CN111808874A - 一种磷酸三酯酶8047-pte的编码基因及其应用 - Google Patents

一种磷酸三酯酶8047-pte的编码基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种磷酸三酯酶8047‑PTE的编码基因及其应用。本发明提供了核苷酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第1‑1116位所示的DNA分子。采用本发明改造后的基因序列(SEQ ID No.1)经大肠杆菌原核表达，能显著提高磷酸三酯酶8047‑PTE(SEQ ID No.2)的可溶表达量，且所得磷酸三酯酶8047‑PTE具有活性高、稳定性强等特点，在不额外添加任何保护剂的情况下，4℃储存357天，蛋白无降解，活性仍为初始值的69％。

Description

一种磷酸三酯酶8047-PTE的编码基因及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种磷酸三酯酶8047-PTE的编码基因及其应用。
背景技术
有机磷化合物是人工合成的含磷高毒物质，包括磷酸酯类、磷酸硫醇酯类、膦酸或氨基磷酸酯类、V型和G型神经毒剂等多种类型。自二次世界大战结束以来，有机磷化合物作为主要有效成分被广泛应用于农药、阻燃剂、增塑剂、化学武器等农业、工业和国防领域。
有机磷类农药(organophosphorus pesticides,OPs)，由于其具有高效、广谱、低残留和使用成本低等特点，在农业生产中被广泛使用。目前，世界上有机磷农药的种类已达150多种，我国生产的有机磷农药的品种就有30余种，包括杀虫剂、除草剂、杀菌剂等。在有机磷农药中80％以上是剧毒有机磷农药如对硫磷、内吸磷、甲拌磷、氧化乐果、甲基对硫磷、甲胺磷、敌敌畏等。此外，包括二嗪农、甲拌磷、乐果、甲基对硫磷、氧化乐果、敌敌畏、杀螟硫磷、倍硫磷、对硫磷、甲胺磷、马拉硫磷在内的多种有机磷农药在果蔬产品中均有检出。有机磷农药均具有抑制人体乙酰胆碱酯酶的功能,对人存在着程度不同的毒性,急性中毒可引起人肌肉痉挛、瞳孔收缩、呼吸困难直至死亡。残留在蔬菜、水果等食品上的低剂量有机磷农药对人可产生慢性毒性,会诱导多发性神经病、中风等。随着人们生活质量的提高和环保意识的加强,有机磷农药的残留毒性问题越来越受到人们的关注。
原核和真核来源的有机磷水解酶(OPHEs)可以水解和失活多种有机磷化合物，酶本身具有较宽的底物谱，可以水解包含P–F,P–O,P–S和P–CN的多种有机磷化合物。有机磷水解酶为金属离子依赖的水解酶。有机磷水解酶OPHs(Organophosphate hydrolase)主要被分为两类，一类是芳基二烷基磷酸酶(Aryltriphosphatase，A-esterase，EC3.1.8.1)，一类是二异丙基-氟磷酸酯酶(E.C.3.1.8.2)。芳基二烷基磷酸酯酶最早在短波单胞菌属Brevundimonas diminuta MG和鞘脂菌属Sphingobium fuliginis ATCC27551中被发现，在农杆菌属Agrobacterium radiobacter P230菌中的有机磷水解酶被称为OpdA。
当前已发现的磷酸三酯酶由于在催化活性、酶稳定性特别是产率方面具有很大缺陷，因此开发新一代高活力，高稳定性且能高效表达的有机磷水解酶具有重要应用价值和社会意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种磷酸三酯酶8047-PTE的编码基因及其应用。
第一方面，本发明要求保护一种DNA分子。
本发明所要求保护的DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第1-1116位。SEQ ID No.1的第1-1116位为经过改造的磷酸三酯酶8047-PTE-GD3的编码基因，是从来自西南印度洋热液样品中分离的橙单胞菌科锰氧化菌Fulvimarina manganoxydanssp.nov.(personal::8047,CGMCC:1.10972)基因组DNA中分离得到的SEQ ID No.2所示DNA分子(原始8047PTE基因)添加促溶序列标签(GDDD)3的编码序列GGCGATGATGATGGCGATGACGACGGCGACGATGAT得到的。SEQ ID No.1的第1117-1158位为质粒载体pET21a(+)(Novagen)HindⅢ酶切位点开始到终止密码子的序列。
第二方面，本发明还要求保护含有所述DNA分子的表达盒。
其中，所述表达盒由能够启动所述DNA分子表达的启动子，所述DNA分子，以及转录终止序列组成。
在本发明的一个实施例中，所述表达盒自上游到下游由T7启动子、所述DNA分子和T7终止子组成。
第三方面，本发明还要求保护含有前文第一方面中所述DNA分子或第二方面中所述表达盒的重组载体。
其中，所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因细胞进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可发光化合物的基因(GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)等。
在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体具体为将SEQ ID No.1的第1-1116位所示DNA分子插入到pET-21a(+)(Novagen)载体的多克隆位点(Nde I和Hind III)处后得到的重组质粒。该重组质粒中含有“自上游到下游由T7启动子、所述DNA分子和T7终止子组成的表达盒”。
