CN110819608B - 一种玉米赤霉烯酮及其衍生物的水解方法 - Google Patents
一种玉米赤霉烯酮及其衍生物的水解方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种玉米赤霉烯酮及其衍生物的水解方法，以玉米赤霉烯酮或其衍生物为底物，利用玉米赤霉烯酮降解酶对所述底物进行水解，所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，本发明所述的玉米赤霉烯酮降解酶具有酶活高、温度与pH耐受性良好等优点，可以广泛应用于玉米赤霉烯酮及其几种衍生物的酶解，底物范围广，其中对玉米赤霉烯酮、α‑玉米赤霉醇和β‑玉米赤霉醇具有较高活性，SEQ ID NO:2在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列上将第158位T突变为H，突变后其对于底物α‑玉米赤霉烯醇的酶活提高40％。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种玉米赤霉烯酮降解酶在水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用以及一种玉米赤霉烯酮及其衍生物的水解方法。
背景技术
玉米赤霉烯酮首先是从玉米中分离出来的，是可以由许多镰孢属物种产生的一种非甾体雌激素霉菌毒素，作物在收获前后都会产生。玉米赤霉烯酮总是在包括玉米、大麦、小麦等许多作物和谷类副产品中被发现，尤其是在适合真菌生长的环境中。
玉米赤霉烯酮的衍生物有很多，例如玉米赤霉烯醇，他们会通过污染的作物进入食物链并积累在人体和动物体内，对生物造成损害。玉米赤霉烯酮及其衍生物的化学结构类似于天然雌激素，因此他们能够竞争性地结合雌激素受体，引起外部和内部生殖器改变和繁殖障碍，导致高雌性激素症和不孕症，次来毒素还会刺激乳腺癌细胞系的生长并在小鼠中致癌。
鉴于此类毒素的危害，玉米赤霉烯酮等在谷物、食品和饲料中的含量必须低于一定标准。玉米赤霉烯酮等是极端稳定的，使用传统的物理和化学方法除去此类毒素是低效的，为了解决这些问题，降低此类毒素污染的一个有希望的策略是酶降解。酶降解不仅可以高效地将毒素转化为无毒性产物，安全环保，而且酶催化反应专一性强、降解效率高，不会破坏谷物的营养物质。
迄今为止，已经进行表征的玉米赤霉烯酮降解酶根据其特性可分为三类：一是Zhd101类，包含玉米赤霉烯酮降解酶Zhd101、ZEN-JJM和Zlhy-6，因后两者与Zhd101的氨基酸一致性为99％和98％，性质基本一致，故分为一类，Zhd101的最适反应温度是37℃、最适pH为9.5；二是Zhd518类，包含玉米赤霉烯酮降解酶Zhd518，其与Zhd101的氨基酸同源性在65％，最适温度为40℃、最适pH为8.0；三是ZhdAY3，其与Zhd101和Zhd518的氨基酸同源性分别为为63％和65％，最适温度为40℃、最适pH为9.5。但是，这些玉米赤霉烯酮降解酶仅对玉米赤霉烯酮(ZEN)具有较高的活性，对其衍生物玉米赤霉烯醇(ZOL)和玉米赤霉醇(ZAL)具有低相对活性，均不是很适合大规模工业应用，需要获得一种能够克服这些弊端，适合大规模工业应用的降解酶。
发明内容
发明人在研究过程中意外发现氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的蛋白质以及对SEQ ID NO:1所示序列的158位氨基酸进行点突变得到的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示的蛋白质均具有玉米赤霉烯酮降解酶活性，且酶的稳定性好，作用pH广，对玉米赤霉烯酮(ZEN)，α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、α-玉米赤霉醇(α-ZAL)和β-玉米赤霉醇(β-ZAL)均有较高的相对活性。
本发明为解决上述技术问题提供了一种玉米赤霉烯酮降解酶在高效水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种玉米赤霉烯酮降解酶在水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用，所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或将SEQ ID NO:1所示序列的第158位突变为组氨酸得到的SEQ ID NO:2所示。
进一步，所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
进一步，所述玉米赤霉烯酮的衍生物为α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇或β-玉米赤霉醇中的一种或多种。
本发明还提供了一种玉米赤霉烯酮及其衍生物的水解方法，包括以下步骤：以玉米赤霉烯酮或其衍生物为底物，利用玉米赤霉烯酮降解酶对所述底物进行水解，所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或将SEQ ID NO:1所示序列的第158位突变为组氨酸得到的SEQ ID NO:2所示。
进一步，所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
进一步，所述玉米赤霉烯酮的衍生物为α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇或β-玉米赤霉醇中的一种或多种。
