CN111662894B - 一种嗜冷碱性脂肪酶PgLip1及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1及其编码基因和酶学性质。发明提供了一种来源于谷关假单胞菌的嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，理论分子量为27.4kDa。本发明的嗜冷、碱性脂肪酶除了具有嗜冷、耐碱的特性，还具有金属离子抗性和表面活性剂抗性，在农业生物技术领域具有潜在的应用价值。

Description

一种嗜冷碱性脂肪酶PgLip1及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种嗜冷碱性脂肪酶PgLip1及其编码基因和应用。

背景技术

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)是指催化三酯酰甘油水解的一类酶的总称，是一类特殊的酯键水解酶，其天然底物是长链脂肪酸酯，既可以在两相系统(油、水界面)中起作用，也可以在水相中起作用。脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的水解和合成反应，且反应条件温和、副产物少。因此，脂肪酶的应用十分广泛，如食品行业、医药卫生、饲料、化学化工、环境保护、能源开发、皮革等领域，已成为在生物技术和有机合成方面应用最广泛的一类酶。

脂肪酶广泛存在于动物、植物和微生物中。动物体内含脂肪酶较多的部位是胰脏和脂肪组织；植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子；微生物脂肪酶一般是由细菌、真菌和酵母分泌所产生，应用较为广泛。此外，微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，已成为工业生产脂肪酶的主要来源。

脂肪酶在工业领域的应用，要求其具有低温、耐碱、受表面活性剂的强烈激活和受醇类激活等特性，然而现有脂肪酶仅具有其中的一个或两个特性，没有兼具上述特性的脂肪酶，限制了脂肪酶的应用。

发明内容

为了解决上述技术问题，提出并完成了本发明。

本发明的目的在于提供一种嗜冷碱性脂肪酶PgLip1。

本发明的再一目的在于提供上述嗜冷碱性脂肪酶PgLip1的编码基因。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供上述嗜冷碱性脂肪酶PgLip1的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述嗜冷碱性脂肪酶PgLip1的应用。

本发明的嗜冷碱性脂肪酶PgLip1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示：

MLCSIGARTRQRKDVCCAALPMWWFAGRWRLVQQQWNEEASMFDLKFGGLAAACLLLCSTALAAPLPDTPGAPFPAVANFDRSGPYATSSQSEGPSCRIYRPSNLGQGGVRHPVILWGNGTGTGPSTYAGLLSHWASHGFVVAAAETSNAGTGREMLACLDYLVRENNNPYGTYAGKLNTGRVGTSGHSQGGGGSIMAGQDTRVRTTAPIQPYTIGLGHDSASQRRQQGPMFLMSGGGDTIAIPYLNAQPVYLRANVPVFWGERRYVSHFEPVGDGGAYRGPSTAWFRLQLMDDQGARGTFYGALCSLCSSLLWSVDRRGF

该酶包括321个氨基酸，N端63个氨基酸为其信号肽序列，信号肽的序列如SEQ IDNO.2所示：

MLCSIGARTRQRKDVCCAALPMWWFAGRWRLVQQQWNEEASMFDLKFGGLAAACLLLCSTALA

成熟的脂肪酶PgLip1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

APLPDTPGAPFPAVANFDRSGPYATSSQSEGPSCRIYRPSNLGQGGVRHPVILWGNGTGTGPSTYAGLLSHWASHGFVVAAAETSNAGTGREMLACLDYLVRENNNPYGTYAGKLNTGRVGTSGHSQGGGGSIMAGQDTRVRTTAPIQPYTIGLGHDSASQRRQQGPMFLMSGGGDTIAIPYLNAQPVYLRANVPVFWGERRYVSHFEPVGDGGAYRGPSTAWFRLQLMDDQGARGTFYGALCSLCSSLLWSVDRRGF

