JP4513967B2 - Ｄ−アミノアシラーゼの活性向上方法 - Google Patents

Description

本発明は、Ｄ−アミノアシラーゼの活性向上方法に関する。更に詳細には、Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に亜鉛を添加することを特徴とするＤ−アミノアシラーゼの活性向上方法に関する。

アミノ酸は、構造上、光学異性体を形成し得るが、天然に存在し、生命体に利用されるアミノ酸のほとんどはＬ体である。しかしながらＤ-アミノ酸が微量ながら生体中に存在する事実も近年次々と明らかにされており、それらが有する生理活性の有用性から、Ｄ−アミノ酸およびその誘導体が医薬品として利用されてきている。現在のところＤ−アミノ酸は醗酵生産が不可能であるため、その製造は有機合成法に頼らざるを得ない。しかしながら有機合成で生成されるアミノ酸は光学的にＬ体とＤ体が混在した状態であることから、光学異性体を分離し所望の光学活性を有するアミノ酸を抽出する操作が必要となる。この方法としてはＮ-アシル-ＤＬ-アミノ酸にＤ-アミノアシラーゼ（以下、「ＤＡＡ」ともいう）を作用せしめてＤ-アミノ酸を生成しこれを抽出する方法が公知である。

ＤＡＡを工業的な利用に十分な量で生産する手段としては、他の産業上利用しうる酵素及びその他の蛋白質と同様、当該蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて形質転換微生物を構築し、高発現を行う方法が適用可能である。このような遺伝子組換え体を用いたＤＡＡ生産量増大の方法として、培養培地に亜鉛を添加し、発現量を増大する方法が、天野エンザイム（株）より特許出願されている（特許文献１参照）。これによると、培養培地に亜鉛を添加することで発現量が増大し、その上昇度は終濃度２．０ｍＭとなるよう酸化亜鉛を添加した場合で無添加に比べ５倍程度である。

一方、ＤＡＡに関して、アルカリゲネス・キシロソーキシダンス・亜種キシロソーキシダンスＡ−６（Alcaligenes xylosoxydans subsp. xylosoxydans A-6）由来のものが詳細に調べられ、構造決定がなされている（非特許文献１参照）。これによると当酵素は活性中心に２個の亜鉛を配位しており、うち一個は脱アシル化活性に必須であって、亜鉛の配位がＤＡＡの活性に必須であるとされる。しかし、該文献には亜鉛の追添によるＤＡＡの活性増強は起こらないと記載されている。

またこれまで、亜鉛の存在が、ＤＡＡの構造安定化に関わるとの報告はなされていない。

即ち、亜鉛添加によるＤ−アミノアシラーゼの活性化及び／又は安定化については、これまで報告がなされていない。
国際公開００／７８９２６号パンフレット Journal of Biological Chemistry 2003, Vol.278, 4957-4962

本発明は、Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程において、酵素活性の高い状態を維持し、望む収量で精製ＤＡＡを得るための技術を提供することを主な目的とする。また、Ｄ−アミノアシラーゼを安定化及び／又は活性化する技術を提供することを主な目的とする。

本発明者は上記に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、微生物が産生したＤ−アミノアシラーゼの回収、精製および／または粉末化工程において、Ｄ−アミノアシラーゼ含有溶液もしくは処理工程に用いる溶媒又は溶液に亜鉛を添加することにより、亜鉛無添加の場合と比較して比活性の高められたＤＡＡを収率よく得られることを見いだし、更に鋭意検討を重ねて本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下の活性向上方法を提供するものである。

項１：Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に亜鉛を添加することを特徴とするＤ−アミノアシラーゼの活性向上方法。

項２：Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に亜鉛の終濃度が約０．００１〜約１ｍＭとなるように亜鉛を添加する項１に記載のＤ−アミノアシラーゼの活性向上方法。

亜鉛添加量を亜鉛とＤＡＡの結合比率の観点から表す場合には、Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に、Ｄ−アミノアシラーゼ１分子につき亜鉛分子約０．００６〜約５０分子となるように亜鉛を添加する項１のＤ−アミノアシラーゼの活性向上方法であることが好ましい。