第四方面，本发明还要求保护含有前文第一方面中所述DNA分子或前文第二方面中所述表达盒或前文第三方面中所述重组载体的重组菌。
进一步地，所述重组菌具体可为将前文第一方面中所述DNA分子或前文第二方面中所述表达盒或前文第三方面中所述重组载体导入大肠杆菌后得到的重组菌。
更进一步地，所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌E.coli BL21(λDE3)(F-ompT[lon]hsdS)。
第五方面，本发明还要求保护含有前文第一方面中所述DNA分子或前文第二方面中所述表达盒或前文第三方面中所述重组载体的转基因细胞系。
所述转基因细胞系可为将前文第一方面中所述DNA分子或前文第二方面中所述表达盒或前文第三方面中所述重组载体导入受体细胞得到的稳定表达的重组细胞系。
第六方面，本发明还要求保护前文所述DNA分子或所述表达盒或所述重组载体或所述重组菌或所述转基因细胞系在表达SEQ ID No.3或SEQ ID No.3的第1-372位所示蛋白质中的应用。
其中，所述表达为原核表达。
进一步地，所述原核表达为在大肠杆菌中的表达。
第七方面，本发明还要求保护所述DNA分子或所述表达盒或所述重组载体或所述重组菌或所述转基因细胞系在制备磷酸三酯酶中的应用。
第八方面，本发明还要求保护一种制备磷酸三酯酶的方法。
本发明所提供的制备磷酸三酯酶的方法具体可包括如下步骤：
(a1)对前文第四方面中所述的重组菌进行诱导培养，收集菌体；
所述诱导培养为：加入IPTG至终浓度0.5mM(加入IPTG时培养体系的OD600值达到0.6-0.8左右)，16℃条件下培养16-20小时；
(a2)超声(如超声5s，间歇5s，40w的功率，30个循环)破碎步骤(a1)所得菌体并离心(如12,000rpm离心15min)，从离心所得上清液中获得磷酸三酯酶。
在步骤(a2)中，在所述离心后还包括对所述上清液进行纯化(如进行镍柱亲和层析纯化和脱盐纯化)的步骤。
在本发明的一个实施例中，具体是按照包括如下步骤的方法对所述上清液进行纯化的：
第一步：进行镍柱亲和层析纯化(如在Amersham公司的AKTA FPLC系统中用1ml装量的HiTrap chelating HP column(镍柱)纯化)，包括如下步骤：用非变性镍柱结合缓冲液Ⅰ进行平衡纯化柱体并上样(其中，蛋白上样量可为10ml，流速可设为1ml/min)；用20％非变性镍柱洗脱缓冲液进行洗涤，去除非特异性结合的杂蛋白；用80％非变性镍柱洗脱缓冲液进行洗脱，收集含洗脱峰的洗脱液。
其中，所述非变性镍柱结合缓冲液Ⅰ的组成如下：20mM Na2HPO4/NaH2PO4(每1000ml溶液中加入1.154ml的1mol/L Na2HPO4和0.846mL的1mol/L的NaH2PO4，其余用蒸馏水补足)，0.5M NaCl，20mM咪唑；pH＝7.0。
所述20％非变性镍柱洗脱缓冲液为所述非变性镍柱结合缓冲液Ⅰ和非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ按照体积比为80：20的比例混合后得到的混合溶液；所述80％非变性镍柱洗脱缓冲液为所述非变性镍柱结合缓冲液Ⅰ和所述非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ按照体积比为20：80的比例混合后得到的混合溶液。
所述非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ的组成如下：20mM Na2HPO4/NaH2PO4(每1000ml溶液中加入1.154ml的1mol/L Na2HPO4和0.846mL的1mol/L的NaH2PO4，其余用蒸馏水补足)，0.5MNaCl，0.5M咪唑；pH＝7.0。
第二步：将第一步得到的所述洗脱液进行脱盐柱Hitrap Q(Pharmacia)(5mL)纯化，洗脱缓冲液为磷酸盐缓冲液：10mM K2HPO4/KH2PO4(每1000ml溶液中加入1.154ml的1mol/L Na2HPO4和0.846ml的1mol/L的NaH2PO4，其余用蒸馏水补足)，pH7.0。
实验证明，采用本发明改造后的基因序列(SEQ ID No.1)经大肠杆菌原核表达，能显著提高磷酸三酯酶8047-PTE(SEQ ID No.2)的可溶表达量，且所得磷酸三酯酶8047-PTE具有活性高、稳定性强等特点，在不额外添加任何保护剂的情况下，4℃储存357天，蛋白无降解，活性仍为初始值的69％。
附图说明
图1为8047PTE蛋白和8047PTE-GD3蛋白表达电泳图。A：M、蛋白分子量标记(Fermentas,SM0431)；1、8047PTE基因重组表达菌株pET-8047PTE[BL21(λDE3)]30℃诱导表达的全菌液；2、8047PTE基因重组表达菌株pET-8047PTE[BL21(λDE3)]30℃诱导表达的菌体上清液；3、8047PTE基因重组表达菌株pET-8047PTE[BL21(λDE3)]16℃诱导表达的全菌液；4、8047PTE基因重组表达菌株pET-8047PTE[BL21(λDE3)]16℃诱导表达的菌体上清液；12.5％SDS-PAGE检测。B：M、蛋白分子量标记(Fermentas,SM0431)；1、8047PTE-GD3基因重组表达菌株pET-8047PTE-GD3[BL21(λDE3)]30℃诱导表达的全菌液；2，3、8047PTE-GD3基因重组表达菌株pET-8047PTE-GD3[BL21(λDE3)]30℃诱导表达的菌体上清液；4、8047PTE-GD3基因重组表达菌株pET-8047PTE-GD3[BL21(λDE3)]16℃诱导表达的全菌液；5、8047PTE-GD3基因重组表达菌株pET-8047PTE-GD3[BL21(λDE3)]16℃诱导表达的菌体上清液；6、8047PTE-GD3经亲和层析和脱盐柱纯化后的蛋白(理论分子量大小为42kDa)，浓度为0.47mg/ml，上样量10μl，12.5％SDS-PAGE检测。
