JP6728294B2

JP6728294B2 - たんぱく質精製の新規な方法

Info

Publication number: JP6728294B2
Application number: JP2018188899A
Authority: JP
Inventors: スティーブンホーリー，
Original assignee: Ansun Biopharma Inc
Current assignee: Ansun Biopharma Inc
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2018-10-04
Publication date: 2020-07-22
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: CN105247036B; AU2014239573B2; US10351828B2; IL268868A; IL241278B; KR102186997B1; IL241278A0; JP6416867B2; US20140308729A1; CN110295114A; WO2014152524A2; AU2014239573A1; EP2970857A4; KR20200138420A; WO2014152524A3; EP2970857A2; CA2906593C; HK1220224A1; KR102350205B1; US11697803B2

Description

連邦支援研究に関する陳述
ここに開示する本発明は、部分的に政府資金援助を受けてなされ、政府は本発明において特定の権利を有するものである。具体的には、ここに開示する本発明の数部分は、部分的に、米国国立保健研究所による契約番号No. N01-AI-60015Cの下で資金援助を受けた。

発明の分野
本開示は、概して、細胞培養物から細胞内たんぱく質を得るための新規な方法及び試薬に関する。

背景
タンパク質の大規模精製を取り巻く懸念は、バイオテクノロジー産業にとってますます重要な問題である。例えばゴーシェ病、ファブリー病及びポンペ病などの異栄養性表皮水疱症、及びリソソーム貯蔵障害を含め、数多くの障害が、たんぱく質又は酵素置換療法の対象になってきた。患者に供給する必要のある大規模たんぱく質生成は原価重視で、生成効率を有し、高い品質の製品を生まねばならない。たんぱく質精製の過程は長時間であり、面倒な上に費用もかかる。これらの短所はたんぱく質置換療法の費用に大きく影響し、一般的な保健にとって大きな課題を呈する。

たんぱく質生成は、主に細胞内、即ち、目的のたんぱく質の遺伝子を含有する組換えプラスミドの挿入によりそのたんぱく質を産生するように操作された哺乳類、細菌又は真菌ないで行われる。目的のたんぱく質を発現する細胞は、動物の血清製剤から通常提供される、糖類、アミノ酸及び成長因子を含有する複合成長媒質中で培養される。ヒトの治療薬として用いるために高品質で充分な量を精製するには、精製では、細胞に提供された化合物の混合物や細胞片から所望のたんぱく質を分離する必要がある。

細胞片からのたんぱく質精製法は長大かつ複雑である。目的のたんぱく質を取り出すのに必要な複数かつ反復的なステップは、最終的なたんぱく質の収率及び品質を大きく損なう。多くの場合、たんぱく質は精製後も機能的でなければならない。

生物学的発現系の細胞内区画内で発現した組換えたんぱく質は一般に、細胞壁がある場合には機械的破壊によって発現系の細胞から放出される。このような機械的方法にはホモジナイゼーション、マイクロ流動化、窒素バースト、超音波、及びビーズ撹拌法がある。他の方法には、細胞壁成分を部分的に分解するために酵素を添加した後、浸透圧剤を加えて周辺質成分の破裂及び遊離を誘導する方法がある。酵素消化及び化学的処置を組み合わせたこれらの方法は、グラム陰性細菌内の周辺質空間内をターゲットとした発現たんぱく質に広く用いられている。細胞壁を持たない細胞は、酵素の添加無しでも浸透圧により破壊されるか、又は、界面活性剤又は有機溶媒を用いた細胞膜の破壊により完全に破壊させられよう。効率を上げるために破壊法を組み合わせて用いてもよい。

以前の方法の大半は、周辺質区画からのたんぱく質の遊離のみに適しているか、又は細胞区画を完全に破壊してしまう。細胞が完全に破壊されると、DNAは細胞レベル下区画から放出され、粘性の高い液体を形成し得る。粘性を下げ、大規模精製中に加工流体流が操作できるように、DNAをせん断するか、又は酵素分解させることができる。製薬等級のたんぱく質の作製のために、これらのステップは成功裏に用いられるが、各加工ステップは製造の複雑さ、時間及び費用を増す。

発明の概要
本開示は、（ｉ）培養培地から細胞を取り出すことなく、（ｉｉ）細胞の機械的破壊を用いることなく、又は、細胞壁を破壊するために酵素を用いることなく；そして（ｉｉｉ）細胞集団を硬化させて濃縮ペレット型にすることなく、培養培地中に存在する細菌細胞、特にE. coliから目的の細胞内たんぱく質を精製するための新規な方法と、該方法に関する試薬を提供するものである。

開示された方法は、DNAの放出量を下げ、粘性を上げるような細胞の全体的破壊を起こすことなく、組換えたんぱく質の放出に向けて細胞を可溶化させるために所定の組合せの無機塩及び界面活性剤を添加することで、細胞内組換えたんぱく質を放出させるために用いられる。

残った細胞片は、遠心分離ステップ後の選択的沈殿により、可溶性の組換えたんぱく質から精製により取り除いてもよい。

本方法は、細胞培養の完了後にバイオリアクターに適した化学的試薬を添加すること、即ち発酵、を含む一連のステップによって達成されよう。これらの化学的試薬は培養物に段階的に添加される。該試薬はまた、当該試薬の特定の濃度を達成するためにも添加される。本方法には、規定量の時間、溶液中に化学的試薬が存在することが必要である。

本方法には、細胞培養物から細胞を単離する必要がない。更にそれは、試薬（「遊離試薬」の添加前に成長培地を除去する必要がない。本方法は、細胞を溶解させるために機械的破砕を用いない。

