CN105543185B - 一种从动物血块提取、纯化sod冻干粉的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种从动物血块提取、纯化SOD冻干粉的生产方法，是将动物血块经破碎后，经过乳化、溶血、沉淀、压滤、超滤、热变性、柱色谱、修饰、丙酮沉淀、冻干等工序，最后得到修饰SOD冻干粉产品。本发明采用的原料上使用凝固血块，而不用加抗凝剂的红血球，一般的提取是先按比例添加一定的抗凝剂而收集未凝固血液，再离心收集红血球，用生理盐水反复离心洗涤红血球，这样费时费力，离心负荷很大，且抗凝剂的比例掌握不好会发生凝血或溶血；而本发明是在收集血液时不加抗凝剂，也不用反复离心收集、洗涤红血球，直接用自然凝固的血块做原料，这样省时省力，也不用离心，适于规模化生产。本发明在沉淀血红蛋白时不用易挥发的乙醇，也不用有毒害的氯仿，而用无机盐，不仅沉淀效果好，又减少了环境污染和对生产人员的身体伤害。

Description

一种从动物血块提取、纯化SOD冻干粉的生产方法
技术领域
本发明涉及生物化学技术领域，具体说是一种从动物血块提取、纯化 SOD冻干粉的生产方法，SOD冻干粉产品应用于食品、化妆品及药品等领域。
背景技术
自由基学说是在生命科学领域中，越来越被人们广泛接受的关于生命体衰老理论的学说，该学说认为自由基是造成生命体老化及诸多疾病的重要原因。据估计80～90%的老化性、退行性疾病都与自由基有关，其中包括癌症、老年痴呆症、帕金森氏症、皮肤色素沉积、白内障、心脏病等，所以清除自由基对维持健康体魄和保持年轻体态至关重要。
而SOD是专一的自由基清除剂。SOD是一种广泛存在于动物、植物和微生物中，具有催化超氧阴离子自由基发生歧化反应的生物酶，其催化的歧化反应式如下：
•O2¯ + •O2¯ + 2H+ → H2O2 + O2
SOD能清除人体细胞内的超氧阴离子自由基（生物垃圾），因而被誉为人体的生物垃圾清道夫，而自由基过多则导致多种疾病，因此人体适时适量补充SOD，就能预防甚至治疗因自由基过多而导致的多种疾病，具有抗氧化、抗辐射、抗癌变、消炎等功能，用于治疗或辅助治疗心脑血管疾病、自身免疫性疾病、血液再灌注损伤、慢性炎症和癌症等，而且可用于日常的抗衰老保健，防治老年性疾病和慢性病等。
提取、纯化SOD冻干粉从上世纪80年代末开始在我国兴起，但到目前为止还没有形成一个较大的产业，固然有市场方面的原因，也有技术方面的不成熟。本发明在前人研究的基础上，突破了几个关键技术点，并在本公司实现了规模化生产。
发明内容
本发明的目的是提供了一种从动物血块提取、纯化SOD冻干粉的生产方法，可进行规模化生产。
本发明通过以下步骤来实现：动物血块经破碎、乳化、溶血、沉淀、压滤、超滤、热变性、柱色谱、修饰、丙酮沉淀、冻干等工序，得到修饰SOD冻干粉产品，其步骤如下：
1）、收集牦牛、黄牛、猪、羊等多种动物在屠宰时的血液，自然凝固后滤去血清得到的新鲜血块，或新鲜血块冷冻储藏后的冷冻血块；
2）、用破碎机将大血块破碎成小血块；
3）、将破碎后的小血块倒入乳化机中乳化15～40分钟；
4）、将乳化后的血液，泵入到1.2～2.0倍血液体积的二级反渗透水中，搅拌30～60分钟，使红血球破膜而溶血，得溶血液；
5）、在常温下，向溶血液中同时加入两种无机盐，使血红蛋白沉淀下来，SOD溶解在悬浊液中；所述的一种无机盐是氯化钠，重量占溶血液体积的1.5～5.0%；另一种无机盐是氯化铜，或硫酸铜，重量占溶血液体积的0.6～1.5%；
6）、将步骤5的悬浊液泵入到压滤缸中，加压过滤得到SOD压滤液；
7）、将SOD压滤液泵入到截留分子量为3000～10000D的中空纤维超滤器中，超滤浓缩，得到SOD浓缩液；
8）、将SOD浓缩液于55～65℃水浴中加热10～30分钟，冷却后离心，去除杂蛋白沉淀，收集SOD热变液；