項３：工程液が緩衝液である項１又は２に記載のＤ−アミノアシラーゼの活性向上方法。

項４：Ｄ-アミノアシラーゼの処理工程が、Ｄ−アミノアシラーゼ生産能を有する微生物が産生するＤ-アミノアシラーゼの処理工程である項１〜３のいずれかに記載のＤ−アミノアシラーゼの活性向上方法。

項５：Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程が、Ｄ−アミノアシラーゼ生産能を有する微生物が産生するＤ-アミノアシラーゼの回収、精製もしくは粉末化工程である、項４に記載のＤ−アミノアシラーゼの活性向上方法。

項６：Ｄ−アミノアシラーゼ生産能を有する微生物がＤ−アミノアシラーゼ生産能を有する形質転換微生物である項４又は５記載のＤ−アミノアシラーゼの活性向上方法。

項７：Ｄ−アミノアシラーゼがデフルビバクター・ルサチエンシス(Defluvibacter lusatiensis)由来である項１〜６のいずれかに記載のＤ−アミノアシラーゼの活性向上方法。

項８：活性向上方法が活性化方法であって、Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に、亜鉛の終濃度が約０．００１〜約０．１ｍＭとなるように亜鉛を添加する項１〜７のいずれかに記載のＤ−アミノアシラーゼの活性向上方法。

換言すると、Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に、亜鉛の終濃度が約０．００１〜約０．１ｍＭとなるように亜鉛を添加することを特徴とするＤ−アミノアシラーゼの活性化方法。

亜鉛添加量を亜鉛とＤＡＡの結合比率の観点から表す場合には、Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に、Ｄ−アミノアシラーゼ１分子につき亜鉛分子約０．００６〜約５分子となるように亜鉛を添加するＤ−アミノアシラーゼの活性化方法であることが好ましい。

項９：活性向上方法が安定化方法であって、Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に、亜鉛の終濃度が約０．０１〜約１ｍＭとなるように亜鉛を添加する項１〜７のいずれかに記載のＤ−アミノアシラーゼの活性向上方法。

換言すると、Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に、亜鉛の終濃度が約０．０１〜約１ｍＭとなるように亜鉛を添加することを特徴とするＤ−アミノアシラーゼの安定化方法。

亜鉛添加量を亜鉛とＤＡＡの結合比率の観点から表す場合には、Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に、Ｄ−アミノアシラーゼ１分子につき亜鉛分子約０．０６〜約５０分子となるように亜鉛を添加するＤ−アミノアシラーゼの安定化方法であることが好ましい。

本発明により、Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に亜鉛を添加することで、ＤＡＡ活性を向上させ、ＤＡＡを活性化及び／又は安定化することができ、或いはＤＡＡ活性の低下を抑制することができる。

更に、ＤＡＡの回収、精製及び／又は粉末化工程を含むＤＡＡの処理工程において、ＤＡＡの収率を大幅に改善することができる。

これにより、Ｄ−アミノアシラーゼ生産能を有する微生物、好ましくは、ＤＡＡ生産能を有する形質転換微生物から、高活性のＤＡＡを高収率で得ることができる。

本発明により高収率で得られる高活性のＤＡＡは、Ｄ−アミノ酸の製造にも好適に利用し得ることから、本発明はＤ−アミノ酸の製造効率の改善にも寄与しえる。

Ｄ−アミノ酸またはその誘導体は、生理活性の高い有用な物質として医薬品等における利用度が高まっており、本発明は、医薬品製造技術や、Ｄ−アミノ酸又はその誘導体の製造技術、更にはD−アミノアシラーゼの研究等に、大きく寄与し得るものである。

以下、本発明について、具体的に説明する。

Ｄ−アミノアシラーゼ
Ｄ−アミノアシラーゼ（以下、ＤＡＡともいう。）は公知の方法で得られるものを用いることができる。例えば、Ｄ-アミノアシラーゼ生産能を有する微生物により産生されたＤ−アミノアシラーゼを用い得る。

Ｄ−アミノアシラーゼ生産能を有する微生物としては、野生状態において固有遺伝子としてＤ−アミノアシラーゼ遺伝子を有しこれを発現する微生物、または、Ｄ−アミノアシラーゼをコードする遺伝子を各種遺伝子組換え用プラスミドに挿入し形質転換した遺伝子組換え微生物を用いることができる。Ｄ−アミノアシラーゼを安定かつ大量に産生させるためには、形質転換微生物を用いることが好ましい。

