JPH05500602A - 微生物学的に生成されたキモシンの回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物学的に生成されたキモシンの回収方法発明の背景 １、発明の分野 本発明は微生物学的に生成されたキモシンの回収に関する。特に、本発明は、キ モシンを生成するために調製された培養微生物から生じる発酵ビール（ｒｅｒｍ ｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｅｅｒ）からキモシンを回収する方法に関する。本発明は さらに、微生物学的に生成されたキモシンの選択的回収およびその後の純化の方 法に関する。

２、技術水準 キモシンはチーズの製造に特に有用な公知の酵素である。

最近まで、商業的に使用されるほとんど全てのキモシンは、子牛の４番目の胃か ら回収されていたが、子羊、ヤギ等の他の哺乳動物の胃からキモシンを回収する こともこれまでに知られている。しかしながら、近年の子牛の生産の減少によっ て、そのようなキモシンの天然源が減っており、それによってキモシンの微生物 による生産にはずみがついた。

このような状況下、最近の特許および特許出願は、遺伝子工学による微生物の発 酵によってキモシンが生成され得ることを開示している。例えば、キモシンを発 現し、分泌するよう遺伝的に変更された糸状菌の発酵によるキモシンの生成が、 米国特許出願箱０７７１６３．２１９号に開示されており、この開示内容は本出 願に引用として取り込まれている。同様に、１９８７年５月１９日に発行の米国 特許第４．６６６．８４７号は、キモシンを発現し、分泌するよう遺伝的に変更 されたＥ。

Ｃ０１１（バクテリア）の発酵によるキモシンの生産、並びにキモシンを発現し 、分泌するよう遺伝的に変更されたＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉ ｓｊａｅ　（酵母）の発酵によるキモシンの生産を開示しており、この開示内容 は本出願に引用されている。

キモシンの微生物学的生産は、キモシンに加えて酵素の発現をももたらすので、 発酵ビールからのキモシンの回収および純化は現存する問題をかかえている。例 えば、キモシンを上記米国出願節０７／１６３，２１９号のようにして生産する と、α−アミラーゼ、酸性ホスファターゼ、レウアミノペプチダーゼ（Ｉｅｕ　 ａｍｉｎｏ　ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）等の酵素か、前記発酵中に同時生成されてし まう。発酵ビール中に上記のような付加的酵素か存在することにより、そのよう なビールからのキモシンの回収および純化にさらなる困難性が生じる。

発酵ビールから酵素を分離するための種々の方法が開示されているが、出願人の 知る限りにおいて、キモシンと共に酵素を含む発酵ビールから選択的に極めて多 量（すなわち分配係数（Ｋ）　＞ｇｓ）のキモシンを回収できることを開示した 引例はない。

例えば、米国特許第４．１４４．１３０号は、細胞から細胞間酵素が遊離されて いった水溶液からそれら細胞間酵素を回収するため、（１）高分子量不置換また は置換ポリアルコール、ポリエーテル、ポリビニルピロリドンまたは多糖類と無 機塩との混合物、（２）前記高分子量ポリマーの２種以上の混合物の使用を開示 している。ポリエチレングリコールと無機塩の混合物を使用すると、所望の細胞 間酵素が上部ポリエチレングリコール層に入り、一方、細胞の残骸（ｃｅｌｌｄ ｅｂｒｉｓ）と他の発酵製品か下部の塩含有層に入る。この引例は、通常の細胞 集団を処理する際にはグリコール層に回収された種々の酵素の分配係数が約０． ３であり、冷凍細胞を水と混合し、解体して酵素を遊離すると前記分配係数か約 ３に上がることを開示している。しかしながら、この引例は単一酵素の選択的回 収ましてや１種以上の酵素を含む発酵ビールからのキモシンの選択的回収を教示 しておらず、示唆もしていない。

同様にして、米国特許第４，７２Ｌ６１３号は、細胞外で生成された酵素（例え ばプロテアーゼ、アミラーゼおよび微生物的レンネット）を、ポリエチレングリ コール、ポリエチレングリコールのアミン誘導体、ポリエチレングリコールのカ ルボキシレート誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール のアミン誘導体、ポリプロピしｌングリコールのカルボキシレート誘導体、ポリ （エチレングリコール）エステル、ポリエチレンイミン、トリメチルアミノ−ポ リエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンおよびそ れらの混合物から成る群より選択されるポリマーと無機塩とを用いて、全発酵ビ ール（ｗｈｏｌｅ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｅｅｒ）から回収する方法を 開示している。この引例の実施例は前記細胞外酵素に対して約８０までの分配係 数を達成することを開示しているが、ポリエチレングリコール／塩混合物からの キモシンの回収並びに１種類以上の酵素を含む発酵ビールからのキモシンの選択 的回収について開示してはいない。

同様に、Ｋｕｌａ等の＋Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ｂ ｙ　Ｌｉｑｕｉｄ−Ｌｉｑｕｉｄ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ−は、液体−液体抽出 による酵素の純化の種々の方法を記載している。開示される種々の方法の中で、 Ｋｕｌａ等は、酵素を含む水溶液にポリエチレングリコール／無機塩混合物を加 えることによって、ポリエチレングリコール相が酵素を含むような２相系か形成 されることを開示している。Ｋｕｌａ等はさらに、１１１ページに、酵素をイオ 〕／交換体に吸着させ、相形酸ポリマーを洗浄し、そして酵素をその後回収する ことによって、酵素から相形酸ポリマー（ポリエチレングリコール）を除去でき ることを開示している。しかしなから、この引例は、ポリエチレングリコール／ 塩混合物を用いるキモシンの回収並びに１種類以上の酵素を含む発酵ビールから のキモシンの選択的回収について開示していない。

一方、米国特許第４．５０８．８２５号は、細胞外プロテアーゼおよび共生酸ア ミラーセを生成できる微生物の発酵中に、ポリエチレングリコールとカチオン性 エビハロヒドリン／ポリアミンコポリマーまたはデキストランポリマーを発酵媒 体に加え、これらポリマーを相分離させてプロテアーゼリッチ相およびアミラー ゼリッチ相を形成することによって、前記細胞外プロテアーゼおよび共生底アミ ラーゼを分離することを開示している。

また、米国特許第４，５９１，５８３号は、蔗糖上の培養媒体からのデキストラ ン−スクラーゼの同時純化および濃縮の方法を開示している。特に、開示された 方法は、２相を形成するためにポリエチレングリコールなどのポリエーテルを加 えることを含む。この２相とは、濃縮および純化デキストラン−スクラーゼ酵素 を含む重デキストランリッチ相と、除去物である汚染酵素活性を含む軽ポリエー テルリッチ相である。

以上より、引用例は、約８５より大のキモシン分配係数を有する２相液体−液体 抽出方法を用いた発酵ビールからの微生物学的に生成されたキモシンの回収を開 示していないことは明らかである。

さらに、引用例は、キモシンと共に発酵酵素を含む（すなわち、はとんどのキモ シンは１つの層から回収され、一方はとんどの他の発酵酵素はもう１つの層から 回収される）発酵ビールからキモシンを選択的に回収することを開示していない 。

一方、微生物学的活性およびその後の純化によるキモシンの工業的または商業的 規模の生産は、液体−液体の２相系におけるキモシンの大分配係数、並びにその ような２相系か使用される際のビールに含まれる他の発酵酵素からのキモシンの 選択的回収によって、大きく促進される。