そうする際に、本方法は、製造の複雑さ、時間及び費用を減じながらも、DNA放出量が少ないために強健性を増している。

本書類は、目的のたんぱく質を発現する細菌細胞又は真菌から目的のタンパク質を放出させる方法を提供させるものである。本方法は：（ａ）目的のたんぱく質を発現する細胞の培養物（例えば目的のたんぱく質を発現する細胞と、細胞が培養された成長培地）を提供するステップ；（ｂ）細胞の培養物を無機塩に接触させる（例えば無機塩を含む組成物を培養物に加えるなどにより）ステップ；（ｃ）少なくとも１０分間、添加された無機塩を含有する培養物を保持するステップ；（ｄ）添加された無機塩を含有する培養物をキレート剤に接触させる（例えばキレート剤を含む組成物を培養物に加えるなどにより）ステップ；（ｅ）添加された無機塩及び添加されたキレート剤を含有する培養物を少なくとも１０分間、保持するステップ；（ｆ）添加された無機塩及び添加されたキレート剤を含有する培養物のｐＨを、選択に応じて、４乃至９の間のｐＨに調節するステップ；（ｇ）ｐＨ調節後、添加された無機塩及び添加されたキレート剤を含有する培養物を少なくとも１５分間、保持するステップ；（ｈ）添加された無機塩及び添加されたキレート剤を含有する培養物を界面活性剤に接触させるステップ；（ｉ）添加された無機塩、添加されたキレート剤、及び添加された界面活性剤を含有する培養物を少なくとも１時間、保持するステップ；（ｊ）選択に応じて、添加された無機塩、添加されたキレート剤、及び添加された界面活性剤を含有する培養物の温度を下げるステップ；（ｋ）添加された無機塩、添加されたキレート剤、及び添加された界面活性剤を含有する培養物を沈殿剤に接触させるステップ；（ｌ）添加された無機塩、添加されたキレート剤、添加された界面活性剤、及び添加された沈殿剤を含有する培養物を少なくとも１時間、保持するステップ；及び（ｍ）添加された無機塩、添加されたキレート剤、添加された界面活性剤、及び添加された沈殿剤を含有する培養物に、細胞片の実質的な部分（例えば少なくとも９０％）を取り除く方法を行うステップ、を含む。本方法は、（ｉ）細胞の機械的破壊；（ｉｉ）添加前に細胞培地の全て又は実質的にすべてを取り除くステップ、及び（ｉｉｉ）細胞壁物質を消化する酵素の添加、から成る群より選択される少なくとも二つのステップを含まない。場合によっては、本方法は、（ｉ）細胞の機械的破壊、（ｉｉ）細胞培地の実質的全部を取り除くステップ、及び（ｉｉｉ）細胞壁物質を消化する酵素の添加、のいずれをも含まない。上記の方法は更に、細胞培地の一部又は実質的に全部を取り除くステップを含むことができる。

無機塩を用いる上記の方法においては、無機塩は、リン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、及び塩化ナトリウムであってよい。界面活性剤を用いる上記の方法においては、それはトリトン、SDS、CHAPS 3、Nonidet P40、n-オクチルグルコシド、及びツィーン-20であってよい。更に上記の方法は、トリトン、SDS、CHAPS 3、Nonidet P40、n-オクチルグルコシド、及びツィーン-20から選択される二つの界面活性剤の混合物も用いる。更に上記の方法は、PEI、及びアンモニウム塩、並びにポリエチレングリコール、TCA及びエタノールであってもよい沈殿剤を用いる。

いくつかの場合では、所望のたんぱく質を発現する細胞はE. coliである。上記の方法は、グラム陰性細菌である細菌細胞を用いる。所望のたんぱく質は細胞内たんぱく質である（即ち、それは細胞から分泌されない）。所望のたんぱく質はDAS181であってよい。

上記のすべての方法において、無機塩を含有する培養物を保持するステップは少なくとも２０分間、続く。上記のすべての方法において、無機塩及びキレート剤を含有する培養物を保持するステップは、少なくとも１５分間であってよく、少なくとも３０分間、４５分間、又は１時間、あるいは３０分間乃至１時間である。

上記のすべての方法において、無機塩、キレート剤及び界面活性剤を含有する培養物を保持するステップは、少なくとも１時間、少なくとも３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、時間６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間又は５乃至１３時間、起きてよい。上記のすべての方法において、無機塩、キレート剤、界面活性剤及び沈殿剤を含有する培養物を保持するステップは、少なくとも１時間、少なくとも３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間時間６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、又は５乃至１３時間、起きてよい。

該ステップは、混合物が２５乃至３５℃、好ましくは３０℃の時に行うことができる。混合物の温度は、沈殿剤の添加前に、例えば２５及び２０℃の間乃至２１及び２３℃の間など、２５℃未満に下げることができる。

図１は、新規なたんぱく質放出プロトコルの実施態様のフローチャートである。図２は、新規なたんぱく質放出法（「界面活性剤可溶化」）に対する、ホモジナイゼーション溶解を要するたんぱく質放出法の比較である。図３Ａ−３Ｅは、ホモジナイゼーション溶解プロトコル及び界面活性剤可溶化プロトコルのSDS PAGE解析である。図３Ａ及びＢは、ホモジナイゼーションプロトコル（図３Ａ）及び界面活性剤可溶化プロトコル（図３Ｂ）から単離されたたんぱく質のクーマシー検出を示す。図３Ｃ及びＤは、ホモジナイゼーションプロトコル（図３Ｃ）及び界面活性剤可溶化プロトコル（図３Ｄ）から単離されたたんぱく質の銀検出を示す。図３Ｅは、銀検出によるSDS-PAGE比較ゲルである。図３Ａにおいて、レーン１−１０は：それぞれ分子量マーカー、清澄させたホモジネート、SPフロー・スルー、SP 溶出物、HIC溶出物、Post HIC TFF、RPC負荷物、RPC溶出物、及びDAS181 Ref Std 750-0406-002を含有する。図３Ｂにおいて、レーン１−１０は：それぞれ分子量マーカー、PEI 清澄済み界面活性剤、界面活性剤SP負荷物、界面活性剤SP フロー・スルー、界面活性剤SP溶出物、界面活性剤HIC溶出物、界面活性剤Post-HIC TFF、RPC Load、RPC 溶出物及びDAS181 Ref Std 750-0406-002を含有する。図３Ｃにおいて、レーン１−１０は：分子量マーカー、清澄させたホモジネート、SP フロー-スルー、SP溶出物、HIC溶出物、Post HIC TFF、RPC 溶出物、及びDAS181 Ref Std 750-0406-002をそれぞれ含有する。図４は、界面活性剤可溶化の至適化法とたんぱく質精製ステップのフローチャートである。図５Ａ−Ｆは、Ａ及びＢ連のたんぱく質の解析である。図Ａ−Ｃは、それぞれランＡの界面活性剤可溶化収量のクーマシー染色、ウェスタン・ブロット及び銀染色解析である。これらの解析のレーン１−１０は以下の通りである：それぞれ分子量マーカー、 SP 溶出物 (Ferm 20110523F2)、HIC FT、UF/DF #1 プール、Capto Adhere FT pH 7.7、滴定済みCapto Adhere FT pH 5.0、薬物物質及びDAS181 Ref. Std。図Ｄ−Ｆは、それぞれランＢの界面活性剤可溶化収量のクーマシー染色、ウェスタン・ブロット及び銀染色である。これらの解析のレーン１−１０は以下の通りである：それぞれ分子量マーカー、SP 溶出物（Ferm 20110613F2）、HIC FT、UF/DF #1 プール、Capto Adhere FT pH 7.7、滴定済みCapto Adhere FT pH 5.0、薬物物質、及び DAS181 Ref. Std. Lot 46-012。図６Ａ及び６Ｂは、DAS181純度のSDS-PAGE解析である。図４Ａに示す：レーン１は1 分子量マーカー、レーン２は薬物物質Ferm 20110523F2、レーン４及び５は薬物物質Ferm 20110613F2、及びレーン６は DAS181 フェーズ2 Ref. Std. Lot 46-012である。図４Ｂに示すのは、異なる濃度のたんぱく質：8-20μgである。図７Ａ−７Ｃは、一体化ランＡ、一体化ランＢ及びDAS参考基準からのDAS181のRP-HPLC比較を示す。図８Ａ−８Ｃは、一体化ランＡ、一体化ランＢ及びDAS参考からのDAS181のCEX-HPLC比較を示す。図９は、数週間の保管にわたるDAS181安定性のSDS-PAGE解析である。