本发明的编码上述嗜冷碱性脂肪酶PgLip1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.4

GTGCTCTGCTCCATCGGCGCCCGCACTCGCCAGCGCAAGGATGTGTGCTGCGCCGCTCTGCCGATGTGGTGGTTCGCAGGGCGATGGCGACTCGTACAACAACAATGGAACGAGGAAGCTTCGATGTTCGACTTGAAATTCGGTGGCCTGGCGGCCGCCTGCCTGCTGCTCTGCTCCACCGCCCTGGCCGCTCCCCTGCCGGACACGCCGGGAGCGCCATTTCCGGCCGTAGCCAATTTCGACCGCAGTGGCCCGTACGCCACCAGTAGCCAGAGCGAGGGGCCGAGTTGTCGCATCTACCGGCCCAGCAACCTGGGGCAGGGCGGCGTGCGTCATCCGGTTATTCTCTGGGGCAATGGCACCGGCACCGGGCCAAGCACCTACGCCGGGTTGCTGTCGCACTGGGCCAGCCATGGCTTCGTGGTGGCTGCAGCGGAAACCTCCAATGCCGGCACCGGCCGGGAAATGCTGGCCTGCCTGGACTATCTGGTGCGGGAGAACAACAACCCCTACGGCACCTACGCCGGCAAGCTCAATACCGGGCGCGTCGGCACCTCCGGGCATTCCCAGGGCGGCGGCGGTTCGATCATGGCCGGGCAGGACACCCGGGTGCGTACCACGGCGCCAATCCAGCCCTACACCATCGGTCTGGGGCACGACAGCGCCTCGCAGCGCCGCCAGCAGGGGCCGATGTTCCTGATGTCCGGCGGCGGCGACACCATTGCCATTCCCTACCTCAACGCCCAGCCGGTCTACCTGCGCGCCAACGTGCCGGTGTTCTGGGGTGAGCGGCGTTACGTCAGCCACTTCGAGCCGGTCGGCGACGGCGGTGCCTACCGCGGCCCCAGCACGGCCTGGTTCCGCCTCCAGCTGATGGATGACCAGGGCGCGCGCGGCACCTTCTACGGCGCGCTGTGCAGCCTGTGCAGCAGCCTGCTGTGGTCGGTGGACCGTCGCGGTTTCTAG

其中，信号肽的编码序列如SEQ ID NO.5所示：

SEQ ID NO.5

GTGCTCTGCTCCATCGGCGCCCGCACTCGCCAGCGCAAGGATGTGTGCTGCGCCGCTCTGCCGATGTGGTGGTTCGCAGGGCGATGGCGACTCGTACAACAACAATGGAACGAGGAAGCTTCGATGTTCGACTTGAAATTCGGTGGCCTGGCGGCCGCCTGCCTGCTGCTCTGCTCCACCGCCCTGGCC

因此，成熟的脂肪酶PgLip1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

GCTCCCCTGCCGGACACGCCGGGAGCGCCATTTCCGGCCGTAGCCAATTTCGACCGCAGTGGCCCGTACGCCACCAGTAGCCAGAGCGAGGGGCCGAGTTGTCGCATCTACCGGCCCAGCAACCTGGGGCAGGGCGGCGTGCGTCATCCGGTTATTCTCTGGGGCAATGGCACCGGCACCGGGCCAAGCACCTACGCCGGGTTGCTGTCGCACTGGGCCAGCCATGGCTTCGTGGTGGCTGCAGCGGAAACCTCCAATGCCGGCACCGGCCGGGAAATGCTGGCCTGCCTGGACTATCTGGTGCGGGAGAACAACAACCCCTACGGCACCTACGCCGGCAAGCTCAATACCGGGCGCGTCGGCACCTCCGGGCATTCCCAGGGCGGCGGCGGTTCGATCATGGCCGGGCAGGACACCCGGGTGCGTACCACGGCGCCAATCCAGCCCTACACCATCGGTCTGGGGCACGACAGCGCCTCGCAGCGCCGCCAGCAGGGGCCGATGTTCCTGATGTCCGGCGGCGGCGACACCATTGCCATTCCCTACCTCAACGCCCAGCCGGTCTACCTGCGCGCCAACGTGCCGGTGTTCTGGGGTGAGCGGCGTTACGTCAGCCACTTCGAGCCGGTCGGCGACGGCGGTGCCTACCGCGGCCCCAGCACGGCCTGGTTCCGCCTCCAGCTGATGGATGACCAGGGCGCGCGCGGCACCTTCTACGGCGCGCTGTGCAGCCTGTGCAGCAGCCTGCTGTGGTCGGTGGACCGTCGCGGTTTCTAG