従って、本発明の目的は、発酵または他の微生物学的活性により生産される酵素 の水性混合物から微生物学的に生成されるキモシンを回収する有効な方法、特に キモシンの商業的規模の回収に有効な方法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、約８５を超えるキモシンの分配係数を有する液体− 液体２相系を用いた微生物学的に生成されるキモシンの回収方法を提供すること である。

本発明のさらにもう１つの目的は、他の酵素を含む発酵ビールに含まれる他のポ リペプチドからのキモシンの選択的回収を可能にする、液体−液体２相系を用い た微生物学的に生成されるキモシンの回収方法を提供することである。

本発明のさらにもう１つの目的は、微生物学的に生成されるキモシンの回収およ び純化の方法を提供することである。

これらおよびその他の目的は、以下に述べる発明の概要、発明の詳細な記述、実 施例および請求の範囲に示されるように、本発明によって達成される。

発明の概要 １つの側面において、本発明は、２相系を形成するために有効量のポリエチレン グリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ）と無機塩を発酵ビールに加え：発酵ビールとポリエチ レングリコールと無機塩との混合物を、キモシンリッチで発酵ポリペプチドプア のポリマー相と、キモシンブアで発酵ポリペプチドリッチの瑞相とに分離させ： そして前記キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリマー相を回収すること がら成る、発酵ポリペプチドを付加的に含む水性発酵ビールから微生物学的に生 成されるキモシンを回収する方法にある。

驚いたことに、この回収方法は、発酵ビールに見出される発酵ポリペプチドから のキモシンの選択的回収をｉＪ能にし、さらにまた、約８５を超え、好ましくは 約１００を超えるキモシン回収の分配係数を与える。

通常、発酵ビールのｐＨは、キモシンが安定であるようなあらゆるｐＨ（すなわ ち約６．５以下）とすることができる。

しかしながら、好ましい実施態様においては、小さいｐＨ（すなわち３以下のｐ Ｈ１好ましくは約２から約２．５までのｐＨ）を発酵ビールに用いると、約３か ら約６．５のｐＨを使用した場合に比べて、キモシンをポリエチレングリコール 相へと分離するためのより大きい分配係数（より大きい選択性）（１０００以上 ）を与えることがわかった。

従って、本発明による好ましい方法は、発酵ポリペプチドを付加的に含む水性発 酵ビールから微生物学的に生成されるキモシンを回収する方法であって、発酵ビ ールのｐＨを約３未満に調整し、次に発酵ビールに有効量のポリエチレングリコ ール（ＰＥＧ）と無機塩とを加えて２相系を形成し、発酵ビール−ポリエチレン グリコール−無機塩混合物を、キモシンリッチで発酵ポリペプチドブアのポリマ ー相とキモシン回収で発酵ポリペプチドリッチの瑞相とに分離させ、そしてキモ シンリッチで発酵ポリペプチトブアのポリマー相を回収することから成る方法に 関する。

本発明のさらなる側面において、ポリエチレングリコール相を、キモシンがイオ ン交換樹脂に結合する条件下で該イオン交換樹脂と接触させることにより、キモ シンがポリエチレングリコール相から分離できることがわかった。これらの条件 下において、ポリエチレングリコールかイオン交換樹脂を通過し、キモシンが該 イオン交換樹脂から回収される。従って、本発明の上記側面による方法は、発酵 ポリペプチドを付加的に含む水性発酵ビールから微生物学的に生成されるキモシ ンを回収および純化する方法であって、ａ）有効量のポリエチレングリコール（ ＰＥＧ）と無機塩を発酵ビールに加えて２相系を形成し、ｂ）発酵ビール−ポリ エチレングリコール−無機塩混合物が、キモシンリッチで発酵ポリペプチドブア のポリエチレングリコール相とキモシンブアで発酵ポリペプチドリッチの瑞相に 分離するのを許容し、 Ｃ）キモシンリッチで発酵ポリペプチドブアのポリエチレングリコール相を回収 し、 ｄ）キモシンがイオン交換樹脂に結合しかつポリエチレングリコールがイオン交 換樹脂を通過する条件下で、キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエチ レングリコール相をイオン交換樹脂と接触させ、そしてｅ）イオン交換樹脂から キモシンを回収することから成る方法に関する。

本発明のこの側面において、そして上記した理由により、ポリエチレングリコー ル／塩を該発酵ビールに加える前に、最初の発酵ビールのｐＨを約３以下に調整 することか好ましい。さらにまた、前記ＰＥＧ相の分離および該ＰＥＧ相とイオ ン交換樹脂との接触の期間を通してｐＨを約３未満に維持することが好ましい。

発明の詳細な記述 種々の分子量のポリエチレングリコールなどのポリマーと他のポリマー（例えば デキストラン）または無機塩との組合せを用いて水溶液から種々の酵素を分離す ることは公知である。しかしなから、本発明は、十分な量のポリエチレングリコ ールと無機塩を発酵ビールに加えて２相系を形成することによって、微生物学的 に生成されるキモシン（特に細胞外で生成されるキモシン）の抽出のための極め て大きい分配係数が達成できるという予期せぬ発見に一部関する。これらの状況 下において、はとんど全てのキモシンかポリエチレングリコール相に分配される 。このことは、ポリエチレングリコール相におけるキモシンの分配係数が約８５ より大、好ましくは約１００より大であることによって示される。

さらに、本発明はまた、ポリエチレングリコールと無機塩の添加による発酵ビー ルからの微生物学的に生成されるキモシンの抽出（回収）か大きく選択的である という予期せぬ発見に関する。すなわち、この抽出工程はキモシンにとって選択 的であり、発酵ビールに見い出される（他の酵素を含む）他のポリペプチドが優 先的にキモシン含有溶液に保持される。この後者の発見は、ポリマーと無機塩の 添加による水溶液からの酵素回収を論じた従来技術は前記水溶液に存在する１つ の酵素を他の酵素から選択的に回収することを教示していない、という事実に鑑 みて、特に驚くべきことである。

しかしながら、本発明を詳しく論する前に、以下の用語を定義してお（。

″微生物学的に生成されるキモシン“とは、天然に生成されるキモシンの酵素活 性を獲得するよう天然に生成されるキモシンに対する十分なアミノ酸の相同性を 有し、かつここに述べる液体−液体２相水性系中における天然に生成されるキモ シンの分配特性を有する微生物学的に生成されるポリペプチドを意味する。微生 物学的に生成されるキモシンは、通常、ホスト微生物（すなわち糸状菌、）＜ク チリア、酵母その他）を培養（発酵）し、キモシンの全であるいは大部分をエン コードする組換えＤＮＡで形質変換され、生成されたポリペプチドか天然に生成 されるキモシンの酵素活性を獲得することにより作り出される。微生物学的に生 成されるキモシンを生成できる適当な形質変換ホスト微生物の開示に関して例え ば米国特許出願第１６３．２１９号および米国特許第４，８６６．８４７号を参 照のこと。