进一步，所述水解的条件为：反应温度为35-50℃，pH为6.0-9.0，水解过程中补加所述玉米赤霉烯酮降解酶的频率为每0.5-2h补加一次。
进一步，所述水解的条件为：反应温度为40-45℃，pH为7-8.5，水解过程中补加所述玉米赤霉烯酮降解酶的频率为1.5-2h补加一次。
本发明的有益效果是：氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示序列的蛋白质具有玉米赤霉烯酮及其几种衍生物的降解活性，属于玉米赤霉烯酮降解酶，该蛋白与其他已经表征的玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列相比，相似性不大于75％，属于一种全新的玉米赤霉烯酮降解酶，为人们降解玉米赤霉烯酮及其衍生物增加了一种新的选择。本发明的玉米赤霉烯酮在以玉米赤霉烯酮作为底物时，在40℃，pH为7-8.5条件下具有最高的酶活性，为17.8U/mg,同时具有在较宽pH条件下降解活性较高的特性，同时其在不同pH下的稳定性较好，还具有优良的热稳定性，更重要的是对玉米赤霉烯酮(ZEN),α-玉米赤霉醇(α-ZAL)和β-玉米赤霉醇(β-ZAL)均有较高的相对活性。
具体如下：
(1)本发明得到的Zhd11B与Zhd518只有73.03％的同源性，确定是一种新型的玉米赤霉烯酮降解酶。另外，已经表征的玉米赤霉烯酮降解酶Zhd101的最适反应温度是37℃、最适pH为9.5；玉米赤霉烯酮降解酶Zhd518的最适反应温度是40℃、最适pH为8.0。本发明中的Zhd11B的最适温度为40℃、最适pH为8.0-8.5。Zhd11B在温度为30-50℃的范围内依然具有60％的酶活，在pH为6.0-9.5的范围内具有60％以上的酶活。这些优点在已表征的ZEN降解酶中都是未发现的，这说明了本发明得到的Zhd11B具有显著的优势，具有大规模工业应用的潜力；
(2)本发明提供的玉米赤霉烯酮降解酶Zhd 11B对ZEN及其四种衍生物都具有降解活性，但降解能力有所差别。结果如下：将稀释酶液分别在相同浓度(反应体系中底物终浓度为20.0μg/ml)的不同底物条件下进行酶活测定。以玉米赤霉烯酮为底物测得酶活为参比(100％)，以α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇为底物所测相对酶活分别为64.19％，33.02％，124.17％，120.89％。因此，该酶对玉米赤霉烯酮(ZEN)、α-玉米赤霉醇(α-ZAL)和β-玉米赤霉醇(β-ZAL)的活性比较高，其他次之；
(3)本发明中提供的玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11B在经过一个定点(T158H)突变后得到SEQ ID NO:2所示蛋白，该蛋白利用不同底物进行酶活测定，以玉米赤霉烯酮为底物测得酶活为参比(100％)，以α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇为底物所测相对酶活分别为91.18％，4.35％，72.07％，83.89％。对于底物α-玉米赤霉烯醇的酶活增加了40％。
附图说明
图1为本发明玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11B蛋白纯化前后的SDS-PAGE电泳图，其中泳道M为标准分子量蛋白(170,130，100,70,55,40,35kDa)，泳道1为大肠杆菌BL21/pET28a-zhd11B破菌后的上清液；泳道2为Ni-NTA柱纯化后的Zhd11B蛋白；泳道3为GE Desalting脱盐柱纯化后的Zhd11B蛋白；
图2为本发明玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11B的活性随温度的变化的结果；
图3为本发明玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11B的活性随pH的变化的结果；
图4为玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11B在40℃下的热稳定性；
图5为玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11B的活性在不同pH下的稳定性；
图6为玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11B和其突变体T158H对不同底物的降解相对活性。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
发明人在研究过程中发现，氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的蛋白质具有玉米赤霉烯酮及其衍生物的降解活性，属于玉米赤霉烯酮降解酶，该酶属于一种内酯水解酶，具有269个氨基酸组成，并且该蛋白与其他已经表征的玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列相比，其序列相似性不大于75％，属于一种全新的玉米赤霉烯酮降解酶。本发明对其降解性质进行了研究，上述玉米赤霉烯酮降解酶可以直接通过人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
SEQ ID NO:1的序列为：