本发明还提供了包含编码上述嗜冷碱性脂肪酶PgLip基因的重组载体。将本发明的编码嗜冷碱性脂肪酶的基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。本发明将编码上述嗜冷碱性脂肪酶的基因插入到质粒pET-28a(+)上的NdeI和XbaI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达质粒pET-28a(+)-PgLip1。

本发明还提供了包含编码上述嗜冷、碱性脂肪酶的基因PgLip1的重组菌株，优选为重组大肠杆菌菌株Transetta(DE3)。

本发明还提供了一种制备嗜冷碱性脂肪酶PgLip1的方法，包括以下步骤：

(1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；

(2)培养重组菌株，诱导重组嗜冷、碱性脂肪酶表达；

(3)纯化嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1。

本发明提供了上述嗜冷碱性脂肪酶PgLip1酶的应用。

本发明的嗜冷、碱性脂肪酶除了具有嗜冷、耐碱的特性，还具有金属离子抗性和表面活性剂抗性，在农业生物技术领域具有潜在的应用价值。

附图说明

图1显示重组嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1最适pH；

图2显示重组嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1最适温度；

图3显示重组嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1的pH稳定性；

图4显示重组嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1的温度稳定性；

图5显示重组嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1的底物特异性；

图6显示重组嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1的金属离子抗性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1.菌株及载体：大肠杆菌表达载体pET-28a(+)及菌株Transetta(DE3)。

2.酶类及其它生化试剂：内切酶、重组酶。

3.培养基：大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH 7.0)。

实施例1嗜冷、碱性脂肪酶编码基因的克隆

本发明目的基因来源于谷关假单胞菌(Pseudomonas guguanensis),通过反复优化设计特异性引物，克隆获得脂肪酶基因PgLip1。

实施例2重组嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1的制备

将获得的含有成熟脂肪酶基因PgLip1的重组大肠杆菌表达质粒pET-28a(+)-PgLip1转化大肠杆菌Transetta(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株Transetta(DE3)/PgLip1。

取含有重组质粒的Transetta(DE3)/PgLip菌株，接种于50mL LB培养液中，37℃220rpm振荡培养12h后，按2％比例转接于300mL LB培养基中，37℃ 220rpm振荡培养约2h(OD₆₀₀≈0.5)。再加入300μL浓度1M的诱导剂IPTG，于16℃ 220rpm继续培养16h后离心收集菌体。采取超声法裂解菌体，利用镍柱进行亲和层析纯化获得单一的PgLip1蛋白。

实施例3重组嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1酶活测定、酶学性质测定

脂肪酶PgLip1活力测定采用pNPM法，具体方法如下：

1.称取0.03gpNPM溶于10ml DMSO中；

2.将pNPM溶液与底物缓冲液1:9混合，每只试管中加入2.4mL上述混合液，37℃预热3min，再加入适当稀释的酶液100μL，37℃反应15min，加入2mL的95％终止反应。

3.12,000rpm离心3min，取上清液在410nm读取吸光值。

酶活力定义单位：在温度为37℃，pH值8.0的条件下，样品水解底物pNPM，每分钟释放出1μmolpNPM所需的酶量为一个酶活力单位(U)。

重组嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1酶学性质：

1.最适pH和pH稳定性

配制pH不同的缓冲溶液，其浓度均为50mM；按上述方法测定不同pH缓冲溶液中嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1的活性(图1)；配制pH不同的缓冲溶液，其浓度均为50mM；将酶液在不同pH下37℃处理1h，pH 8.0，50mM Tris-HCl作为缓冲溶液按上述方法测定嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1的活性(图3)。

