CN113061590A

CN113061590A - 藻毒素降解酶及复合材料与应用

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Publication number: CN113061590A
Application number: CN202110439927.5A
Authority: CN
Inventors: 冯玲玲; 刘红林; 郭小亮; 程才; 闫明月; 何炎林
Original assignee: Central China Normal University
Current assignee: Central China Normal University
Priority date: 2021-04-23
Filing date: 2021-04-23
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2041-04-23
Also published as: CN113061590B

Abstract

本发明涉及生物、农渔业和环境保护领域，公开了一种藻毒素降解酶及复合材料与应用，本发明公开了一种(a)或(b)所示的藻毒素降解酶：(a)由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的藻毒素降解酶；(b)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活性不变的由(a)衍生的蛋白质，或者，在SEQID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质。本发明改造后藻毒素降解酶的产量和酶降解藻毒素的活性比改造前的野生型藻毒素降解酶高，且产量和酶活性均得到提高，0℃时半衰期也较长。

Description

藻毒素降解酶及复合材料与应用

技术领域

本发明涉及生物、农渔业和环境保护领域，具体地，涉及一种藻毒素降解酶及复合材料与应用。

背景技术

近几十年来水资源富营养化程度日益严重，加之气候变暖，蓝藻水华在发生频率、强度和持续时间等方面不断加大、增强，导致世界范围内水质受损严重，各地不断大规模爆发蓝藻水华事件。更糟糕的是，蓝藻水华，尤其是有害微囊藻水华(Harmful MicrocystisBlooms,HMBs)，产生的微囊藻毒素(Microcystins,MCs)会导致动物和人类致癌甚至死亡(Huisman等，Nat.Rev.Microbiol.2018,16,471-483；Xiao等，Biol.Rev.2018,93,1399-1420)。HMBs和MCs直接影响周边地区生活用水和工业用水，严重破坏生态系统，给农业、渔业生产和旅游业发展带来巨大的经济损失，也给公众健康带来极大隐患。因此，减少蓝藻水华和降解藻毒素以保护水环境并维持其可用性迫在眉睫。

常用抑制或杀灭蓝藻的方法有：(1)物理法，如换水、人工打捞、紫外辐射等；(2)化学杀藻剂法，如以硫酸铜为代表的重金属化合物类杀藻剂，以高锰酸钾、过氧化物为代表的强氧化剂类杀藻剂，以敌草隆等为代表的除草剂类杀藻剂。以上方法没有考虑去除水体中藻毒素的问题。细菌、链霉菌等生物法降解藻毒素具有一定的吸引力，但降解藻毒素效率低，同时可能向水体中分泌未知的有毒物质或成为新的生态危害，具有潜在的风险。因此，开发一种安全有效的去除MCs和HMBs的方法仍然是一个重大挑战。

目前已经从富营养化湖泊和水库中鉴定出一些能有效降解藻毒素的天然菌株，但其降解效率相对较低，在藻毒素水平较高的水体中应用潜力有限。生物酶法降解藻毒素因具有专一、高效且不会产生有毒物质等特点而备受关注(Dexter,et al.Water Research,2021,189,116646)。研究发现藻毒素降解酶(Microcystinase,MlrA)不仅可以将环状高毒的MCs降解为低毒或无毒的线状MCs，而且还可抑制或杀灭蓝藻，达到杀藻和解毒双重功效，有望实现MCs和HMBs的综合治理(Liu et al.,Environ.Sci.Techol.,2020,54,8811)。但野生型的游离酶MlrA的应用仍存在产量及活性较低、易失活或变性、稳定性差等问题。

酶固定化是目前普遍认为可以提高酶稳定性、改善酶性能的有效途径之一。用于固定酶的材料有许多种，由于不同的酶具有不同的结构特点和酶学性质，所以并不存在适合所有酶的特定固定化材料和固定化酶方法。针对不同的酶，人们提出了不同固定化酶的解决方法，比如，CN104569099A采用1-氨基芘修饰还原氧化石墨烯为载体材料，利用戊二醛交联固定酪氨酸酶。CN105713892B公开了一种介孔硅球利用低温吸附法固定芳香化酶的方法，获得的固定化酶半衰期和重复使用率均提高。CN106191025B公开了一种利用氧化石墨烯-金属离子配位固定化酶的方法，利用金属离子的配位作用，不仅可使氧化石墨烯均匀分散，增大酶的负载量，并且通过与酶组氨酸标签的配位相互作用，实现酶在石墨烯上的固定化。上述专利文献针对不同的酶选择不同的材料和不同的固定化酶方法来提高酶的应用潜能。吴湘等用L-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯材料来固载MlrA，得到的固定化MlrA可以降解节球菌藻毒素(Nodularin)，固定化酶及降解产物无明显细胞毒性，0℃时固定化酶半衰期从4天延长到8天。但是，该固定化材料固载酶的效率偏低，1g L-半胱氨酸修饰的氧化石墨烯材料120分钟固载MlrA负载量仅为89.77mg，应用于实际生产仍有很大的难度(Wu,etal.,Environmental Pollution,2020,258,113653)。

综上所述，要充分发挥MlrA的应用潜能，用单一酶MlrA来杀藻和降解藻毒素，还需要一方面通过生物技术对MlrA编码基因进行修饰或改造以提高MlrA的产量和活性。另一方面通过对固载MlrA的材料、固定化方法等进行探索以提高MlrA降解效率、稳定性，降低生产成本，提高MlrA的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种藻毒素降解酶及复合材料与应用。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种(a)或(b)所示的藻毒素降解酶：

(a)由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的藻毒素降解酶；

(b)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活性不变的由(a)衍生的蛋白质，或者，在SEQ ID NO：2、SEQID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质。

第二方面，本发明提供了一种能够编码第一方面所述的藻毒素降解酶的基因。

第三方面，本发明提供了一种含有第二方面所述的基因的表达载体。

第四方面，本发明提供了一种含有第三方面所述的表达载体的表达菌株。

第五方面，本发明提供了一种制备藻毒素降解酶的方法，该方法包括：(1)培养第四方面所述的表达菌株，诱导藻毒素降解酶的编码基因的异源表达；(2)获得第一方面所述的藻毒素降解酶。

第六方面，本发明提供了一种具有降解藻毒素功能的复合材料，该复合材料包括石墨烯材料和固载于所述石墨烯材料上的第一方面所述的藻毒素降解酶。

第七方面，本发明提供了一种第一方面所述的藻毒素降解酶、第二方面所述的基因、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的表达菌株及第六方面所述的复合材料在抑制蓝藻生长和/或降解藻毒素中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明改造后的藻毒素降解酶的产量和酶活性比改造前的野生型藻毒素降解酶高，且蛋白产量提高1.1-2倍以上，酶活性提高1.2-5倍以上，0℃时半衰期为10-12天；(2)在优选的实施方式中，使用富氧石墨烯材料(FGOs)负载酶，1g FGOs负载量酶量可达到1000-1900mg/g左右，有效降低了生产成本，更具有工业应用价值；(3)在优选的实施方式中，获得的藻毒素降解酶复合材料(固定化藻毒素降解酶)稳定性更高，具体地，藻毒素降解酶复合材料0℃时半衰期可长达为25天，同时具有更高的热稳定性和pH稳定性；(4)在优选的实施方式中，本发明获得的藻毒素降解酶复合材料不仅消除了石墨烯材料对人源细胞的毒性，而且可以降解多种藻毒素，同时还可以抑制蓝藻的生长或杀灭蓝藻，可以应用于农业、渔业(包括水产养殖等)生产及水环境污染处理中。