Met Pro Ala Gln Arg ThrArg Ser Thr Val Arg ThrAsn Asp Gly Ile Thr TrpTyr Tyr Glu Gln Glu Gly Ser Gly Pro Asp Ile Val Leu Ile Pro Asp Gly Val GlyAsp Cys Gly Leu Phe Asp Gln Pro Met Ser Thr Ile Ala Ser Ser Gly Phe Arg ValThr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met SerArg SerAlaAla ThrAla Pro Pro Glu Thr TyrGln Asp Val Thr Gly Gln Lys LeuAla Gly Tyr Ile Val Thr Leu MetAsp Glu Leu GlyIle Lys Ser Ala Ala Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Thr Thr Val Leu Ala LeuCys Ser Gly Phe Pro Asp Arg ValArg Asn Gly Met Pro His Glu Val Pro Thr ValAsnPro Asp Asn Leu Lys Asn Ile His Glu Val ThrAsp ThrAsp Ala Leu Thr Ala Glu LeuAla Ala Thr Ile Arg Thr Met SerAla Asn Glu Ala Ala Trp Asp Ala Leu GlyAla GluVal His GluArg LeuArg GlyAsn TyrAla Arg Trp Ala Tyr Gly Tyr Pro Arg Thr IlePro Gly Ser Ala Ala Thr Lys Thr Glu Asp Leu His Lys Val Pro Ile Asp Trp ThrVal Gly Gly Ala Gly Pro Met Gln Ala Phe Phe Glu Asn Val Val Ile Ala ThrArgGlu Lys Ile Pro Ile Thr Thr Leu Pro Gly Phe His Phe Pro TyrVal Ser His ProGluAla PheAlaArg TyrVal Val Glu Thr SerArg Lys TyrVal Leu Glu
本发明以合成编码基因，制备重组载体，然后转化进行生物表达为例，制备并纯化所述玉米赤霉烯酮降解酶。重组载体为将玉米赤霉烯酮降解酶编码基因插入出发载体(例如：pET28a)的多克隆位点得到的重组表达载体。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
实施例1玉米赤霉烯酮降解酶的制备与纯化
(1)基因序列的人工合成
委托武汉金开瑞生物工程有限公司合成SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，并将该序列插入质粒载体pET28a中，保存，备用。
SEQ ID NO:3的序列如下：
atgccagctcagagaaccagatccaccgttagaactaacgacggtatcacctggtactacgagcaagaaggttctggtccagacatcgttttgatcccagatggtgttggtgactgcggtttgttcgatcagccaatgtctactattgcctcctccggtttcagagttaccactttcgatatgccaggtatgtccagatctgctgctactgctccaccagaaacttaccaagacgttaccggtcaaaagctggccggttacatcgttactttgatggacgagttgggtatcaagtccgctgctgtttggggttgttcttctggtgctactactgttttggccctgtgttctggtttcccagacagagttagaaacggtatgccacacgaggttccaactgttaacccagacaacctgaagaacatccacgaggttactgacactgacgctttgactgctgaattggctgctaccatcagaactatgtctgctaacgaagctgcttgggatgctttgggtgctgaagttcacgaaagactgagaggtaactacgctagatgggcttacggttacccaagaactattccaggttccgctgctactaagactgaggacttgcacaaggttccaatcgactggactgttggtggtgctggtccaatgcaagctttcttcgagaacgttgttatcgccaccagagagaagatcccaatcactactttgccaggttttcacttcccatacgtgtctcacccagaagctttcgccagatacgttgttgagacttcccgtaagtacgttctcgag
(2)基因序列的扩增
根据SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列设计引物如下：
正向引物：5′-cgcggatccatgccagctcagagaaccag-3′(SEQ ID NO:5)；
反向引物：5′-gtgctcgagaacgtacttacgggaagtctcaa-3′(SEQ ID NO:6)
正向引物的下划线部分为BamHI的酶切位点，反向引物的下划线部分为XhoI酶切位点。