在50mmol/LpH为8.5的Tris-HCl缓冲液中，PgLip1的脂肪酶活性最高，达到3.1U/mg。当pH为8.0时，该酶有71.6％的活性，而在pH为7.0则迅速下降为4.0％。当pH为9.0时，该酶有84.4％的活性，而在pH为10.0仅剩余3.8％的活性。在pH稳定性方面，当pH为3.0～12时，酶相对活性至少保持在60％以上，说明该脂肪酶具有较宽的pH耐受性。但在pH 3以下，该酶的酶活几乎完全丧失。

2.最适温度和温度稳定性

在pH 8.0、50mM Tris-HCl作为缓冲溶液，按上述反应混合体系，在不同温度(0～40℃)下测定嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1的活性(图2)；将嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1置于不同温度(40～60℃)预处理1h，于20℃下，pH 8.5、50mM Tris-HCl的缓冲溶液中，按上述方法测定嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1的活性(图4)。

脂肪酶PgLip1催化水解pNPC的最适温度为10℃，但酶在0℃仍然具有60.5％的酶活，说明该酶是一个低温脂肪酶，能在低温下较好的降解底物。当孵育温度高于10℃时，该脂肪酶的酶活性开始逐渐下降。在20℃、30℃和40℃，其相对酶活分别为55.2％、42.1％和3.4％。将PgLip1脂肪酶在40℃、50℃和60℃分别孵育处理，发现该酶在40℃处理30min仍然能保持93.0％酶活力，继续孵育至45min残余酶活为72.1％。在50℃处理5min后，剩余酶活为61.1％，此后基本不变。在60℃处理酶活则迅速下降，30min后酶活基本已完全丧失(7.1％)。

3.底物特异性

以6种不同长度脂肪酸链的对硝基苯酚为底物(图5)，分别测定脂肪酶的酶活力，以最高酶活力为100％，计算其它底物下酶的相对活力。可见，谷关假单胞菌来源的重组脂肪酶PgLip1对于具有不同长度脂肪链的pNP底物均具有一定活性。该酶能催化含C₂、C₄、C₈、C₁₂、C₁₄和C₁₆脂肪链的对硝基苯酚酯降解，对pNPB(碳链长度为4)的活性最高，达到110U/mg。对C2和C8的pNP底物依次缓慢下降，分别为101U/mg和54U/mg；对C12、C14和C16的pNP底物活性则快速下降，依次分别为17.4U/mg、12.2U/mg和6.4U/mg。

4.金属离子抗性

以50mM，pH 7.0的Tris-HCl为溶剂配制不同金属离子溶液，金属离子终浓度均为5mM，将嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1在各种金属离子溶液中37℃下处理1h，以不加金属离子作为对照。再按照上述方法测定在pH 8.0，50mM Tris-HCl为缓冲溶液，20℃测定嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1的活性(图6)。在含Pb²⁺、Co²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺和Na⁺的溶液中，PgLip1相对比较稳定，其活性分别是未用离子处理时的101.3％、92.3％、98.1％、83.3％和78.1％。相反，Mg²⁺、Fe³⁺、K⁺、Cr⁺、Zn²⁺、Ni⁺和Mn²⁺对脂肪酶PgLip1有抑制作用，在含这些离子的溶液中该酶的相对酶活分别为20.1％、48.1％、29.1％、37.2％、8.0％、11.2％和20.3％。

5.表面活性剂对脂肪酶活性的影响

将酶液在终浓度为1％的Tween-80、Tween-20、Triton X-100，终浓度0.1％SDS中37℃下处理1h，再按照上述方法测定在pH 8.0，50mM Tris-HCl为缓冲溶液中，20℃测定嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1的活性(图6)。可见，表面活性剂Tween-20、Tween-80和Triton X-100对脂肪酶PgLip1都有一定的促进作用。