附图说明

图1示出了藻毒素降解酶MlrAs的SDS-PAGE图，其中：1.MlrA，2.H6MA，3.MH6A，4.MAH6；

图2示出了制备的FGOs形貌表征SEM图谱，其中：1.FGO0，2.FGO1，3.FGO2，4.FGO3，5.FGO4。

具体实施方式

本文所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明提供的藻毒素降解酶为(a)或(b)：

(b)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活性不变的由(a)衍生的蛋白质，或者，在SEQ ID NO：2、SEQID NO：3或SEQ ID NO：4的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质。其中，酶活性不变是指在相同的测定条件下，由(a)衍生的蛋白质的酶活力与(a)的酶活力之间的百分比(相对活性)不低于95％(或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。

组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水口袋结构的作用)没有改变，对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述藻毒素降解酶的任意一个氨基酸残基位置上。

如前所述，本发明提供的藻毒素降解酶还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所述“衍生的蛋白质”指与具有上述氨基酸序列的藻毒素降解酶具有氨基酸序列上的差异，也可以有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术。所述“衍生的蛋白质”还包括具有天然L型氨基酸的残基的类似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、γ-氨基酸等)的类似物。

修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。

为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对(a)进行添加修饰，举例来说，(b)可以通过在(a)的氨基末端和/或羧基末端连接下表I所示的标签(如Poly-Arg、Poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ和c-myc中的至少一种)而获得。所述标签不会影响本发明的藻毒素降解酶的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。

表I常用的修饰标签

标签	残基数	氨基酸序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR(SEQ ID NO：9)
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH(SEQ ID NO：10)
			FLAG	8	DYKDDDDK(SEQ ID NO：11)
Strep-tagⅡ	8	WSHPQFEK(SEQ ID NO：12)
			c-myc	10	EQKLISEEDL(SEQ ID NO：13)

上述藻毒素降解酶可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。

本发明还提供了能够编码上述藻毒素降解酶的基因。相应地，所述基因可以为如下的(1)或(2)：

(1)核苷酸序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码的藻毒素降解酶的酶活性不变的DNA分子。其中，所述严格条件可以为：在6×SCC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SCC，0.1％SDS和1×SCC，0.1％SDS各洗膜一次。酶活性不变是指在相同的测定条件下，由(2)编码的蛋白质的酶活力与(1)编码的蛋白质的酶活力之间的百分比(相对活性)不低于95％(或96％，或97％，或98％，或99％，或100％)。

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的重组藻毒素降解酶活性不变的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可以通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述藻毒素降解酶活性一致的氨基酸序列。

优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。

如上所述，相应地，核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有上表I所示的标签的编码序列。

本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。

一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。

此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。

本发明提供的表达载体含有本发明提供的基因。

表达载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选pMAL-C2X质粒。表达载体构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种核酸内切酶(如对于pUC18，可用SalⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ等；对于pET28a，可用NdeⅠ、NheⅠ、EcoRⅠ、BamH、HindⅢ等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连接，获得重组质粒。本发明优选采用BamHI和HindIII双酶切pMAL-C2X及与其连接的基因片段，经连接酶连接，构建得到表达载体。

本发明提供的表达菌株含有本发明提供的表达载体。

可以通过本领域常规的方法将所述表达载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为杆状菌(如大肠杆菌(Escherichiacoli)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、酵母菌(如毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或曲霉菌(如黑曲霉Aspergillus niger)，更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌(如Escherichia coliTB1)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)及毕赤酵母(Pichia pastoris)。

本发明提供的制备藻毒素降解酶的方法包括：培养本发明提供的表达菌株，诱导编码藻毒素降解酶的基因的表达；分离提纯所表达的藻毒素降解酶。所述培养条件为常规的培养条件，如使用LB培养基(溶剂为水，溶质及其终浓度分别为：Tryptone 10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)，在20-25℃下培养8-10h。由于本发明提供的表达菌株中含有编码藻毒素降解酶的基因，其可以高效地表达藻毒素降解酶。培养后经过分离提纯，即可得到藻毒素降解酶。可以采用本领域技术人员公知的方法进行分离提纯(如，高速冷冻离心诱导后的培养液收集细胞，然后通过超声破碎细胞，离心得到含有藻毒素降解酶的粗酶液，将粗酶液用含有直链淀粉的树脂进行纯化，得到纯度较高的藻毒素降解酶)，在此不再赘述。

本发明提供的具有降解藻毒素功能的复合材料包括石墨烯材料和固载于所述石墨烯材料上的本发明的藻毒素降解酶。其中，相对于每克的石墨烯材料，所述藻毒素降解酶的含量优选为1000-1900mg。

所述石墨烯材料优选为富氧石墨烯材料，所述富氧石墨烯材料的含氧量大于20重量％，比表面积大于150m²/g。所述石墨烯材料优选通过以下方法制得：

在冰水浴下将石墨粉、酸、氧化剂和添加剂混合，将混合物加热至35-45℃，搅拌10-60min；继续加热至90-100℃并在此温度下搅拌10-20min；冷却至室温后与过氧化氢水溶液(20-30体积％)混合；固液分离，对固相进行洗涤和干燥后得到富氧石墨烯材料。其中，相对于每克的石墨粉，酸的用量可以为30-125g(如30g、50g、55g、60g、65g、70g、80g、90g、110g、120g、123g、125g或上述数值之间的任意值)，氧化剂的用量可以为1.6-15g(如1.6g、1.8g、2.5g、3.5g、4.5g、5.5g、6.5g、8.5g、9.5g、10.5g、12g、15g或上述数值之间的任意值)，添加剂的用量可以为0.3-20g(0.3g、0.4g、0.6g、1g、3g、5g、7g、9g、10g、12g、12.5g、15g、20g或上述数值之间的任意值)。所述石墨粉可以通过石墨矿、壳聚糖、麦秸杆、虾蟹壳等生物质材料制备而得到。优选情况下，所述生物质材料为石墨矿、壳聚糖、虾蟹壳中的一种。所述酸可以为强酸，如硫酸或硝酸。所述氧化剂可以为高锰酸钾和/或氯酸钾。所述添加剂可以为NaNO₃和/或H₃PO₄。所述方法还可以包括活化的步骤，活化使用的活化剂可以为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(NHS)和吗啉乙磺酸(MES)。但是本发明的发明人发现，本发明的石墨烯材料不经活化比经活化的石墨烯材料具有更优的载酶性能(不仅负载量高且固定化酶活性损失也较小)，因此，本发明的制备石墨烯材料的方法优选不包括活化的步骤。