これらＤＡＡ生産菌を通常栄養培地で培養することでＤＡＡを安定かつ多量に産生させることができる。

形質転換微生物の場合、導入したプラスミドを保有する組換え菌のみを選択的に生育せしめるために抗生物質等の薬剤を添加することが望ましい。さらに挿入遺伝子上流に存在する発現プロモーター活性を誘導しうる物質を培地中に添加することが好ましい。このような誘導物質としては、例えばエシェリヒア・コリを宿主とした場合に多用されるｌａｃ等のプロモーターの系であれば、ラクトースもしくはイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などが挙げられる。これらを培地調製時もしくは培養途中の適当な時期に培地中に投入することでＤＡＡ発現量を増大させることができる。

ＤＡＡ生産菌の種類は特に限定されないが、アルカリゲネス・キシロソーキシダンス・亜種キシロソーキシダンス（Alcaligenes xylosoxydans subsp. xylosoxydans ）Ａ−６株、デフルビバクター・ルサチエンシス（Defluvibacter lusatiensis）Ａ１３１−３株などが挙げられる。

このうち、本発明は、特に、デフルビバクター・ルサチエンシス（Defluvibacter lusatiensis）由来のＤ−アミノアシラーゼに好適に適用し得る。

アルカリゲネス・キシロソーキシダンス・亜種キシロソーキシダンスＡ−６由来のＤＡＡについては、非特許文献１において、当酵素が活性中心に２個の亜鉛を配位しており、うち一個は脱アシル化活性に必須であることが報告されている。

デフルビバクター・ルサチエンシス由来ＤＡＡは、アルカリゲネス・キシロソーキシダンス由来ＤＡＡとアミノ酸配列上の相同性が２６％程度であり、相同性としては決して高いとはいえない。但し、アルカリゲネス・キシロソーキシダンス由来ＤＡＡにおいて亜鉛を配位する残基、基質のカルボキシル基をトラップする残基あるいは基質の疎水性残基が位置すると推定される疎水ポケットに属する残基など、ＤＡＡとしての機能に関わる残基として同定されているアミノ酸残基の多くは、デフルビバクター・ルサチエンシス由来ＤＡＡ中においても保存されているかもしくは類似した性質を有するアミノ酸残基に置き換わっており、おそらくはアルカリゲネス・キシロソーキシダンス由来ＤＡＡに類似した機構を有するものと推測される。

Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液
本発明のＤＡＡ活性向上方法においては、ＤＡＡに接触する溶液又はＤＡＡ溶液、即ち、Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に、亜鉛を添加することを特徴とする。このとき、Ｄ−アミノアシラーゼの供給段階、例えば、ＤＡＡ生産菌の培養段階や未精製ＤＡＡ原料等における亜鉛の有無は特に限定されない。

工程液とは、Ｄ−アミノアシラーゼを処理する工程に用いる各種溶媒又は溶液を意味する。
処理工程が多数の工程から構成される場合には、そのうち、１又は複数の工程で用いる溶媒又は溶液を意味する。

溶媒としては、緩衝液が挙げられる。また、溶液としては、例えば、抽出液、分離液、溶出液等が挙げられ、緩衝液を溶媒とする溶液が好適に用いられる。

緩衝液としては、例えば、ｐＨ６〜９程度の範囲において緩衝能を有するＫ−リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液等が挙げられる。

また、Ｄ−アミノアシラーゼ含有溶液としては、具体的には、Ｄ−アミノアシラーゼを産生する微生物の培養液、Ｄ−アミノアシラーゼの粗抽出液又は精製溶液等が挙げられる。

Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に添加する亜鉛の量は、本発明の効果を奏し得る範囲で適宜設定し得るが、亜鉛の終濃度が約０．００１〜約１ｍＭの範囲が好ましく、約０．０１〜約０．１ｍＭの範囲がより好ましい。

より具体的に、活性化の効果を奏するためには、亜鉛の終濃度が約０．００１〜約０．１ｍＭの範囲であることが好ましく、安定化の効果を奏するためには、約０．０１〜約１ｍＭの範囲であることが好ましい。