詳細な説明
ここに記載する方法は概して、細菌細胞、特にE. coliから細胞内たんぱく質を放出させるために用いることができる。ここに記載する例は、E. coliからの DAS181 (Malakhov et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1470-1479 (2006))の放出に関する。DAS181は融合タンパク質であり、ヒトアンフィレギュリン由来のヘパリン（グリコサミノグリカン、又はGAG）結合ドメインを、そのN末端で、アクチノミセス-ヴィスコサス（原語：Actinomyces Viscosus ）（例えば SEQ ID NO: 1（アミノ末端メチオニンなし）及び SEQ ID NO: 2（アミノ末端メチオニンを含む）に記載されたアミノ酸の配列) の触媒ドメインのＣ末端に融合させて含む。ここで記載された遺伝子操作された細胞は、DAS181たんぱく質をコードする一つ以上の核酸を含有する。DAS181のin vivo産生、又はここで記載するポリペプチドのいずれかの組換え産生に適する細胞は、細菌のものでも、真菌由来のものでもよい。

細胞（例えば細菌細胞）内でのたんぱく質の過剰発現は、発現ベクターを用いて達成することができる。発現ベクターは自己由来でも、又は一体のものでもよい。組換え核酸（例えばDAS181をコードするものなど）は、プラスミドなどの発現ベクターの形で細胞内に導入することができる。組換え核酸は染色体外に維持することもできるが、あるいは染色体DNA中にそれを組み込むこともできる。発現ベクターは、（所望の核酸で形質転換した細胞を検出及び／又は選択することができるように）所定の条件下で細胞生存率に必要なたんぱく質をコードする選択マーカー遺伝子を含有することができる。発現ベクターはまた、自己由来複製配列（ARS）も含むことができる。

形質転換細胞（即ち細菌細胞）は、限定はしないが、形質転換後の自己栄養性細胞を必要な生化学的生成物の非存在下で培養するステップ、新規な表現型について選択及び検出するステップ、又は、形質転換体に含有された耐性遺伝子の非存在下で酵母にとって毒性の抗生物質の存在下で培養するステップ、を含む、適した技術を用いることにより選択することができる。形質転換体は更に、例えばサザン・ブロット又はPCR解析などにより評価することのできる、ゲノムへの発現カセットの組込みにより、選択及び／又は確認することができる。目的の標的細胞へベクターを導入する前に、上記のとおり、エシェリヒア-コリ（E. coli）などの細菌細胞内でベクターを成長（例えば増殖）させることができる。ベクターDNAは、細菌ミリューからベクターDNAが精製される、当業で公知の方法のいずれかによって細菌細胞から単離することができる。精製されたベクターDNAは、フェノール、クロロホルム、及びエーテルでよく抽出することで、E. coliたんぱく質がプラスミドDNA標品中に確実に存在しないようにすることができる。なぜならこれらのたんぱく質は哺乳動物細胞にとって毒性かも知れないからである。

ポリペプチドの小規模又は大規模製造に用いることのできる発現系には、限定はしないが、核酸分子を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、又はコスミドDNA 発現ベクターで形質転換させた細菌（例えばE. coli）などの微生物、並びに、核酸分子を含有する組換え真菌発現ベクターで形質転換させた真菌（例えばS. セレビジエ）がある。

一般的には、細菌（例えばE. coli）組換え細胞による目的のたんぱく質のin vivo生成のためには、細胞を同化可能な窒素及び炭素のソースを含む水性の栄養培地中で、典型的には浸水させた好気条件下で培養することができる（振盪培養、浸水培養等）。水性培地は、4.0乃至8.0（例えば4.5、5.0、5.5、6.0、又は7.5）のｐＨに、培地中のたんぱく質成分、培地に取り込まれた緩衝剤を用いたり、又は必要に応じて酸又は塩基の外部からの添加したりすることにより、維持することができる。栄養培地中の炭素の適した源には、例えば、ブドウ糖、ショ糖、果糖、グリセロール、でんぷん、植物油、石油化学由来の油類、スクシネート、ギ酸等の糖質、脂質及び有機酸などを含めることができる。窒素の適した源には、例えば酵母抽出物、コーン・スティープ・リカー、食品抽出物、ペプトン、植物性食品、可溶性蒸留物、乾燥酵母等や、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸塩、尿素、アミノ酸等の無機窒素源を含めることができる。

組み合わせると有利な炭素及び窒素源は純粋な形で用いる必要はない。なぜなら、微量の成長因子及び相当量のミネラル栄養分を含有する純度の低い物質もまた使用に適するからである。リン酸ナトリウム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウム、マグネシウム塩、銅塩等の好ましい鉱物塩を培地に加えることができる。液体パラフィン又は植物油などの消泡剤を、必要に応じて微量加えてもよいが、典型的には必要ではない。

目的のたんぱく質を発現する組換え細胞（例えばE. coli）の培養は、最適なバイオマス及び／又は酵素力価収率を促進する条件下で行うことができる。このような条件には、例えば、バッチ、供給バッチ又は連続培養がある。更に、条件のパラメータへの変更も、DAS181タンパク質の最適なバイオマス及び／又は酵素力価収率を促進することができる。このような条件には、例えば、培養基中のグリセロール濃度及び高いpO₂がある。多量のバイオマスの生成には、浸水式の好気性培養法を用いることができるが、少量であれば振盪フラスコで培養することができる。大型のタンクでの生成の場合、多数のより小さな接種物タンクを用いて、生成容器中でのラグタイムを抑えるのに充分なレベルまで接種材料を構築することができる。生体触媒の生成のための培地は一般的には（例えばオートクレーブにより）、細胞への接種前に滅菌される。培養物の通気及び撹拌は、機械的手段、無菌空気の同時添加、又は気泡反応器内で空気のみを添加することにより、達成することができる。例えば最適なバイオマスを促進するためのバイオ反応器内で、より多量のpO₂（溶解酸素）を培養中に用いることができる。更にそれを、バイオマス培養物中の最適な活性たんぱく質発現を促進するためにも用いることができる。より高い部分的酸素圧力及び段階的グリセロール枯渇を含む、このような発酵パラメータの実施により、目的のたんぱく質の生成を増加させることができる。