本发明中，所述藻毒素降解酶复合材料可以按照常规的方式制备，例如将藻毒素降解酶与石墨烯材料共同孵育即可。

本发明还涉及一种组合物，该组合物含有上述藻毒素降解酶或复合材料。所述组合物还可以含有另外的酶、载体等。另外的酶可以选自青枯菌酶、谷胱甘肽转移酶、细胞色素P450氧化酶、过氧化氢酶、漆酶等中的至少一种。载体可以选自麦芽糖糊精、麦麸、米糠、淀粉和硫酸镁中的至少一种。所述组合物可以与水体中允许的载体或稀释剂混合，借此将其调制成通常使用的各种剂型，如水合剂、乳剂、水溶剂、可流动剂等，从而作为抑藻剂或藻毒素解毒剂使用。

本发明还提供了本发明的上述重组藻毒素降解酶、基因、重组载体、重组菌株以及组合物在抑制蓝藻生长和/或降解藻毒素中的应用。“抑制蓝藻生长”抑制蓝藻的设置、繁殖受到抑制，无法正常生长，包括杀灭蓝藻。

本发明中，所述蓝藻可以为各种引发水污染的常见蓝藻，包括铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、节球藻(Nodularia spumigena)、颤藻(Oscillatoria)、念珠藻(Nostoc)等。所述藻毒素为来自蓝藻所释放的藻毒素MC-LR、MC-YR、MC-RR、Nodularin中的一种或多种。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

实施例1

本实施例用来说明本发明所述藻毒素降解酶基因序列的制备、载体的构建、酶的制备及酶活性的测定。

(1)藻毒素降解酶编码基因的获得和表达载体的构建

将编码藻毒素降解酶野生型MlrA及其突变体H6MA、MH6A和MAH6的基因序列，SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示核苷酸序列(对应的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)通过人工化学合成，然后装载到pMAL-C2X质粒中，得到藻毒素降解酶的表达载体(委托北京擎科生物科技公司武汉分公司完成)。

(2)表达菌株的获得及藻毒素降解酶的制备

将藻毒素降解酶的表达载体转入大肠杆菌TB1感受态细胞(购自New EnglandBiolabs Inc.)中，培养并测序验证后，得到表达菌株。具体过程参见文献Liu et al.,Environ.Sci.Techol.,2020,54,8811。

含有藻毒素降解酶野生型(MlrA)及其突变体H6MA、MH6A和MAH6基因的表达菌株在20℃±2℃下由IPTG诱导剂诱导12小时。表达菌株生长在LB培养基中，培养基组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、氨苄青霉素50mg/L。

诱导12小时后，高速冷冻离心诱导后的细胞培养液收集细胞。然后通过超声破碎细胞，离心得到含有藻毒素降解酶的粗酶液C-MlrAs，包含C-MlrA,C-H6MA、C-MH6A和C-MAH6。将C-MlrAs用含有直链淀粉的树脂进行纯化，可以得到纯度较高的藻毒素降解酶MlrAs，包含MlrA，H6MA，MH6A及MAH6。

通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析藻毒素降解酶。通过Braford方法测定藻毒素降解酶的蛋白含量。每升培养基获得藻毒素降解酶C-MlrA、C-H6MA、C-MH6A和C-MAH6的蛋白产量分别为150±20mg/L、310±14mg/L、290mg/L±30mg/L、167mg/L±15mg/L。C-H6MA、C-MH6A和C-MAH6的蛋白产量分别是野生型蛋白产量的2.1倍，1.9倍及1.1倍。

图1示出了纯化的藻毒素降解酶的SDS-PAGE图，其中，M为Marker；1为MlrA；2为H6MA；3为MH6A；4为MAH6。

(3)藻毒素降解酶酶活性的测定

通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)分析法测定剩余藻毒素的量，计算降解前后藻毒素量的变化，评估藻毒素降解酶的活性。

本发明中藻毒素的测定方法采用高效液相色谱(high performance liquidchromatography，HPLC)分析法(DIONEX UltiMate 3000，Thermo,USA)，柱子为Acclaim^TM120C18色谱柱(4.6mm x 250mm，5μm)，流速为1.0mL min^-1，上样量为50μL，检测波长为238nm。其具体方法为：取390μL PBS(pH7.5)与10μL藻毒素(终浓度250μg/L)混合液，测量藻毒素的出峰面积和出峰时间。然后取380μL PBS(pH7.5)与10μL藻毒素(终浓度250μg/L)混合液，加入10μL藻毒素降解酶(终浓度0.03μg/L)，25℃，反应5分钟后，测定降解后样品中剩余的藻毒素的出峰面积和出峰时间，根据出峰面积计算样品中藻毒素的量，并根据藻毒素的量计算酶活力。

每升培养基获得所述藻毒素降解酶C-MlrA、C-H6MA、C-MH6A和C-MAH6的总活力分别为810±50U，4400±150U，3100±180U，960±80U。C-H6MA、C-MH6A和C-MAH6的总活力分别是野生型蛋白总活力的5.4倍，3.8倍，1.2倍。酶活力单位U的定义为单位时间(1分钟)内降解1μg藻毒素MC-LR所需要的酶量。

实施例2

本实施例用来说明高效固载藻毒素降解酶的富氧石墨烯材料FGOs的制备方法，其具体制备步骤如下：

1、称取0.1-0.5g石墨粉，加入强酸(浓硫酸，浓度为98重量％)及添加剂(NaNO₃或浓H₃PO₄(浓度为85.8重量％))，冰水浴下缓慢加入不同质量的强氧化剂(高锰酸钾)，加热到40℃左右，搅拌氧化10-60分钟(具体加入量及时间如表1所示)。

表1不同条件下合成的FGOs的特征参数及最大负载酶量

表1中GO1-GO3为不同的商品化氧化石墨烯，分别购自苏州晶硅电子科技有限公司，中国；FGO0为本实施例制备富氧石墨烯使用原料(石墨粉，购自上海麦克林生化科技有限公司，中国)。

2、加入15mL水，并升温至近沸状态(95℃左右)，并在此状态下搅拌15分钟左右，然后将反应混合物置于室温冷却，添加40mL水和0.3mL 30体积％H₂O₂(30mL H₂O₂溶于70mL水里)，混合均匀，反应10分钟左右后，离心去除上清，收集沉淀；

3、将收集的沉淀用纯净水洗涤3次，除去杂质，用20重量％稀盐酸(用市售浓度为37重量％的浓盐酸配制)洗涤2次，再用水洗涤至中性(pH 7左右)后烘干备用。通过本实施例制备所得的富氧石墨烯命名为FGOs；

4、制备的FGOs按照以下步骤藻毒素降解酶复合材料：

(1)将FGO4(0.5mg)加入去离子水(1mL)中，在室温下超声分散20min左右。

(2)离心弃上清，取沉淀，用PBS(pH7)洗涤沉淀2次。再用0.2mL的pH7.4的磷酸缓冲液重悬。

(3)室温下，加入通过实施例1制备的藻毒素降解酶C-MlrA、C-H6MA、C-MH6A和C-MAH6 0.8mL，固载开始时酶初始浓度为2mg/mL。

(4)藻毒素降解酶与FGO共同孵育30分钟，进行酶的固定化过程。

(5)离心，收集沉淀，并用相应制备缓冲液洗涤3次，以除去未结合的蛋白，收集沉淀后重悬在pH7.0的缓冲液中，即为制备的藻毒素降解酶复合材料。

表1示出部分FGOs的制备条件、特征参数、每克FGOs的负载酶量。其中，负载酶量(mg/g)＝(初始加入的蛋白量–固载后离心所得上清液中含有的蛋白量)/初始加入材料量(下同)。