ＤＡＡの活性が変動的であることから概算となるが、亜鉛添加量を亜鉛とＤＡＡの結合比率の観点から表す場合、好ましい亜鉛添加量はＤＡＡ１分子につき亜鉛約０．００６〜約５０分子程度である。具体的に、活性化の効果を奏するための好ましい亜鉛添加量は、ＤＡＡ１分子につき亜鉛約０．００６〜約５分子程度、安定化の効果を奏するための好ましい亜鉛添加量はＤＡＡ１分子につき亜鉛約０．０６〜約５０分子程度である。

また、亜鉛を添加する時点での溶液中の、ＤＡＡを含む可溶性蛋白質濃度は、約１〜約１００ｍｇ／ｍｌ程度であることが好ましい。

Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液には、種々の安定化剤等、公知の添加物を、本発明の効果が奏し得る範囲内で、所望に応じて適宜溶解してもよい。

Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に亜鉛を添加する方法及び／又は手段は特に限定されないが、例えば、Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に、亜鉛の塩化物、硫酸塩、酢酸塩等の固体化合物を、所望の終濃度となるような量で投与及び溶解する方法や、それら固体化合物を高濃度で溶解した溶液を予め作製し、この高濃度溶液を所望の終濃度となるような量でＤ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に添加する方法が挙げられる。

Ｄ-アミノアシラーゼの処理工程
本発明は、Ｄ−アミノアシラーゼにおける処理工程の工程液に亜鉛を添加することより、ＤＡＡを活性化及び／又は安定化する方法を提供する。

Ｄ−アミノアシラーゼを処理する工程の種類や条件は、本発明の効果を奏し得る範囲であれば、特に限定されないが、ＤＡＡ生産能を有する微生物、好ましくはＤＡＡ生産能を有する形質転換微生物が産生するＤＡＡの回収、精製、もしくは粉末化工程において、特に好適に利用し得る。

・Ｄ−アミノアシラーゼの回収工程
本発明において、ＤＡＡの回収工程には、ＤＡＡ生産菌を培養した培養液もしくは培養菌体からＤＡＡを含む粗抽出画分を回収する工程又は回収するための各種処理工程が包括される。

ＤＡＡが培養液中に存在する場合の工程としては、例えば、ＤＡＡ生産菌の培養終了後に、遠心分離もしくはろ過により、培養上清を培養菌体から分離する工程が挙げられる。

また、ＤＡＡが菌体内に蓄積する場合の工程としては、例えば、遠心分離等により培養上清を除く工程、培養菌体を緩衝液等の溶媒に再懸濁し、菌体を破砕する工程、菌体破砕後の液からＤＡＡを抽出する工程等が挙げられる。

菌体を破砕する方法等の条件は特に限定されないが、例えば、超音波破砕、フレンチプレス或いはダイノミル等の機械的な破砕、もしくは、リゾチームなどによる酵素的破砕方法が挙げられる。

具体的態様としては、例えば、遠心分離もしくはろ過により、培養上清を培養菌体から分離する工程において、ＤＡＡ生産菌の培養終了後の培養液中に亜鉛を添加し、遠心分離もしくはろ過を行う場合が挙げられる。また、例えば、菌体を破砕する工程において、亜鉛を添加した緩衝液に培養菌体を再懸濁し、菌体を破砕する場合が挙げられる。

・Ｄ−アミノアシラーゼの精製工程
本発明において、Ｄ−アミノアシラーゼの精製工程には、粗抽出蛋白質からより純度の高いＤＡＡを得る工程又はより純度の高いＤＡＡを得るための各種処理工程およびそれらに準じる精製工程が包括される。

粗抽出蛋白質からより純度の高いＤＡＡを得る工程としては、例えば水溶性有機溶媒による分別沈降、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等を用いた塩析処理、加温処理、ろ過、等電点電気泳動、透析、遠心除濁、並びに、ゲルろ過・疎水・イオン交換・アフィニティー等各種クロマトグラフィーを用いた分離等の各処理工程が挙げられる。

これらに準じる精製工程としては、例えば、濃縮工程、添加剤添加工程が挙げられる。濃縮工程としては、例えば、膜濃縮や減圧濃縮が挙げられる。添加剤添加工程としては、例えば、活性化剤添加工程、安定化剤添加工程等が挙げられる。