微生物学的に生成されるキモシンはさらに細胞内生成または細胞外生成に分類で きる。より詳細には、細胞内生成酵素は、発酵中にホスト細胞内で生成かつ保持 され、発酵の完了時には（通常細胞を溶解（Ｉｙｓｊｎｇ）することによって） 細胞から遊離しなければならない酵素である。細胞は従来のようにして殺され、 熱を用いて溶解される。例えば、ｌＮｅｇｎｅｒ等の米国特許第４，８０１．９ ８１３号参照のこと。ある種の微生物に有用なもう１つの方法は、細胞を溶解（ ｌｙｓｅ）させる浸透圧を変えることである。例えば、Ａｕｂｅｒｔ等の米国特 許第４，２９９４５８号を参照のこと。細胞を溶解するためのもう１つの従来法 は、細胞壁または膜を分解する酵素を導入することによる方法である。この方法 の例が村山の米国特許第３．８１６．２６０号、小林等の米国特許第３．８９［ １，１９ｇ号、止材等の米国特許第３，９１７，５１０号に開示されている。こ れらの特許の開示内容は本出願に引用として取り込まれている。

細胞外生成酵素は、微生物が細胞壁を横断して移送可能であり、従ってさらなる 処理を細胞に加えずに発酵の完了時に発酵ビール中に見られる酵素である。

“天然に生成されるキモシン”とは、ビールに施されるその後の処理を含む形質 変換ホスト細胞の発酵から回収されるキモシン含有溶液をいう。そのような任意 の処理工程には、例えば、無機塩およびポリエチレングリコールの発酵ビールへ の添加前に発酵ビール中で細胞（微生物）を殺すことか含まれる。微生物を殺す ことは、米国特許出願第０７７３８５．９４５号に記載されるようにして行うの か好ま［７い。

この出願の開示内容は本出願に引用する。さらに、無機塩およびポリエチレング リコールを加える前に発酵ビールから細胞および／または細胞屑（ｃｅｌｌ　ｄ ｅｂｒｉｓ）を除去することが望ましい場合もある。そのような除去は、細胞お よび／または細胞屑を含む固体のほとんどまたは全てを除去する濾過工程によっ て行い得る。同様に、無機塩およびポリエチレングリコールを加える前に発酵ビ ールのｐ＋＋を調整することが望ましい場合もある。また、細胞内生成キモシン にとって、溶解細胞を除去しそしてタンパク質構造の巻き戻し後に本発明のよう にして処理されるキモシンのバルクを含む封入体を回収することは一般的である 。

“発酵ポリペプチドとは、キモシン以外のポリペプチドであって、ポリエチレン グリコールおよび無機塩を加える時点で発酵ビールに含まれるホスト微生物（キ モシンと共に）によって発酵中生成され得るポリペプチドをいう。

そのような発酵ポリペプチドの主な成員は発酵中に共生成される酵素である。例 えば、米国特許出願第０７／１［ｉ３．２］、９号に記載されるようなキモシン の細胞外生成もまた、α−アミラーゼ、酸性ホスファターゼ、レウアミノベブチ ダーゼ（ｌｅｕ　ａｔｎｉｎｏ　ｐｅｐｔｊｄａｓｅ）等の酵素の生成を生じさ せる。これら酵素は発酵の完了時の発酵ビールにみられる。同様に、キモシンが 細胞内で生成される場合、キモシンと共に生成される酵素には、ホスト細胞の発 酵中に生成されるあらゆる細胞外酵素やキモシンを遊離させるために発酵の完了 時にホスト細胞を溶解する際に遊離されたあらゆる細胞内酵素かある。

“発酵副生物″とは、ポリエチレングリコールと無機塩を発酵ビールに加えた時 に発酵ビールに含まれる非ポリペプチド生成物（例えば有機酸、錯カルボッ＼イ ドレート等）をいう。

“ポリエチレングリコール”とは、本発明のようにキモシンを抽出するのに使用 できるあらゆる分子量のポリエチレングリコールをいう。ポリエチレングリコー ルは約４００から約２２．０００の分子量で得られる。本発明で使用するのに好 ましいポリエチレングリコールは約６００から約１２，０００の範囲の分子量を 有する。特に好ましいポリエチレングリコールはＰ　Ｅ　Ｇ　−８０００、すな わち約８０００の分子量を有するポリエチレングリコールである。使用するポリ エチレングリコールの選択は、キモシンを抽出すべき混合物の組成に一部依存し 、プロセスの経済性に一部依存し、その他の要因にも依存する。

“無機塩“とは、本発明のようにしてキモシンを抽出するのに使用できるあらゆ る無機塩をいう。適した無機塩には、例えば、硫酸塩、リン酸塩その他がある。

硫酸塩は好ましく、例えば硫酸す）・リウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニ ウムその他がある。さらに、適した塩の混合物も使用でき、さらにそのような塩 の混合物と塩化ナトリウムなどの塩との組合せも使用できる。塩化ナトリウムな どの塩は、それ自体ではポリエチレングリコールで２相系に分かれないか、適当 な無機塩と組合わせると酵素の分配係数を向上させることが知られている。

“分配係数（Ｋ）”とは、 式　Ｋ−Ｃ，／Ｃｂ （ここて、Ｃ１は上部相の分配コンパウンドの平衡濃度を表わし、Ｃ６は上部相 の分配コンパウンドの平衡濃度を表わす）で定義される。従って、各相の分配コ ンパウンドの量はその分配係数と各相の容積に依存する。すなわち、分配コンパ ウンドか一体的な分配係数を有する（分配コンパウンドか上部相および上部相に おいて等しく分配される）場合、両ト目か同容積の場合のみ両相は同量の分配コ ンパウンドを含む。」一部用か上部相の１０９０の容積を何する場合、分配係数 が一体的であるとすると上部相は１０？ｏの分配コンパウンド（７か含まない。

以上より、上部相の容積か上部相に比べて小さい場合でも上部相て多ユの分配コ ンパウンドを回収できることから分配コンパウンドの分配係数がとても大きいこ とか極めて有益である。このように、本発明においては、大変大きい分配係数の ため、ポリエチレングリコールの使用量を小さくしながらキモシンの回収口を大 変大きくすることかできる。

“等電点（Ｉ’Ｐ）”とは、ポリペプチドか静電的に中性（すなわち、ポリペプ チドか同数のプラスおよびマイナスに帯電した機能体（「ｕｎｃｔｉｏｎａｌ　 １ｔｙ）をＨする）となるｐＨをいう。キモシンの等電点は約４６である。等電 点未満のｐＨにおいて、キモシンは正味正電荷を有し、等電点より大き１、）ｐ ｌ＋において、キモシンは正味負電荷を有する。

“イオン交換樹脂”とは、帯電化合物を静電的に結合する能力を有するタンパク 相容性（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）樹脂状材料をいう。

イオン交換樹脂は公知であり、カチオンおよびアニオン交換樹脂を含む。

本発明の実施に際し、キモシンの溶液を、キモシンかイオン交換樹脂に結合する 条件下で、イオン交換樹脂と接触させる。本発明においてカチオン交換樹脂を使 用するかアニオン交換樹脂を使用するかは、ポリエチレングリコール相のｐｌ＋ 　（すなわち、溶液のｐＨかキモシンの等電点より１−か下か）による。従って 、キモンン含仔溶液を、キモシンかイオン交換樹脂に結合する条件下で、イオン 交換樹脂と接触させるとは、単にキモシンがイオン交換樹脂に結合するよう溶液 のｐＨをその等電点より上か下に調整することをいう。