本发明的发明人发现，如表1所示，用以上合成的富氧石墨烯材料FGOs和获得的藻毒素降解酶MlrAs通过本发明的方法固载藻毒素降解酶具有高负载效果。富氧石墨烯材料FGOs固载该酶的量较优可以达到1000-1600mg/g左右，比对比材料(购买的商品化氧化石墨烯GO1-GO3)最优提高1.5-20倍，可以有效降低生产成本，更具有工业应用价值。

5、表征所制备的FGOs材料的形貌、含氧量、比表面积等特征参数，用扫描电子显微镜(SEM，JSM-7900F，JEOL，日本)表征表面形态和微观结构。用高分辨X-射线光电子能谱仪(EscaLab 250Xi，ThermoFisher，美国)分析石墨烯材料和复合材料的元素组成和表面官能团组成。通过对高分辨XPS(C1s)光谱进行了反卷积分析，使用高斯函数对C1s光谱进行了分峰处理，定量分析了FGOs含氧官能团类型及含量。样品的比表面积由比表面及孔径分析仪(ASAP2020HD88，美国)测量。

图2示出了制备的部分FGOs形貌表征(SEM图谱)：(1)FGO0、(2)FGO1、(3)FGO2、(4)FGO3、(5)FGO4。从图2可以看出随着氧化剂(高锰酸钾)加入量的增加，材料表面形貌褶皱度提高，石墨烯材料含氧量提高，结合表1中数据，说明本发明中合成的富氧石墨烯材料可以明显地提高负载量藻毒素降解酶的能力。

实施例3

本实施例用来说明藻毒素降解酶复合材料的制备方法1，该方法是通过直接吸附方法制备藻毒素降解酶复合材料，其具体制备步骤如下：

(1)将实施例2制备的FGO4(0.5mg)加入去离子水(1mL)中，在室温下超声分散20min左右。

(2)离心弃上清，取沉淀，用PBS(pH7)洗涤沉淀2次。再用0.2mL不同pH的磷酸缓冲液重悬。

(3)室温下，加入通过实施例1制备的藻毒素降解酶C-MlrA、C-H6MA、C-MH6A和C-MAH6 0.8mL，固载开始时酶初始浓度为2.0-3.0mg/mL(如表2所示)。

(4)藻毒素降解酶与FGO4共同孵育10～60分钟，进行酶的固定化过程。

(6)藻毒素降解酶在FGO4上的固载率随着藻毒素降解酶初始浓度、FGO4含氧量、固载孵育时间、固载缓冲液的pH等条件的变化而变化。结果如表2所示。

表2示出了FGO4负载藻毒素降解酶的负载量随着初始酶浓度、固载时间、缓冲液pH及酶种类等条件的变化而变化情况。

本发明的发明人发现，用以上合成的富氧石墨烯材料FGO4通过本发明的固定化酶方法固载藻毒素降解酶C-MlrA及其突变体C-H6MA、C-MH6A和C-MAH6藻毒素降解酶均具有高负载的效果。随着负载时间的延长，负载量越大，但负载时间30分钟后负载量增加缓慢。在弱酸性条件下(pH6.9)比在弱碱性条件负载效果要好。例如，初始浓度为3mg/mL的C-H6MA在pH6.9磷酸缓冲溶液中负载60分钟，负载量最高，可达到1898mg/g，比文献报道的负载量89.77mg/g(Wu et al.,Environmental Pollution,2020,258,113653)有明显提高，有效降低生产成本，具有工业应用价值。

表2实施例2获得的FGO4通过实施例3所示的固载方法对不同酶在不同初始酶量、固载时间及不同负载缓冲液pH条件下进行负载的情况

实施例4

本实施例用来提供藻毒素降解酶复合材料的制备方法2，该方法是先活化固定化材料FGO4，再进行藻毒素降解酶复合材料的制备。其具体制备步骤如下：

1、将实施例2制备的FGO4加入10mL去离子水中，室温超声20min。

2、加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(NHS)，再加入适量0.5M吗啉乙磺酸(MES)，室温下，200rpm，反应60分钟，活化FGO4上的羧基。

3、离心弃上清，收集沉淀，用PBS(pH7)洗2次，除去未反应的EDC、NHS及MES。活化后的FGO4用10mL PBS(pH7)重悬。

4、室温下加入实施例1制备的4种藻毒素降解酶C-MlrA、C-H6MA、C-MH6A和C-MAH6，与FGO4共同孵育30分钟，进行酶的固定化过程。

5、离心，收集沉淀，并用PBS洗涤2次，以除去未结合的蛋白，收到沉淀后重悬在pH7的缓冲液中，即为制备的藻毒素降解酶复合材料。结果见表3。

表3示出了随着EDC、NHS浓度变化、藻毒素降解酶初始浓度的变化，FGO4负载藻毒素降解酶的负载量变化情况。

本发明的发明人发现，用以上合成的富氧石墨烯材料FGO4通过本发明的复合材料制备方法固载藻毒素降解酶C-MlrA及其突变体C-H6MA、C-MH6A和C-MAH6藻毒素降解酶也可以达到较高的负载效果，负载量达到513-1655mg/g左右，比文献报道的负载量89.77mg/g(Wu et al.,Environmental Pollution,2020,258,113653)有明显提高，有效降低生产成本，具有工业应用价值。同时对比实施例3和实施例4，发现制备的FGO4采用直接吸附法可以更有效地固载藻毒素降解酶MlrAs。

表3实施例2获得的FGO4通过实施例4所示的固载方法对不同酶在初始浓度不同的条件下进行负载的情况

实施例5

本实施例用来说明藻毒素降解酶及藻毒素降解酶复合材料在降解藻毒素MCs中的应用，具体操作步骤如下：

1、取以上实施例制备的藻毒素降解酶及实施例3制备的藻毒素降解酶复合材料，加入藻毒素MCs(MC-LR)。在室温下孵育5min时间，加入磷酸水溶液(浓度为50mmol/L)终止反应。其中，藻毒素降解酶复合材料为采用实施例3相似的方法得到的藻毒素降解酶复合材料C-MlrA@FGO4，C-H6MA@FGO4，C-MH6A@FGO4及C-MAH6@FGO4。固载溶液为pH7.4磷酸缓冲液，固载时间30min，酶起始浓度为2mg/mL。

2、离心后取上清液，用高效液相色谱仪(HPLC，DIONEX UltiMate 3000，Thermo，美国)检测上清液中MCs含量。测定方法同实施例1所述藻毒素降解酶活性测试方法(pH7.5，反应5min，25℃)，计算比活力，结果见表4。

