CN110592046B

CN110592046B - 玉米赤霉烯酮降解酶在水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用

Info

Publication number: CN110592046B
Application number: CN201910938276.7A
Authority: CN
Inventors: 张桂敏; 王辉; 蒋思婧; 王美星; 马延和
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2019-09-30
Filing date: 2019-09-30
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2039-09-30
Also published as: CN110592046A

Abstract

本发明涉及一种玉米赤霉烯酮降解酶在水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用，所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的玉米赤霉烯酮降解酶的最适天然底物为玉米赤霉烯酮，在45℃、pH为8的条件下具有最高的酶活性，为70.42U/mg，同时具有在较宽pH条件下降解活性较高的特性，其在不同pH下的稳定性较好，还具有优良的热稳定性。

Description

玉米赤霉烯酮降解酶在水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种玉米赤霉烯酮降解酶在水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用。

背景技术

玉米赤霉烯酮(ZEN)是由镰刀菌产生的类雌激素样真菌毒素，其全名为6-(10-羟基-6-氧基-1-十一碳烯基)-β-雷锁酸内酯。在合适的环境下，作物很容易被镰刀菌感染，进而产生高水平的ZEN及衍生物，造成食物或饲料污染。

ZEN的化学结构类似于天然的雌激素，故其及其衍生物可与雌激素受体竞争性结合，进而影响机体的生殖功能，以及细胞凋亡、致畸、损伤DNA、氧化损害、影响免疫机能等机制,来影响动物与人类的健康。

鉴于此类毒素的危害，玉米赤霉烯酮等在谷物、食品和饲料中的含量必须低于一定标准。目前开发的降低其危害的方法有三种：分别是物理、化学、生物法。其中物理和化学法使用热处理或者酸碱处理等，有着步骤繁琐、破坏食品或饲料营养物质或者分解产物的毒性依然未知等缺陷，而生物法通过微生物菌体吸附和微生物或酶降解两种方式，有望开发成为一种安全、有效的真菌毒素清除方法，如后者通过微生物或酶将ZEN降解为无毒的产物，是最有潜力的方式。迄今为止，已经进行表征的玉米赤霉烯酮降解酶根据其特性可分为三类：一是Zhd101类，包含玉米赤霉烯酮降解酶Zhd101、ZEN-JJM和Zlhy-6，因后两者与Zhd101的氨基酸一致性为99％和98％，性质基本一致，故分为一类，Zhd101的最适反应温度是37℃、最适pH为9.5；二是Zhd518类，包含玉米赤霉烯酮降解酶Zhd518，其与Zhd101的氨基酸同源性在65％，最适温度为40℃、最适pH为8.0；三是ZhdAY3，其与Zhd101和Zhd518的氨基酸同源性分别为为63％和65％，最适温度为40℃、最适pH为9.5。但是，这些玉米赤霉烯酮降解酶的稳定性不好，且作用PH范围比较窄，均不是很适合大规模工业应用，需要获得一种能够克服这些弊端，适合大规模工业应用的降解酶。

发明内容

发明人在研究过程中意外发现氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的蛋白质具有玉米赤霉烯酮降解酶活性，且酶稳定性好，作用pH广。

本发明所要解决的技术问题是提供一种玉米赤霉烯酮降解酶在高效水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种玉米赤霉烯酮降解酶在水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用，所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步，所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因如SEQ ID NO:2所示。

进一步，所述衍生物为α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇或β-玉米赤霉醇中的一种或多种。

本发明还提供了一种玉米赤霉烯酮及其衍生物的水解方法，包括以下步骤：以玉米赤霉烯酮或其衍生物为底物，利用玉米赤霉烯酮降解酶对所述底物进行水解，所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步，所述玉米赤霉烯酮的衍生物为α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇或β-玉米赤霉醇中的一种或多种。