溶液のｐＨは通常的６．５以下であるか、等電点付近のｐＨ（すなわち、約３６ から約５．０のｐｔ（）はキモシンの正味静電荷が小さくなるので好ましくない 。正味静電荷か小さいと、イオン交換樹脂との効果的な結合かできにくくなる。

サラニ、ポリエチレングリコール相（溶液）を３．０〜５．０のｐ＋＋に維持す る場合、キモシンはより有効な自己分解を生じる。自己分解は、水中よりポリエ チレングリコール中でかなり小さい。とにかく、水性ポリエチレングリコール相 を３．０〜５．０のｐＨに維持すると、自己分解によるキモシン産生量のいく分 かのロスを生じる。従って、カチオン交換樹脂を使用する場合は、溶液のｐＨを 約３．０未満にし、アニオン交換樹脂を使用する場合は、ｐＨを約５．０より大 とすることが好ましい。

上記の理由から、好ましくは、ポリエチレングリコール溶液のｐＨは約３以下、 より好ましくは約３未満、さらに好ましくは約２から約２．５とする。小さいｐ Ｈ値を用いる場合、発酵副生物は容易にイオン交換樹脂を通過し、一方大きいｐ Ｈ値（５以上のｐＨ値）においてアニオン交換樹脂を用いると、発酵副生物のい くらかが不可逆的にアニオン交換樹脂に結合して使用期間を短かくしてしまう。

本発明に用いるのに好ましいカチオン交換樹脂には、例えば、ＩＢＦ　ＳＰ　５ ｐｈｅｒｏｄｅｘ、　Ｐｈａｒｏａｃｉａ　５Ｐ−３ｅｐｈａｄｅｘ。

Ｉｎｄｉｏｎ　５Ｐ−２，ＩＢＦ　５Ｐ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌその他がある。本 発明に用いるのに好ましいアニオン交換樹脂には、例えば、ＩＢＰＱ　５ｐｈｅ ｒｏｄｅｘ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｑ−３ｐｈａｄｅｘ、　Ｉｎｄｉｏｎ　Ｑ −２，１Ｂ［’　Ｑ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　その他がある。

本発明の方法は、微生物学的に生成されるキモシンの回収および／または純化に 有用である。微生物学的に生成されるキモシンを回収および純化する際、全発酵 ビールまたは混合物はその粗形性で使用でき、所望ならば、発酵混合物をまず濾 過してほとんどあるいは全ての固形分を除去した後に液体の濾液を使用してもよ い。

本発明の１つの側面において、発酵ビールに有効量のポリエチレングリコール（ ＰＥＧ）と有効量の無機塩を加えて２相系を形成することにより、微生物学的に 生成されるキモシンを回収する、得られた溶液は放置されてキモシンリッチで発 酵ポリペプチドブアのポリエチレングリコール相とキモシンブアで発酵ポリペプ チドリッチの瑞相とに分離される。次にキモシンリッチで発酵ポリペプチドブア のポリエチレングリコール相が従来の技術によって回収される。

これらの条件下において、前記ポリエチレングリコール相において８５より大、 好ましくは１００より大のキモシンの分配係数か達成されることがわかった。ポ リエチレングリコール抽出は大きいｐＨ値（すなわちｐ＋＋ｅ５以上）でキモシ ンを回収するのに有用であるが、ｐＨ３未満でキモシンを回収するのにより有効 である。そのような小さいｐＨ値において、１０００あるいはそれを超えるまで の分配係数が達成され得る。大きい分配係数は特に好ましい。と言うのは、大き い分配係数により、発酵ビールからのキモシンの所望の分離を達成するのに少量 のポリエチレングリコールで済み、次の段階としてポリエチレングリコールから のキモシンの分離が促進される（すなわち、分離すべきポリエチレングリコール が少なくて済む）からである。

１回の抽出の結果、ポリエチレングリコールは発酵ビールに元から存在する全キ モシンの９５％以上を含み得ると共に、発酵ビールからの発酵ポリペプチドまた は発酵副生物をあったとしてもほとんどない程度に含むのみとなる。このように 、発酵ビールに含まれる微生物学的に生成されるキモシンのほぼ全部を回収する 手段を提供するのみならず、本発明はまた、発酵ビールからのキモシンの選択的 回収をも提供する。キモシン回収のこの選択性は、発酵ビールからキモシンを回 収することを可能にするのみならす、発酵中に共生成された発酵副生物および発 酵ポリペプチドのほとんどからキモシンを分離することを可能にする。このよう に、本発明によるキモシンの回収は、抽出前、すなわち発酵ビール中における発 酵ポリペプチドおよび発酵副生物によるキモシンの汚染に比べてそれらによるキ モシンの汚染が約７５９０以上少ない（好ましくは約９００６以１少ない）ポリ エチレングリコールを目を与える。

本発明のもう１つの側面において、抽出されたキモシンを含むポリエチレングリ コール相か他の相から分離され、このポリエチレングリコール相が、キモシンが イオン交換樹脂に結合するようなｐｉｌに調整しながら、イオン交換樹脂と接触 される。これらの条件下でポリエチレングリコール□は帯電していないので、ポ リエチレングリコールはイオン交換樹脂を通過し、ポリエチレングリコールから のキモシンの純化か達成される。このように、抽出されたキモシンを含む単離し たポリエチレングリコール和か、キモシンがイオン交換樹脂に結合する条件下で 、イオン交換樹脂と接触されると、略合でのキモシンかポリエチレングリコール から出て来てイオン交換樹脂に結合し、ポリエチレングリコールはイオン交換樹 脂カラムを通過する。最初の接触後、好ましくはイオン交換樹脂からキモシンを 除去せずに、残るポリエチレングリコールを除去するため、イオン交換樹脂は水 または水と塩で洗浄される。次に、キモシンは、キモシンをイオン交換樹脂から 除去するｐ）Ｉに維持された緩衝剤と塩溶液を用いて、カラムから溶離される。

キモシン回収の高選択性により、イオン交換樹脂の勾配溶離または段階的溶離を 用いる必要かない。と言うのは、ポリエチレングリコール相てイオン交換樹脂と 結合し、その後イオン交換樹脂から遊離されるほぼ唯一の酵素または物質はキモ シンだからである。従って、塩溶液を用い、（もちろん、カチオン交換樹脂を使 うかアニオン交換樹脂を使うかによって）　ｐｉｌを上げるか下げるかしてイオ ン交換樹脂に結合したキモシン全部を１ハツチで溶離させるワンバルク工程でキ モシンを溶離てきる。好ましくは、溶離の速度または程度を援助するため、ある いは、ある場合（すなわちアニオン交換樹脂を用いて）イオン交換樹脂からのキ モシンの溶離を行わせるため、溶離溶液に塩を加える。好ましくは、溶離溶液と 共に塩か使用される。と言うのは、キモシンは通常塩溶液の形態で販売されてお り、従ってこの段階でキモシンに塩を取り込むことは好都合である。

プロセス全体を通して大きいｐＨ（約６．５までのｐＨ）か使用できるか、発酵 ビールからキモシンを抽出する際のポリエチレングリコール／無機塩混合物の効 率、よってプロセスの効率は、抽出工程全体を通して小さいｐｉｌが保たれた場 合程高くはない。従って、プロセス全体の効率を高めるため、小さいｐｉｌ、よ ってカチオン交換樹脂を使用するのか好ましい。