藻毒素降解酶比活力(单位时间内单位酶降解藻毒素的速率)计算公式为(降解前藻毒素含量-降解后藻毒素含量)/降解时间/酶量。

表4藻毒素降解酶及藻毒素降解酶复合材料比活力及储存稳定性(半衰期)的比较

	比活力(U/mg)	半衰期(天)
			C-MlrA	5.4	10
C-H6MA	14.2	12
			C-MH6A	10.7	10
C-MAH6	5.75	9
			C-MlrA@FGO4	5.2	25
C-H6MA@FGO4	18.6	28
			C-MH6A@FGO4	13.2	26
C-MAH6@FGO4	5.1	23

3、将所述藻毒素降解酶放置在0℃，在不同时间取样测试，以计算酶活性半衰期，结果见表4。酶活性半衰期是指酶活性降低到一半时需要的时间。

4、所述藻毒素降解酶放置在不同温度或不同pH条件下处理1小时取样。然后，各样品在25℃，pH7.5磷酸缓冲液中，反应5min，测试反应体系中剩余藻毒素的量，计算酶活性，评估藻毒素降解酶的pH稳定性(结果见表5)或热稳定性(结果见表6)。

本发明的发明人发现，(1)改造后的藻毒素降解酶C-H6MA、C-MH6A和C-MAH6比改造前的C-MlrA比活力得到明显提高，比活力提高1.1-2.6倍；(2)复合材料C-MlrA@FGO4、C-H6MA@FGO4、C-MH6A@FGO4和C-MAH6@FGO4的比活力与游离酶的比活力相当或略有上升。(3)藻毒素降解酶复合材料的储存稳定性明显提高，C-H6MA@FGO4在0℃时的半衰期长达28天。

表5不同pH下处理1小时后，再按实施例1所述测活方法(pH7.5,25℃)测定藻毒素降解酶的活性(U/mg)

表6不同温度下处理1小时后，再按实施例1所述测活方法(pH7.5,25℃)测定藻毒素降解酶的活性(U/mg)

实施例6

本实施例用来说明藻毒素降解酶及藻毒素降解酶复合材料在抑制蓝藻生长或杀灭蓝藻，和/或降解藻毒素中的应用，具体操作步骤如下：

1、取实施例1制备获得的藻毒素降解酶或按照实施例3相似的方法制备获得的藻毒素降解酶复合材料，加入到100mL含有初始藻细胞浓度约1.0×10⁶个藻细胞/mL的培养液中。实验用藻细胞包括产毒藻(铜绿微囊藻FACHB-905)(见表7)和不产毒藻(集胞藻PCC6803、小球藻FACHB-1227)。

藻毒素降解酶复合材料制备方法为采用实施例3的方法固载藻毒素降解酶C-MlrA，C-H6MA，C-MH6A及C-MAH6而得到。固载溶液为pH7.4磷酸缓冲液，固载时间30min，酶起始浓度为2mg/mL。

表7藻毒素降解酶处理铜绿微囊藻FACHB-905细胞9天后的抑制率以及细胞内外藻毒素含量

2、处理0，3，6，9天，连续观察，并检测产毒藻(铜绿微囊藻FACHB-905)(见表7)和不产毒藻(集胞藻PCC6803、小球藻FACHB-1227)(表8)的生长状况。测定藻毒素降解酶在不同浓度下处理9天的藻液的OD₇₃₀值，并以“(初始OD₇₃₀值-处理后的OD₇₃₀值)/初始OD₇₃₀值×100％”的计算结果用抑制率表示。

3、将连续处理9天后的细胞培养液离心，分为上清液和细胞沉淀。上清用来测定细胞外藻毒素含量，细胞沉淀用来测定细胞内藻毒素含量(见表7)。对照为不加藻毒素降解酶但同样生长9天的藻样。藻毒素的测试方法同实施例1。

表7示出藻毒素降解酶处理铜绿微囊藻FACHB-905细胞9天后的抑制率以及细胞内外藻毒素含量。从中可以看出藻毒素降解酶的浓度为50-300mg/L时对蓝藻有很好的抑制效果，同时可以有效地降低藻细胞内外的藻毒素。

从表7所示结果，本发明的发明人发现，用本发明方法制备藻毒素降解酶及藻毒素降解酶复合材料在降解藻毒素的同时，抑制或杀灭蓝藻：(1)改造后的藻毒素降解酶C-H6MA、C-MH6A和C-MAH6比改造前的C-MlrA抑制藻生长及降解细胞内外藻毒素的能力得到明显提高；(2)藻毒素降解酶复合材料C-MlrA@FGO4、C-H6MA@FGO4、C-MH6A@FGO4和C-MAH6@FGO4的抑制藻生长及降解细胞内外藻毒素的能力与游离酶的能力相当或略有上升。

表8藻毒素降解酶处理不产藻毒素的集胞藻PCC6803及小球藻FACHB-1227细胞9天后的抑制率，其中酶量为300mg/L。

从表8所示结果，本发明的发明人发现，用本发明方法制备藻毒素降解酶及藻毒素降解酶复合材料可以高效抑制或杀灭产毒的铜绿微囊藻FACHB-905，而对不产毒的集胞藻PCC6803及小球藻FACHB-1227没有明显的抑制作用。这样说明了本发明所述的藻毒素降解酶及其复合物具有一定的生态安全性。

实施例7

本实施例用来说明藻毒素降解酶及藻毒素降解酶复合材料对三种人源细胞的安全性(见表9)，具体操作步骤如下：

1、将200μL含有初始人源细胞(人肾癌细胞ACHN、肝癌细胞Huh7和正常肝细胞LO2)浓度约1×10³个细胞/mL接种至96孔板中，置于37℃、5％CO₂条件下培养24小时至细胞贴壁。

2、在各孔细胞中分别加入10μg/mL MC-LR，能将10μg/mL MC-LR完全降解的实施例1制备获得的藻毒素降解酶、实施例2制备的材料FGO4、实施例3制备获得的藻毒素降解酶复合材料(固载条件为：固载溶液为pH7.4磷酸缓冲液，固载时间30min,酶起始浓度为2mg/mL)、被等量藻毒素降解酶降解的MC-LR降解产物，同时只加入1％甲醇为对照组(实验组样品溶解于甲醇水溶液中，甲醇的终浓度为1％)，共培养48h。

3.每孔加入10μL CCK-8溶液(购自北京索莱宝科技有限公司)，用不加细胞仅有培养液的孔作为空白对照。在细胞培养箱内继续孵育0.5h，用酶标仪在450nm测定吸光度。各样品对人源细胞的抑制率计算公式如下：抑制率＝(A_对照组-A_实验组)/A_对照组×100％

其中A_对照组是对照组与对应无细胞培养液在450nm处的吸光度值的差值；A实验组是样品处理组与对应无细胞培养液在450nm处的吸光度的差值。结果见表9。

表9藻毒素降解酶及其降解产物对人源细胞的毒性测试。

经10μg/mL MC-LR处理48h后，三种细胞的活性均被抑制50％以上，FGO₄对三种细胞均体现出不同程度的毒性，但是无论是游离酶C-MlrA、C-H6MA，还是藻毒素降解酶复合材料C-MlrA@FGO₄、、C-H6MA@FGO₄都没有明显的毒性，甚至还促进细胞的生长，说明游离酶及藻毒素降解酶复合材料对人源细胞具有安全性。同时也说明MlrAs负载在FGO₄上能使其对人源细胞的毒性降低，说明酶的负载能提高氧化石墨烯材料的安全性。