また、精製したＤＡＡ溶液に亜鉛を添加し活性化を図るような工程も含まれる。

Ｄ−アミノアシラーゼ精製工程に用いる工程液又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液としては、例えば、各種緩衝液、Ｄ−アミノアシラーゼ粗抽出液等が挙げられる。緩衝液としては、例えば、ｐＨ６〜９程度の範囲において緩衝能を有するＫ−リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液等が挙げられる。

具体的態様としては、例えば、上述の精製工程およびそれに準じる精製工程において、適当量の亜鉛を添加した緩衝液を用いる場合が挙げられる。より具体的に、クロマトグラフィーの溶出液、濃縮における抽出液、遠心除濁における分離液として、亜鉛を添加した緩衝液を用いる場合が挙げられる。また、Ｄ−アミノアシラーゼ含有溶液に亜鉛を添加して、上述の各精製処理に供する場合が挙げられる。

・Ｄ−アミノアシラーゼの粉末化工程
本発明においてＤ−アミノアシラーゼの粉末化工程には、ＤＡＡ、好ましくは精製ＤＡＡを、粉末化する工程及び粉末化するための各種処理工程及びそれらに準じる工程が包括される。

粉末化工程には、例えば、自然乾燥、凍結乾燥、低温乾燥、熱風乾燥等の各種乾燥工程が含まれる。また、造粒化する工程も含まれる。

具体的態様としては、例えば、Ｄ−アミノアシラーゼ含有溶液に、適当量の亜鉛を添加して、凍結乾燥に供する場合が挙げられる。

活性向上方法
本発明において、ＤＡＡの活性向上方法とは、ＤＡＡの活性化及び／又は安定化を目的とする方法全般を包括する概念であり、ＤＡＡの活性化方法及び安定化方法を包含する。

本発明において、活性化とは、酵素が本来有しえる活性を十分に発揮できない状態において、立体構造の適正化、補酵素やリガンド等の付与により、該酵素の活性をより高める処理を含む。また再び活性を向上させる再活性化を含む。

活性化は、酵素に安定化効果のあるとされる添加物を添加し、適当な条件でインキュベートした後、酵素活性が添加物無添加の場合と比して上昇しているかどうかを確認することで調べることができる。

また、本発明において、安定化とは、酵素の立体構造の適正化等により、酵素活性が不可逆的に低下するのを抑制する処理を含む。

安定化は、粉末もしくは溶液状態の酵素を長期保存した後の活性の残存率を測定することで調べることができる。一般的に、常温を超える温度で一定時間加温処理した後の活性残存率が高い酵素は安定性に優れた酵素とみなすことができるので、酵素を加温処理後、活性残存率を測定することにより、安定化の効果を調べることもできる。

活性化のための亜鉛の添加は、ＤＡＡ溶液における亜鉛の終濃度が約０．００１〜約０．１ｍＭの範囲となるように調製することが好ましい。

亜鉛添加量を、亜鉛とＤＡＡとの結合比率の観点から考えると、ＤＡＡ１分子に対し亜鉛が約０．００６〜約５分子程度、特に約０．０１〜約１分子程度となるように調製することが好ましい。

また、亜鉛を添加する時点での溶液中のＤＡＡを含む可溶性蛋白質濃度が約１〜約１００ｍｇ／ｍｌ、特に約４〜約８０ｍｇ／ｍｌ程度とすることが好適である。

安定化のための亜鉛の添加濃度は、ＤＡＡ溶液における亜鉛の終濃度が約０．０１〜約１ｍＭの範囲となるように調製することが好ましい。

亜鉛添加量を亜鉛とＤＡＡとの結合比率の観点から考えると、ＤＡＡ１分子に対し亜鉛が約０．０６〜約５０分子程度、特に約０．１〜１０分子程度となるように調製することが好ましい。