进一步，水解的条件为：反应温度为35～50℃，pH值为6.0～9.5，不另外补加所述玉米赤霉烯酮降解酶的反应时间为0.5-2小时。

进一步，反应温度为40～45℃，pH值为6.5～9.0，不另外补加所述玉米赤霉烯酮降解酶的反应时间为1.5-2小时。

本发明的有益效果是：氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的蛋白质具有玉米赤霉烯酮及其几种衍生物的降解活性，属于玉米赤霉烯酮降解酶，该蛋白与其他已表征的玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列相比，相似性不大于75％，属于一种全新的玉米赤霉烯酮降解酶，为人们降解玉米赤霉烯酮增加了一种新的选择。本发明的玉米赤霉烯酮降解酶的最适天然底物为玉米赤霉烯酮，在45℃、pH为7-8.5的条件下具有最高的酶活性，为70.42U/mg，同时具有在较宽pH条件下降解活性较高的特性，同时其在不同pH下的稳定性较好，还具有优良的热稳定性，具体如下：

(1)本发明得到的Zhd11c与Zhd518只有73.9％的同源性，最适温度为45℃，最适pH为7-8.5，但是其在pH6.5-9.0的范围内都具有90％以上活性，在pH6-9.5范围内都具有70％以上的活性，在40～45℃条件下，具有97％以上的活性，同时其热稳定性较突出，在45℃放置2h仍具有65％以上的残余活性，这些优点在已表征的ZEN降解酶中都是未发现的，这说明了本发明得到的Zhd11c具有显著的优势，具有大规模工业应用的潜力；

(2)本发明提供的玉米赤霉烯酮降解酶Zhd 11c对ZEN及其四种衍生物都具有降解活性，但降解能力有所差别。结果如下：将稀释酶液分别在相同浓度(反应体系中底物终浓度为20.0μg/ml)的不同底物条件下进行酶活测定。以玉米赤霉烯酮为底物测得酶活为参比(100％)，以α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇为底物所测相对酶活分别为38.80％，16.74％，66.90％，11.24％。因此，该酶对玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉醇的活性比较高，其他次之。

附图说明

图1为本发明玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11c蛋白纯化前后的SDS-PAGE电泳图，其中泳道M为标准分子量蛋白(180,130，100,70,55,40,35kDa)，泳道1为大肠杆菌BL21/pET28a-zhd11c破菌后的上清液；泳道2为Ni-NTA柱纯化后的Zhd11c蛋白；泳道3为GE Desalting脱盐柱纯化后的Zhd11c蛋白；

图2为本发明玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11c的活性随温度的变化的结果；

图3为本发明玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11c的活性随pH的变化的结果；

图4为玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11c在45℃下的热稳定性；

图5为玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11c的活性在不同pH下的稳定性。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

发明人在研究过程中发现，氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的蛋白质具有玉米赤霉烯酮及其衍生物的降解活性，属于玉米赤霉烯酮降解酶，该酶属于一种内酯水解酶，有270个氨基酸组成，并且该蛋白与其他已经表征的玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列相比，其序列相似性不大于75％，属于一种全新的玉米赤霉烯酮降解酶。本发明对其降解性质进行了研究，上述玉米赤霉烯酮降解酶可以直接通过人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

SEQ ID NO:1的序列为：

Met SerAla GluArg Val Arg Ser Thr Val Leu Thr Lys Asp Gly Ile Asn TrpTyr Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Leu Val Leu Ile Pro Asp Gly Leu GlyAsp Cys Gln Met Phe Asp Lys Pro Met Ser Leu Ile Ala Ser SerArg Phe Lys ValThr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met SerArg Ser SerAla Ala Pro Pro Glu Thr Tyr GlnGlu Val Thr Gly Glu Lys LeuAla Thr Tyr Ile Asp Thr Leu MetAsp Lys Leu Asp IleThr Thr Ala Ser Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Leu Ala Leu CysAlaAsn Phe Pro His Arg ValArgAsnAla Met Pro His Glu Leu Pro Thr Thr Asn ProPro Ser Ile Asp Asn Ile His Glu Ala Asp Pro Ala Thr Leu Pro Ala Ala LeuAlaAla Thr Ile Arg Thr Met Ser Gly Gly Glu Ala Ala Trp Asp Ala Leu Gly ProGlu Val His Asp Arg Leu Arg AlaAsn Asn Tyr Val Arg Trp Ala Tyr Gly Tyr ProArg Thr Ile Pro Gly Ser Ala Pro Thr Leu Thr Thr Thr Glu Asn Leu His Lys ValPro Ile Asp Trp Thr Val Gly Gly Ala Gly Pro Met Gln Val Phe Phe Glu Asn ValVal Ile AlaAlaArg Glu Lys Ile Pro Ile Thr Thr Leu Pro Gly Phe His Phe Pro TyrVal Ser His Pro Glu Val Phe Ala Lys Tyr Val Val Glu Thr Cys Arg Lys Tyr LeuLeu Glu