图2为8047PTE-GD3蛋白在不同条件下的酶活力。A：P0、纯化后的8047PTE-GD3蛋白在磷酸盐缓冲液中的相对活力；P1、纯化后的8047PTE-GD3蛋白在磷酸盐缓冲液中4℃放置1天后的相对活力；H2、纯化后的8047PTE-GD3蛋白在HEPES缓冲液中4℃放置2天后的相对活力；H7、纯化后的8047PTE-GD3蛋白在HEPES缓冲液中4℃放置7天后的相对活力；H8、纯化后的8047PTE-GD3蛋白在HEPES缓冲液中4℃放置8天后的相对活力；H13、纯化后的8047PTE-GD3蛋白在HEPES缓冲液中4℃放置13天后的相对活力(以新鲜的8047PTE-GD3蛋白在磷酸盐缓冲液中的活力为100％)。B：1、新纯化的8047PTE-GD3蛋白(浓度为0.311mg/ml)在HEPES缓冲液中的酶活力；培养条件为LB培养基中添加0.2mM CoCl2，测活反应为1.5ml反应体系中加入6μl纯化后的酶液，以1mM4-硝基苯乙酸酯为底物，所测得的酶活。酶活力单位(U)：25℃下，每升反应体系，每分钟反应得到1μmol产物，定义为一个酶活力单位；2、上述纯化后的8047PTE-GD3蛋白在磷酸盐缓冲液中4℃放置357天后的酶活力，测活反应为1.5ml反应体系中加入6μl纯化后的酶液，以1mM4-硝基苯乙酸酯为底物，所测得的酶活。C：M、蛋白分子量标记(Fermentas,SM0431)；8047PTE-GD3经亲和层析和脱盐柱纯化后的蛋白(理论分子量大小为42kDa)，蛋白原液浓度0.311mg/ml，4℃保存425天后，取10μl于12.5％SDS-PAGE蛋白电泳检测。
图3为8047PTE-GD3蛋白最适温度以及温度稳定性检测。A：8047PTE-GD3蛋白在50mMHEPES，pH7.0的缓冲液中，不同温度下的相对酶活，以25℃下该酶在50mM HEPES，pH7.0的缓冲液中的酶活力为100％。B：8047PTE-GD3蛋白在10mM K2HPO4/KH2PO4 pH7.0的缓冲液中，不同温度(40℃、50℃、60℃、70℃)下处理不同的时间(0min、5min、10min、20min、30min)的相对酶活，以25℃，10mM K2HPO4/KH2PO4 pH7.0的缓冲液中该酶的活力为100％。
图4为8047PTE-GD3-apo蛋白和8047PTE-GD3/8047PTE-GD3-Zn2+蛋白的圆二色谱。A：8047PTE-GD3-apo蛋白的圆二色谱。B：8047PTE-GD3/8047PTE-GD3-Zn2+蛋白的圆二色谱。8047PTE-GD3蛋白在10mM K2HPO4/KH2PO4 pH7.0的缓冲液中，20.0℃至96.5℃连续升温过程中的圆二色谱的变化，波长范围190-260nm，纵坐标为摩尔椭圆率，单位为度·厘米2/分克分子(deg·cm2·dmol-1)。
图5为8047PTE-GD3蛋白pH稳定性。8047PTE-GD3蛋白在室温下，在不同pH值的缓冲液中(pH2.4、pH3.2、pH4.0、pH5.2、pH6.0、pH7.0、pH7.6、pH8.2、pH9.2、pH10.0)放置2小时后，测定其在10mM K2HPO4/KH2PO4，pH7.0的缓冲液中的酶活力，以8047PTE-GD3蛋白在磷酸盐缓冲液10mM K2HPO4/KH2PO4，pH7.0的初始酶活力为100％。
图6为在磷酸盐培养基和LB培养条件下重组表达的磷酸三酯酶活力比较。A：pET-8047PTE-GD3[BL21(λDE3)]宿主菌在添加相应金属离子(0.1mM ZnCl2、0.1mM CoCl2、0.1mMMnCl2)的磷酸盐培养基中培养，经亲和层析、脱盐后所得到的蛋白溶液，将蛋白浓度调整到1mg/ml，取5μl，在50mM HEPES，pH7.0的缓冲液中，以乙酸4-硝基苯酯为底物测得的酶活力。CK为不添加任何金属离子的对照，CoCl2-1、CoCl2-2分别为添加0.1mM CoCl2两次培养提取纯化后的蛋白，MnCl2-1、MnCl2-2分别为添加0.1mM MnCl2两次培养提取纯化后的蛋白；B：pET-8047PTE-GD3[BL21(λDE3)]宿主菌在添加相应金属离子(0.2mM ZnCl2、0.2mM CoCl2、0.2mM MnCl2)的LB培养基中培养，经亲和层析、脱盐后所得到的蛋白溶液，将蛋白浓度调整到1mg/ml，取5μl，在50mM HEPES，pH7.0的缓冲液中，以乙酸4-硝基苯酯为底物测得的的酶活力，CK为不添加金属离子培养条件下所得蛋白的酶活力，ZnCl2、CoCl2、MnCl2分别为添加相应金属离子培养获得的蛋白8047PTE-GD3-Zn2+、8047PTE-GD3-Co2+、8047PTE-GD3-Mn2+的酶活力。
图7为磷酸三酯酶对不同底物的酶活力。A：8047PTE-GD3-Co2+蛋白(磷酸盐培养基)终浓度为1.54ⅹ10-3mg/ml，分别以1mM乙酸4-硝基苯酯、乙酸苯酯、α-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯为底物，在50mM HEPES，pH7.0缓冲液中，25℃下所测得的酶活。B：磷酸三酯酶8047PTE-GD3-Zn2+(LB培养基)蛋白终浓度为1.43ⅹ10-3mg/ml，分别以1mM乙酸4-硝基苯酯(pNPC2)、丁酸4-硝基苯酯(pNPC4)、己酸4-硝基苯酯(pNPC6)、辛酸4-硝基苯酯(pNPC8)、癸酸4-硝基苯酯(pNPC10)和月桂酸4-硝基苯酯(pNPC12)为底物，在50mM HEPES，pH7.0缓冲液中，25℃下所测得的酶活。
