CN101845089A - 一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法，是将眼镜蛇蛇毒干粉溶解于pH7.520mmol/L的Tris缓冲液中，离心，过0.22μm微孔滤膜后上样到同溶液平衡的CM Sepharose FF层析柱，分别用含氯化钠的平衡缓冲液洗脱，收集目的蛋白以3K超滤膜膜包超滤脱除缓冲液，脱盐后的蛋白溶液按比例加入适量的过氧化氢，静置后用二氧化锰催化降解过氧化氢，再用0.22μm的微孔滤膜过滤去除二氧化锰，即为成品准备冻干，本发明与现有技术方法相比减少了纯化步骤，提高了处理量和得率，适用于规模化生产，且处理后的眼镜蛇蛇毒神经毒素在镇痛效果不变的情况下神经毒性大为降低。

Description

一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法

技术领域

本发明属于生物医药提取技术领域，尤其是涉及一种从眼镜蛇蛇毒中提取神经毒素并通过修饰使其神经毒性的降低方法。

背景技术

眼镜蛇毒是由眼镜蛇的毒腺分泌的一种天然毒蛋白，其化学成分非常复杂，含有多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质，具有广泛的生物学活性。随着现代生物技术的发展，眼镜蛇毒的许多组分已得到分离纯化和序列测定，各种成分广泛应用于生物化学、分子生物学、毒理学和药物学理论研究和临床应用。

自1933年Monaelesser和Taguet首次报道眼镜蛇毒对癌组织压迫神经引起疼痛的病例的显著疗效以来，眼镜蛇毒的镇痛作用得到了深入的研究，其中眼镜蛇毒神经毒素(neurotoxin，NTX)显示了独特的镇痛作用，NTX的镇痛机理与吗啡类似，镇痛效果大于吗啡，持续时间长，无麻醉作用，无成瘾性和耐药性，但起效较吗啡慢；同时NTX还能戒除吗啡毒瘾，所以在癌痛或戒毒等方面具有独特的治疗作用。

原有的眼镜蛇蛇毒神经毒素的制备方法通常采用两步式纯化，分别使用离子交换树脂和分子筛进行粗纯和精纯，步骤较多、生产周期长，并因此导致回收率较低。并且眼镜蛇蛇毒神经毒素虽然具有很好的镇痛效果，但本身也具有相当的神经毒性，使用中会产生安全隐患。

发明内容

本发明的目的在于改进已有技术的不足而提供一种生产周期短、生产效率高、采用一步式阶段洗脱方式来制备眼镜蛇蛇毒神经毒素适于规模化生产的方法，并且通过过氧化氢对神经毒蛋白的氨基酸残基进行弱氧化修饰，在保持其镇痛活性的同时降低其神经毒性。

本发明的目的是这样实现的，一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法，其特点是该方法包括以下步骤：

1)将眼镜蛇蛇毒冻干粉溶于pH7.5，20mmol/L的Tris缓冲液中，10000rpm离心20min，取出后小心倒出上清液。将上清液过0.22μm滤膜；

2)将过膜后的上清液上样到pH7.5，20mmol/L的Tris缓冲液平衡的CM Sepharose FF层析柱，分别用缓冲液中加NaCL浓度为0.1，0.2，0.4M的溶液洗脱，流速10ml/min，收集目的蛋白；

3)用3K分子量的超滤膜膜包将目的蛋白脱除缓冲盐，成为无盐蛋白溶液；

4)根据纯水溶液中神经毒素的浓度加入30％H₂O₂溶液，按照1mg蛋白加入1ml 30％过氧化氢，静置12～48h后用二氧化锰催化降解过氧化氢，再用0.22μm的微孔滤膜过滤去除二氧化锰，即为神经毒素蛋白原液，真空冷冻干燥后保存。

二氧化锰催化降解过氧化氢所使用的高锰酸钾是：取高锰酸钾充分灼烧，且灼烧残留物反复清洗，洗去紫色可溶高锰酸钾和褐色可溶锰酸钾，待洗至溶液澄清时将固体不溶物滤出待用，此为催化降解过氧化氢的新制备二氧化锰。

本发明方法与原有方法相比大大缩短了生产周期，提高了处理量和得率，适用于规模化生产，且处理后的眼镜蛇蛇毒神经毒素安全可靠，具有极高的药用价值。

本发明使用超滤膜膜包有如下特点：1、超滤过程在常温下进行，能耗低，不需加热，无热效应及相态变化，不需加入其它物质即可达到分离、浓缩、纯化即分级等目的，故特别适用于：1)热敏性物质(生物制品、菌体、蛋白质)的浓缩分离。2)极稀溶液的浓缩回收。3)恒体积恒浓度下的脱盐纯化。2、超滤膜耐化学侵蚀，PH适应范围广。3、处理量大，速度快，适合于工业化生产和放大。