9）、将SOD热变液上样到预先用平衡液平衡的Sepharose Fast Flow色谱柱中，再用平衡液平衡6～15小时，至柱流出液A280值为0.1以下；再用洗脱液洗脱，收集蓝绿色SOD色谱带的下柱液；所述的平衡液为pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris-HCl缓冲液，所述的洗脱液为含0.1mol/L NaCl的pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris-HCl缓冲液；
10）、把SOD下柱液置于48～55℃的水浴中，用碱溶液调pH值至9.0～9.5，缓慢加入蛋白质修饰剂，反应1.2～1.5小时，冷却后离心，得到修饰SOD液；所述的碱溶液是1 ～4mol/L的氢氧化钠溶液，或1 ～4 mol/L的氢氧化钾溶液，所述的蛋白质修饰剂是肉豆蔻酰氯；
11）、在修饰SOD液中加入1.4～2.0倍体积的冷丙酮，搅拌放置后SOD沉淀下来，再离心收集SOD沉淀；
12）、将SOD沉淀放置于冻干机中，进行真空冷冻干燥，得到修饰SOD冻干粉。
本发明具有以下几个特点：
1、本发明采用的原料上使用凝固血块，而不用加抗凝剂的红血球，一般的提取是先按比例添加一定的抗凝剂而收集未凝固血液，再离心收集红血球，用生理盐水反复离心洗涤红血球，这样费时费力，离心负荷很大，且抗凝剂的比例掌握不好会发生凝血或溶血；而本发明是在收集血液时不加抗凝剂，也不用反复离心收集、洗涤红血球，直接用自然凝固的血块做原料，这样省时省力，也不用离心，适于规模化生产。
2、本发明使用破碎机破碎大血块成小血块，便于下步的乳化，破碎机的产能大，1个班8小时1台普通破碎机就能破碎10吨以上的血块，适于规模化生产。
3、本发明在沉淀血红蛋白时不用易挥发的乙醇，也不用有毒害的氯仿，而用无机盐，不仅沉淀效果好，又减少了环境污染和对生产人员的身体伤害。
4、现有沉淀血红蛋白分离SOD时，一般在此步骤需加热整个溶血液（一罐1吨以上液体），导致能耗大，且传热不均，温度难以控制，SOD活性易损失。本发明在沉淀步骤加入无机盐，无需加热，用压滤缸压滤时分离效果好；仅在超滤浓缩后加热，用于去除杂蛋白，体积已缩小40倍左右（1吨清亮的SOD压滤液超滤浓缩至25L左右），这样能耗很小，温度易控制，SOD活性几乎无损失。
5、本发明在柱色谱时用Sepharose Fast Flow色谱介质，不仅流速快，而且该介质不受pH值、离子强度等因素的影响而膨胀或收缩，易于生产人员的操作。
6、本发明工艺简单，操作方便，获得的SOD比活性达10000 U/mg以上，蛋白含量达95%以上，每公斤血块生产出SOD的总活力达45万U以上，产品质量高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1
1）、收集新鲜黄牛血液，经过滤后得到黄牛血块500公斤；
2）、用破碎机将大血块破碎成小血块；
3）、将破碎后的小血块倒入乳化机中，乳化20分钟；
4）、将乳化后的血液，泵入到750L的电导率为3 us/cm的二级反渗透水中，搅拌40分钟，使红血球破膜而溶血，得溶血液1250L；
5）、在常温下，向溶血液中加入40公斤氯化钠和15公斤氯化铜，边加边搅拌，使血红蛋白沉淀下来，SOD溶解在悬浊液中；
6）、将步骤5的悬浊液泵入到压滤缸中，加压过滤得到SOD压滤液900L；最后压干的血渣可进一步提取氯化血红素；
7）、将SOD压滤液泵入到截留分子量为6000D的中空纤维超滤器中，超滤浓缩，得到SOD浓缩液22L；
8）、将SOD浓缩液于60℃水浴中加热15分钟，冷却后离心，去除杂蛋白沉淀，收集SOD热变液；