約３以下のｐＨてポリエチレングリコール抽出を行い、分離されたポリエチレン グリコール相をｐｉｌを小さく保ちなからカチオン交換樹脂と接触させることに よって本発明の上記好ましい側面を組合わせると、１回のポリエチレンクリコー ル抽出およびイオン交換樹脂との１回の（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｓｓ）接触で、最 初の発酵ビールに存在していた全キモシンの９０〜９５％を回収できることかわ かった。

一方、ポリエチレングリコール抽圧工程に大きいｐＨを用い、さらにキモシンの 等電点より大きいｐＨに維持しながらアニオン交換樹脂を使用しても、許容でき る結果か得られる。しかしながら、その場合には、不可逆的に結合した発酵副生 物の蓄積によってアニオン交換樹脂の耐用年数は減じられる。キモシンを抽出す るのに大きいｐｉｌを使用する場合、前述した問題は、ポリエチレングリコール 抽出物のｐｉｌをキモシンの等電点より小さくシ（好ましくは約３．６以丁、よ り好ましくは約３以下）、次にキモシンをカチオン交換樹脂と接触させることに よって回避できる。

前述したポリエチレングリコール／無機塩混合物を用いることによるキモシン回 収の高い効率に加えて、ポリエチレングリコール中のキモシンの溶解度か大変高 くてキモシンか水性ト目からポリエチレングリコール相に急速に移動することが わかった。ポリエチレングリコール相へのキモシンの抽出に８要な時間は通常大 変短いので、それは重要なプロセス設計ファクターではない。従って、この方法 は大変有効で実施に際して経済的であり、商業生産へと容易にスケールアップさ れる。

明らかなように、ｐ旧二関係なく、本発明の方法は、水性混合物からより疎水性 のポリエチレングリコール相へのキモシンの移動を伴う。これは、少なくとも一 部は、非ポリエチレングリコール柑の塩濃度によって促進される。小さい分子量 のポリエチレングリコールを使用すると、ポリエチレングリコールは疎水性か小 さくなり、非ポリエチレングリコール相中の高い塩濃度か必要となって、実施の コストを上げる。大きい分子量でより疎水性のポリエチレングリコールを使用す ると、より少ない塩で済むが、高分子量ポリエチレングリコールの高粘度のため に分離速度が小さくなる。このように、本発明の方法は、所望のポリエチレング リコール分子量、塩濃度そして所望の経済性を与える他のパラメータを選択する ことにより、どのような特定のオペレーションにも最適化できる。１つの目的は 、ポリエチレングリコール相へのキモシンの移動に必要な時間を最小にすること であるか、もう１つの目的はポリエチレングリコール相にほとんと全てのキモシ ンを移動させるのに用いられる塩の二を最小にすることである。非ポリエチレン グリコール相中の塩濃度は２０ｖｔ％以上にもすることかできるか、通常適切な ポリエチレングリコールと共に用いて約１５％未満とする。例えば、Ｐ　Ｅ　Ｇ −８０００と共に用いて約１０〜１３％の硫酸ナトリウムが適当である。一方、 最少無機塩濃度は、ポリエチレングリコールによって２相系を形成するのに必要 な塩の濃度によって決定される。しかしながら、好ましい実施態様において、無 機塩濃度は、発酵ビールの容積を基準にして約８５から約２０の対容積重量％（ ｗｅｉｇｈｔｔｏ　ｖｏｌｕｍｅ　ｐｅｒｃｅｎｔ）である。

また、好ましくは、用いられるポリエチレングリコール濃度は、発酵ビールの容 積を基準にして約２０対容積重二％未満、より好ましくは約１５対容積重二％未 満である。経済性および後の分離の容易性の点から、ポリエチレングリコールは できる限り少なく使用するのか好ましい。使用されるポリエチレングリコールお よび無機塩の正確な濃度は、当業者によって容易に決定（７得る。

キモシンがイオン交換樹脂と結合した後、イオン交換樹脂を通過したポリエチレ ングリコール相を集め、そして活性炭などの化学種で処理して付加的不純物を除 去するかまたは集めたポリエチレングリコ・−ル相を直接出発材料の他のバッチ に加えることにより、ポリエチレングリコール相は回収されそして再使用され得 る。

同様に、イオン交換樹脂は、適切なｐＨに調整された水溶液でイオン交換樹脂を 洗浄することにより、キモシンを含むポリエチレングリコールの次のバッチに使 用するため再生できる。例えば、カチオン交換樹脂を使用する場合、ｐＨを約２ にするのに十分な硫酸を含む水溶液で洗浄することにより該カチオ〉・交換樹脂 は再生できる。

ポリエチレングリコールのリサイクリングとイオン交換樹脂の再使用を可能にす る本発明のＬ記側面により、本発明の方法は、キモシン（特に微生物学的に生成 されるキモシン）の工業的量の純化のための有効な商業的および工業的オペレー ションに特に有用となる。

本発明について概要を述べてきたか、以下の実施例に示される実施態様を参照す ることにより、本発明がより明確に理解されよう。しかしながら、本発明の範囲 は添付の請求の範囲によって決定されるものであり、以下の実施例は、本発明か 実施できる特定の様態の単なる例示に過きない。

本実施例は、水性２相ポリエチレングリコール抽出とそれに続くイオン交換樹脂 との接触を用いて食品グレートキモシンを生産するキモシン回収方法を記載する 。キモシンはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　Ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｊ の発酵から回収される。

プロセスは、３０００１　発酵槽と約２５００１　のブロスノ＼−ベスト容積（ ｂｒｏｔｈ　ｈａｒｖｅｓｔ　ｖｏｌｕｌｌ＋ｅ）で記載する。発酵か完了する と、硫酸および酢酸の添加によりｐＨを２．０〜２，５に調整することにより、 ブロス（ｂｒｏｔｈ）を不活性化する（米ｌ特許出願第０７／３８５，９４５号 、　Ｌａｖｌｉｓ等により１９８９年６月１３日出願（開示内容は本出願に引用 ）をり照のこと）。この不活性化状態を１時間、発酵温度において空気流れ中で 保持する。この不活性化は、汚染物をこわすために十分な実行可能な細胞減少（ ｖｉａｂｌｅ　ｃｅｌｌ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を達成する。

不活性化の後に、ｐｌ＋を２０〜２．５に維持する。不活性化は、約１２５ｋｇ の硫酸と２５ｋｇの酢酸を必要とする。

Ｐ　Ｅ　Ｇ　８０００／硫酸ナトリウム系を用いてｐＨ２，０〜２．５において 水で３×に稀釈し、その後、４％重量／容積のＰＥＧ３０００　（７５ｋｇ）と １０５％重量／容積の無水硫酸ナトリウムを加えることにより、ブロスを抽出す る。ＰＥＧ／塩系とブロスを混合すると、短時間でキモシンかＰＥＧ相に抽出さ れる。この２相混合物を、抽出遠心機を用いて分離する。

キモシンリッチの軽ＰＥＧ相をさらなる処理のために集める。このプロセスを用 いてＰＥＧ抽出のために２５００１　のブロスを約７５００１　に稀釈し、約７ ００１のＰＥＧ柑抽出物を得る。