MC-LR经游离酶C-MlrA、C-H6MA，及复合材料C-MlrA@FGO₄、C-H6MA@FGO₄降解后的产物对细胞的生长展现出弱抑制或促进细胞的生长，说明CMlrA@FGO₅和CMlrA@CGO₁对MC-LR的降解能大大降低MC-LR对人源细胞的毒性。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

以下示出了本发明中述及的主要序列：

SEQ ID NO：2藻毒素降解酶H6MA氨基酸序列

MHHHHHHKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISDEVDAGSMREFVKQRPLLCFYALAILIALTAHALRAMSPTPLGPMFKMLQETHAHLNIITAVRSTFDYPGAYTLLLFPAAPMLAALIVTGIGYGRSGFRELLSRCAPWRSPVSWRQGVTVIAVCFLAFFALTGIMWVQTYLYAPPGTLDRTFLRYGSDPVAIYMMLAASLLLSPGPLLEELGWRGFALPQLLKKFDPLAAAVILGLMWWAWHLPRDLPTLFSGEPGAAWGVIVKQFVIIPGFIAGTIIAVFVCNKLGGSMWGGVLIHAIHNELGVNVTAEWAPTVAGLGWRPWDLVEFAVAIGLVLICGRSLGAASPDNARLAWGNVPPKLPGGATDKSGANA

SEQ ID NO：3藻毒素降解酶MH6A氨基酸序列

MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISDEVDAHHHHHHGSMREFVKQRPLLCFYALAILIALTAHALRAMSPTPLGPMFKMLQETHAHLNIITAVRSTFDYPGAYTLLLFPAAPMLAALIVTGIGYGRSGFRELLSRCAPWRSPVSWRQGVTVIAVCFLAFFALTGIMWVQTYLYAPPGTLDRTFLRYGSDPVAIYMMLAASLLLSPGPLLEELGWRGFALPQLLKKFDPLAAAVILGLMWWAWHLPRDLPTLFSGEPGAAWGVIVKQFVIIPGFIAGTIIAVFVCNKLGGSMWGGVLIHAIHNELGVNVTAEWAPTVAGLGWRPWDLVEFAVAIGLVLICGRSLGAASPDNARLAWGNVPPKLPGGATDKSGANA

SEQ ID NO：4藻毒素降解酶MAH6氨基酸序列

MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISDEVDAGSMREFVKQRPLLCFYALAILIALTAHALRAMSPTPLGPMFKMLQETHAHLNIITAVRSTFDYPGAYTLLLFPAAPMLAALIVTGIGYGRSGFRELLSRCAPWRSPVSWRQGVTVIAVCFLAFFALTGIMWVQTYLYAPPGTLDRTFLRYGSDPVAIYMMLAASLLLSPGPLLEELGWRGFALPQLLKKFDPLAAAVILGLMWWAWHLPRDLPTLFSGEPGAAWGVIVKQFVIIPGFIAGTIIAVFVCNKLGGSMWGGVLIHAIHNELGVNVTAEWAPTVAGLGWRPWDLVEFAVAIGLVLICGRSLGAASPDNARLAWGNVPPKLPGGATDKSGANAHHHHHH

SEQ ID NO：6藻毒素降解酶H6MA核苷酸序列

ATGCACCACCACCACCACCACAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGATGAGGTTGATGCTGGATCCATGCGGGAGTTTGTCAAACAGCGACCTTTGCTCTGCTTCTATGCGTTGGCTATCCTGATCGCTCTCACGGCCCATGCGCTGCGCGCGATGAGCCCGACTCCGCTCGGCCCGATGTTCAAGATGCTGCAGGAGACGCACGCTCACCTCAACATTATTACCGCTGTCAGGTCTACGTTCGATTACCCGGGAGCCTATACGCTTTTGCTGTTTCCGGCCGCCCCAATGCTCGCGGCTCTGATCGTAACCGGTATCGGATACGGGCGCTCAGGATTTCGTGAACTGCTCAGCCGATGCGCCCCGTGGCGATCGCCTGTTTCCTGGCGTCAGGGCGTTACCGTCATAGCCGTGTGTTTCCTTGCGTTCTTCGCGCTCACAGGAATTATGTGGGTTCAGACATATCTCTACGCTCCGCCCGGCACGCTTGATCGCACCTTCTTGCGCTATGGGTCAGATCCGGTCGCCATTTATATGATGCTGGCAGCATCGCTGCTACTCAGCCCTGGCCCGCTGCTCGAAGAACTGGGCTGGCGCGGCTTTGCGCTGCCGCAGCTCCTCAAGAAGTTTGACCCCCTGGCCGCAGCGGTGATCCTCGGCCTCATGTGGTGGGCTTGGCATTTGCCGCGCGACTTGCCGACGCTGTTCTCCGGCGAACCTGGCGCGGCCTGGGGCGTTATCGTCAAGCAATTCGTTATCATTCCGGGGTTCATCGCCGGCACCATCATCGCTGTTTTCGTATGCAACAAGCTCGGCGGATCGATGTGGGGTGGCGTGCTCATTCACGCGATCCATAACGAACTGGGCGTAAACGTCACTGCCGAATGGGCTCCAACGGTTGCAGGGCTTGGGTGGCGCCCTTGGGATTTGGTCGAATTCGCCGTGGCCATTGGGCTCGTCCTGATTTGTGGAAGGAGCCTTGGTGCCGCATCTCCTGACAATGCGCGATTGGCTTGGGGCAACGTGCCGCCAAAGCTGCCGGGCGGAGCGACTGACAAGTCCGGCGCGAACGCG

