CN102526116B - 一种蜂毒的精制方法 - Google Patents
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Abstract
一种蜂毒的精制方法,取蜂毒加5-10倍量的水溶解后高速离心,分离后得到水相;向水相中加入1-3倍体积的丙酮于温度≤-8℃下静置至沉淀完全,分离后向沉淀物中加入丙酮并捣碎,过滤分离,沉淀物挥去丙酮得到蜂毒粗品;粗品用0.08-0.12mol/L醋酸溶液溶解后用葡聚糖凝胶G50层析柱分离纯化,用同浓度的醋酸溶液洗脱,并用紫外检测器在280nm波长下在线检测,收集第三峰的洗脱液,加活性炭,缓慢搅拌,分离后滤液冷冻干燥。本精制蜂毒中,蜂毒素含量≥76%,大分子物质含量<1.5%,可直接加供临床注射用的冻干剂。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种蜂毒的分离纯化方法,具体地说是一种蜂毒的精制方法。
二、背景技术
蜂毒是工蜂腺体分泌出来的一种具有芳香气味的毒液,储存于毒囊中,当工蜂攻击其它物种时由尾部蛰针排出,它是一种复杂的混合物,其化学组成复杂,主要分为多肽,大分子量的酶类,小分子量的胺类等物质,肽类主要包括蜂毒素(约占蜂毒干重的50%),蜂毒明肽,MCD肽,心脏肽,安度肽,组胺肽等,酶类包括55种以上的酶类物质,其中磷脂酶A2(简称PLA2,平均分子量14500)是受蜂蜇之后产生过敏反应的主要物质,胺类包括组织胺、儿茶酚胺等其它活性胺类物质,胺类与受蜂蜇产生疼痛有关。
蜂毒在民间用于医疗保健历史悠久,现代研究证实,蜂毒具有抗炎和镇痛作用,用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎,强直性脊椎炎等风湿性疾病,周围神经炎肌神经痛等疾病有确切的疗效,然而蜂毒中大分子量的酶类物质容易造成过敏,小分子量的胺类物质容易造成疼痛,极大地影响了蜂毒制剂在临床上的推广使用。
CN101088514A公开了一种蜂毒的精制方法,是将粗蜂毒溶于乙醇溶液中去除蜂毒中的蜂胶、蜂蜜等杂质,再采用溶媒萃取方法,得到精制蜂毒。先将粗蜂毒加入95%乙醇制成悬浊液,过滤去除杂质,滤液离心后去除液相,沉淀物加入无水乙醇脱水,再将提出的沉淀物加入水于10±2℃下浸提12-15HR;浸提液用乙醇沉淀,去除乙醇水溶液,沉淀物加入0.15-0.2摩尔的氢氧化铵与正丁醇溶液中萃取,弃除沉淀物,蒸馏萃取液,浓缩物进行冷冻干燥即得到精制蜂毒。
CN1416827A公开了一种蜂毒的提取方法。该发明所述的方法如下:将活体大胡蜂剪去羽翅置于有密封盖的容器内,加入40%以上浓度的乙醇水溶液或者40℃以上的食用酒,使活体大胡蜂完全浸泡于其中,将容器加盖密封,静置至少3天,取其容器内下部的乳白色液体,过滤。
CN101455287A公开了一种蜂毒肽的分离提纯方法,是将粗蜂毒用水浸洗,滤液用乙醇沉淀,沉淀物用氢氧化铵和正丁醇萃取,萃取液以丙酮沉淀,使沉淀物溶于脲的醋酸盐缓冲液A中,在离子交换柱上作洗脱层析,柱下收集溶血活性最强吸收峰V的层析馏分浓缩,浓缩液经葡聚糖凝胶G-10柱脱盐,丙酮沉淀,再溶解、脱盐沉淀处理,沉淀物溶于醋酸盐缓冲液B中,在葡聚糖凝胶G-25柱上以缓冲B液作梯度洗脱,柱下收集吸收峰时层析馏分浓缩、脱盐冷冻干燥即得到电泳级蜂毒肽。
CN1088215A公开了一种快速从粗蜂毒中分离蜂肽的方法,将粗蜂毒溶解在蒸馏水中,使用超滤膜和透析袋对蜂毒进行分离、纯化。
三、发明内容
本发明旨在提供临床注射用的精制蜂毒,所要解决的技术问题是尽可能多地除去蜂毒中的酶和生物胺类。
本精制方法包括蜂毒粗品的制备和蜂毒粗品的纯化,具体步骤如下:
1、溶解:取蜂毒加5-10倍重量的去离子水溶解后高速离心(3000rpm)10-15分钟,倾出上清液,包括棕灰色残渣内的残留物再加去离子水溶解、高速离心后过滤分离,合并水相,备用。高速离心的作用是使油脂状杂质与残渣分离,转移并漂浮在水相的表面。
2、沉淀:向上述水相中加入1-3倍体积的丙酮,于温度≤-8℃条件下静置至沉淀完全(实验表明不少于10小时),倾出上清液,向沉淀物中再加入丙酮并捣碎,过滤分离,沉淀物挥去丙酮便得到蜂毒粗品。