この抽出物は脱イオン水て３×に稀釈され、イオン交換工程の前にセルロース　 パッドを通して濾過される。濾過された抽出物を、４０〜１００ミクロンの粒径 を有するＩＢＦＳｐｈｅｒｏｄｅｘ　ＳＰカチオン交換樹脂の１．０１カラムに 通す。充填したカラムを、ｐＨ２の３０１６％ＮａＣｊ７溶液で洗浄する。

このカラムをｐＨ６，０において５０ｍＭリン酸塩緩衝剤と２ＭＮａＣｆ１で溶 離する。イオン交換樹脂の能力は樹脂１−当り約６０ｇのキモシンまでである。

キモシンを含む溶離画分を次の処理のために集める。カラムは、硫酸でｐ）１２ に調整された水で洗浄することによって再使用のため再生される。

溶離されたキモシン溶液は商業的食品グレード使用のため１７９６ＮａＣΩとさ れるか、所望ならば他の目的用に処理される。

実施例２ 本実施例は、本発明の方法により得られる、ＰＥＧ相へのキモシンの高分配を示 すものである。実施例１と同じ発酵ブロスを用いて同しように不活性化し、以下 の抽出を、全ブロス（サンプル］）および回転真空ドラムフィルターからの全ブ ロスの濾液（サンプル２および３）に対して行った。３つのサンプル全てを処理 のためｐｌ＋２に維持し、５％重量／容積のＰ　Ｅ　Ｇ　８０００および１０％ 重量／容積の硫酸ナトリウムて抽圧した。サンプル１および２をボトル遠心機（ ＲＣ３Ｂ）で相分離し、サンプル３を５Ａ−１連続実験遠心機で分離した。

容　積　（活性）　全キモシン　回　収金ブロスの抽出 粗供給物　１０　３０　３００ 処理済供給物　１５　１３　１９５ ＰＥＧ棺　１．．７　２０６　３５０　１１７残り　１３　１　、５　１−９　 ５ マスバランス＝１２２ ａ液の抽出 粗供給物　１４　１．３．７　１．９２ＰＥＧ相　３．３　４９　１６４　８５ 残り　１１．．３　０．７８　９　５ マスバランス−９０ に−６２ 容　積　（活性）　全キモシン　回　収（ρ）　（ＣＨＵ＃　）　（ＣＨｔｌ） 　（％）サンプル３： ａｔ＆の抽出 粗供給物　４３０　７．１６　３０７８ＰＥＧ相　６２　５２．３　３１２７　 １０４残り　３８５　０．２４　９６　３ マスバランス−１０７ に−２０１ （ＣＩ−１１１−Ｃｈｒｉｓ、　）Ｉａｎｓｅｎ単位−！：ｌ　ＣＨＵ／ｍｌ　 、以下の条件下基　体＋１１０ｇの低温スプレー乾燥、スキムミルク粉末をＩＣ ＩＣｌ０ｎ＋２の０．０５％塩化カルシウムに懸濁させる。このミルクを室温で ３０分間撹拌し、そしてさらに３０分間放置する。このミルクは４〜２５℃の範 囲の温度で３時間以下の期間貯蔵しなければならない。

温　度：恒温水浴中で３２±０．２℃ 酵素添加：　０．５　ｍｌの酵素溶液を２５ｍ１の戻したスキムミルクに加え、 稀釈して３８０〜５００秒の凝固時間を与える。

（４１０〜４６０の凝固時間を与える）ある値の測定に用いた方法は曖昧であっ ておよその値を与えるものであるため、上記マスバランス（ｍａｓｓ　ｂａｌａ ｎｃｅ）は１００％ではない。しかしながら、上記試験は、試験方法の実験誤差 を許容する本発明によって達成されるキモシンの相対分配を表わしている。

実施例３ 本実施例では、脱イオン水で稀釈し濾過した実施例１と類似のＰＥＧ相を、Ｉ） Ｈ−２の脱イオン水中で平衡させられた各樹脂１ｍｌのカラムに通した。流れ速 度は１．０ｍｌ／分であり、ｐＨ−２，０の脱イオン水て洗浄した。ｐＨ−５， ８、２ＭＮａＣｊ７．５０ｍＭリン酸ナトリウム（Ｐｉ）で溶離した。

樹脂： ＩＢＦ　ＳＰ−円ＩＡＲＭＡｃＩＡ　ＩＮＤＩＯＮ　ＩＢＦ　５Ｐ−８ＰＨＥＲ ＯＤＥＸ　５Ｐ−３ＥＰＨＡ、　５Ｐ−２ＴＲｌ５ＡＣＲＹＬ稀釈　稀釈　稀釈 　稀釈 １：２１＋４１：２１・４Ｌ：２１：４１．：２１＝４充　填（ｍｇｓ） ３４．３　３４，３　３４．３　３４Ｊ　３４．３　３４，３　３４．３　１７ ．Ｓ未結合（ｍｇｓ） ９．８　３．８２　２Ｂ、５　０．３１２３４ｙ８　１７．６　２７．３　０． ３３Ｂ溶　離（ｍｇｓ） ２Ｂ、５　２６　８．８４　２１．２　０．３２　１．０５　１０．ｆｌ　Ｉア 、３マスバランス（％） １０１３　８７　１０３　８３　１０２　５４　１１．１　１００実施例４ 本実施例は、多段階溶離を以下のように行った以外は実施例３と同じである。す なわち、　６７０ｍ１の５Ｐ−３ｐｈｅｒｏｄｅｘ樹脂；充填および溶離＠　４ ５０ｍ１．分：１．：４ＰＥＧ抽出物の稀釈ｐＨ−２，０充填（ｌｏａｄ　１： ４　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｏｒＰＥＧ　ＥｘｔｒａｃｔｐＨ−２，０）　＋脱イｆ ンＨ２０ｐＨ２，０，２Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＮ　Ｉ）ｔ（２，０で洗浄；２Ｍ　Ｎａ ＣＩ、２００ｄ　Ｐ　ｉ、　ｐＨ５，８で溶離。

＃　記　述　容積（！：ｌ）　ＣＨＩ／Ω　ＣＨＵｌ　開始　２４０　１］、、 ０７２６５８．８２　（空隙）　１　１７０　０．８９　１１７．３３　（空隙 ）２６０　７．２１　４３２．８４　脱イオン水洗浄　２．５　０　０ ５　ＮａＣｆＩ洗浄　７．４　４．８９　３１１ｉ、１８１１ｉ６　溶離＃１　 １　１３４７　１３４７７　溶離＃２　１　９２４　９２４ ８　溶離＃３　１　２１４　２１４ ９　溶離＃４　１　１０８１０８ １０　溶離＄５　１　２５．６　２５．６１１　溶離＃６　１　１３．８　１３ ．８マスバランス゛　Ｌ２１．１４ 収率（結合物の％）　：　１２７．１３能力（ＭＧ／ＭＬ）　：　５１．０８ 実施例５ 本実施例は、８６０ｍ１のＰＥＧ抽出物を１％′″Ｎｕｃｈａｒ　ＳＡ−木炭で ３０分間処理し、濾過し、に３に稀釈し、次に３．２（７）の床法を有する２、 ５ｍｌの樹脂のカラムに供給した以外は実施例４と同しである。結果は以下の通 りであった。