图8为磷酸三酯酶蛋白分子筛层析图谱。A：将牛血清白蛋白10mg/ml(单体分子量大小为66.43kDa，二聚体分子量大小为132.86kDa)以及在LB添加0.2mM ZnCl2培养条件下纯化的8047PTE-GD3-Zn2+蛋白，用10kD超滤管浓缩至浓度3mg/ml，加入AKTA FPLC 100μl上样环中，利用supdex 200凝胶过滤柱(位点排阻层析)分离鉴定，洗脱缓冲液为50mM HEPES缓冲液,pH7.0。B：将上述不同金属离子培养下纯化的磷酸三酯酶蛋白，浓度分别为8047PTE-GD3-apo(CK，LB中不额外添加金属离子)0.298mg/ml，8047PTE-GD3-Zn2+(LB中添加0.2mM ZnCl2)0.24mg/ml，8047PTE-GD3-Co2+(LB中添加0.2mM CoCl2)0.263mg/ml，8047PTE-GD3-Mn2+(LB中添加0.2mM MnCl2)0.246mg/ml，各100μl加入AKTA FPLC 100μl上样环中，利用supdex 200凝胶过滤柱(位点排阻层析)分离鉴定，洗脱缓冲液为50mM HEPES缓冲液,pH7.0。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、8047PTE蛋白的表达及活性测定
一、8047PTE蛋白及其编码基因的获得
自西南印度洋热液样品中分离的橙单胞菌科锰氧化菌Fulvimarinamanganoxydans(CGMCC1.10972)基因组DNA为模版，用8047PLL-F1和8047PLL-R1引物进行PCR扩增：
8047PLL-F1：5’-AGCAAATGGGTCGCGGATCCATGACCTCTCACGACACTTC-3’；
8047PLL-R1：5’-TCGAGTGCGGCCGCAAGCTTGGCGGCTGCGTGAAAAAC-3’
回收PCR扩增产物、克隆至pET21a(+)载体(Novagen)(BamH I和Hind III)，得到重组载体pET-8047PTE，将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后送交测序。
测序结果表明：该PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，将该序列所示的基因命名为8047PTE，该基因编码的蛋白命名为8047PTE，8047PTE的氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。
以pET-8047PTE质粒为模版，用8047PLL-GD3-F1和8047PLL-GD3-R1引物进行PCR扩增：
8047PLL-GD3-F1：5’-GGGAATTCCATATGACCTCTCACGACACTTCGAGCG-3’；
8047PLL-GD3-R1：5’-CCCAAGCTTATCATCGTCGCCGTCGTCATCGCCATCAT CATCGCCGGCGGCTGCGTGAA-3’。
回收PCR扩增产物、克隆至pET21a(+)载体(Nde I和Hind III)得到重组载体pET-8047PTE-GD3，将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)后送交测序。在不改变氨基酸的前提下，添加GDDDGDDDGDDD促溶序列标签，对以上所得原始8047PTE基因序列(SEQ ID No.2)添加标签后，得到优化后的8047PTE-GD3基因序列，如SEQ ID No.1的第1-1116位所示。重组载体pET-8047PTE-GD3携带有SEQ ID No.1所示DNA片段(完整的开放阅读框)，SEQ ID No.1所示DNA片段编码SEQ ID No.3所示蛋白。
二、磷酸三酯酶8047PTE获得
1、重组载体的构建
(1)表达原始8047PTE基因的重组载体的构建
用限制性内切酶对BamHI和Hind III对上述获得的PCR扩增产物(含有SEQ IDNo.2所示的原始8047PTE基因)和pET-21a(+)载体进行双酶切，连接，得到重组载体pET-8047PTE，并送交测序。
测序结果表明：pET-8047PTE为将pET-21a(+)载体的BamH I和Hind III位点间的DNA替换为SEQ ID No.2所示的原始8047PTE基因，保持pET-21a(+)载体的其他序列不变得到的重组载体。原始8047PTE基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
(2)表达8047-PTEGD3基因的重组载体的构建
在SEQ ID No.1所示DNA片段(优化后的8047PTE基因)的两端分别添加酶切位点NdeI和Hind III的识别序列，然后用限制性内切酶对NdeI和Hind III对该片段和pET-21a(+)载体进行双酶切，连接，得到重组载体pET-8047PTE-GD3，并送交测序。
测序结果表明：pET-8047PTE-GD3为将pET-21a(+)载体的Nde I和Hind III位点间的DNA替换为SEQ ID No.1所示的优化后8047PTE基因，保持pET-21a(+)载体的其他序列不变得到的重组载体。优化后8047PTE基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2、重组菌的获得
用氯化钙化学转化法将步骤1中得到的重组载体pET-8047PTE和pET-8047PTE-GD3杆菌BL21(DE3)中，得到两种重组菌，用含有氨苄(100μg/ml)的LB培养基对重组菌进行筛选培养，挑取单菌落，提取质粒并进行菌落PCR验证，PCR引物本别为8047PLL-F1/8047PLL-R1和8047PLL-GD3-F1/8047PLL-GD3-R1两对引物(序列同上)。将含有大小为1080bp的8047PTE基因以及1116bp的8047PTE-GD3插入片段的重组菌为阳性。最终得到两种阳性重组菌分别命名为pET-8047PTE[BL21(DE3)]和pET-8047PTE-GD3[BL21(DE3)]。