界面活性剤可溶化の方法
In-situ界面活性剤可溶化
所望のたんぱく質発現のために充分な培養を行った後、反応器内への供給添加及び気流を停止させ、撹拌速度を１００から２５０rpmへ下げることにより、培養物を回収する。温度は、透過可能化ステップに備えて１５℃乃至４５℃の範囲に設定する。いくつかの場合では、温度を３０℃に設定してもよい。これはまた本開示中では予備処理ステップとしても言及される。無機塩（例えばリン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、及び塩化ナトリウム）を10-100 mMの範囲の最終濃度まで添加することができる。いくつかの実施態様では、無機塩の最終濃度は50 mMである。溶液を少なくとも１０分間又は少なくとも２０分間、混合させる。エチレンジアミン四酢酸(EDTA)などのキレート剤を50-200 mM の範囲の最終濃度まで添加し、少なくとも１０分間又は少なくとも２０分間、混合する。いくつかの実施態様では、EDTA を100 mM (例えば50 nM-250 nM)の最終濃度まで添加する。pHを次に5.0-6.0 （例えばリン酸を用いるなどにより）に調節することができる。いくつかの実施態様では、pH を6に調節する。材料を少なくとも１０分間（例えば３０分間乃至１８０分間又はそれ以上の範囲の時間の量）、混合しながら（例えば400-450 rpmの混合速度で）インキュベートする。本方法のいくつかの実施態様では、材料を６０分間、インキュベートする。界面活性剤（例えばトリトン、SDS、CHAPS 3、Nonidet P40、n-オクチルグルコシド、及びトゥイーン-20）又は界面活性剤の組合せ、例えばドデシル硫酸ナトリウム (SDS)トリトン-X 100を混合物に加える。トリトン-X 100 を0.01-1% SDSと一緒に組み合わせて2-15%の範囲、用いてもよい。いくつかの実施態様では、10% SDS 溶液を次に0.1% の最終濃度まで添加し、Triton X-100 を同時に7%の最終濃度まで添加する。該溶液を、15-45^oCの範囲の温度で中程度の速度で１乃至５時間の範囲の時間量、混合することができる。いくつかの実施態様では、該溶液を３０℃で中程度の速度で３時間、混合する。

清澄化
界面活性剤の組合せ中でのインキュベート後、混合物温度を２２℃まで下げる。１０パーセント (10%) PEI、pH 6.0ストック溶液を次に0.5%の最終濃度まで添加する。該溶液は、２２℃で６乃至２４時間の範囲の時間量、混合することができる。いくつかの実施態様では、該溶液を２２℃で６乃至１２時間、混合する。本方法の別の実施態様では、該溶液を２２℃で６乃至８時間を目的として混合する。該混合物をその後、Sharples AS-14 （流速： 1 L/分）を用いた連続流遠心分離により、清澄させる。該混合物の混濁度(OD600nm) をT=0で測定する。たんぱく質精製プロセス開始前に、該混合物を選択的に一晩、周囲温度に維持することができる。

上記の界面活性剤可溶化法に続き、生成物を更なる精製にかけてもよい。

実施例
本発明は更に以下の実施例で解説するが、以下の実施例は、本請求項に記載された本発明の範囲を限定するものではない。

本発明は、細胞の機械的破壊を必要としたり、外部から添加された酵素により細胞壁の酵素分解したりすることなく行われる新規なたんぱく質精製プロトコルである。更に、細胞培養物からの細胞の単離を要せず、更に細胞培養物からの細胞の除去を要しないことも考察される。

本新規な可溶化プロトコルは、高品質で安定な目的たんぱく質DAS181を生ずるように最適化された。この新規なたんぱく質精製の最適化をここに定義する。本プロトコルはまた、当業で公知の通常の態様のたんぱく質精製、即ちホモジナイゼーション、を超える利益を有するものでもある。ホモジナイゼーションを通じて精製された、目的のたんぱく質DAS181の品質、安定性及び一体性が、新規な可溶化プロトコルを通じたものと比較されている。本たんぱく質精製プロトコルは、明示した時間の間、明示された濃度で試薬を利用する。これらのパラメータの最適化を以下に論じる。

実施例１
界面活性剤可溶化法に比較したときのホモジナイゼーションで生ずるたんぱく質の収率及び品質
広範な調査を行って、機械的ホモジナイゼーションを含むプロトコルに代わる流線型の代替法として、細胞から目的のたんぱく質DAS181のin situ放出のための可溶化を最適化した。ホモジナイゼーションに比較した場合の可溶化は、細胞単離、細胞洗浄、再懸濁、及びホモジナイゼーションのステップなしで、細胞からのDAS181の放出を可能にすることにより、加工時間を減じるであろう。実施例１の詳細は、ホモジナイゼーションに比較したときの可溶化法と、たんぱく質収率や、精製後のたんぱく質の品質に関するその後の結果を解説している。可溶化法及びホモジナイゼーションの両者の方法を示すフローチャートは図２に提示されている。

方法
発酵物20100201 F2 (F2) 及び20100201 F3 (F3) を誘導から２４時間後に回収した。発酵物をプールし、二つのアリクォートに分けた。各アリクォートに可溶化法又は現行のホモジナイゼーションを行った。

ホモジナイゼーション法による調製：一つのアリクォート（A）を遠心分離して培養媒質を取り除いた。ペレットになった細胞を50 mMのリン酸カリウム及び 200 mM NaCl, pH 8を含む緩衝液中に懸濁させ、その後、氷上で15,000psiで二回のホモジナイゼーションを行った。次にホモジネート物を更なる加工まで周囲温度に維持した。次にホモジネート物を0.5%の最終濃度までポリエチレンイミン(PEI; ストック10% PEI, pH 8) で処理し、周囲温度に維持した。

可溶化法により調製：二番目のアリクォート（B）を３０℃での可溶化に向けてインキュベータにそのまま、返した。二塩基性のリン酸ナトリウムヘパタハイドレート及び 1M EDTA (pH 8.7の遊離酸) をそれぞれ最終濃度50 mM、及び100 mMになるように、ゆっくり撹拌しながら添加した。ｐＨを6.0 に 50% HCl で調節し、撹拌を増した。混合物を１時間、インキュベートしてからSDS及びトリトン X-100 をそれぞれ0.3% 及び 5%の最終濃度になるように添加した。界面活性剤可溶化の６時間後、可溶化物の温度を２２℃に下げ、その後10% PEI, pH 6 を最終濃度0.5%になるように添加した。

前に進めながら、両方のアリクォートを等しく処理した。アリクォートＡ及びＢを一晩、撹拌しながらインキュベートした。次にホモジネートをpH 6まで50% HCl を用いて滴定し、ほぼ５時間、振盪させた。両方のアリクォートを遠心分離し、上清を更なる精製法を用いてろ過した。清澄させた界面活性剤可溶化DAS181 を 1:1 に H2O で希釈し、更なる精製法を行った。更なる精製の生成物の負荷希釈なしでホモジネートを精製した。各ステップの試料を OD600nm及びDTM CEX-HPLC で測定して、収率及び品質を推断した。

DAS181基準材料は、下記の検定の標準として用いられる。Das181基準材料は、従来の均質なたんぱく質精製法を用いて精製された。精製済みのDAS181はその活性な形で存在する。