PCR反应体系：
| Primestar Max | 25μL |
| 正向引物 | 1μL |
| 反向引物 | 1μL |
| 模板 | 0.5μL |
| 水 | 22.5μL |
PCR反应条件：98℃预变性5min，然后98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸15s，28个循环，最后72℃延伸5min。
PCR产物用质量分数为0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒(超薄离心柱型，天根公司生产)纯化。将纯化的PCR产物进行测序，结果表明PCR产物的序列包括SEQ ID NO：:3所示1-807位，并将其命名为zhd11B DNA片段。
(3)重组表达载体的构建
1)将上述测序正确的PCR产物用BamHI和XhoI双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。
2)将质粒pET28a(Cat.N069864-3,Novogen)用BamHI和XhoI双酶切，琼脂糖电泳回收酶切产物。
3)将步骤1)的酶切产物和步骤2)的酶切产物进行连接，连接产物电击转化大肠杆菌DH5α后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，将得到的转化子用上述的正向引物和反向引物进行菌落PCR，筛选到含有zhd11B基因的重组菌，提取重组菌的质粒，进行测序验证，结果表明，在pET28a的BamHI和XhoI酶切位点之间插入了zhd11BDNA片段，该片段包括SEQ ID NO：3的自5′端起第1至807位的核苷酸，插入方向正确，将该重组质粒命名为pET28a-zhd11B。
(4)工程菌的制备
将质粒pET28a-zhd11B电击转化大肠杆菌BL21(DE3)(Cat.N0 CD601,全式金公司)后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，得到含有质粒pET28a-zhd11B的工程菌，记作BL21/pET28a-zhd11B。
用pET28a代替pET28a-zhd11B，转化大肠杆菌BL21(DE3)，步骤同上，得到含有pET28a的重组菌，作为对照菌。将转入BL21(DE3)的阳性重组菌记作BL21/pET28a。
(5)目标蛋白的表达和纯化
His60 Ni Superflow resin纯化柱购自TaKaRa公司，产品目录号为635660。
GE HiTrap Desalting纯化柱购自GE Healthcare公司，产品目录号分别为17-1408-01。
将上述步骤4制备的阳性重组菌BL21/pET28a-zhd11B培养于含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养3h；OD600＝0.7时，加入IPTG至其在LB培养基中的终浓度0.1mM，转至18℃继续培养16h。
在3800rpm、15min条件下离心收集菌体，悬浮于溶液A(50mM Tris-HCl，pH8.0)中，于冰浴中超声破碎(300w，10min；超声2s，停止4s)，之后12000rpm离心10min除去细胞碎片，取上清液；将上清液先过0.22μm滤膜，再过His60 Ni Superflow resin纯化柱，用5mL溶液A冲洗，再用10mL溶液B(50mM Tris-HCl，pH8.0，20mM咪唑)漂洗，最后用5mL溶液C(50mMTris-HCl，pH8.0，300mM咪唑)洗脱，收集洗脱液。然后将洗脱液用脱盐柱GE HiTrapDesalting进行脱盐处理，用溶液A进行洗脱，得到Zhd11B纯酶液。
将步骤(4)制备的对照菌采用相同的步骤进行培养和纯化，得到的溶液作为对照酶液。
SDS-PAGE电泳，结果如图1所示，泳道M表示蛋白分子量标准(170,130，100,70,55,40,35kDa)；泳道1表示大肠杆菌BL21/pET28a-zhd11B破菌后的上清液；泳道2表示Ni-NTA柱纯化后的Zhd11B蛋白；泳道3表示GE Desalting脱盐柱纯化后的Zhd11B蛋白，结果显示纯化的Zhd11B蛋白的分子量约为35kDa，符合理论推断的34.2kDa和30.4kDa，获得了Zhd11B蛋白。同时进行了对照组的实验，但是对照菌并没有获得目的蛋白。
实施例2以玉米赤霉烯酮为底物验证玉米赤霉烯酮降解酶的功能
酶活单位定义为1min内降解1μg底物玉米赤霉烯酮所需要的酶量作为一个酶活单位U。
(1)最适温度
用pH8.0的50mM Tris-HCl缓冲液稀释实施例1的步骤5中的Zhd11B纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。将稀释后的酶液记作稀释酶液。
溶液A组成：由50mM，pH为8.0的Tris-HCl缓冲液和玉米赤霉烯酮溶液组成；底物玉米赤霉烯酮在反应体系0.5mL中的终浓度为10.0μg/ml。
实验组：活性测定反应体系为0.5mL，由0.45mL溶液A和0.05mL稀释酶液；反应体系的pH值为8.0；反应体系在特定温度范围(25-60℃)内温育10min后，0.5mL色谱级甲醇终止反应，冷却后使用高效液相色谱仪(HPLC)测定底物降解量。
结果如图2所示，在40℃条件下，玉米赤霉烯酮降解酶具有最高的酶活性，为17.8U/mg；将此温度下的酶活反应体系的底物玉米赤霉烯酮降解量作为相对活性100％，其他温度下酶活反应体系的底物玉米赤霉烯酮降解量与此最高酶活体系的底物玉米赤霉烯酮降解量的比值作为相对活性。在35～45℃条件下，具有95％以上的活性，在30-50℃条件下均具有60％以上的活性。