3、磷酸三酯酶8047PTE/8047PTE-GD3的获得
分别挑取pET-8047PTE[BL21(DE3)]和pET-8047PTE-GD3[BL21(DE3)]的单菌落接入含有氨苄(100μg/ml)的LB培养基(或者磷酸盐培养基)中(含有0.2mM ZnCl2或者0.2mMCoCl2或者0.2mM MnCl2)，于37℃过夜培养。将过夜培养物接种于1L含有氨苄(100μg/ml)的LB培养基，37℃剧烈振荡(200rpm)培养，至发酵液的OD600值达到0.6-0.8左右，再向发酵体系中加入IPTG(终浓度0.5mM)，16℃条件下再培养16-20小时。发酵完毕后，5000rpm离心15分钟，弃上清，收集菌体；用非变性镍柱结合缓冲液Ⅰ重悬菌体，超声波破碎(超声5s，间歇5s，40w的功率，30个循环)后12,000rpm离心15min。收集上清液即为含有目的蛋白8047PTE(SEQ ID No.4)和8047PTE-GD3(SEQ ID No.3)的粗酶液。培养基中不添加任何金属离子获得的蛋白为CK对照，称为8047PTE-GD3-apo蛋白；培养基中添加ZnCl2所获得的蛋白称为8047PTE-GD3/8047PTE-GD3-Zn2+；培养基中添加CoCl2所获得的蛋白称为8047PTE-GD3-Co2+，培养基中添加MnCl2所获得的蛋白称为8047PTE-GD3-Mn2+。
4、磷酸三酯酶8047PTE-GD3的纯化
非变性镍柱结合缓冲液Ⅰ：20mM Na2HPO4/NaH2PO4(每1000ml溶液中加入1.154ml的1mol/L Na2HPO4和0.846ml的1mol/L的NaH2PO4，其余用蒸馏水补足)，0.5 M NaCl，20mM咪唑；pH＝7.0。
非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ：20mM Na2HPO4/NaH2PO4(每1000ml溶液中加入1.154ml的1mol/L Na2HPO4和0.846ml的1mol/L的NaH2PO4，其余用蒸馏水补足)，0.5 M NaCl，0.5 M咪唑；pH＝7.0。
20％非变性镍柱洗脱缓冲液：非变性镍柱结合缓冲液Ⅰ和非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ按照体积比为80：20的比例混合后得到的混合溶液。
80％非变性镍柱洗脱缓冲液：非变性镍柱结合缓冲液Ⅰ和非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ按照体积比为20：80的比例混合后得到的混合溶液。
采用镍柱亲和层析进行纯化，在Amersham公司的AKTA FPLC系统中用1ml装量的HiTrap chelating HP column(镍柱)纯化上清。非变性镍柱结合缓冲液Ⅰ用于平衡纯化柱体和上样。将步骤3所得的菌体破碎离心后的上清液用0.22μm滤膜过滤后，加入FPLC上样环中，并甭入亲和层析柱中，蛋白上样量为10ml，流速设为1ml/min。用20％非变性镍柱洗脱缓冲液进行洗涤，去除非特异性结合的杂蛋白。用80％非变性镍柱洗脱缓冲液进行洗脱，收集含洗脱峰的洗脱液，经过脱盐柱Hitrap Q(5ml)纯化，洗脱缓冲液为50mM HEPES缓冲液，pH7.0。得到纯化后的磷酸三酯酶8047PTE-GD3。用SDS-PAGE检测洗脱液中磷酸三酯酶8047PTE-GD3的纯度。结果如图1中B所示：8047PTE-GD3蛋白大小为42kDa与预期结果一致。
三、磷酸三酯酶活性测定方法
1、酶活的测定方法
磷酸三酯酶8047PTE-GD3的酶活测定采用比色分析法。具体方法如下：取步骤二得到的6μl的纯化的磷酸三酯酶8047-PTE-GD3(0.47mg/mL)加入到3mL的测活缓冲液中，25℃反应5min，405nm实时监测吸光度的变化。
酶活定义：25℃下，在磷酸盐或HEPES缓冲液中，每分钟水解底物(对硝基苯乙酸酯)产生1μmol产物(对硝基苯酚)定义为一个酶活力单位。
测活缓冲液的制备方法：磷酸盐缓冲液：10mM K2HPO4/KH2PO4(每1000ml溶液中加入0.577ml的1mol/L Na2HPO4和0.423mL的1mol/L的NaH2PO4，其余用蒸馏水补足)，pH7.0；HEPES缓冲液：50mM HEPES缓冲液，pH7.0。(没有特殊要求，底物都用1mM4-硝基苯乙酸酯，4-硝基苯乙酸酯溶解在DMSO中，DMSO在测活缓冲液中的终浓度为1％。)
制作4-硝基苯酚标准曲线，将磷酸三酯酶8047PTE的测定结果与4-硝基苯酚标准曲线比对，得到磷酸三酯酶8047PTE酶活大小。实验设3次重复。
2、8047PTE-GD3最适温度测定方法
挑取pET-8047PTE-GD3[BL21(DE3)]的单菌落接入含有100μg/ml氨苄和0.2mMZnCl2的LB培养基中，于37℃过夜培养。后续菌体培养和蛋白纯化过程如步骤二中第3、4所述。得到的纯化后的8047PTE-GD3蛋白，蛋白浓度0.74mg/ml，将此蛋白溶液稀释100倍(取15μl蛋白溶液，用50mM HEPES,pH7.0的缓冲液稀释至1ml)，取150μl上述稀释后的蛋白溶液，添加750μl50mM HEPES,pH7.0的缓冲液。向上述300μl溶液中加入3μl 100mM 4-硝基苯乙酸酯(溶解在100％DMSO中)，迅速混匀，置于Beckman Coulter DU800分光光度计专用比色皿中，调节仪器温度，在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃分别温育3分钟，并且实时监测405nm吸光值的变化，每隔10s计数，监测0-180s内吸光值的变化，从而计算不同温度下的酶的活力。以25℃下该酶的活力值为100％。每个温度下平行测定三次。