PEI処理後の遠心分離されたライセートの混濁度は、更なる精製前後に判定された。連続流遠心分離後、両方のライセートは、ほぼ0.9のOD600nmで混濁度が同様であることがみとめられた。更なる精製に向けて、清澄させたホモジネートの混濁度は0.1であることが観察されたが、清澄させた界面活性剤材料の混濁度は0.2であった。ホモジネート材料中で観察された低下した混濁度は、可溶化法の界面活性剤ステップでのｐＨ６とは対照的に、ｐＨ８で行われたPEIステップに起因するとした。加えて、遠心分離前にホモジネート材料はｐＨ６に滴定する必要があるため、当該材料は時間にわたって安定性が低かった。室温及び４℃に維持された、清澄させたホモジネート材料は２４時間後に混濁度が０．１から０．２に増加させたが、他方、成長させた界面活性剤材料の混濁度は変わらないままだった。

各加工ステップでの収率は、表１に示すように両方の溶解法と著しく同様であった。界面活性剤可溶化ステップの結果、全細胞たんぱく質量の８３％が放出されたが、ホモジナイゼーションステップの収率は９２％だった。しかしながら、ホモジナイゼーション前に細胞遠心分離ステップで消失が観察された。従って発酵からホモジナイゼーションまでの該収率は８５％だった。ホモジネートのPEI沈降及び各カラム・ステップ後の収率は同様であった。ホモジナイゼーションの全体的収率は４８％だったが、界面活性剤可溶化法の収率は４４％だった。

更なる精製を行ったが、生成物品質の要約を表２に示す。ホモジナイゼーション泳ぎ界面活性剤可溶化法の最終生成物はそれぞれ９９．９％及び９９．８％単量体であることが示された。ホモジネートの純度は９７．９％だったが、界面活性剤プールの純度は９８．４％だった。更なる精製では、ホモジネートRT FTプールは6.5% ピークF、12.6 デアミド化（ピークＣ）、及び81.0% メイン・ピーク（ピークＡ）であることが示された。界面活性剤プールは 7.3%ピークF、8.2% デアミド化（ピークＣ）、及び84.5% メイン・ピーク（ピークＡ）だった。デアミド化の違いはおそらく、ホモジナイゼーションではｐＨ８で起きるのに対し、界面活性剤プロセスではｐＨ６で起きる結果であろう。

表２：ホモジナイゼーション及び新規な「可溶化」法の間のDAS181品質要約比較

更なる精製を用いた解析も、各溶解法で出たカラム画分で行ない、表２に要約する。ホモジネートのSP溶出物は、界面活性剤のSP溶出物のほぼ２倍の量のHCPを含有していた。更なる精製後のホモジネートは４０倍を超える量のHCPを含有していた。更なる精製後のホモジネートは、それぞれ227 ng/mg HCP 及び≦16 ng/mg (BLQ)を含有していた。

SDS-PAGE解析では、ホモジナイゼーションから生成されたSP溶出物が、界面活性剤のSP溶出物よりも僅かに低い純度であるらしいことが示された（図３Ａ−３Ｃ）。全体的に、両方の溶解法で生じた試料は同様であった。ホモジナイゼーション法及び界面活性剤可溶化法からの最終的プールは、それぞれ図３Ａ、Ｂ及びＣのレーン９、１０、及び８のDAS181 参考標準と一致していた。

界面活性剤可溶化法及びホモジナイゼーション法の結果の全体的収率及び生成物の品質は匹敵するものと結論付けられたが、例外として、ホモジナイゼーション加工法で出たライセート中にはホスト細胞不純物が存在していた。これらの観察は、加工時間の減少、加工強健性の向上、及びホスト細胞不純物の可能な減少は、界面活性剤可溶化法が、たんぱく質精製のためのホモジナイゼーション法に代わる有効な代替法であることを示唆するものであることを示していた。これらの結果は、界面活性剤可溶化法の更なる検査及び最適化を正当化した。

実施例２
たんぱく質発現及び精製のための界面活性剤可溶化法の最適化
新規な界面活性剤可溶化プロトコルの最適化は、DAS181薬物物質の純度を確実に充分かつ再現可能にするためだった。SP捕獲カラムの洗浄は、再生が確実に充分になるように、NaClの代わりにカオトロピック剤であるグアニジンを用いるとより有効になされた。更に、SP溶出物中のDAS181回収率は、セファロース樹脂を添加する前の遠心分離上清の希釈度を増すことにより、向上した。Hexyl-650C樹脂に依る疎水性相互作用クロマトグラフィーは、添加能力の増加によって更に最適化された。ろ過及び研磨段階は、マルチモード強力陰イオン交換樹脂を用いた単一のクロマトグラフィー操作に置き換えられた。

方法
発酵試料20110523F2 及び 20110613F2 は誘導２４時間後に回収された。撹拌は250 rpmに設定された。二相性七水和リン酸ナトリウム及びｐH８．７の1 M EDTA 遊離酸を最終濃度50 mM 及び100 mMまで添加した。撹拌を350 rpmに上昇させ、リン酸を添加してｐＨを 6.0 に調節した。この混合物を１時間、インキュベートしてから、撹拌を 400 rpmに上昇させ、SDS 及びTriton X-100 をそれぞれ0.1% 及び7%の最終濃度まで添加した。界面活性剤透過可能化から３時間後に透過可能化ライセートの温度を２２℃まで下げた。ｐＨ６の１０パーセント(10%) PEIを最終濃度0.5%まで添加した。この材料を６時間、インキュベートしてから分離した。その結果の上清を更なる精製法を用いてろ過した。清澄した界面活性剤透過可能化ライセートを125% 体積から最終的な2 M 尿素濃度まで希釈した。

結果
最終的な最適化された回収及び精製プロセスを図４に要約する。新規な界面活性剤プロトコルの二つの別々の操作（ランＡ及びランＢ）を並行して行い、分析して当該プロトコルの最適化を推断した。ランＡ（図５Ａ−５Ｃ）及びランＢ（図５Ｄ−５Ｆ）からの精製中間物のクーマシー・ブルー、銀染色によるSDS-PAGE、及びウェスタン・ブロット解析は、精製が進むにつて、純度が段階的に増すことを示していた。ランＡ及びＢから精製された最終的なDAS181薬物物質は、クーマシー・ブルーによるSDS-PAGEで検出されたDAS181参考基準に匹敵していた。しかしながら、銀染色検出では、ランＡ及びＢの試料から出た主要なバンドの下方にいくつかの僅かに染色されたバンドが見出され、不純物が示された。反対に、ランＡ及びＢは、参考基準よりも少ない量の高分子量不純物を有していた。これらのバンドのいずれも、クーマシー染色検出では可視でなかった。SDS-PAGE ／クーマシー・ブルー解析（図６Ａ）へのたんぱく質添加量を増すと、ランＡ及びＢからの薬物物質は、参考基準に匹敵することが明らかになった。50kDa近くの一本の主要なDAS181 バンドがみとめられたが、コントラストを強調した接近画像では、各添加された試料について主要なバンドのすぐ下方に小さなバンドがみとめられた。これは、ゲルに過剰添加したことによる人工物の可能性がある。多様な量の参考基準（8 ng 乃至20μg）を添加した別のゲルは、コロイド状の青色染色によるSDS PAGEは、20ngという低い量のたんぱく質添加物も検出できたことを実証した（図６Ｂ）。ランＡ及びＢからの20μgの薬物物質を添加したレーンは、コロイド状青色検出による可視できるバンドは他にないことを示した（図５）。従って、薬物物質レーン中で銀染色を用いて検出された小さな不純物のバンドは、試料添加量の0.1%未満を占め（図５Ａ−Ｆ）たが、なぜなら20ngのレベルに達したバンドは、コロイド状クーマシー・ブルー染色で可視化されただろうからである。