对照组：以对照菌BL21/pET28a获得的蛋白(记作对照酶液)进行上述实验，结果不管在哪个温度条件下，对照酶液都没有降解玉米赤霉烯酮的活性。
实验设3次重复，结果一致。
(2)最适pH值
如下各组中的稀释酶液均是用各组中的缓冲液稀释实施例1的步骤5中的Zhd11B纯酶液得到的。
实验组：活性测定反应体系为0.5mL，分别由0.45mL溶液B(B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、B10、B11、B12、B13、B14、B15、B16、B17和B18)和0.05mL稀释酶液组成，底物玉米赤霉烯酮在反应体系0.5mL中的终浓度为10.0μg/ml。
B1、B2、B3和B4均由50mM柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液和底物玉米赤霉烯酮组成，其pH值分别为5.0、5.5、6.0和6.5；
B5、B6、B7、B8和B9均由50mM NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液和底物玉米赤霉烯酮组成，其pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0；
B10、B11、B12、B13和B14均由50mM Tris-HCl缓冲液和底物玉米赤霉烯酮组成，其pH值分别为7.0、7.5、8.0、8.5和9.0；
B15、B16、B17和B18均由50mM glycine-NaOH缓冲液和底物玉米赤霉烯酮组成，其pH值分别为9.0、9.5、10.0和10.5。
将反应体系在45℃温育10min后，加入0.5mL色谱级甲醇终止反应，冷却后使用高效液相色谱仪(HPLC)测定底物降解量，实验设三次重复。
结果如图3所示，玉米赤霉烯酮降解酶在pH为5.0至10.5之间的条件下均具有水解玉米赤霉烯酮的活性，即可以降解玉米赤霉烯酮。
玉米赤霉烯酮降解酶在pH 8.0-pH 8.5条件下具有最高酶活性。以此最高酶活性体系的底物玉米赤霉烯酮降解量作为相对活性100％，其它反应体系的底物玉米赤霉烯酮降解量与此最高酶活性体系的底物玉米赤霉烯酮降解量的比值作为各自的相对活性。在pH6.0-pH 9.5条件下均具有60％以上的活性，在pH 7.0-pH 9.0条件下均具有80％以上的活性。
对照组：以对照菌BL21/pET28a获得的蛋白(记作对照酶液)进行上述实验，结果不管在哪个pH条件下，对照酶液都没有降解玉米赤霉烯酮的活性。
(3)酶热稳定性
用pH8.0的50mM Tris-HCl缓冲液稀释实施例1的步骤5中的Zhd11B纯酶液，用稀释后的酶液以玉米赤霉烯酮为底物进行酶活测定。将稀释后的酶液记作稀释酶液。
将稀释酶液在40℃水浴分别放置10、30、60、90和120分钟，测定酶的残余活性。结果如图4所示，酶在40℃处理30min后，仍具有90％以上的残余活性，在40℃处理120分钟还有60％以上的残余活性，说明该酶具有优良的热稳定性。
(4)pH耐受性
将稀释酶液分别在pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0条件下,温度4.0℃条件下放置16h后，以玉米赤霉烯酮为底物测定残余酶活。结果如图5所示，pH 6.5-9.0条件下仍然残留50％以上的相对酶活。说明该酶具有良好的pH耐受性。
(5)底物特异性
将稀释酶液分别在相同浓度(反应体系中底物终浓度为10.0μg/ml)的不同底物条件下进行酶活测定，底物分别为玉米赤霉烯酮(ZEN)、α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)、α-玉米赤霉醇(α-ZAL)、β-玉米赤霉醇(β-ZAL)。
以玉米赤霉烯酮为底物测得酶活为参比(100％)，以α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇为底物所测相对酶活分别为64.19％，33.02％，124.17％，120.89％。因此，该酶对玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的活性比较高。
实施例3玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11B点突变
将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11B的第158位由苏氨酸突变为组氨酸得到玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11B(T158H)，点突变之后的玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11B(T158H)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。其中，
SEQ ID NO:2