采用琼脂糖凝胶介质，有以下特点：1、介质载体为刚性材料，粒度90μm，流速快，结合量大，线速度可达到300-500cm/h，对粗提液处理速度快。2、该介质再生效果好。活性部分洗脱后，可用0.5MNaOH溶液进行在位清洗，洗脱杂质效果好。同时避免了拆柱和再次装柱，节省时间。3、该介质装填不需要特殊设备，效果重现性好，可以按比例放大适合工业化生产。

采用过氧化氢对眼镜蛇神经毒蛋白进行修饰，有操作简单，安全可靠，效果稳定的特点。经过减毒后的眼镜蛇神经毒素经动物实验比为减毒前的眼镜蛇神经毒素神经毒性降低30％-40％。这大大提高了眼镜蛇神经毒素的药用价值和安全性。

本发明通过使用CM-Sepharose FF层析树脂通过一步式层析、阶段式洗脱以及使用流速更快、分辨率更高的层析介质达到了节约生产时间、生产成本，提高了原料处理量，获得高品质、高得率产品的目的。所采用的过氧化氢蛋白质修饰方案具有操作简单，安全可靠，效果稳定的特点，对眼镜蛇蛇毒神经毒素的神经毒性降低效果明显。适用于规模化生产。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例，一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法，该方法包括以下步骤：

(1)处理眼镜蛇蛇毒原料：

将10g眼镜蛇蛇毒冻干粉溶于100ml pH7.5，20mmol/L的Tris缓冲液中，为加速溶解可适当搅拌，注意不要搅起过多的泡沫，充分溶解后的原料溶液10000rpm离心10min，取出后小心倒出上清液，用0.22μm无菌滤膜将其过滤以除去杂质颗粒和细菌；

(2)CM Sepharose FF层析：

过膜后的上清液用蠕动泵以10ml/min的流速上样到pH 7.5，20mmol/L的Tris缓冲液平衡的CM Sepharose FF层析柱(5.0×30cm)，并用平衡缓冲液洗脱完流穿峰，之后的洗脱缓冲液中加入NaCL分别洗脱。加入的NaCL浓度为0.1M，0.2M，0.4M，所有步骤流速均为10ml/min，收集目的蛋白；

(3)制备二氧化锰催化剂：

取灼烧皿一个，置于铁架台上，取高锰酸钾少许，倒入灼烧皿，置于酒精灯上灼烧至颜色由紫色变为褐色，将灼烧残留物反复清洗，洗去紫色可溶高锰酸钾和褐色可溶锰酸钾，待洗至溶液澄清时将固体不溶物滤出待用，此为二氧化锰；

(4)眼镜蛇毒神经毒素修饰：

将目的蛋白用3K超滤膜膜包脱除缓冲盐，使之成为纯水溶液，根据纯水溶液中神经毒素的浓度加入30％过氧化氢溶液，按照1mg蛋白加入1ml 30％过氧化氢，静置24小时，将二氧化锰作为催化剂以每升10g比例加入到神经毒素-过氧化氢溶液中，缓慢搅动至无泡沫冒出，催化过氧化氢降解，将处理后的溶液用0.22μm无菌滤过滤，真空冷冻干燥后既得减毒后的眼镜蛇神经毒素成品510mg。

Claims (2)

1.一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法，其特征是该方法包括以下步骤：

1)将眼镜蛇蛇毒冻干粉溶于pH7.5，20mmol/L的Tris缓冲液中，10000rpm离心20min，取出后小心倒出上清液，将上清液过0.22μm滤膜；

2)将过膜后的上清液上样到pH7.5，20mmol/L的Tris缓冲液平衡的CMSepharose FF层析柱，柱尺寸为5.0×30cm。分别用缓冲液中加NaCL浓度为0.1，0.2，0.4M的溶液洗脱，流速10ml/min，收集目的蛋白。

3)用3K分子量的超滤膜膜包将目的蛋白脱除缓冲盐，成为无盐蛋白溶液；

4)根据纯水溶液中神经毒素的浓度加入30％ H₂O₂溶液，按照1mg蛋白加入1ml 30％过氧化氢，静置0～48h后用二氧化锰催化降解过氧化氢，再用0.22μm的微孔滤膜过滤去除二氧化锰，即为神经毒素蛋白原液，冻干保存。

2.根据权利要求1所述的一种适合规模化生产眼镜蛇蛇毒神经毒素并降低神经毒性的方法，其特征在于二氧化锰催化降解过氧化氢使用的高锰酸钾是：取高锰酸钾充分灼烧，且灼烧残留物反复清洗，洗去紫色可溶高锰酸钾和褐色可溶锰酸钾，待洗至溶液澄清时将固体不溶物滤出待用，此为催化降解过氧化氢的新制备二氧化锰。