＃　記述　容積（１）■／１　■Ｓ １　開始　２．８００　７５　１９５ ２　（空　隙）　２．６り０　２２．５　５８．５３　脱イオン水　２０　１５ ．７　０．３１４４　塩　３０　１３７　４．１１ ５　複合物　３６　３．６６７　１３２．０（２８０ＣＨＬＩ／ｍｌ） ３２ｇ （結合の収率）：　〜□（１００）　−９６，７％２．５ｍｌ 実施例６ 実施例２の抽出手順と同様であるが、約５，８のｐ＋＋を使用して、下記の酵素 を水溶液から液体−液体２相系のポリエチレングリコール相に抽出して以下の結 果を得た（純粋酵素を使用）。

酸　素　タンパク　活　性　分配係数 ＜ｆｆ１ｇ／　ｍｌ　）　ＣＨＩＪ／　ｍｌｌ子牛モモシン　１．７　２８　８ ７ 牛ベプンン　１．　、９　３　］−３１、５豚ペプシン　２．３　２９．７　１ ．４５Ｅ、ｐａｒａｓｉｔｉｃａ Ｍ、ｍ１ｅｈｅｉ この実験をくり返したが、今度はｐＨを２〜２．５にして以下の結果を得た。

酸　素　タンパク　活　性　分配係数 （ｍｇ／ｍｌ）　Ｃｌ４Ｕ／ｍｌ 子牛キモシン　１．２　８９　＞９４３牛ペプシン　ＩＪ　５０　＞４８２ 豚ペブンン　１．．８　２３．７　＞２０８Ｅ、ｐａｒａｓｉＮｃａ Ｍ、ｍ１ｅｈｅｊ 上記結果は、キモシンが優れた分配係数（すなわち、ｐ）１５８あるいは２〜２ ，５て約８５より大）を与え、一方、牛ペプシンおよび豚ペプシンは小さいｐＨ でのみ優れた分配係数を与えることを示している。しかしなから、牛ペプシンも 豚ペプシンも発酵ビールにみられるポリペプチドではない。

一方、上記データはまた、微生物レンネット（すなわち、Ｅ、　ｐａｒａｓｉｔ ｉｃａアスパラギン酸プロテアーゼ（ａｓｐａｒｔｉｃｐｒｏｔｅａｓｅ）およ びＭ、　ｍ１ｅｈｅｉアスパラギン酸プロテアーゼ）か試験された小さいｐ）Ｉ および大きいｐｌ＋で大きな分配係数を有しないことを示している。

実施例７ 次の実施例は、Ａｓｐｅｒｇｊｌｌｕｓ　Ｎｌｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒ ｉの発酵ビールにみられるグルコアミラーセ（ＣＡＭ）、α−アミラーゼ、酸性 ホスファターゼ、レウアミノペプチダーセアミラーゼ（ｌｅｕ　ａｍｉｎｏ　ｐ ｅｐｔｊｄａｓｅ　ａＩ［１ｙｌａｓｅ）　、そしてキモシンについて、ｐＨ２ 、５と５５での分配係数の直接比較に関する。下記の例外を除いて、抽出は、実 施例２と同様に行っサンプル　開始（濃度）　ＣＨＤ／ｍｌ　分配係数１）！＋ ２．５“細胞なし　７９８ ｐＨ５，５ｗ４胞なし　５．９　９２ ｐｎ　２．５　”細胞　６．３　９８ ｐＨ５，５°細胞　５．９　８８ α−アミラーゼ ｐＨ２，５“細胞なし　１９．４［１００に近いｐＨ５，５”細胞なし　１９． ４００　０１．ｍ近いｐＨ２，５ｂ細胞　１９．４００　０　＋、：近いｐＨ５ ，５°細胞　１９．４００　０　＋、：近いｐ１４２．５　”細胞なし　３，７ ７７．５　０ｉ：近いｐＨ５，５’細胞なし　３．７７７．５　０．ＱＱ１４５ ＩｐＨ２，５”ＭＥ胞　３．７７７．５　０．０ｆｌ１９Ｈｐ８５．５　’細胞 　３．７７７．５　０．（］（Ｈ］９８［）ｐｌ＋　２．５　”細胞なり、　５ ９４　０１．：近いｐ）１５．５′細胞なし　５９４　０に近いｐ＋＋　２．５ 　ｂ細胞　５９４　０！：近いｐ＋＋　５．５　ｃ細胞　５９４ｏに近いｐＨ２ ，５“細胞なし　１．６３９　０に近い１）８５．５　”細胞なし　１，６３９ 　０．０００１８２ｐＨ２，５１′細胞　１．８３９　０１：近いｐｏｓ、ｓ° 細胞　１．［ｉ３９　０　’：近いａ−まず細胞を殺すことなく細胞を除去する ために遠心分離した発酵ビール。

ｂ−遠心分離していない発酵ビールで細胞はまた生きているもの。

Ｃ＝遠心分離していない発酵ビールで細胞はまだ生きているもの。

ｄ−マイクログラム　グルコース７ｍｌ７分で表示した開始濃度。開始濃度（全 ての酵素）はｐＨ５、５で測定した。

上記データは、キモシンかポリエチレングリコール相に分配され、発酵ビールの 他の酵素はポリエチレングリコール相に分配されないことを示している。このデ ータは、発酵ポリペプチドの存在下で、キモシンかポリエチレングリコール相に 選択的に分配されることを立証している。

実施例８ ｐＨ５，８のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　Ｎｉｇｅｒ　ｖａｒ、　ａｗａｍｏｒｉ の１ｇアリコートをＲＣ−３Ｂ遠心機（Ｓｏｒｖａｌｌ）で約５０００Ｘ　ｇに て約１５分間遠心分離して細胞（殺さずに）を除去した。得られた発酵ブロス（ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｂｒｏｔｈ）を約３７°Ｃにあたためた。

この溶液に、硫酸ナトリウム（１０，５対容積重量％）とＰＥＧ３０００　（４ 対容積重量％）を加えた。この溶液を成分が溶解するまで混合させた。次にこの 溶液を５０００Ｘ　ｇの遠心分離に約１５分間（遠心機で）供し、得られた相の 分離を促進させた。キモシンリッチポリエチレングリコール相（上部相）を塩リ ッチ相（上部相）から、バースタルティックポンプ（ｐｅｒｓｔａｌｔｉｃ　ｐ ｕｍｐ）を用いて上部相を除去することにより、分離した。上部相の半分（４５ ｍｌ）を蒸留水で１＝３に稀釈し、５０１ＩＩＭリン酸ナトリウムＩ）Ｈ５，Ｉ ｌｌで平衡させた２、５ｍｌ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｑ−８ｅｐｈａｒｏｓｅカ ラムに充填した。このカラムを同じ緩衝剤の１４カラム容積で洗浄した。キモシ ンを５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ５，８，２Ｍ　Ｎ　ａ　（１７で溶離した 。

溶離剤の容積は４５ｍ１であった。結果は以下の通りである。

容積　活性全キモシン回収 （ｆｆ　）　（ＣＨＵ／ｍ１．）　（％）（粗ブロス）　ｌ　１１．［１１１， ６００１００抽出物　０．０９２５　１０２．９　９，７７５″　８４ラフイネ ート　０．９２５　０．５３　４９０　４Ｑ−ｓｅｐｈ　、空隙　０．１．０１ 　１．５４　３Ｑ−ｓｅｐｈ、溶離液　０．０４５　７５　３．３７５　６９’ 全回収　５８ マスバランス　６９ 分配係数（Ｋ）　約１９０１ ｅ−前述したように、抽出物の半分のみしか使用しなかった。つまり、キモシン の半分のみ（９７７５／　２または４８８７ＣＨＵ）をアニオン交換樹脂に施し た。