6.重组表面活性剂、变性剂、EDTA对嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1活性的影响

将酶液在终浓度1％的Tween-80、Tween-20、Triton X-100，终浓度0.1％SDS中37℃下处理1h，再按照上述方法测定在pH 8.5，50mM Tris-HCl为缓冲溶液，20℃测定脂肪酶PgLip1的活性(表1)。在终浓度1％的表面活性剂Tween-20、Tween-80和Triton X-100的溶液中，PgLip1的酶活分别上升到初始条件的220％、396％和1264％。而当溶液中含有5mM的金属离子螯合剂EDTA、变性剂SDS和β-巯基乙醇时，PgLip1的酶活分别下降为43.1％、7.0％和6.0％。

表1表面活性剂、变性剂以及EDTA对脂肪酶PgLip1活性的影响

7.有机溶剂对对嗜冷、碱性脂肪酶PgLip1活性的影响。

酶样品中分别加入不同浓度有机溶剂(丙酮、甲醇、乙醇、异戊醇、乙腈、乙酸乙酯、异丙醇)30℃下处理1h，在最佳温度条件下测定酶活，以未加任何化学试剂的反应作为对照，并以该反应的酶活力为100％，测定有机溶剂对脂肪酶PgLip1活性的影响(表2)。可以看出，PgLip1对50％的异丙醇和异戊醇有良好的稳定性。在这两种有机试剂中，其剩余酶活分别随着有机试剂的浓度上升而增加，例如在10％的异丙醇中酶活只有7.6％，但在30％的异丙醇中则为175％，而当异丙醇的浓度为50％时，酶活增加至239％。同样，在甲醇和乙醇中，虽然PgLip1的酶活均小于未用有机试剂处理的酶活，但该酶的酶活也随着两种醇浓度的增加而上升。在丙酮、乙腈和乙酸乙酯中，PgLip1的酶活均有下降，且酶活并没有随着有机溶剂浓度的增加而上升的趋势。

表2.有机试剂对脂肪酶PgLip1活性的影响

序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 一种嗜冷碱性脂肪酶PgLip1及其编码基因和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 321

<212> PRT

<213> 谷关假单胞菌(Pseudomonas guguanensis)