本发明以合成编码基因，制备重组载体，然后转化进行生物表达为例，制备并纯化所述玉米赤霉烯酮降解酶。重组载体为将玉米赤霉烯酮降解酶编码基因插入出发载体(例如：pET28a)的多克隆位点得到的重组表达载体。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

实施例1玉米赤霉烯酮降解酶的制备与纯化

(1)基因序列的人工合成

委托武汉金开瑞生物工程有限公司合成SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，并将该序列插入质粒载体pET26b中，保存，备用。

SEQ ID NO:2的序列如下：

atgtccgccgagagagttagatccaccgttttgactaaggacggtatcaactggtactacgagcaagaaggtactggtccagacttggttttgatcccagatggtttgggtgactgccagatgttcgataagccaatgtccttgattgcctcctccagattcaaggttaccaccttcgatatgccaggtatgtccagatcttctgctgctccaccagaaacctaccaagaggttactggtgagaagttggctacctacatcgacaccttgatggacaagctggacatcactactgcttccgtttggggttgttcttctggtgcttctactgttttggccctgtgtgctaacttcccacacagagttagaaacgctatgccacacgagctgccaactactaatccaccatccattgacaacatccacgaagctgatccagctactttgccagctgctttggctgctactatcagaactatgtctggtggtgaagctgcttgggatgctttgggtcctgaagttcacgatagactgagagccaacaactacgttagatgggcttacggttacccaagaactattccaggttccgctccaactttgactaccactgaaaacttgcacaaggtcccaatcgactggactgttggtggtgctggtccaatgcaggttttcttcgagaacgttgttatcgccgccagagagaagatcccaattactaccttgccaggttttcacttcccatacgtttctcacccagaggtgttcgccaagtacgttgttgagacttgcagaaagtacttgctcgag

(2)基因序列的扩增

根据SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列设计引物对如下：

正向引物：5′-cgcggatccatgtccgccgagagagttag-3′(SEQ ID NO:3)；

反向引物：5′-gtgctcgagctcgagcaagtactttctgcaa-3′(SEQ ID NO:4)

正向引物的下划线部分为BamHI的酶切位点，反向引物的下划线部分为XhoI酶切位点。

PCR反应体系：

Primestar Max	25μL
		正向引物	1μL
反向引物	1μL
		模板	0.5μL
水	22.5μL

PCR反应条件：98℃预变性5min，然后98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸6s，28个循环，最后72℃延伸5min。

PCR产物用质量分数为0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒(超薄离心柱型，天根公司生产)纯化。将纯化的PCR产物进行测序，结果表明PCR产物的序列包括SEQ ID NO.2所示1-810位，并将其命名为zhd11c DNA片段。

(3)重组表达载体的构建

1)将上述测序正确的PCR产物用BamHI和XhoI双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

2)将质粒pET28a(Cat.N069864-3,Novogen)用BamHI和XhoI双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。

3)将步骤1)的酶切产物和步骤2)的酶切产物进行连接，连接产物电击转化大肠杆菌DH5α后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，将得到的转化子用上述的正向引物和反向引物进行菌落PCR，筛选到含有zhd11c基因的重组菌，提取重组菌的质粒，进行测序验证，结果表明，在pET28a的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了zhd11c DNA片段，该片段包括SEQ ID NO.2的自5′端起第1至810位的核苷酸，插入方向正确，将该重组质粒命名为pET28a-zhd11c。

(4)工程菌的制备

将质粒pET28a-zhd11c电击转化大肠杆菌BL21(DE3)(Cat.N0 CD601,全式金公司)后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，得到含有质粒pET28a-zhd11c的工程菌，记作BL21/pET28a-zhd11c。

用pET28a代替pET28a-zhd11c，转化大肠杆菌BL21(DE3)，步骤同上，得到含有pET28a的重组菌，作为对照菌。将转入BL21(DE3)的阳性重组菌记作BL21/pET28a。