また、亜鉛を添加する時点での溶液中のＤＡＡを含む可溶性蛋白質濃度が１〜１００ｍｇ／ｍｌ、特に４〜８０ｍｇ／ｍｌ程度とすることが好適である。

以下、本発明を実施例及び比較例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

測定方法
（１）ＤＡＡ活性
以下の実施例において、Ｄ−アミノアシラーゼ（ＤＡＡ）の活性は以下のように測定した。

＜試薬＞
Ｋ−リン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０)８．７ｍｌに、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ溶液（バイオザイム社製、２０Ｕ／ｍｌ）１ｍｌ、４−アミノアンピシリン溶液（第一化学薬品製、６．１ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌ、ＴＯＯＳ溶液（同仁化学研究所製、３２．２ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌ、ペルオキシダーゼ溶液（東洋紡績製ＰＥＯ−３０１、３００Ｕ／ｍｌ）０．１ｍｌを混合して第一反応試薬とした。

＜測定条件＞
第一反応試薬１．５ｍｌと酵素溶液０．１ｍｌをキュベット中で混合し、３７℃で１分間予備加温する。２５ｍＭ Ｎ−アセチル−ＤＬ−バリン溶液（東京化成製）１．４ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に、３７℃に制御された分光光度計で、５５５ｎｍの吸光度変化を１０分記録し、その吸光度変化を測定する。盲検は、酵素を溶解する溶媒を、酵素溶液の代わりに試薬混液に加えて、同様に吸光度変化を測定する。あらかじめＤ−バリン標準液を用いて作成した検量線を元に１分間あたりに生成したＤ−バリン量を算出する。上記条件下で１分間に１マイクロモルのＤ−バリンを生成する酵素量を１単位（１Ｕ）として酵素活性を算出する。

（２）蛋白質濃度及び総蛋白質量
蛋白質濃度および総蛋白質量は以下のように求めた。
２８０ｎｍにおける吸光度が０．１〜１．０ＡｂｓとなるようＤＡＡ溶液を蒸留水で希
釈し、この希釈液の２８０ｎｍにおける吸光度を紫外分光光度計で測定する。

ここでは１Ａｂｓ＝約１ｍｇ／ｍｌ蛋白質と近似し、これに基づいて溶液中の蛋白質濃度を算出した。

このように求められた蛋白質濃度に液量を乗じることで総蛋白質量を算出する。

＜実施例１＞
（１）遺伝子組換えによるＤ-アミノアシラーゼ生産菌の構築と培養
デフルビバクター・ルサチエンシス Ａ１３１−３株由来のＤ−アミノアシラーゼをコードする構造遺伝子を、発現ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＮ（＋）のｌａｃプロモーター制御下に位置するマルチクローニングサイトに挿入し、発現プラスミドｐＤＡＡ３を構築した。挿入したＤ−アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。このｐＤＡＡ３を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡績製コンピテントハイＪＭ１０９）を当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、ＤＡＡ生産菌コロニーを２００μｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）を含むＬＢ寒天培地上に得た。このＤＡＡ生産菌コロニーを、５００ｍｌ容坂口フラスコ中の２００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む０．５×ＬＢ液体培地２００ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で１６時間振とう培養して種培養液を得た。ＤＡＡ生産培地（１．０％グリセリン、１．２％ポリペプトン、２．４％酵母エキス、１．２５％リン酸２カリウム、０．２３％リン酸１カリウム、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ、２００μｇ/ｍｌアンピシリン、ｐＨ７．４）６リットルを１０リットル容ジャーファーメンター中に調製したのち種培養液を投入し、通気量２Ｌ/分、攪拌数４８０ｒｐｍ、培養温度３７．５℃で１８時間通気攪拌培養した。培養終了時に測定した菌体濁度（６６０nm吸光度）は１５．３であった。

（２）ＤＡＡ生産菌からのＤＡＡ回収
（１）で得られた培養液を５００ｍｌ容遠心チューブに分注し、日立製作所製高速遠心機を用いて回転数８０００ｒｐｍで１０分遠心し、デカントにより上清を除いて培養菌体を得た（得られた培養菌体は、以降、「培養菌体Ｉ」とも称す。）。この培養菌体の一部をとり、酢酸亜鉛二水和物を溶解した５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）もしくは亜鉛を含有しない５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に添加して、菌体濁度１８となるよう懸濁し、再懸濁液を得た。酢酸亜鉛二水和物を溶解した５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液は、亜鉛の終濃度が０．００１ｍＭ、０．００１ｍＭ、及び０．１ｍＭとなるよう、調製した。