实验表明,要使以蜂毒素为主的肽类沉淀完全(≥99%),丙酮与水溶液的体积比要≥1,取1∶1为佳,这样可节省丙酮用量。
3、纯化:用浓度0.08-0.12mol/L醋酸溶液溶解蜂毒粗品,上葡聚糖凝胶G50层析柱,以0.08-0.12mol/L醋酸溶液洗脱,并用UV-3000紫外检测器在280nm波长下进行在线检测,当第三峰出现时开始收集,至第三峰下降到100mV停止收集。向洗脱液中加入活性炭,缓慢搅拌0.5-1小时,过滤分离,滤液冷冻干燥,得精制蜂毒。
实验表明葡聚糖凝胶G50可有效去除大分子量的PLA2和HAase(透明质酸酶,分子量45000)等酶类蛋白质,又可去除小分子量的胺类物质。活性炭的作用不仅是脱色,同时可有效去除内毒素,活性炭的加入量为洗脱液质量的0.02-0.05%。
蜂毒中大分子量物质约占蜂毒干重的16%左右,通过柱色谱分离,大分子量物质含量<1.5%,蜂毒素含量≥76%(粗品中蜂毒素含量45%左右),本精制蜂毒可直接加工供临床注射用的冻干制剂。
四、附图说明
图1是柱层析时紫外在线检测图谱。
五、具体实施方式
非限定实施例叙述如下:
(一)蜂毒粗品的制备
1、溶解
取蜂毒加入8倍重量的去离子水溶解,高速离心(3000rpm)12分钟,倾出上清液,向残留物中再加去离子水(同第一次加水量)同法操作,,高速离心后过滤分离,合并水相,备用。
2、沉淀:
向上述水相中加入1倍体积的丙酮,于温度-10℃下静置12小时,倾去上清液,向沉淀物中再加入丙酮并捣碎沉淀物,过滤,沉淀物低温挥去丙酮,得蜂毒粗品。
(二)粗品的精制
3、用0.1mol/L醋酸溶液溶解蜂毒粗品,上葡聚糖凝胶G50层析柱[(2.0-10.0cm)×100cm],以0.1mol/L醋酸溶液洗脱,流速5-30mL/min,并用UV-3000紫外检测器在280nm波长下进行在线检测,当第三峰出现时开始收集,至第三峰下降到100mV停止收集,向洗脱液中加入适量活性炭,缓慢搅拌1h,过滤,滤液冷冻干燥,得精制蜂毒。经测定,蜂毒素含量79.56%,大分子物质含量1.29%。
蜂毒素的含量按《中国药典》2010年版一部附录VID规定的高效液相色谱法测定。
大分子物质含量用高效液相色谱法测定,测定条件如下:
对照品:核糖核酸酶A(分子量13700)。由中国药品生物制品检定所提供。
色谱柱:TSK gel G3000pw凝胶色谱柱(7.5mm×300mm)。日本TOSOH。
流动相:三氟醋酸-乙腈-水混合液,混合重量比为0.025∶30∶70,理论板数按核糖核酸酶A峰计不低于1500。
柱温:30℃。
流速:0.7mL/min。
检测波长:214nm。
(三)冻干制剂
取甘露醇40g,加入注射用水使溶解,加活性炭适量,加热至沸15分钟,滤过,滤液冷至室温,加入精制蜂毒0.35g(以蜂毒素计),搅拌,无菌滤过,定量罐装制成1000瓶(规格0.35mg/瓶)或500瓶(规格0.7mg/瓶),冷冻干燥,即得。
Claims (1)
1.一种蜂毒的精制方法,包括蜂毒粗品的制备及其纯化,其特征在于:所述的蜂毒粗品的制备步骤为:
(1)溶解:取蜂毒加5-10倍重量的去离子水溶解后以3000rpm离心10-15分钟,倾出上清液,残留物中再加去离子水溶解、离心后过滤分离,合并水相;
(2)沉淀:向上述水相中加入1倍体积的丙酮于温度≤-8℃下静置不少于10小时,倾出上清液,向沉淀物中加入丙酮并捣碎,过滤分离,沉淀物挥去丙酮便得到蜂毒粗品;
所述的纯化步骤为:
(3)纯化:用浓度0.08-0.12mol/L醋酸溶液溶解上述粗品,上葡聚糖凝胶G50层析柱,以0.08-0.12mol/L醋酸溶液洗脱,并用UV-3000紫外检测器在280nm波长下进行在线检测,当第三峰出现时开始收集,至第三峰下降到100mV停止收集,向洗脱液中加入活性炭,缓慢搅拌0.5-1小时,过滤分离,滤液冷冻干燥;活性炭的加入量为洗脱液质量的0.02-0.05%。
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