Met Pro Ala Gln Arg ThrArg Ser Thr Val Arg Thr Asn Asp Gly Ile ThrTrp Tyr Tyr Glu Gln Glu Gly Ser Gly Pro Asp Ile Val Leu Ile Pro Asp Gly ValGlyAsp Cys Gly Leu Phe Asp Gln Pro Met Ser Thr Ile Ala Ser Ser Gly Phe ArgVal Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met SerArg SerAlaAla ThrAla Pro Pro Glu ThrTyr GlnAsp Val Thr Gly Gln Lys Leu Ala Gly Tyr Ile Val Thr Leu Met Asp GluLeu Gly Ile Lys Ser Ala Ala Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Thr Thr ValLeuAla Leu Cys Ser Gly Phe Pro Asp Arg ValArgAsn Gly Met Pro His Glu Val ProThr Val Asn Pro Asp Asn Leu Lys Asn Ile His Glu Val ThrAsp ThrAsp Ala LeuThrAla Glu Leu Ala Ala His Ile Arg Thr Met Ser Ala Asn Glu Ala Ala Trp AspAla Leu GlyAla Glu Val His GluArg LeuArg GlyAsn TyrAlaArg Trp Ala Tyr Gly TyrPro Arg Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Lys Thr Glu Asp Leu His Lys Val ProIle Asp Trp Thr Val Gly Gly Ala Gly Pro Met Gln Ala Phe Phe Glu Asn Val ValIleAla ThrArg Glu Lys Ile Pro Ile Thr Thr Leu Pro Gly Phe His Phe Pro TyrValSer His Pro GluAla PheAlaArg TyrVal Val Glu Thr SerArg Lys Tyr Val Leu Glu
SEQ ID NO:4
atgccagctcagagaaccagatccaccgttagaactaacgacggtatcacctggtactacgagcaagaaggttctggtccagacatcgttttgatcccagatggtgttggtgactgcggtttgttcgatcagccaatgtctactattgcctcctccggtttcagagttaccactttcgatatgccaggtatgtccagatctgctgctactgctccaccagaaacttaccaagacgttaccggtcaaaagctggccggttacatcgttactttgatggacgagttgggtatcaagtccgctgctgtttggggttgttcttctggtgctactactgttttggccctgtgttctggtttcccagacagagttagaaacggtatgccacacgaggttccaactgttaacccagacaacctgaagaacatccacgaggttactgacactgacgctttgactgctgaattggctgctcacatcagaactatgtctgctaacgaagctgcttgggatgctttgggtgctgaagttcacgaaagactgagaggtaactacgctagatgggcttacggttacccaagaactattccaggttccgctgctactaagactgaggacttgcacaaggttccaatcgactggactgttggtggtgctggtccaatgcaagctttcttcgagaacgttgttatcgccaccagagagaagatcccaatcactactttgccaggttttcacttcccatacgtgtctcacccagaagctttcgccagatacgttgttgagacttcccgtaagtacgttctcgag
点突变实验设计如下：
通过整个环状质粒pET28a-Zhd11B的反向聚合酶链式反应扩增进行突变。Zhd11B(T158H)的诱变引物如下：
T158H-F：5'–attggctgctcacatcagaactatgtctgctaacga-3'(SEQ ID NO:7)
T158H-R：5'-gttctgatgtgagcagccaattcagcagtca-3'(SEQ ID NO:8)
琼脂糖电泳回收PCR产物，之后用DpnI酶处理以除去模板链，电击转化大肠杆菌DH5α后涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃过夜培养，将得到的转化子进行测序验证，结果表明，158位的T被突变成H而其他位置未发生突变，将该重组质粒命名为pET28a-Zhd11B(T158H)。
之后按照实施例1中的方法制备目标蛋白并按照实施例2中的方法进行底物特异性测定。将稀释酶液分别在相同浓度(反应体系中底物终浓度为10.0μg/ml)的不同底物条件下进行酶活测定，底物分别为玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇。以未突变的酶对玉米赤霉烯酮为底物测得酶活为参比(100％)，以玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇为底物所测相对酶活分别为70.54％、91.18％、4.35％、72.07％、83.89％，其相对与玉米赤霉烯酮降解酶Zhd11B对底物α-玉米赤霉烯醇的酶活提升了40％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种玉米赤霉烯酮及其衍生物的水解方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Pro Ala Gln Arg Thr Arg Ser Thr Val Arg Thr Asn Asp Gly Ile