各再懸濁液１ｍｌを、２ｍｌ容マイクロチューブに入れた後、ガラスビーズを添加して、安井器械製ビードビーダーを用いて破砕した。これを卓上遠心機で１２０００ｒｐｍ５分遠心してビーズおよび菌体残渣を沈殿させたのち、上清のＤＡＡ活性を測定した。結果を表１に示す。

（３）ＤＡＡ活性の評価

亜鉛無添加の場合もＤＡＡ活性を有しているが、これは培地に使用している培地成分が含む亜鉛及び水に微量存在する亜鉛イオンを配位し活性を発現していることの影響によると考えられる。

表１に示すとおり、菌体を破砕する工程に用いた緩衝液に亜鉛を添加した場合に、亜鉛終濃度が０．００１ｍＭ乃至０．１ｍＭの範囲において、亜鉛無添加と比較してＤＡＡ活性が高まっていることがわかった。特に終濃度０．０１ｍＭとなるように亜鉛を添加した場合においては、無添加の場合と比較して、２０％程度高いＤＡＡ活性が示された。すなわち菌体を破砕する工程に用いる工程液に亜鉛を添加したことで、より比活性の高められたＤＡＡ粗抽出液が得られることがわかった。

＜実施例２＞
（１）ＤＡＡ粗抽出液からの精製及び粉末化
実施例１で得られた培養菌体Ｉを二分し、一方は２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（Ａ）に懸濁して懸濁液（２−Ａ）を調製し、他方は酢酸亜鉛０．０１ｍＭを含有する２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（Ｂ）に懸濁して懸濁液（２−Ｂ）を調製した。

懸濁液（２−Ａ）は、続いてフレンチプレスによる菌体破砕を行った。さらに、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を溶媒に用いて、陰イオン交換樹脂によるクラマトグラフィー、限外膜を用いた濃縮（蛋白質濃度が３０乃至５０ｍｇ／ｍｌとなるよう濃縮）、遠心分離（日立製作所製高速遠心機使用、回転数１２０００ｒｐｍ、１０分間）による除濁（遠心除濁）、及びＧ−２５セファロース（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いたゲルろ過の各処理工程を行い、精製ＤＡＡを得た。さらにこれを凍結乾燥して粉末化した。

この全工程に渡り、亜鉛を含有しない緩衝液（Ａ）を用いた場合についての工程推移、総活性、比活性及び収率を表２に示す。

ここで、比活性とは、ＤＡＡ活性（総活性）／蛋白質量（総蛋白質量）を示す。精製工程で蛋白質量が変動することから、比活性も指標とした。

また、収率とは、菌体破砕から各工程終了後までの収率を示す。

一方、亜鉛添加緩衝液（Ｂ）を用いた懸濁液（２−Ｂ）を、フレンチプレスにより菌体破砕した後、二分して、懸濁液（２−Ｂ１）及び懸濁液（２−Ｂ２）とした。

懸濁液（２−Ｂ１）を、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（Ａ）を溶媒に用いて、懸濁液（２−Ａ）を用いた工程と同様に、陰イオン交換クロマトグラフィー、濃縮、遠心除濁、ゲルろ過、凍結乾燥の各処理を行った。

この、菌体破砕工程のみ亜鉛添加緩衝液（Ｂ）を用いた場合についての工程推移、総活性、比活性及び収率を、表３に示す。

また、懸濁液（２−Ｂ２）を、亜鉛終濃度０．０１ｍＭの酢酸亜鉛を添加した２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（Ｂ）を溶媒に用いて、懸濁液（２−Ａ）を用いた工程と同様に、陰イオン交換クロマトグラフィー、濃縮、遠心除濁、ゲルろ過、凍結乾燥を行った。

このように全工程に渡って亜鉛添加緩衝液を用いた場合についての工程推移、総活性、比活性及び収率を、表４に示す。

（２）ＤＡＡ活性の評価

表２から明らかなように、回収、精製及び粉末化の各工程において亜鉛を含有しない緩衝液を用いた場合では、酵素活性の大幅な低下がおこり、通常ならば酵素の精製が進行するに従って比活性も向上すべきところが、逆に酵素の精製が進むにつれ、比活性が低下した。