3、8047PTE-GD3温度稳定性测定方法
挑取pET-8047PTE-GD3[BL21(DE3)]的单菌落接入含有100μg/ml氨苄和0.2mMZnCl2的LB培养基中，于37℃过夜培养。后续菌体培养和蛋白纯化过程如步骤二中第3、4所述。得到的纯化后的8047PTE-GD3蛋白，蛋白浓度0.47mg/mL，将该蛋白溶液分别在40℃、50℃、60℃、70℃水浴中温育30分钟，在5min、10min、20min、30min时，各取10μL蛋白样品，在10mM K2HPO4/KH2PO4,pH7.0的缓冲液中，3ml反应体系下，添加30μl 100mM对硝基苯乙酸酯(溶解在100％DMSO中)，迅速混匀，5分钟以内实时监测405nm吸光值的变化，每隔30s计数一次。以热处理前，25℃下该酶的活力值为100％。每个温度和处理时间下平行测定三次。
4、8047PTE-GD3二级结构和Tm值测定
挑取pET-8047PTE-GD3[BL21(DE3)]的单菌落接入含有100μg/ml氨苄的LB培养基中，于37℃过夜培养。后续菌体培养和蛋白纯化过程如步骤二中第3、4所述。得到的纯化后的8047PTE-GD3-apo蛋白，蛋白浓度1.05mg/ml，溶解在磷酸盐缓冲液：10mM K2HPO4/KH2PO4(每1000ml溶液中加入0.577ml的1mol/L Na2HPO4和0.423ml的1mol/L的NaH2PO4，其余用蒸馏水补足)，将该蛋白溶液稀释10倍后，取300-400μl蛋白溶液进行圆二色谱检测，设置温度20℃-96℃，波长190nm-260nm，步移1.0nm。通过升温过程中220nm吸光值的变化，通过线性拟合得到8047PTE-GD3-apo蛋白二级结构解链的温度Tm。
挑取pET-8047PTE-GD3[BL21(DE3)]的单菌落接入含有100μg/mL氨苄和0.2mMZnCl2的LB培养基中，于37℃过夜培养。后续菌体培养和蛋白纯化过程如步骤二第3、4所述。得到的纯化后的8047PTE-GD3蛋白，蛋白浓度157μg/mL，溶解在磷酸盐缓冲液：10mM K2HPO4/KH2PO4(每1000ml溶液中加入0.577mL的1mol/L Na2HPO4和0.423ml的1mol/L的NaH2PO4，其余用蒸馏水补足)，将该蛋白溶液300-400μl蛋白溶液进行圆二色谱检测，设置温度20℃-96℃，波长190nm-260nm，步移1.0nm。通过升温过程中220nm吸光值的变化，通过线性拟合得到8047PTE-GD3蛋白二级结构解链的温度Tm。
5、8047PTE-GD3 pH稳定性测定方法
挑取pET-8047PTE-GD3[BL21(DE3)]的单菌落接入含有100μg/ml氨苄和0.2mMZnCl2的LB培养基中，于37℃过夜培养。后续菌体培养和蛋白纯化过程如步骤二第3、4所述。得到的纯化后的8047PTE-GD3蛋白，蛋白浓度0.74mg/ml，将蛋白溶液置于pH2.4、pH3.2、pH4.0、pH5.2、pH6.0、pH7.0、pH7.6、pH8.0、pH8.2、pH9.0、pH10.0的缓冲液中孵育2小时，取10μl孵育后的酶液，加入2.96ml磷酸盐缓冲液中10mM K2HPO4/KH2PO4(每1000ml溶液中加入0.577mL的1mol/L Na2HPO4和0.423mL的1mol/L的NaH2PO4，其余用蒸馏水补足)，pH 7.0，加入30μl 100mM 4-硝基苯乙酸酯(溶解在100％DMSO中)，迅速混匀，5分钟以内实时监测405nm吸光值的变化，每隔30s计数一次。以热处理前，25℃下该酶的活力值为100％。每个温度和处理时间下平行测定三次。
6、不同金属离子培养pET-8047PTE-GD3[BL21(DE3)]重组菌
挑取pET-8047PTE-GD3[BL21(DE3)]的单菌落接入含有100μg/ml氨苄的磷酸盐或者LB培养基中，分别添加终浓度为0.1mM或0.2mM ZnCl2、CoCl2和MnCl2，于37℃过夜培养。磷酸盐培养基配方如下：12g/L胰蛋白胨(Bactro)，24g/L酵母粉(Bacto)，80mM K2HPO4，20mMKH2PO4，4g/L甘油；LB培养基配方：10g/L胰蛋白胨(Bactro)，5g/L酵母粉(Bacto)，10g/LNaCl；后续菌体培养和蛋白纯化过程如步骤二第3、4所述。不同培养基和金属离子培养下纯化得到的磷酸三酯酶蛋白，取蛋白浓度为1mg/ml，5μl蛋白溶液，而后添加浓度为100mM乙酸4-硝基苯酯(C2)、(溶解在100％DMSO中)15μl，其余用50mM HEPES缓冲液，pH7.0补足，实时监测405nm吸光值的变化，每30s计数一次，每种底物平行测定三次。
7、不同金属离子培养条件下纯化的磷酸三酯酶蛋白分子量大小和金属离子含量测定
将在LB中不同金属离子(0.2mM ZnCl2、CoCl2和MnCl2)培养条件下纯化的磷酸三酯酶蛋白，用10kD超滤管浓缩至浓度>1mg/ml，加入AKTA FPLC 100μl上样环中，利用supdex200凝胶过滤柱(位点排阻层析)分离鉴定，以10mg/ml BSA(单体分子量大小为66.43kDa，二聚体分子量大小为132.86kDa)为标记蛋白。洗脱缓冲液为50mM HEPES缓冲液,pH7.0。