1 5 10 15
Thr Trp Tyr Tyr Glu Gln Glu Gly Ser Gly Pro Asp Ile Val Leu Ile
20 25 30
Pro Asp Gly Val Gly Asp Cys Gly Leu Phe Asp Gln Pro Met Ser Thr
35 40 45
Ile Ala Ser Ser Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met
50 55 60
Ser Arg Ser Ala Ala Thr Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Gln Asp Val Thr
65 70 75 80
Gly Gln Lys Leu Ala Gly Tyr Ile Val Thr Leu Met Asp Glu Leu Gly
85 90 95
Ile Lys Ser Ala Ala Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Thr Thr Val
100 105 110
Leu Ala Leu Cys Ser Gly Phe Pro Asp Arg Val Arg Asn Gly Met Pro
115 120 125
His Glu Val Pro Thr Val Asn Pro Asp Asn Leu Lys Asn Ile His Glu
130 135 140
Val Thr Asp Thr Asp Ala Leu Thr Ala Glu Leu Ala Ala Thr Ile Arg
145 150 155 160
Thr Met Ser Ala Asn Glu Ala Ala Trp Asp Ala Leu Gly Ala Glu Val
165 170 175
His Glu Arg Leu Arg Gly Asn Tyr Ala Arg Trp Ala Tyr Gly Tyr Pro
180 185 190
Arg Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Lys Thr Glu Asp Leu His Lys
195 200 205
Val Pro Ile Asp Trp Thr Val Gly Gly Ala Gly Pro Met Gln Ala Phe
210 215 220
Phe Glu Asn Val Val Ile Ala Thr Arg Glu Lys Ile Pro Ile Thr Thr
225 230 235 240
Leu Pro Gly Phe His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Glu Ala Phe Ala
245 250 255
Arg Tyr Val Val Glu Thr Ser Arg Lys Tyr Val Leu Glu
260 265
<210> 2
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Pro Ala Gln Arg Thr Arg Ser Thr Val Arg Thr Asn Asp Gly Ile
1 5 10 15
Thr Trp Tyr Tyr Glu Gln Glu Gly Ser Gly Pro Asp Ile Val Leu Ile
20 25 30
Pro Asp Gly Val Gly Asp Cys Gly Leu Phe Asp Gln Pro Met Ser Thr
35 40 45
Ile Ala Ser Ser Gly Phe Arg Val Thr Thr Phe Asp Met Pro Gly Met
50 55 60
Ser Arg Ser Ala Ala Thr Ala Pro Pro Glu Thr Tyr Gln Asp Val Thr
65 70 75 80
Gly Gln Lys Leu Ala Gly Tyr Ile Val Thr Leu Met Asp Glu Leu Gly
85 90 95
Ile Lys Ser Ala Ala Val Trp Gly Cys Ser Ser Gly Ala Thr Thr Val
100 105 110
Leu Ala Leu Cys Ser Gly Phe Pro Asp Arg Val Arg Asn Gly Met Pro
115 120 125
His Glu Val Pro Thr Val Asn Pro Asp Asn Leu Lys Asn Ile His Glu
130 135 140
Val Thr Asp Thr Asp Ala Leu Thr Ala Glu Leu Ala Ala His Ile Arg
145 150 155 160
Thr Met Ser Ala Asn Glu Ala Ala Trp Asp Ala Leu Gly Ala Glu Val
