM都可以指示具有生物学活性的唯一肽段，或者它们可以匹配到基因的片段。

实施例3多肽的合成

将美洲大蠊的成熟肽段(H-KPEMDSSGFHGDTFR-OH)送去生物公司合成，多肽纯度为95％以上，合成好后的多肽冻干粉，在双蒸水溶解稀释成以5mg/ml的浓度的母液，并通过0.22μm的无菌装置(MF-Millipore^TM)过滤除杂后，备用。

试验例1多肽在NIH-3T3细胞划痕修复活性检测

哺乳动物NIH-3T3细胞培养在加入10％的胎牛血清，1％青霉素-链霉素的DMEM培养液中，并放于37℃恒温培养箱中培养(Thermo Fisher)，基本每隔2-3天后待细胞密度长满80％-100％，用PBS溶液洗涤两遍，并用胰蛋白酶消化两分钟，最终以1:4的比例稀释培养基作细胞传代。

将细胞以每孔1.5×10⁵个细胞的密度接种在24孔板中，在37℃下孵育48小时达到完全长满培养皿的单层后，用无菌的200μL移液管尖端(Axygen,USA)在孔底中央竖直划痕，并用PBS洗涤两次去除划下的细胞。随后，实验组(即PAE-0.5mg/mL和PAE-1mg/mL)分为不同浓度组，在每组中分别加入1μL，浓度为0.5mg/mL或1m g/mL的多肽溶液(由实施例3制备得到)，空白对照组加入1μL超纯水，每组三孔。用倒置显微镜(Primovert microscope,Zeiss，Germa ny)在加样后的12和24小时拍摄单层细胞划痕愈合的图像，其余时间放回二氧化碳培养箱继续孵育。结果如图2所示，从图中可看到，加入多肽处理的组与对照组相比，无论是12h，还是24h，划痕的面积更小，细胞迁移的速度更快。且低浓度的多肽迁移效果更好

在加样后的12和24小时拍摄单层细胞划痕愈合的图像，使用图像分析软件ImageJ分析计算划痕面积，用划痕后各时间点划痕区域的总面积相对于刚划痕时划痕面积的百分比表示细胞迁移率，即划痕愈合率，对迁移率进行统计分析，判断是否有显著差异。对照组是不做处理的，实验组是加有不同浓度多肽溶液处理，比较划痕愈合率来判断多肽溶液否对细胞的划痕有修复作用，是否能促进细胞迁移。结果如图3所示：实验组相对于对照组对NIH-3T3细胞划痕修复均比较明显(P<0.005)。

本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。

Claims (8)

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为KPEMDSSGFHGDTFR。

2.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸序列为编码如权利要求1所述的多肽的核酸。

3.一种载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求3所述的载体。

5.一种权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，包括：1）培养如权利要求4所述的宿主细胞；2）从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

6.权利要求1所述的多肽在制备创伤愈合药物中的应用。

7.权利要求1所述的多肽在制备抗溃疡药物中的应用。

8.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的多肽、权利要求3所述的载体或权利要求4所述的宿主细胞。

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