(5)目标蛋白的表达和纯化

His60 Ni Superflow resin纯化柱购自TaKaRa公司，产品目录号为635660。

GE HiTrap Desalting纯化柱购自GE Healthcare公司，产品目录号分别为17-1408-01。

将上述步骤4制备的阳性重组菌BL21/pET28a-zhd11c培养于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3h；OD₆₀₀＝0.7时，加入IPTG至其在LB培养基中的终浓度0.1mM，转至18℃继续培养16h。

在3800rpm、15min条件下离心收集菌体，悬浮于溶液A(50mM Tris-HCl，pH8.0)中，于冰浴中超声破碎(300w，10min；超声2s，停止4s)，之后12000rpm离心10min除去细胞碎片，取上清液；将上清液先过0.22μm滤膜，再过His60 Ni Superflow resin纯化柱，用5mL溶液A冲洗，再用10mL溶液B(50mM Tris-HCl，pH8.0，20mM咪唑)漂洗，最后用5mL溶液C(50mMTris-HCl，pH8.0，300mM咪唑)洗脱，收集洗脱液。然后将洗脱液用脱盐柱GE HiTrapDesalting进行脱盐处理，用溶液A进行洗脱，得到Zhd11c纯酶液。

将步骤(4)制备的对照菌采用相同的步骤进行培养和纯化，得到的溶液作为对照酶液。

SDS-PAGE电泳，结果如图1所示，泳道M表示蛋白分子量标准(180,130，100,70,55,40,35kDa)；泳道1表示大肠杆菌BL21/pET28a-zhd11c破菌后的上清液；泳道2表示Ni-NTA柱纯化后的Zhd11c蛋白；泳道3表示GE Desalting脱盐柱纯化后的Zhd11c蛋白，结果显示纯化的Zhd11c蛋白的分子量约为35kDa，符合理论推断的34.2kDa和30.4kDa，获得了Zhd11c蛋白。同时进行了对照组的实验，但是对照菌并没有获得目的蛋白。

实施例2以玉米赤霉烯酮为底物验证玉米赤霉烯酮降解酶的功能

酶活单位定义为1min内降解1μg底物玉米赤霉烯酮所需要的酶量作为一个酶活单位U。

(1)最适温度

用pH8.0的50mM Tris-HCl缓冲液稀释实施例1的步骤5中的Zhd11c纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。将稀释后的酶液记作稀释酶液。

溶液A组成：由50mM，pH8.0 Tris-HCl缓冲液和玉米赤霉烯酮溶液组成；底物玉米赤霉烯酮在反应体系0.5mL中的终浓度为20.0μg/ml。

实验组：活性测定反应体系为0.5mL，由0.45mL溶液A和0.05mL稀释酶液；反应体系的pH值为8.0；反应体系在特定温度范围(25-60℃)内温育10min后，0.5mL色谱级甲醇终止反应，冷却后使用高效液相色谱仪(HPLC)测定底物降解量。

结果如图2所示。图2表明，玉米赤霉烯酮降解酶具有降解玉米赤霉烯酮的活性。在45℃条件下，玉米赤霉烯酮降解酶具有最高的酶活性，为70.42U/mg；将此温度下的酶活反应体系的底物玉米赤霉烯酮降解量作为相对活性100％，其他温度下酶活反应体系的底物玉米赤霉烯酮降解量与此最高酶活体系的底物玉米赤霉烯酮降解量的比值作为相对活性。在40～45℃条件下，具有97％以上的活性，在35-50℃条件下均具有75％以上的活性。

对照组：以对照菌BL21/pET28a获得的蛋白(记作对照酶液)进行上述实验，结果不管在哪个温度条件下，对照酶液都没有降解玉米赤霉烯酮的活性。

实验设3次重复，结果一致。

(2)最适pH值

如下各组中的稀释酶液均是用各组中的缓冲液稀释实施例1的步骤5中的Zhd11c纯酶液得到的。

实验组：活性测定反应体系为0.5mL，分别由0.45mL溶液B(B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10、B11、B12、B13、B14、B15、B16、B17和B18)和0.05mL稀释酶液组成，底物玉米赤霉烯酮在反应体系0.5mL中的终浓度为20.0μg/ml。