SEQ ID NO：7藻毒素降解酶MH6A核苷酸序列

ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTAATTCGAGCTCGAACAACAACAACAATAACAATAACAACAACCTCGGGATCGAGGGAAGGATTTCAGATGAGGTTGATGCTCACCACCACCACCACCACGGATCCATGCGGGAGTTTGTCAAACAGCGACCTTTGCTCTGCTTCTATGCGTTGGCTATCCTGATCGCTCTCACGGCCCATGCGCTGCGCGCGATGAGCCCGACTCCGCTCGGCCCGATGTTCAAGATGCTGCAGGAGACGCACGCTCACCTCAACATTATTACCGCTGTCAGGTCTACGTTCGATTACCCGGGAGCCTATACGCTTTTGCTGTTTCCGGCCGCCCCAATGCTCGCGGCTCTGATCGTAACCGGTATCGGATACGGGCGCTCAGGATTTCGTGAACTGCTCAGCCGATGCGCCCCGTGGCGATCGCCTGTTTCCTGGCGTCAGGGCGTTACCGTCATAGCCGTGTGTTTCCTTGCGTTCTTCGCGCTCACAGGAATTATGTGGGTTCAGACATATCTCTACGCTCCGCCCGGCACGCTTGATCGCACCTTCTTGCGCTATGGGTCAGATCCGGTCGCCATTTATATGATGCTGGCAGCATCGCTGCTACTCAGCCCTGGCCCGCTGCTCGAAGAACTGGGCTGGCGCGGCTTTGCGCTGCCGCAGCTCCTCAAGAAGTTTGACCCCCTGGCCGCAGCGGTGATCCTCGGCCTCATGTGGTGGGCTTGGCATTTGCCGCGCGACTTGCCGACGCTGTTCTCCGGCGAACCTGGCGCGGCCTGGGGCGTTATCGTCAAGCAATTCGTTATCATTCCGGGGTTCATCGCCGGCACCATCATCGCTGTTTTCGTATGCAACAAGCTCGGCGGATCGATGTGGGGTGGCGTGCTCATTCACGCGATCCATAACGAACTGGGCGTAAACGTCACTGCCGAATGGGCTCCAACGGTTGCAGGGCTTGGGTGGCGCCCTTGGGATTTGGTCGAATTCGCCGTGGCCATTGGGCTCGTCCTGATTTGTGGAAGGAGCCTTGGTGCCGCATCTCCTGACAATGCGCGATTGGCTTGGGGCAACGTGCCGCCAAAGCTGCCGGGCGGAGCGACTGACAAGTCCGGCGCGAACGCG

SEQ ID NO：8藻毒素降解酶MAH6核苷酸序列

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SEQUENCE LISTING

<110> 华中师范大学

<120> 藻毒素降解酶及复合材料与应用

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<213> 人工序列

<400> 5

atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60

ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120

ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180

atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240

accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300

aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360

gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420

aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480

ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540

gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600

aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660

ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720

gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780

ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840

ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900

ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960

actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020

tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080

gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140

aacctcggga tcgagggaag gatttcagat gaggttgatg ctggatccat gcgggagttt 1200

gtcaaacagc gacctttgct ctgcttctat gcgttggcta tcctgatcgc tctcacggcc 1260

catgcgctgc gcgcgatgag cccgactccg ctcggcccga tgttcaagat gctgcaggag 1320

acgcacgctc acctcaacat tattaccgct gtcaggtcta cgttcgatta cccgggagcc 1380

tatacgcttt tgctgtttcc ggccgcccca atgctcgcgg ctctgatcgt aaccggtatc 1440

ggatacgggc gctcaggatt tcgtgaactg ctcagccgat gcgccccgtg gcgatcgcct 1500

gtttcctggc gtcagggcgt taccgtcata gccgtgtgtt tccttgcgtt cttcgcgctc 1560

acaggaatta tgtgggttca gacatatctc tacgctccgc ccggcacgct tgatcgcacc 1620

ttcttgcgct atgggtcaga tccggtcgcc atttatatga tgctggcagc atcgctgcta 1680

ctcagccctg gcccgctgct cgaagaactg ggctggcgcg gctttgcgct gccgcagctc 1740

ctcaagaagt ttgaccccct ggccgcagcg gtgatcctcg gcctcatgtg gtgggcttgg 1800

catttgccgc gcgacttgcc gacgctgttc tccggcgaac ctggcgcggc ctggggcgtt 1860

atcgtcaagc aattcgttat cattccgggg ttcatcgccg gcaccatcat cgctgttttc 1920

gtatgcaaca agctcggcgg atcgatgtgg ggtggcgtgc tcattcacgc gatccataac 1980

gaactgggcg taaacgtcac tgccgaatgg gctccaacgg ttgcagggct tgggtggcgc 2040

ccttgggatt tggtcgaatt cgccgtggcc attgggctcg tcctgatttg tggaaggagc 2100

cttggtgccg catctcctga caatgcgcga ttggcttggg gcaacgtgcc gccaaagctg 2160

ccgggcggag cgactgacaa gtccggcgcg aacgcg 2196

<210> 6

<211> 2214

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgcaccacc accaccacca caaaatcgaa gaaggtaaac tggtaatctg gattaacggc 60