更なる精製後の凝集解析では、ランＡ及びＢの薬物物質は、それぞれ99.8% 及び 99.9%単量体であることが明らかになった（表３）。

表３：代替的な更なる精製による生成物の分析比較

更なる精製による純度解析では、ランＡ及びＢからの最終的な薬物物質はそれぞれ純度が97.1% 及び96.7%であったことが実証された（表４）。

代替的な更なる精製による生成物の分析比較

ランＡ及びＢで用いられた、最適化されたプロセス・パラメータは、更なる精製不純物ピークから減少したピーク面積及び品質試料をもたらした（図７Ａ−Ｅ）。加えて、ラン＃１乃至＃４からの薬物物質試料の主なDAS181ピークから離れた肩は参考基準よりも目立たなかった。

更なる精製法で得られたDAS181純度及びバリアントの分析では、デアミド化の違いを除き、ベンチスケールで一体化ランＡ及びＢの最終的な薬物物質の、DAS181参考基準に匹敵するクロマトグラフィ・プロファイルが示された（図８）。デアミド化DAS181の増加（ピークＣ）がランＡ及びＢからの薬物物質で（参考基準の13.2±0.1%に対して29.6±2.4%で）観察された。DAS181の対応する減少（ピークＡ）も観察された。ピークＡは、ランＡ及びＢからではそれぞれ62.3% 及び65.4% であると判定された（表５）。

表５： CEX-HPLC分析比較

これらの数値は、75.5±0.4%にピークＡを有するDAS181参考基準よりも僅かに下回る。DAS181デアミド化の増加は、特定の更なる精製法に必要な高ｐＨ環境が起因であるとされた。ピークＣのパーセント面積は、ｐＨを最初のｐＨ5.0から7.7に６乃至７時間、維持した時には二倍に増加した。フェーズ１臨床治験で用いられた薬物物質は ~49%だったが、これは多数のフェーズ１プロセスステップをｐＨ８．０で行なったからであった（表５、図８Ｆ）。

誤って折り畳まれたDAS181を表すピーク１の面積は、参考基準でよりもランＡ及びＢでの方が小さかった。ランＡ及びＢ薬物物質のピーク４及びピークＦの面積は参考基準と一致した。ランＡ及びＢで生じた最終的な薬物物質の更なる精製の分析は、それぞれ測定値での測定は 15 ng/mg 及び 33 ng/mgであった（表６）。これらの数値はこの検定については定量限界 (16 ng/mg) 未満であるか、又は近傍である。最終的な薬物物質の更なる精製後の生成物レベルは代替的な精製の生成物で判明したレベルにほぼ同一であると判定された。

表６：更なる精製の生成物のELISA分析比較

シアリダーゼ特異活性の分析では、ランＡ及びＢで生じた最終的な薬物物質はそれぞれ827 U/mg 及び847 U/mgであることが示された（表７）。シアリダーゼ特異活性は、品質管理のために試料の横に泳動させたDAS181参考基準(826 U/mg) に匹敵していた。

表７：シアリダーゼ活性分析比較

ベンチスケールで一体化させたランＡ及びＢで生じた最終的な薬物物質のエンドトキシン分析は、それぞれ0.018 EU/mg 及び0.043 EU/mgを測定した（表８）。DAS181薬物物質のエンドトキシン明細は0.5 EU/mgである。両方のランで生じた薬物物質のエンドトキシン・レベルはこの最大値の遥かに下方だった。ランＡ及びＢは、それぞれ明細限界の僅かに3.5% 及び8.7%だった。

表８： LAL色素産生性エンドトキシン分析比較

ベンチスケールで一体化ランＡ及びＢで得られたDAS181精製回収率はそれぞれ 45.9% 及び 55.0%だった（表８９．全体の収率は細胞透過可能化及び清澄回収を通じたDAS181放出の成果に大きく影響され、最小量のDAS181材料がクロマトグラフィー作業中に失われた。予測されたステップ収率は一時回収率には合わなかったが、精製作業に予測されたよりも高かった。合計ではDAS181回収率は一時回収分の3.9 ± 1.5%、減少した。

表９：予測されたステップ収率との、一体化ランＡ及びＢのDAS181回収率

ランＡ及びＢの更なる精製後の生成物の回収率は93.1 ± 1.5%だった。これは、89.9 ± 2.4% の回収率を生じた、ラン＃１及び＃２で用いられた代替的に更に精製された生成物の生成物に対する向上だった。UF/DF #1 作業の収率は、全てのベンチスケール一体化ランで予測された~88-90%よりも低かった。予測されたステップ収率は、すべてのクロマトグラフィー作業で超過された。

向上させたパラメータで最適化した、提案されたフェーズ３DAS181精製プロセスは、純度、精製回収率、及び活性の点で、DAS181基準に匹敵するか、又は場合によってはより良好な薬物物質を生じたと結論された。低いRP-HPLC純度という問題が前に経験されたが、RPクロマトグラフィーの代わりにCapto Adhereクロマトグラフィーで補正された。

実施例３
界面活性剤可溶化たんぱく質精製法の試薬の最適化パラメータ
界面活性剤可溶化プロトコルの様々な試薬の多様なパラメータを検定して、たんぱく質収率に基づいて検定の最適化のために比較した。まず、限られた範囲のSDS濃度と組み合わせた多様な濃度のトリトンを選択して、DAS181回収率について評価した。更に、多様な組合せのリン酸ナトリウム及びEDTA予備処置をｐＨ6で、7%のトリトンX-100及び0.1%のSDSを用いた界面活性剤可溶化法により、DAS181回収に対する効果について調べた。加えて、PEI処置の時間が、室温で最長５日間に上る保持時間中のDAS181の特徴に影響するかどうかを判定した。最後に、４℃で保存された、DAS181清澄化界面活性剤可溶化物の安定性を評価し、大規模製造用のSPクロマトグラフィー前に、許容できる保持時間を判定するために用いた。