B1、B2、B3和B4均由50mM柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液和底物玉米赤霉烯酮组成，其pH值分别为5.0、5.5、6.0和6.5；

B5、B6、B7、B8和B9均由50mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液和底物玉米赤霉烯酮组成，其pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0；

B10、B11、B12、B13和B14均由50mM Tris-HCl缓冲液和底物玉米赤霉烯酮组成，其pH值分别为7.0、7.5、8.0、8.5和9.0；

B15、B16、B17和B18均由50mM glycine-NaOH缓冲液和底物玉米赤霉烯酮组成，其pH值分别为9.0、9.5、10.0和10.5。

将反应体系在45℃温育10min后，加入0.5mL色谱级甲醇终止反应，冷却后使用高效液相色谱仪(HPLC)测定底物降解量，实验设三次重复。

结果如图3所示，玉米赤霉烯酮降解酶在pH为5.0至10.5之间的条件下均具有水解玉米赤霉烯酮的活性，即可以降解玉米赤霉烯酮。

玉米赤霉烯酮降解酶在pH 7-pH 8.5条件下具有最高酶活性。以此最高酶活性体系的底物玉米赤霉烯酮降解量作为相对活性100％，其它反应体系的底物玉米赤霉烯酮降解量与此最高酶活性体系的底物玉米赤霉烯酮降解量的比值作为各自的相对活性。在pH6.0-pH 9.5条件下均具有70％以上的活性，在pH 6.5-pH 9.0条件下均具有90％以上的活性。

对照组：以对照菌BL21/pET28a获得的蛋白(记作对照酶液)进行上述实验，结果不管在哪个pH条件下，对照酶液都没有降解玉米赤霉烯酮的活性。

(3)酶热稳定性

用pH8.0的50mM Tris-HCl缓冲液稀释实施例1的步骤5中的Zhd11c纯酶液，用稀释后的酶液以玉米赤霉烯酮为底物进行酶活测定。将稀释后的酶液记作稀释酶液。

将稀释酶液在45℃水浴分别放置10、30、60、90和120分钟，测定酶的残余活性。结果如图4所示，酶在45℃处理30min后，仍具有90％以上的残余活性，在45℃处理120分钟还有67％的残余活性，说明该酶具有优良的热稳定性。

(4)pH耐受性

将稀释酶液分别在pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0条件下,温度4.0℃条件下放置16h后，以玉米赤霉烯酮为底物测定残余酶活。结果如图5所示，pH 6.5-9.0条件下仍然残留60％以上的相对酶活。说明该酶具有良好的pH耐受性。

(5)底物特异性

将稀释酶液分别在相同浓度(反应体系中底物终浓度为20.0μg/ml)的不同底物条件下进行酶活测定，底物分别为玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇。

以玉米赤霉烯酮为底物测得酶活为参比(100％)，以α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇为底物所测相对酶活分别为38.80％，16.74％，66.90％，11.24％。因此，该酶对玉米赤霉烯酮和α-玉米赤霉醇的活性比较高。

实施例3以β-玉米赤霉烯醇为底物验证玉米赤霉烯酮降解酶的功能

如下所述的稀释酶液是用50mM Tris-HCl缓冲液稀释实施例1的步骤5中的Zhd11c纯酶液得到的。

实验组：以β-玉米赤霉烯醇为底物(底物在反应体系中的终浓度为20.0μg/ml),活性测定反应体系为0.5mL，由0.45mL底物溶液和0.05mL稀释酶液；反应体系的pH值为8.0；反应体系在最适温度40℃下反应10min后，0.5mL色谱级甲醇终止反应，冷却后使用高效液相色谱仪(HPLC)测定底物降解量。

实验设三次重复，结果一致。

结果显示在45℃、pH8.0条件下，以β-玉米赤霉烯醇为底物所测酶活为12U/mg。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 玉米赤霉烯酮降解酶在水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用

<140> 2019109382767

<141> 2019-09-30

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Ala Glu Arg Val Arg Ser Thr Val Leu Thr Lys Asp Gly Ile

1 5 10 15

Asn Trp Tyr Tyr Glu Gln Glu Gly Thr Gly Pro Asp Leu Val Leu Ile

20 25 30

Pro Asp Gly Leu Gly Asp Cys Gln Met Phe Asp Lys Pro Met Ser Leu

35 40 45

Ile Ala Ser Ser Arg Phe Lys Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met