将上述不同金属离子培养下纯化的磷酸三酯酶蛋白，浓度分别为8047PTE-GD3-apo(LB中不额外添加金属离子)0.298mg/ml，8047PTE-GD3(LB中添加0.2mM ZnCl2)0.24mg/ml，8047PTE-GD3-Co2+(LB中添加0.2mM CoCl2)0.263mg/ml，8047PTE-GD3-Mn2+(LB中添加0.2mM MnCl2)0.246mg/ml。送往清华大学分析中心原子光谱与无机质谱组ICP-MS等离子质谱检测Zn、Mn、Co、Ni、Cd的含量。测得的金属离子含量分别为8047PTE-GD3-apo(CK)：Zn615.4ng/ml、Mn 192.3ng/ml；8047PTE-GD3(ZnCl2)：Zn 579.3ng/ml、Mn 158.0ng/ml；8047PTE-GD3-Co2+(CoCl2)：Zn 487.7ng/ml、Mn 168.0ng/ml、Co 157.4ng/ml；8047PTE-GD3-Mn2+(MnCl2)：Zn 318.4ng/ml、Mn 337.6ng/ml。
8、磷酸三酯酶对不同底物酶活性测定方法
在磷酸盐培养基中添加0.2mM CoCl2培养条件下纯化得到的8047PTE-GD3-Co2+蛋白，浓度为311μg/ml，1.5ml反应体系中添加上述蛋白溶液5μl，而后分别添加浓度为100mM乙酸4-硝基苯酯(C2)、(溶解在100％DMSO中)15μl，其余用50mM HEPES缓冲液，pH7.0补足，实时监测405nm吸光值的变化，每30s计数一次，每种底物平行测定三次。不加蛋白溶液所测得的吸光值随时间的变化为底物自水解速率，在实际计算该酶对底物的水解活性时应扣除底物自水解导致的吸光值的变化。
在磷酸盐培养基中添加0.2mM CoCl2培养条件下纯化得到的8047PTE-GD3-Co2+蛋白，浓度为311μg/ml，1.5ml反应体系中添加上述蛋白溶液5μl，而后添加浓度为100mM乙酸苯酯(溶解在100％DMSO中)15μl，其余用50mM HEPES缓冲液，pH7.0补足，实时监测270nm吸光值的变化，每30s计数一次，每种底物平行测定三次。
在磷酸盐培养基中添加0.2mM CoCl2培养条件下纯化得到的8047PTE-GD3-Co2+蛋白，浓度为311μg/ml，1.5ml反应体系中添加上述蛋白溶液5μl，而后分别添加浓度为100mM1-乙酸萘酯、2-乙酸萘酯(溶解在100％DMSO中)15μl，其余用50mM HEPES缓冲液，pH7.0补足，实时监测320nm吸光值的变化，每30s计数一次，每种底物平行测定三次。
在LB中添加0.2mM ZnCl2培养条件下纯化得到的8047PTE-GD3蛋白，浓度为717μg/ml，1.5ml反应体系中添加上述蛋白溶液3μl，而后分别添加浓度为100mM丁酸4-硝基苯酯(C4)、己酸4-硝基苯酯(C6)、辛酸4-硝基苯酯(C8)、癸酸4-硝基苯酯(C10)、月桂酸4-硝基苯酯(C12)(溶解在100％DMSO中)15μl，其余用50mM HEPES缓冲液，pH7.0补足，实时监测405nm吸光值的变化，每30s计数一次，每种底物平行测定三次。
9、磷酸三酯酶对不同底物的酶促反应动力学参数的测定方法
(1)在磷酸盐培养基中添加0.2mM CoCl2(磷酸盐培养基配方如下：12g/L胰蛋白胨(Bactro)，24g/L酵母粉(Bacto)，80mM K2HPO4，20mM KH2PO4，4g/L甘油)培养条件下纯化得到的8047PTE-GD3-Co2+蛋白，浓度为311μg/ml，1.5ml反应体系中添加上述蛋白溶液5μl，而后分别添加终浓度为10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM、2000μM乙酸4-硝基苯酯(C2)(原液溶解在100％DMSO中，反应体系中DMSO的终浓度为1％)，其余用50mM HEPES缓冲液，pH7.0补足，实时监测405nm吸光值的变化，每30s计数一次，每种底物浓度下平行测定三次。以底物浓度的倒数1/[S]为横坐标，以反应速度的倒数1/v为纵坐标作图，所得直线的斜率为Km/Vmax，所得直线的截距为1/Vmax。
(2)在磷酸盐培养基中添加0.2mM CoCl2(磷酸盐培养基配方如下：12g/L胰蛋白胨(Bactro)，24g/L酵母粉(Bacto)，80mM K2HPO4，20mM KH2PO4，4g/L甘油)培养条件下纯化得到的8047PTE-GD3-Co2+蛋白，浓度为462μg/ml，将纯化后的蛋白溶液稀释10倍后，向1.5ml反应体系中添加上述蛋白溶液10μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，而后添加终浓度为1mM乙酸4-硝基苯酯(C2)(原液溶解在100％DMSO中，反应体系中DMSO的终浓度为1％))，其余用50mM HEPES缓冲液，pH7.0补足，实时监测405nm吸光值的变化，每30s计数一次，每种酶浓度下平行测定三次。以酶浓度[E]为横坐标，以最大反应速度Vmax为纵坐标作图，所得直线的斜率为kcat。
(3)在磷酸盐培养基中添加0.2mM CoCl2(磷酸盐培养基配方如下：12g/L胰蛋白胨(Bactro)，24g/L酵母粉(Bacto)，80mM K2HPO4，20mM KH2PO4，4g/L甘油)培养条件下纯化得到的8047PTE-GD3-Co2+蛋白，浓度为311μg/ml，1.5ml反应体系中添加上述蛋白溶液5μl，而后分别添加终浓度为100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM、2-乙酸萘酯(原液溶解在100％DMSO中，反应体系中DMSO的终浓度为1％)，其余用50mM HEPES缓冲液，pH7.0补足，实时监测405nm吸光值的变化，每30s计数一次，每种底物浓度下平行测定三次。以底物浓度的倒数1/[S]为横坐标，以反应速度的倒数1/v为纵坐标作图，所得直线的斜率为Km/Vmax，所得直线的截距为1/Vmax。