方法
界面活性剤濃縮分析：発酵液をアリクォートし、界面活性剤可溶化精製法を行った。

界面活性剤を多様な濃度で添加し、３０℃で６時間、撹拌した。上清に陽イオン交換HPLCを行った。相対的ピーク面積（総ピーク面積の％）をピークＡ、Ｃ、及びＦについて判定した。DAS181濃度を、CEX総ピーク面積を既知の濃度の基準に比較することにより判定し、この濃度を、シアリダーゼ検定で判定された発酵回収率に正規化して回収率を出した（採集分の％）。10% PEI (50 mM リン酸カリウム、200 mM NaCl、最終 pH は6.0の中で) を添加することで、選択された界面活性剤可溶化試料を清澄させ、0.48%の最終濃度に達させた。上清に混濁度測定と、更なる精製を行った。

リン酸ナトリウム及びEDTA予備処置分析：
発酵液は２４時間の誘導後に採集された。ｐＨ8.7の二相性の七水和リン酸ナトリウム及びEDTA遊離酸を多様な濃度の組合せで添加した。試料に界面活性剤可溶化プロトコルを行った。上清を陽イオン交換HPLCにかけた。相対的ピーク面積（総ピーク面積の％）をピークＡ、Ｃ，及びＦについて判定した。DAS181濃度は、既知の濃度の基準に対して総ピーク面積を比較することによって判定され、この濃度を、発酵液採集収率に正規化して回収率を得た（採集の％）。

PEI清澄後透過可能な濃縮液の評価：
発酵液を２４時間の誘導後に採集した。試料に界面活性剤可溶化プロトコルを行った。PEIを最終濃度0.5%まで添加した。試料を多様な間隔と置いて発酵器から取り出した。上清にOD測定及び更なる精製法を行った。
PEI清澄後透過可能化物保存時間の評価：この研究で用いられた開始材料は、発酵作業から出た更に精製済みの透過可能化物だった。これらの試料に更なる精製法を行った。

結果
界面活性剤濃度分析：
界面活性剤トリトン及びSDSを、界面活性化可溶化プロトコル中に様々な濃度の組合せで添加した。結果的なDAS181の収率を表８に要約する。

表８：多様な濃度の組合せのトリトン及びSDSによる処置後のDAS181放出

表８（続き）

トリトンX-100濃度を1% から 8%に増すにつれ、SDS濃度が変化するためにDAS181収率には何の明確な傾向もなかったことから、SDSはそれ自体は重要な因子ではあるが、
その濃度の因子としては収率に影響しなかった。8% のトリトンX-100では、すべてのSDS濃度にわたって73%の平均収量回収率で、より狭い標準偏差のある、明確な回収率増加があった。従ってより高い濃度が調査された。安定な収率は5-9% トリトン X-100であることがみとめられた。収率は、9% トリトンX-100よりも高い濃度で減少し始めた。高いSDS濃度でのDAS181収率の減少傾向も認められた。試料採取中、9% を超えるトリトンX-100を含有する界面活性剤処置は、より低いトリトンX-100 濃度の試料よりも粘性が高いことが観察された。

試料をPEIで処置すると、5-9%のトリトンX-100濃度で一貫した収率があったが、検定ではばらつきがあった。収率の僅かな減少が10%以上のトリトン X-100で観察された。全体的な混濁度増加が、高いトリトンX-100 濃度を用いたプロトコールから分離された試料で観察された（表１０）。

表１０：多様な濃度の界面活性剤の組合せでPEI処置後のDAS回収率

最適なトリトンX-100濃度は、5-8%であると結論され、トリトン濃度への加工寛容度が実証された。DAS181収率は5-10%のトリトンX-100と一致したが、混濁度は5-8% のトリトンX- 100と一致した。これらのデータは0.05-0.2% のSDSと組み合わせた5-8%の範囲のトリトンX-100の使用を裏付けるものである。

リン酸ナトリウム及びEDTA予備処置解析：
当該データは、七水和リン酸ナトリウム及びEDTAの濃度を上昇させるとDAS181放出が概ね増加したことを示している（表１１）。更に、ｐＨ６の透過可能化前に予備処置をしなかったコントロール試料では、DAS181放出はほとんどないか、又は全くないことが観察された。所定の予備処置濃度の50 mM リン酸ナトリウム及び100 mM EDTA でｐＨ５で予備処置すると、ｐＨ６の同じ条件とほぼ同じパーセント回収率のDAS181が得られた（表１１）。

DAS181回収率に対する多様な界面活性剤透過可能化剤の効果

リン酸ナトリウム及びEDTAによる予備処置の組合せは、pDAS181 E. coliに有効なトリトンX-100及びSDS透過可能化を行わせてDAS181を放出させるために必要であると結論付けられた。全体的には、これらの観察は、界面活性剤透過可能化は幅広いリン酸ナトリウム及びEDTA濃度、ｐＨ条件、及びインキュベート時間にわたって強健であることを示唆している。ｐＨ６でのリン酸ナトリウム及び100 mM EDTA の組み合わせが最適な予備処置濃度として選択された。

PEI清澄化透過可能化物の評価：
室温に保持された、PEI処置から清澄させた上清の混濁度は保持時間を長くすると上昇する（表１２）。混濁度の上昇は、PEI処置時間の最も短い試料中で最大であり、混濁度の変化は、PEI処置時間がより長い試料中で最も小さかったことから、PEI処置時間が長くなると、沈殿物形成の少ない、清澄した材料が生じたことが確認された。７時間を超えるPEI処置は、２４時間以内の混濁度上昇が最も小さくなり、２０時間を超えるPEI処置では、測定された１２０時間という最長時間まで最高となる (OD600nm < 2.0) 。PEI処置時間が７時間を超える場合と比較すると、６時間未満のPEI処置では１２０時間で混濁度OD600nm は3.0 を越え、２４時間では混濁度は僅かに上昇した。

DAS181回収率を、PEI処置及び遠心分離直後に判定した。回収率は81 乃至 95% の範囲だった（表４及び図２）。試料点の大半は、83 乃至 89%の間で一致した回収率を有する。高速CEX-HPLC検定で測定したDAS181バリアントの比（ピークＡ、Ｃ及びＦ）は、検定の誤差内で一定であった（表１３）。主なDAS181ピーク（Ａ）は、全てのPEI処置について79.93% 乃至81.63%の間だった。ピークＣは 10.20%乃至 12.06%,の間であり、そしてピークＦは 7.81% 乃至8.91%の範囲だった。これらのデータは、長時間のPEI処置が、DAS181生成物の品質に悪影響をしないことを示すものである。