9）、将SOD热变液上样到预先用平衡液平衡的Sepharose Fast Flow色谱柱中（30×100cm（直径×高度）），再用pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris-HCl平衡液平衡10小时，至柱流出液A280值为0.1以下；用含0.1mol/L NaCl的pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris-HCl洗脱液洗脱，收集蓝绿色SOD色谱带的下柱液8L；
10）、把SOD下柱液置于50℃的水浴中，用2mol/L的氢氧化钠溶液调pH值至9.2，缓慢加入肉豆蔻酰氯液30ml，同时补加2 mol/L的氢氧化钠溶液，使pH值稳定在9.2左右，反应1.4小时，冷却后离心，得到修饰SOD液8.08L；
11）、在修饰SOD液中加入1.8倍体积的冷丙酮，搅拌放置后SOD沉淀下来，再离心收集SOD沉淀。
12）、将SOD沉淀放入冻干机中，进行真空冷冻干燥，得到修饰SOD冻干粉27克，经检测SOD比活性为1.12万U/mg，蛋白含量96.5%，每公斤血块产出SOD总活力为60.48万U。
实施例2
1）、收集新鲜牦牛血液，经过滤后得到牦牛血块600公斤，冷冻储藏（屠宰旺季时冷藏）；
2）、屠宰淡季时解冻牦牛血块，用破碎机将大血块破碎成小血块；
3）、将破碎后的小血块倒入乳化机中，乳化40分钟；
4）、将乳化后的血液，泵入到1000L的电导率为1 us/cm的二级反渗透水中，搅拌60分钟，使红血球破膜而溶血，得溶血液1600L；
5）、在常温下，向溶血液中加入64公斤氯化钠和20公斤氯化铜，边加边搅拌，使血红蛋白沉淀下来，SOD溶解在悬浊液中；
6）、将步骤5的悬浊液泵入到压滤缸中，加压过滤得到SOD压滤液1200L；最后压干的血渣可进一步提取氯化血红素；
7）、将SOD压滤液泵入到截留分子量为3000D的中空纤维超滤器中，超滤浓缩，得到SOD浓缩液30L；
8）、将SOD浓缩液于65℃水浴中加热20分钟，冷却后离心，去除杂蛋白沉淀，收集SOD热变液；
9）、将SOD热变液上样到预先用平衡液平衡的Sepharose Fast Flow色谱柱中（30×100cm（直径×高度）），再用pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris-HCl平衡液平衡12小时，至柱流出液A280值为0.1以下；用含0.1mol/L NaCl的pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris-HCl洗脱液洗脱，收集蓝绿色SOD色谱带的下柱液12L；
10）、把SOD下柱液置于55℃的水浴中，用1mol/L的氢氧化钾溶液调pH值至9.5，缓慢加入肉豆蔻酰氯液50ml，同时补加1 mol/L的氢氧化钾溶液，使pH值稳定在9.5左右，反应1.5小时，冷却后离心，得到修饰SOD液12.15L；
11）、在修饰SOD液中加入1.4倍体积的冷丙酮，搅拌放置后SOD沉淀下来，再离心收集SOD沉淀。
12）、将SOD沉淀放入冻干机中，进行真空冷冻干燥，得到修饰SOD冻干粉32克，经检测SOD比活性为1.32万U/mg，蛋白含量99.5%，每公斤血块产出SOD总活力为70.4万U。
实施例3
1）、收集新鲜羊血液，经过滤后得到羊血块400公斤；
2）、用破碎机将大血块破碎成小血块；
3）、将破碎后的小血块倒入乳化机中，乳化15分钟；
4）、将乳化后的血液，泵入到800L的电导率为4us/cm的二级反渗透水中，搅拌30分钟，使红血球破膜而溶血，得溶血液1200L；
5）、在常温下，向溶血液中加入42公斤氯化钠和10公斤硫酸铜，边加边搅拌，使血红蛋白沉淀下来，SOD溶解在悬浊液中；
6）、将步骤5的悬浊液泵入到压滤缸中，加压过滤得到SOD压滤液1000L；最后压干的血渣可进一步提取氯化血红素；
7）、将SOD压滤液泵入到截留分子量为10000D的中空纤维超滤器中，超滤浓缩，得到SOD浓缩液25L；