165 170 175
His Glu Arg Leu Arg Gly Asn Tyr Ala Arg Trp Ala Tyr Gly Tyr Pro
180 185 190
Arg Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Lys Thr Glu Asp Leu His Lys
195 200 205
Val Pro Ile Asp Trp Thr Val Gly Gly Ala Gly Pro Met Gln Ala Phe
210 215 220
Phe Glu Asn Val Val Ile Ala Thr Arg Glu Lys Ile Pro Ile Thr Thr
225 230 235 240
Leu Pro Gly Phe His Phe Pro Tyr Val Ser His Pro Glu Ala Phe Ala
245 250 255
Arg Tyr Val Val Glu Thr Ser Arg Lys Tyr Val Leu Glu
260 265
<210> 3
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgccagctc agagaaccag atccaccgtt agaactaacg acggtatcac ctggtactac 60
gagcaagaag gttctggtcc agacatcgtt ttgatcccag atggtgttgg tgactgcggt 120
ttgttcgatc agccaatgtc tactattgcc tcctccggtt tcagagttac cactttcgat 180
atgccaggta tgtccagatc tgctgctact gctccaccag aaacttacca agacgttacc 240
ggtcaaaagc tggccggtta catcgttact ttgatggacg agttgggtat caagtccgct 300
gctgtttggg gttgttcttc tggtgctact actgttttgg ccctgtgttc tggtttccca 360
gacagagtta gaaacggtat gccacacgag gttccaactg ttaacccaga caacctgaag 420
aacatccacg aggttactga cactgacgct ttgactgctg aattggctgc taccatcaga 480
actatgtctg ctaacgaagc tgcttgggat gctttgggtg ctgaagttca cgaaagactg 540
agaggtaact acgctagatg ggcttacggt tacccaagaa ctattccagg ttccgctgct 600
actaagactg aggacttgca caaggttcca atcgactgga ctgttggtgg tgctggtcca 660
atgcaagctt tcttcgagaa cgttgttatc gccaccagag agaagatccc aatcactact 720
ttgccaggtt ttcacttccc atacgtgtct cacccagaag ctttcgccag atacgttgtt 780
gagacttccc gtaagtacgt tctcgag 807
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gttctgatgt gagcagccaa ttcagcagtc a 31
Claims (6)
1.一种玉米赤霉烯酮降解酶在水解玉米赤霉烯酮及其衍生物中的应用，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，所述玉米赤霉烯酮的衍生物为α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇或β-玉米赤霉醇中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
3.一种玉米赤霉烯酮及其衍生物的水解方法，其特征在于，包括以下步骤：以玉米赤霉烯酮或其衍生物为底物，利用玉米赤霉烯酮降解酶对所述底物进行水解，所述玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，所述玉米赤霉烯酮的衍生物为α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇或β-玉米赤霉醇中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮降解酶的编码基因如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
5.根据权利要求3-4任一项所述的方法，其特征在于，所述水解的条件为：反应温度为30-50℃，pH为6.0-9.0，水解过程中补加所述玉米赤霉烯酮降解酶的频率为每0.5-2h补加一次。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述水解的条件为：反应温度为40-45℃，pH为8.0-8.5，水解过程中补加所述玉米赤霉烯酮降解酶的频率为1.5-2h补加一次。
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