一方、表３に示すとおり、菌体破砕工程において亜鉛を添加した緩衝液を用いた場合では、このような比活性低下は抑えられ、かつＤＡＡの収率も全工程亜鉛を添加しなかった表２に示す場合に比べ改善されていた。

このことから、ＤＡＡ回収工程において工程液に亜鉛を添加することは、ＤＡＡ活性の向上のみならず、以後の工程における活性の低下を抑える効果があるといえる。

また、全工程に渡って亜鉛を添加した緩衝液を用いた表４に示す場合では、酵素比活性およびＤＡＡの工程収率において大幅な改善が見られた。精製ＤＡＡの比活性は、全工程で亜鉛を添加していない緩衝液を用いた表２に示す場合のおよそ２５０％であった。また菌体破砕から凍結乾燥終了後までの収率は１１３．１％であり、菌体破砕段階の収率と比較しても、精製後に収率が向上しており、高い総活性を有する精製ＤＡＡを得ることができることがわかった。

このように、亜鉛を添加することで、ＤＡＡの安定性が向上するのみならず、ＤＡＡが活性化し、酵素活性をより高める効果があることがわかった。

＜実施例３＞
精製ＤＡＡ溶液への亜鉛添加による再活性化
実施例２において、菌体破砕工程のみ亜鉛を添加した緩衝液を用いて得られた精製ＤＡＡ溶液９００μｌを１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに入れ、これに種々の濃度の酢酸亜鉛水溶液１００μｌもしくは蒸留水１００μｌを加えて、サンプルを作成した。これらサンプルを２５℃恒温槽中で３時間インキュベートし、ＤＡＡ活性を測定した。結果を表５に示す。

亜鉛終濃度が０．００１ｍＭ乃至０．１ｍＭの範囲となるように亜鉛を添加した場合は、亜鉛無添加の場合と比べて高い活性を示し、最大で亜鉛無添加の場合との比率は約１１７％に達した。

好ましい亜鉛終濃度の範囲は０．０１ｍＭから０．１ｍＭであり、この範囲で亜鉛添加による再活性化の効果が高いことがわかった。

但しこれによって回収及び精製工程中に失われた分の活性が完全に戻るわけではない。

精製工程液への亜鉛添加は、活性化のみならず酵素を安定化して不可逆的な失活を抑える効果も持ち合わせていると考えられる。

＜実施例４＞
精製ＤＡＡ溶液への亜鉛添加による安定化
実施例２において、菌体破砕工程のみ亜鉛を添加した緩衝液を用いて得られた精製ＤＡＡ溶液９００μｌを、１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに入れ、これに種々の濃度の酢酸亜鉛水溶液１００μｌもしくは対照として蒸留水１００μｌを加えてサンプルとした。これらサンプルを４０℃で１時間加温処理し、加温前と加温後のＤＡＡ活性の変動を調べた。また、加温処理前の活性に対する加温処理後の活性を活性残存率として表した。結果を表６に示す。

表６に示すとおり、０．０１〜１ｍＭの範囲でＤＡＡ溶液に亜鉛を添加することで、活性残存率が向上した。

特に亜鉛終濃度０．１ｍＭの場合では、加温処理前のＤＡＡ活性に対し、３０％を超える活性増強が見られた。

亜鉛終濃度が１ｍＭになると活性値の低下が顕著になるものの、加温処理後の活性残存率としては高く、この濃度においても安定化効果があるものと考えられる。この効果はＤＡＡの構造安定性等に関与していると考えられる。

以上から、ＤＡＡ溶液への亜鉛の添加は、ＤＡＡを安定化し活性の低下を抑える効果があると考えられる。そしてこの効果がＤＡＡの高い収率に寄与すると考えられる。

Claims (2)

1. Ｄ−アミノアシラーゼの処理工程に用いる溶媒若しくは溶液、又はＤ−アミノアシラーゼ含有溶液に、亜鉛の終濃度が０．００１〜０．１ｍＭとなるように亜鉛を添加するＤ−アミノアシラーゼの活性化方法。
2. Ｄ−アミノアシラーゼがデフルビバクター・ルサチエンシス(Defluvibacter lusatiensis)由来である請求項１に記載のＤ−アミノアシラーゼの活性化方法。