gataaaggct ataacggtct cgctgaagtc ggtaagaaat tcgagaaaga taccggaatt 120

aaagtcaccg ttgagcatcc ggataaactg gaagagaaat tcccacaggt tgcggcaact 180

ggcgatggcc ctgacattat cttctgggca cacgaccgct ttggtggcta cgctcaatct 240

ggcctgttgg ctgaaatcac cccggacaaa gcgttccagg acaagctgta tccgtttacc 300

tgggatgccg tacgttacaa cggcaagctg attgcttacc cgatcgctgt tgaagcgtta 360

tcgctgattt ataacaaaga tctgctgccg aacccgccaa aaacctggga agagatcccg 420

gcgctggata aagaactgaa agcgaaaggt aagagcgcgc tgatgttcaa cctgcaagaa 480

ccgtacttca cctggccgct gattgctgct gacgggggtt atgcgttcaa gtatgaaaac 540

ggcaagtacg acattaaaga cgtgggcgtg gataacgctg gcgcgaaagc gggtctgacc 600

ttcctggttg acctgattaa aaacaaacac atgaatgcag acaccgatta ctccatcgca 660

gaagctgcct ttaataaagg cgaaacagcg atgaccatca acggcccgtg ggcatggtcc 720

aacatcgaca ccagcaaagt gaattatggt gtaacggtac tgccgacctt caagggtcaa 780

ccatccaaac cgttcgttgg cgtgctgagc gcaggtatta acgccgccag tccgaacaaa 840

gagctggcaa aagagttcct cgaaaactat ctgctgactg atgaaggtct ggaagcggtt 900

aataaagaca aaccgctggg tgccgtagcg ctgaagtctt acgaggaaga gttggcgaaa 960

gatccacgta ttgccgccac tatggaaaac gcccagaaag gtgaaatcat gccgaacatc 1020

ccgcagatgt ccgctttctg gtatgccgtg cgtactgcgg tgatcaacgc cgccagcggt 1080

cgtcagactg tcgatgaagc cctgaaagac gcgcagacta attcgagctc gaacaacaac 1140

aacaataaca ataacaacaa cctcgggatc gagggaagga tttcagatga ggttgatgct 1200

ggatccatgc gggagtttgt caaacagcga cctttgctct gcttctatgc gttggctatc 1260

ctgatcgctc tcacggccca tgcgctgcgc gcgatgagcc cgactccgct cggcccgatg 1320

ttcaagatgc tgcaggagac gcacgctcac ctcaacatta ttaccgctgt caggtctacg 1380

ttcgattacc cgggagccta tacgcttttg ctgtttccgg ccgccccaat gctcgcggct 1440

ctgatcgtaa ccggtatcgg atacgggcgc tcaggatttc gtgaactgct cagccgatgc 1500

gccccgtggc gatcgcctgt ttcctggcgt cagggcgtta ccgtcatagc cgtgtgtttc 1560

cttgcgttct tcgcgctcac aggaattatg tgggttcaga catatctcta cgctccgccc 1620

ggcacgcttg atcgcacctt cttgcgctat gggtcagatc cggtcgccat ttatatgatg 1680

ctggcagcat cgctgctact cagccctggc ccgctgctcg aagaactggg ctggcgcggc 1740

tttgcgctgc cgcagctcct caagaagttt gaccccctgg ccgcagcggt gatcctcggc 1800

ctcatgtggt gggcttggca tttgccgcgc gacttgccga cgctgttctc cggcgaacct 1860

ggcgcggcct ggggcgttat cgtcaagcaa ttcgttatca ttccggggtt catcgccggc 1920

accatcatcg ctgttttcgt atgcaacaag ctcggcggat cgatgtgggg tggcgtgctc 1980

attcacgcga tccataacga actgggcgta aacgtcactg ccgaatgggc tccaacggtt 2040

gcagggcttg ggtggcgccc ttgggatttg gtcgaattcg ccgtggccat tgggctcgtc 2100

ctgatttgtg gaaggagcct tggtgccgca tctcctgaca atgcgcgatt ggcttggggc 2160

aacgtgccgc caaagctgcc gggcggagcg actgacaagt ccggcgcgaa cgcg 2214

<210> 7

<211> 2214

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60

ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120

ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180

atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240

accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300

aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360

gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420

aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480

ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540

gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600

aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660

ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720

gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780

ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840

ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900

ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960

actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020

tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080

gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140

aacctcggga tcgagggaag gatttcagat gaggttgatg ctcaccacca ccaccaccac 1200

ggatccatgc gggagtttgt caaacagcga cctttgctct gcttctatgc gttggctatc 1260

ctgatcgctc tcacggccca tgcgctgcgc gcgatgagcc cgactccgct cggcccgatg 1320

ttcaagatgc tgcaggagac gcacgctcac ctcaacatta ttaccgctgt caggtctacg 1380

ttcgattacc cgggagccta tacgcttttg ctgtttccgg ccgccccaat gctcgcggct 1440

ctgatcgtaa ccggtatcgg atacgggcgc tcaggatttc gtgaactgct cagccgatgc 1500

gccccgtggc gatcgcctgt ttcctggcgt cagggcgtta ccgtcatagc cgtgtgtttc 1560

cttgcgttct tcgcgctcac aggaattatg tgggttcaga catatctcta cgctccgccc 1620

ggcacgcttg atcgcacctt cttgcgctat gggtcagatc cggtcgccat ttatatgatg 1680

ctggcagcat cgctgctact cagccctggc ccgctgctcg aagaactggg ctggcgcggc 1740

tttgcgctgc cgcagctcct caagaagttt gaccccctgg ccgcagcggt gatcctcggc 1800

ctcatgtggt gggcttggca tttgccgcgc gacttgccga cgctgttctc cggcgaacct 1860

ggcgcggcct ggggcgttat cgtcaagcaa ttcgttatca ttccggggtt catcgccggc 1920

accatcatcg ctgttttcgt atgcaacaag ctcggcggat cgatgtgggg tggcgtgctc 1980

attcacgcga tccataacga actgggcgta aacgtcactg ccgaatgggc tccaacggtt 2040

gcagggcttg ggtggcgccc ttgggatttg gtcgaattcg ccgtggccat tgggctcgtc 2100

ctgatttgtg gaaggagcct tggtgccgca tctcctgaca atgcgcgatt ggcttggggc 2160

aacgtgccgc caaagctgcc gggcggagcg actgacaagt ccggcgcgaa cgcg 2214

<210> 8

<211> 2214

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60

ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120

ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180

atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240

accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300

aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360

gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420

aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480

ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540

gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600

aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660

ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720

gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780

ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840

ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900

ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960

actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020

tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080

gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140

aacctcggga tcgagggaag gatttcagat gaggttgatg ctggatccat gcgggagttt 1200

gtcaaacagc gacctttgct ctgcttctat gcgttggcta tcctgatcgc tctcacggcc 1260

catgcgctgc gcgcgatgag cccgactccg ctcggcccga tgttcaagat gctgcaggag 1320

acgcacgctc acctcaacat tattaccgct gtcaggtcta cgttcgatta cccgggagcc 1380

tatacgcttt tgctgtttcc ggccgcccca atgctcgcgg ctctgatcgt aaccggtatc 1440

ggatacgggc gctcaggatt tcgtgaactg ctcagccgat gcgccccgtg gcgatcgcct 1500

gtttcctggc gtcagggcgt taccgtcata gccgtgtgtt tccttgcgtt cttcgcgctc 1560

acaggaatta tgtgggttca gacatatctc tacgctccgc ccggcacgct tgatcgcacc 1620

ttcttgcgct atgggtcaga tccggtcgcc atttatatga tgctggcagc atcgctgcta 1680

ctcagccctg gcccgctgct cgaagaactg ggctggcgcg gctttgcgct gccgcagctc 1740

ctcaagaagt ttgaccccct ggccgcagcg gtgatcctcg gcctcatgtg gtgggcttgg 1800

catttgccgc gcgacttgcc gacgctgttc tccggcgaac ctggcgcggc ctggggcgtt 1860

atcgtcaagc aattcgttat cattccgggg ttcatcgccg gcaccatcat cgctgttttc 1920

gtatgcaaca agctcggcgg atcgatgtgg ggtggcgtgc tcattcacgc gatccataac 1980

gaactgggcg taaacgtcac tgccgaatgg gctccaacgg ttgcagggct tgggtggcgc 2040

ccttgggatt tggtcgaatt cgccgtggcc attgggctcg tcctgatttg tggaaggagc 2100

cttggtgccg catctcctga caatgcgcga ttggcttggg gcaacgtgcc gccaaagctg 2160

ccgggcggag cgactgacaa gtccggcgcg aacgcgcacc accaccacca ccac 2214

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 10

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

His His His His His His

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

Claims

1.一种藻毒素降解酶，其特征在于，该藻毒素降解酶为(a)或(b)：

(b)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活性不变的由(a)衍生的蛋白质，或者，在SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的蛋白质。

2.一种能够编码权利要求1所述的藻毒素降解酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：8所示。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2或3所述的基因。

5.一种表达菌株，其特征在于，所述表达菌株含有权利要求4所述的表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达菌株，其中，所述表达菌株为杆状菌、酵母菌或曲霉菌。

7.根据权利要求5或6所述的表达菌株，其中，所述表达菌株为大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和黑曲霉(Aspergillus niger)中的一种。

8.一种制备表达藻毒素降解酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)培养权利要求5-7中任一项所述的表达菌株，诱导藻毒素降解酶编码基因的表达；

(2)分离提纯所表达的藻毒素降解酶。

9.一种具有降解藻毒素功能的复合材料，其特征在于，该复合材料包括石墨烯材料和固载于所述石墨烯材料上的权利要求1所述的藻毒素降解酶；

优选地，所述复合材料的制备方法包括：在冰水浴下将石墨粉、酸、氧化剂和添加剂混合，将混合物加热至35-45℃，搅拌10-60min；继续加热至90-100℃并在此温度下搅拌10-20min；冷却至室温后与过氧化氢水溶液混合；固液分离，对固相进行洗涤和干燥。

10.权利要求1所述的藻毒素降解酶、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的表达载体、权利要求5-7中任意一项所述的表达菌株以及权利要求9所述的复合材料在抑制蓝藻生长和/或降解藻毒素中的应用。