ｆ−抽出物にみつかったキモシンの量と比較して６９％回収が収率である。

ｇ−約２００以上の分配係数は、検定限度のために正確に測定するのか困難であ る。すなわち、分配係数は上部相のキモシンの濃度を上部相のキモシンの濃度で 割った比であるため、そしてさらに上部相のキモシンの量は通常大変少ないため 、この上部相のキモシンの濃度の小さい変化か分配係数の大きな振れを生じさせ る。さらに、検定原理により決定される濃度は特に大変小さい濃度において変動 にさらされる。

上述した手段に従うと、実質的に純粋なキモシンが回収される。すなわち、キモ シンは少なくとも約９０ｖｔ％の純度を有し、好ましくは少なくとも約９５ｗｔ ％の純度を有し、不純物を除くためのさらなる重大な処理を行うことなく商業的 使用のために調製できる。商業的キモシン生成物は通常、１ガロン当り約５ｇま たは１１キモシン当り約１．５ｇに稀・釈する。塩（通常ＮａＣΩ）ａ度は、通 常約１８％までにされ、防腐剤（例えば安息香酸ナトリウムのような）を加える 。食品グレード使用を意図した最終濃縮生成物は通常、最終ａ過にも供されて、 存在するあらゆる望ましくない固形分または粒子を除かれる。

国際調査報告

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．発酵酵素を付加的に含む水性発酵ビールから微生物学的に生成されるキモシ ンを回収する方法であって、発酵ビールに有効量のポリエチレングリコールと無 機塩を加えて２相系を形成し、発酵ビールーポリエチレングリコール−無機塩混 合物がキモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリマー相とキモシンプアで発 酵ポリペプチドリッチの塩相に分離するのを許容し、そしてキモシンリッチで発 酵ポリペプチドプアのポリマー相を回収することからなる方法。
2. ２．発酵ビールのｐＨが約６．５以下であることを特徴とする請求の範囲第１項 記載の方法。
3. ３．発酵ビールのｐＨが約３以下であることを特徴とする請求の範囲第２項記載 の方法。
4. ４．発酵ビールのｐＨが約２．８未満であることを特徴とする請求の範囲第３項 記載の方法。
5. ５．ポリエチレングリコールの平均分子量が約６００〜約１２，０００であるこ とを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．ポリエチレングリコールの平均分子量が約５０００〜約１０，０００である ことを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．無機塩が硫酸塩およびリン酸塩から成る群より選択されることを特徴とする 請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．無機塩が硫酸塩であることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．硫酸塩が硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムから成 る群より選択されることを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．ポリエチレングリコールおよび無機塩を加える前に水性発酵ビールをまず 濾過することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
11. １１．発酵ポリペプチドを付加的に含む水性発酵ビールから微生物学的に生成さ れるキモシンを回収する方法であって、水性混合物のｐＨを約３未満に調整し、 発酵混合物に有効量のポリエチレングリコールと無機塩を加えて２相系を形成し 、発酵ビールーポリエチレングリコール−無機塩混合物がキモシンリッチで発酵 ポリペプチドプアのポリマー相とキモシンプアで発酵ポリペプチドリッチの塩相 に分離するものを許容し、そしてキモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリ マー相を回収することからなる方法。
12. １２．ポリエチレングリコールの平均分子量が約６００〜約１２，０００である ことを特徴とする請求の範囲第１１項記載の方法。
13. １３．ポリエチレングリコールの平均分子量が約５０００〜約１０，０００であ ることを特徴とする請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．無機塩が硫酸塩およびリン酸塩から成る群より選択されることを特徴とす る請求の範囲第１１項記載の方法。
15. １５．無機塩が硫酸塩であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．硫酸塩が硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムから 成る群より選択されることを特徴とする請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．ポリエチレングリコールおよび無機塩を加える前に水性発酵ビールをまず 濾過することを特徴とする請求の範囲第１１項記載の方法。
18. １８．発酵ポリペプチドを付加的に含む水性発酵ビールから微生物学的に生成さ れるキモシンを回収および純化する方法であって、 ａ）有効量のポリエチレングリコールおよび無機塩を発酵ビールに加えて２相系 を形成し、 ｂ）発酵ビールーポリエチレングリコール−無機塩混合物が、キモシンリッチで 発酵ポリペプチドプアのポリエチレングリコール相とキモシンプアで発酵ポリペ プチドリッチの塩相に分離するのを許容し、ｃ）キモシンリッチで発酵ポリペプ チドプアのポリエチレングリコール相を回収し、 ｄ）キモシンがイオン交換樹脂に結合しかつポリエチレングリコールがイオン交 換樹脂を通過する条件下で、キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエチ レングリコール相をイオン交換樹脂と接触させ、そしてｅ）イオン交換樹脂から キモシンを回収する、各工程から成ることを特徴とする方法。
19. １９．ポリエチレングリコールの平均分子量が約６００〜約１２，０００である ことを特徴とする請求の範囲第１８項記載の方法。
20. ２０．ポリエチレングリコールの平均分子量が約５０００〜約１０，０００であ ることを特徴とする請求の範囲第１９項記載の方法。
21. ２１．無機塩が硫酸塩およびリン酸塩から成る群より選択されることを特徴とす る請求の範囲第１８項記載の方法。
22. ２２．無機塩が硫酸塩であることを特徴とする請求の範囲第２１項記載の方法。
23. ２３．硫酸塩が硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムから 成る群より選択されることを特徴とする請求の範囲第２２項記載の方法。
24. ２４．ポリエチレングリコールと無機塩を加える前に水性発酵ビールをまず濾過 することを特徴とする請求の範囲第１８項記載の方法。
25. ２５．発酵ビールのｐＨが約６．５以下であることを特徴とする請求の範囲第１ ８項記載の方法。
26. ２６．発酵ビールのｐＨが約３以下であることを特徴とする請求の範囲第２５項 記載の方法。
27. ２７．発酵ビールのｐＨが約２．８未満であることを特徴とする請求の範囲第２ ６項記載の方法。
28. ２８．キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエチレングリコール相のｐ Ｈが５．０〜６．５の範囲かまたは約３．０以下であることを特徴とする請求の 範囲第１８項記載の方法。
29. ２９．キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエチレングリコール相のｐ Ｈが約３．０以下であり、カチオン交換樹脂を使用することを特徴とする請求の 範囲第２８項記載の方法。
30. ３０．キモシンリッチで発酵ポリペプチドプアのポリエチレングリコール相のｐ Ｈが約５．０〜約６．５の範囲であり、アニオン交換樹脂を使用することを特徴 とする請求の範囲第２８項記載の方法。
31. ３１．工程ａ）を約３以下のｐＨでポリエチレングリコール相の分離後に行い、 この相のｐＨは約５．０〜６．５の範囲に調整され、アニオン交換樹脂を使用す ることを特徴とする請求の範囲第１８項記載の方法。