8）、将SOD浓缩液于55℃水浴中加热30分钟，冷却后离心，去除杂蛋白沉淀，收集SOD热变液；
9）、将SOD热变液上样到预先用平衡液平衡的Sepharose Fast Flow色谱柱中（30×100cm（直径×高度）），再用pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris-HCl平衡液平衡7小时，至柱流出液A280值为0.1以下；用含0.1mol/L NaCl的pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris-HCl洗脱液洗脱，收集蓝绿色SOD色谱带的下柱液7L；
10）、把SOD下柱液置于48℃的水浴中，用4mol/L的氢氧化钾溶液调pH值至9.0，缓慢加入肉豆蔻酰氯液24ml，同时补加4 mol/L的氢氧化钾溶液，使pH值稳定在9.0左右，反应1.2小时，冷却后离心，得到修饰SOD液7.05L；
11）、在修饰SOD液中加入2.0倍体积的冷丙酮，搅拌放置后SOD沉淀下来，再离心收集SOD沉淀。
12）、将SOD沉淀放入冻干机中，进行真空冷冻干燥，得到修饰SOD冻干粉18克，SOD比活性为1.04万U/mg，蛋白含量95.3%，每公斤血块产出SOD总活力为46.8万U。

Claims (1)

1.一种从动物血块提取、纯化SOD冻干粉的生产方法，是将动物血块经破碎、乳化、溶血、沉淀、压滤、超滤、热变性、柱色谱、修饰、丙酮沉淀、冻干，得到修饰SOD冻干粉，其步骤如下：
1）、收集牦牛、黄牛、猪、或羊多种动物在屠宰时的血液，自然凝固后滤去血清得到的新鲜血块，或新鲜血块冷冻储藏后的冷冻血块；
2）、用破碎机将大血块破碎成小血块；
3）、将破碎后的小血块倒入乳化机中，乳化15～40分钟；
4）、将乳化后的血液，泵入到1.2～2.0倍血液体积的二级反渗透水中，搅拌30～60分钟，使红血球破膜而溶血，得溶血液；
5）、在常温下，向溶血液中同时加入两种无机盐，使血红蛋白沉淀下来，SOD溶解在悬浊液中；所述的一种无机盐是氯化钠，重量占溶血液体积的1.5～5.0%；另一种无机盐是氯化铜或硫酸铜，重量占溶血液体积的0.6～1.5%；
6）、将步骤5的悬浊液泵入到压滤缸中，加压过滤得到SOD压滤液；
7）、将SOD压滤液泵入到截留分子量为3000～10000D的中空纤维超滤器中，超滤浓缩，得到SOD浓缩液；
8）、将SOD浓缩液于55～65℃水浴中加热10～30分钟，冷却后离心，去除杂蛋白沉淀，收集SOD热变液；
9）、将SOD热变液上样到预先用平衡液平衡的Sepharose Fast Flow色谱柱中，再用平衡液平衡6～15小时，至柱流出液A280值为0.1以下；再用洗脱液洗脱，收集蓝绿色SOD色谱带的下柱液；所述的平衡液为pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris-HCl缓冲液；所述的洗脱液为含0.1mol/L NaCl的pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris-HCl缓冲液；
10）、把SOD下柱液置于48～55℃的水浴中，用碱溶液调pH值至9.0～9.5，缓慢加入蛋白质修饰剂，反应1.2～1.5小时，冷却后离心，得到修饰SOD液；所述的碱溶液是1 ～4mol/L的氢氧化钠溶液，或1 ～4 mol/L的氢氧化钾溶液；所述的蛋白质修饰剂是肉豆蔻酰氯；
11）、在修饰SOD液中加入1.4～2.0倍体积的冷丙酮，搅拌放置后SOD沉淀下来，再离心收集SOD沉淀；
12）、将SOD沉淀放置于冻干机中，进行真空冷冻干燥，得到修饰SOD冻干粉。
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