<400> 1

Met Leu Cys Ser Ile Gly Ala Arg Thr Arg Gln Arg Lys Asp Val Cys

1 5 10 15

Cys Ala Ala Leu Pro Met Trp Trp Phe Ala Gly Arg Trp Arg Leu Val

20 25 30

Gln Gln Gln Trp Asn Glu Glu Ala Ser Met Phe Asp Leu Lys Phe Gly

35 40 45

Gly Leu Ala Ala Ala Cys Leu Leu Leu Cys Ser Thr Ala Leu Ala Ala

50 55 60

Pro Leu Pro Asp Thr Pro Gly Ala Pro Phe Pro Ala Val Ala Asn Phe

65 70 75 80

Asp Arg Ser Gly Pro Tyr Ala Thr Ser Ser Gln Ser Glu Gly Pro Ser

85 90 95

Cys Arg Ile Tyr Arg Pro Ser Asn Leu Gly Gln Gly Gly Val Arg His

100 105 110

Pro Val Ile Leu Trp Gly Asn Gly Thr Gly Thr Gly Pro Ser Thr Tyr

115 120 125

Ala Gly Leu Leu Ser His Trp Ala Ser His Gly Phe Val Val Ala Ala

130 135 140

Ala Glu Thr Ser Asn Ala Gly Thr Gly Arg Glu Met Leu Ala Cys Leu

145 150 155 160

Asp Tyr Leu Val Arg Glu Asn Asn Asn Pro Tyr Gly Thr Tyr Ala Gly

165 170 175

Lys Leu Asn Thr Gly Arg Val Gly Thr Ser Gly His Ser Gln Gly Gly

180 185 190

Gly Gly Ser Ile Met Ala Gly Gln Asp Thr Arg Val Arg Thr Thr Ala

195 200 205

Pro Ile Gln Pro Tyr Thr Ile Gly Leu Gly His Asp Ser Ala Ser Gln

210 215 220

Arg Arg Gln Gln Gly Pro Met Phe Leu Met Ser Gly Gly Gly Asp Thr

225 230 235 240

Ile Ala Ile Pro Tyr Leu Asn Ala Gln Pro Val Tyr Leu Arg Ala Asn

245 250 255

Val Pro Val Phe Trp Gly Glu Arg Arg Tyr Val Ser His Phe Glu Pro

260 265 270

Val Gly Asp Gly Gly Ala Tyr Arg Gly Pro Ser Thr Ala Trp Phe Arg

275 280 285

Leu Gln Leu Met Asp Asp Gln Gly Ala Arg Gly Thr Phe Tyr Gly Ala

290 295 300

Leu Cys Ser Leu Cys Ser Ser Leu Leu Trp Ser Val Asp Arg Arg Gly

305 310 315 320

Phe

<210> 2

<211> 63

<212> PRT

<213> 谷关假单胞菌(Pseudomonas guguanensis)

<400> 2

Met Leu Cys Ser Ile Gly Ala Arg Thr Arg Gln Arg Lys Asp Val Cys

1 5 10 15

Cys Ala Ala Leu Pro Met Trp Trp Phe Ala Gly Arg Trp Arg Leu Val

20 25 30

Gln Gln Gln Trp Asn Glu Glu Ala Ser Met Phe Asp Leu Lys Phe Gly

35 40 45

Gly Leu Ala Ala Ala Cys Leu Leu Leu Cys Ser Thr Ala Leu Ala

50 55 60

<210> 3

<211> 258

<212> PRT

<213> 谷关假单胞菌(Pseudomonas guguanensis)

<400> 3

Ala Pro Leu Pro Asp Thr Pro Gly Ala Pro Phe Pro Ala Val Ala Asn

1 5 10 15

Phe Asp Arg Ser Gly Pro Tyr Ala Thr Ser Ser Gln Ser Glu Gly Pro

20 25 30

Ser Cys Arg Ile Tyr Arg Pro Ser Asn Leu Gly Gln Gly Gly Val Arg

35 40 45

His Pro Val Ile Leu Trp Gly Asn Gly Thr Gly Thr Gly Pro Ser Thr

50 55 60

Tyr Ala Gly Leu Leu Ser His Trp Ala Ser His Gly Phe Val Val Ala

65 70 75 80

Ala Ala Glu Thr Ser Asn Ala Gly Thr Gly Arg Glu Met Leu Ala Cys

85 90 95

Leu Asp Tyr Leu Val Arg Glu Asn Asn Asn Pro Tyr Gly Thr Tyr Ala

100 105 110

Gly Lys Leu Asn Thr Gly Arg Val Gly Thr Ser Gly His Ser Gln Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Ile Met Ala Gly Gln Asp Thr Arg Val Arg Thr Thr

130 135 140

Ala Pro Ile Gln Pro Tyr Thr Ile Gly Leu Gly His Asp Ser Ala Ser

145 150 155 160

Gln Arg Arg Gln Gln Gly Pro Met Phe Leu Met Ser Gly Gly Gly Asp

165 170 175

Thr Ile Ala Ile Pro Tyr Leu Asn Ala Gln Pro Val Tyr Leu Arg Ala

180 185 190

Asn Val Pro Val Phe Trp Gly Glu Arg Arg Tyr Val Ser His Phe Glu

195 200 205

Pro Val Gly Asp Gly Gly Ala Tyr Arg Gly Pro Ser Thr Ala Trp Phe

210 215 220

Arg Leu Gln Leu Met Asp Asp Gln Gly Ala Arg Gly Thr Phe Tyr Gly

225 230 235 240

Ala Leu Cys Ser Leu Cys Ser Ser Leu Leu Trp Ser Val Asp Arg Arg

245 250 255

Gly Phe

<210> 4

<211> 966

<212> DNA

<213> 谷关假单胞菌(Pseudomonas guguanensis)