表１２：透過可能化物の混濁度に対するPEI処置時間及び清澄後保持時間の効果

PEI処置直後のDAS181回収及びDASバリアント・レベル

室温での２４時間の保持時間後、清澄させた透過可能化物の混濁度は、すべての処置時間で低いままだったが、６時間以上で最も低かったと結論付けられた。４８時間の保持後、混濁度の増加は、より長いPEI処置で最も小さい。DAS181バリアントの比はPEI処置時間で変化しなかった。これらのデータは、６時間を超えるPEI処置時間は、少なくとも２４時間、たんぱく質の良好な安定性を可能にしたことを示している。この研究は更に、PEI清澄化後の上清を、ろ過可能性に影響することなく少なくとも２４時間、保持できることも示している。

PEI成長過誤の透過可能化物保存時間の評価：
付加的に精製された清澄化後界面活性剤透過可能化物の混濁度は、４℃での１週間の保存後も上昇しなかった（表１４）。混濁度は保存の第１週から第２週で４６％、第２週から第３週で約７％、上昇した。

表１４：清澄化後の界面活性剤透過可能化物の混濁度

SP FFクロマトグラフィー回収率は、FT及びUTSP洗浄にわたってDAS181消失に何らかのばらつきがありながらも、各ラン毎に予測通りだった（表１５）。更なる精製時にはほぼ5-6% の消失が観察されたが、更なる精製後にはDAS 181 はほぼ何も観察されなかった

表１５：更なる精製後の生成物の分析比較のための収率及び質量バランス

付加的な、代替的な精製法による純度分析では、４℃で保持された、１乃至３週間後に調製されたSP溶出物は、新鮮な供給ストックで調製されたSP溶出物と同様であることが示された（表１６）。更なる精製にわたって比較的に高い純度が観察された。

更なる精製要約後の清澄化させた界面活性剤透過可能化物の安定性

更なる精製後の結果は、２週間の保存後に生じたSP溶出物中のピークＣのパーセント増加に見られるように、DAS181のデアミド化の僅かな増加を示した（表１６）。このデアミド化の程度は、清澄化後界面活性剤透過可能化物保存について実質的にT=O試料とすべて見なすことができる、更なる精製の最近のベンチ・インテグレーテッド（原語： Bench Integrated ）ラン試料と一致する。SDS-PAGE分析は、代替的な更なる精製の生成物間の一貫した安定性を示した（図９）。不純物のバンド強度は、１、２、及び３週間の４℃での保存後には、更なる精製後の試料とほぼ同一に見えた。T=O 試料の不純物は、他の試料よりも多いように見えたが、これは不可された試料が僅かに多かったことが原因かも知れない。

４℃で最高３週間、保持された供給ストックから生じた更なる精製後の試料の純度には何の減少もなかったことが判定された。しかしながら、CEXHPLC 分析では、２週間の保存後にデアミド化（ピークＣ）に僅かな増加が示された。清澄化させた界面活性剤透過可能化物は、得られた更なる精製済み試料のじゅんどに示すように、最高１週間、４℃で安定である。

DAS181 配列
DAS 181 (アミノ末端のMetなし)
GDHPQATPAPAPDASTELPASMSQAQHLAANTATDNYRIPAITTAPNGDLLISYDERPKDNGNGGSDAPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTIFNFHVKSYDQGWGGSRGGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDKPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGAVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPIGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDKNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPRPWSRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGYTTIAVQSDGSIGLLSEDAHNGADYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPAKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNP (SEQ ID NO:1)

DAS 181 (アミノ末端の Metあり)
MGDHPQATPAPAPDASTELPASMSQAQHLAANTATDNYRIPAITTAPNGDLLISYDERPKDNGNGGSDAPNPNHIVQRRSTDGGKTWSAPTYIHQGTETGKKVGYSDPSYVVDHQTGTIFNFHVKSYDQGWGGSRGGTDPENRGIIQAEVSTSTDNGWTWTHRTITADITKDKPWTARFAASGQGIQIQHGPHAGRLVQQYTIRTAGGAVQAVSVYSDDHGKTWQAGTPIGTGMDENKVVELSDGSLMLNSRASDGSGFRKVAHSTDGGQTWSEPVSDKNLPDSVDNAQIIRAFPNAAPDDPRAKVLLLSHSPNPRPWSRDRGTISMSCDDGASWTTSKVFHEPFVGYTTIAVQSDGSIGLLSEDAHNGADYGGIWYRNFTMNWLGEQCGQKPAKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNP (SEQ ID NO:2)

他の実施態様
本発明は詳細な説明との関連で解説されてきたが、前述の解説は描写を目的としたものであり、本発明の範囲を限定するものであり、本発明の範囲は付属の請求項の範囲によって定義されるものと理解されている。他の局面、利点、及び変更は、以下の請求項の範囲内にある。

Claims

目的のたんぱく質を発現する細菌細胞又は真菌から細胞内の目的たんぱく質を放出させる方法であって、
（ａ）細胞内の目的のたんぱく質を発現する細胞の培養物を提供するステップと；
（ｂ１）前記培養物を無機塩と接触させるステップ；前記添加された無機塩を含有する前記培養物を少なくとも１０分間、保持するステップ；前記添加された無機塩を含有する前記培養物をキレート剤に接触させるステップと；又は
（ｂ２）前記培養物を無機塩及びキレート剤に接触させるステップと；
（ｃ）前記添加された無機塩及び添加されたキレート剤を含有する前記培養物を少なくとも１０分間、保持するステップと；
（ｄ）選択的に、前記添加された無機塩及び添加されたキレート剤を含有する前記培養物のｐＨを４乃至９の間のｐＨに調節するステップと；そして選択的に、前記添加された無機塩及び添加されたキレート剤を含有する前記培養物を少なくとも１５分間、保持するステップと；
（ｅ）前記添加された無機塩及び添加されたキレート剤を含有する前記培養物を界面活性剤に接触させるステップと；
（ｆ）前記添加された無機塩、添加されたキレート剤、及び前記添加された界面活性剤を含有する前記培養物を少なくとも１時間、保持するステップと；
（ｇ）選択的に、前記添加された無機塩、添加されたキレート剤、及び前記添加された界面活性剤を含有する前記培養物の温度を下げるステップと；
（ｈ）前記添加された無機塩、添加されたキレート剤、及び前記添加された界面活性剤を含有する前記培養物を沈殿剤に接触させるステップと；
（ｉ）前記添加された無機塩、添加されたキレート剤、前記添加された界面活性剤、及び前記添加された沈殿剤を含有する前記培養物を少なくとも１時間、保持するステップと；
（ｊ）前記添加された無機塩、添加されたキレート剤、前記添加された界面活性剤、及び前記添加された沈殿剤を含有する前記培養物に、細胞片の実質的部分を取り除く方法を行うことで、目的のたんぱく質を含む組成物を提供するステップと；
（ｋ）遊離された前記目的のたんぱく質をクロマトグラフィーにより精製するステップ
を含み、
前記方法が、（ｉ）細胞の機械的破壊、（ｉｉ）培養培地の実質的全部を取り除くステップ、及び（ｉｉｉ）細胞壁物質を分解する酵素の添加、から成る群から選択される少なくとも二つのステップを含まない、方法。