50 55 60

Ser Arg Ser Ser Ala Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Gln Glu Val Thr Gly

65 70 75 80

Glu Lys Leu Ala Thr Tyr Ile Asp Thr Leu Met Asp Lys Leu Asp Ile

85 90 95

Thr Thr Ala Ser Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Ser Thr Val Leu

100 105 110

Ala Leu Cys Ala Asn Phe Pro His Arg Val Arg Asn Ala Met Pro His

115 120 125

Glu Leu Pro Thr Thr Asn Pro Pro Ser Ile Asp Asn Ile His Glu Ala

130 135 140

Asp Pro Ala Thr Leu Pro Ala Ala Leu Ala Ala Thr Ile Arg Thr Met

145 150 155 160

Ser Gly Gly Glu Ala Ala Trp Asp Ala Leu Gly Pro Glu Val His Asp

165 170 175

Arg Leu Arg Ala Asn Asn Tyr Val Arg Trp Ala Tyr Gly Tyr Pro Arg

180 185 190

Thr Ile Pro Gly Ser Ala Pro Thr Leu Thr Thr Thr Glu Asn Leu His

195 200 205

Lys Val Pro Ile Asp Trp Thr Val Gly Gly Ala Gly Pro Met Gln Val

210 215 220

Phe Phe Glu Asn Val Val Ile Ala Ala Arg Glu Lys Ile Pro Ile Thr

225 230 235 240

Thr Leu Pro Gly Phe His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Glu Val Phe

245 250 255

Ala Lys Tyr Val Val Glu Thr Cys Arg Lys Tyr Leu Leu Glu

260 265 270

<210> 2

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtccgccg agagagttag atccaccgtt ttgactaagg acggtatcaa ctggtactac 60

gagcaagaag gtactggtcc agacttggtt ttgatcccag atggtttggg tgactgccag 120

atgttcgata agccaatgtc cttgattgcc tcctccagat tcaaggttac caccttcgat 180

atgccaggta tgtccagatc ttctgctgct ccaccagaaa cctaccaaga ggttactggt 240

gagaagttgg ctacctacat cgacaccttg atggacaagc tggacatcac tactgcttcc 300

gtttggggtt gttcttctgg tgcttctact gttttggccc tgtgtgctaa cttcccacac 360

agagttagaa acgctatgcc acacgagctg ccaactacta atccaccatc cattgacaac 420

atccacgaag ctgatccagc tactttgcca gctgctttgg ctgctactat cagaactatg 480

tctggtggtg aagctgcttg ggatgctttg ggtcctgaag ttcacgatag actgagagcc 540

aacaactacg ttagatgggc ttacggttac ccaagaacta ttccaggttc cgctccaact 600

ttgactacca ctgaaaactt gcacaaggtc ccaatcgact ggactgttgg tggtgctggt 660

ccaatgcagg ttttcttcga gaacgttgtt atcgccgcca gagagaagat cccaattact 720

accttgccag gttttcactt cccatacgtt tctcacccag aggtgttcgc caagtacgtt 780

gttgagactt gcagaaagta cttgctcgag 810

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatcca tgtccgccga gagagttag 29

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgctcgagc tcgagcaagt actttctgca a 31

Claims

1.一种玉米赤霉烯酮降解酶在水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述玉米赤霉烯酮的衍生物为α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇或β-玉米赤霉醇中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因如SEQ ID NO:2所示。

3.一种玉米赤霉烯酮及其衍生物的水解方法，其特征在于，包括以下步骤：以玉米赤霉烯酮或其衍生物为底物，利用玉米赤霉烯酮降解酶对所述底物进行水解，所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列序列如SEQ ID NO:1所示，所述玉米赤霉烯酮的衍生物为α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇或β-玉米赤霉醇中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因如SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求3-4任一项所述的方法，其特征在于，水解的条件为：反应温度为35～50℃，pH值为6.0～9.5，不另外补加所述玉米赤霉烯酮降解酶的反应时间为0.5-2小时。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，反应温度为40～45℃，pH值为6.5-9.0，不另外补加所述玉米赤霉烯酮降解酶的反应时间为1.5-2小时。