<400> 4

gtgctctgct ccatcggcgc ccgcactcgc cagcgcaagg atgtgtgctg cgccgctctg 60

ccgatgtggt ggttcgcagg gcgatggcga ctcgtacaac aacaatggaa cgaggaagct 120

tcgatgttcg acttgaaatt cggtggcctg gcggccgcct gcctgctgct ctgctccacc 180

gccctggccg ctcccctgcc ggacacgccg ggagcgccat ttccggccgt agccaatttc 240

gaccgcagtg gcccgtacgc caccagtagc cagagcgagg ggccgagttg tcgcatctac 300

cggcccagca acctggggca gggcggcgtg cgtcatccgg ttattctctg gggcaatggc 360

accggcaccg ggccaagcac ctacgccggg ttgctgtcgc actgggccag ccatggcttc 420

gtggtggctg cagcggaaac ctccaatgcc ggcaccggcc gggaaatgct ggcctgcctg 480

gactatctgg tgcgggagaa caacaacccc tacggcacct acgccggcaa gctcaatacc 540

gggcgcgtcg gcacctccgg gcattcccag ggcggcggcg gttcgatcat ggccgggcag 600

gacacccggg tgcgtaccac ggcgccaatc cagccctaca ccatcggtct ggggcacgac 660

agcgcctcgc agcgccgcca gcaggggccg atgttcctga tgtccggcgg cggcgacacc 720

attgccattc cctacctcaa cgcccagccg gtctacctgc gcgccaacgt gccggtgttc 780

tggggtgagc ggcgttacgt cagccacttc gagccggtcg gcgacggcgg tgcctaccgc 840

ggccccagca cggcctggtt ccgcctccag ctgatggatg accagggcgc gcgcggcacc 900

ttctacggcg cgctgtgcag cctgtgcagc agcctgctgt ggtcggtgga ccgtcgcggt 960

ttctag 966

<210> 5

<211> 189

<212> DNA

<213> 谷关假单胞菌(Pseudomonas guguanensis)

<400> 5

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ccgatgtggt ggttcgcagg gcgatggcga ctcgtacaac aacaatggaa cgaggaagct 120

tcgatgttcg acttgaaatt cggtggcctg gcggccgcct gcctgctgct ctgctccacc 180

gccctggcc 189

<210> 6

<211> 777

<212> DNA

<213> 谷关假单胞菌(Pseudomonas guguanensis)

<400> 6

gctcccctgc cggacacgcc gggagcgcca tttccggccg tagccaattt cgaccgcagt 60

ggcccgtacg ccaccagtag ccagagcgag gggccgagtt gtcgcatcta ccggcccagc 120

aacctggggc agggcggcgt gcgtcatccg gttattctct ggggcaatgg caccggcacc 180

gggccaagca cctacgccgg gttgctgtcg cactgggcca gccatggctt cgtggtggct 240

gcagcggaaa cctccaatgc cggcaccggc cgggaaatgc tggcctgcct ggactatctg 300

gtgcgggaga acaacaaccc ctacggcacc tacgccggca agctcaatac cgggcgcgtc 360

ggcacctccg ggcattccca gggcggcggc ggttcgatca tggccgggca ggacacccgg 420

gtgcgtacca cggcgccaat ccagccctac accatcggtc tggggcacga cagcgcctcg 480

cagcgccgcc agcaggggcc gatgttcctg atgtccggcg gcggcgacac cattgccatt 540

ccctacctca acgcccagcc ggtctacctg cgcgccaacg tgccggtgtt ctggggtgag 600

cggcgttacg tcagccactt cgagccggtc ggcgacggcg gtgcctaccg cggccccagc 660

acggcctggt tccgcctcca gctgatggat gaccagggcg cgcgcggcac cttctacggc 720

gcgctgtgca gcctgtgcag cagcctgctg tggtcggtgg accgtcgcgg tttctag 777

Claims (1)

1.氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示蛋白质在以下条件下水解底物的应用，其特征在于，

所述底物为碳链长度为4的pNPB或碳链长度为2的pNP；

所述条件为：

pH为8.0；

温度为0℃~10℃；

终浓度1%的表面活性剂Tween-20、Tween-80和Triton X-100的溶液；

30%~50%的异丙醇或异戊醇。

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