(4)在LB中添加0.2mM ZnCl2培养条件下纯化得到的8047PTE-GD3蛋白，浓度为717μg/ml，1.5ml反应体系中添加上述蛋白溶液3μl，而后分别添加终浓度为20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM、1000μM乙酸4-硝基苯酯(C2)(原液溶解在100％DMSO中，反应体系中DMSO的终浓度为<1％))15μL，其余用50mM HEPES缓冲液，pH7.0补足，实时监测405nm吸光值的变化，每30s计数一次，每种底物浓度下平行测定三次。以底物浓度的倒数1/[S]为横坐标，以反应速度的倒数1/v为纵坐标作图，所得直线的斜率为Km/Vmax，所得直线的截距为1/Vmax。
(5)在LB中添加0.2mM ZnCl2培养条件下纯化得到的8047PTE-GD3蛋白，浓度为717μg/ml，将纯化后的蛋白溶液稀释10倍后，向1.5ml反应体系中分别添加上述蛋白溶液2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、20μl、40μl，而后添加终浓度为1mM乙酸4-硝基苯酯(C2)(原液溶解在100％DMSO中，反应体系中DMSO的终浓度为<1％))15μl，其余用50mM HEPES缓冲液，pH7.0补足，实时监测405nm吸光值的变化，每30s计数一次，每种酶浓度下平行测定三次。以酶浓度[E]为横坐标，以最大反应速度Vmax为纵坐标作图，所得直线的斜率为kcat。
(6)在LB中添加0.2mM ZnCl2培养条件下纯化得到的8047PTE-GD3蛋白，浓度为717μg/ml，1.5ml反应体系中添加上述蛋白溶液3μl，而后分别添加终浓度为8μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、200μM、400μM丁酸4-硝基苯酯(C4)(原液溶解在100％DMSO中，反应体系中DMSO的终浓度为<1％))15μL，其余用50mM HEPES缓冲液，pH7.0补足，实时监测405nm吸光值的变化，每30s计数一次，每种底物浓度下平行测定三次。以底物浓度的倒数1/[S]为横坐标，以反应速度的倒数1/v为纵坐标作图，所得直线的斜率为Km/Vmax，所得直线的截距为1/Vmax。
(7)在LB中添加0.2mM ZnCl2培养条件下纯化得到的8047PTE-GD3蛋白，浓度为717μg/ml，将纯化后的蛋白溶液稀释10倍后，向1.5ml反应体系中分别添加上述蛋白溶液6μl、8μl、10μl、20μl、40μl、60μl，而后添加终浓度为1mM丁酸4-硝基苯酯(C4)(原液溶解在100％DMSO中，反应体系中DMSO的终浓度为<1％))15μl，其余用50mM HEPES缓冲液，pH7.0补足，实时监测405nm吸光值的变化，每30s计数一次，每种酶浓度下平行测定三次。以酶浓度[E]为横坐标，以最大反应速度Vmax为纵坐标作图，所得直线的斜率为kcat。
(8)在LB中添加0.2mM ZnCl2培养条件下纯化得到的8047PTE-GD3蛋白，浓度为717μg/ml，1.5ml反应体系中添加上述蛋白溶液3μl，而后分别添加终浓度为10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、200μM、400μM、600μM、800μM己酸4-硝基苯酯(C6)(原液溶解在100％DMSO中，反应体系中DMSO的终浓度为<1％))15μl，其余用50mM HEPES缓冲液，pH7.0补足，实时监测405nm吸光值的变化，每30s计数一次，每种底物浓度下平行测定三次。以底物浓度的倒数1/[S]为横坐标，以反应速度的倒数1/v为纵坐标作图，所得直线的斜率为Km/Vmax，所得直线的截距为1/Vmax。
(9)在LB中添加0.2mM ZnCl2培养条件下纯化得到的8047PTE-GD3蛋白，浓度为717μg/ml，将纯化后的蛋白溶液稀释10倍后，向1.5ml反应体系中分别添加上述蛋白溶液10μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl，而后添加终浓度为1mM己酸4-硝基苯酯(C6)(原液溶解在100％DMSO中，反应体系中DMSO的终浓度为<1％))15μl，其余用50mM HEPES缓冲液，pH7.0补足，实时监测405nm吸光值的变化，每30s计数一次，每种酶浓度下平行测定三次。以酶浓度[E]为横坐标，以最大反应速度Vmax为纵坐标作图，所得直线的斜率为kcat。
四、磷酸三酯酶活性测定结果
1、优化后的8047PTE-GD3磷酸三酯酶可溶性表达显著提高
深海来源的橙单胞菌科锰氧化菌Fulvimarina manganoxydans(CGMCC1.10972)，通过基因序列比对获得类磷酸三酯内酯酶8047PTE的基因序列，将该序列克隆到pET21a(+)(Novagen)中，并转化大肠杆菌E.coli BL21(λDE3)(F-ompT[lon]hsdS)菌株获得重组菌pET-8047PTE[BL21(λDE3)]，在30℃和16℃下表达，均以大量包涵体的形式存在(图1中A)。当在该基因的C末端添加三个连续的GDDD蛋白序列标签后，获得重组菌pET-8047PTE-GD3[BL21(λDE3)]在30℃和16℃下表达，基本上完全可溶表达，该序列标签大大提高了该蛋白在大肠杆菌中的重组表达的可溶蛋白量(图1中B)。经过纯化，该蛋白纯度>95％，目的蛋白大小与预期分子量42kDa一致(图1中B)。
2、磷酸三酯酶8047PTE-GD3在不同类型缓冲液中的酶活力比较
深海来源的在大肠杆菌中重组表达的磷酸三酯酶8047PTE-GD3在HEPES缓冲液中的活性比磷酸盐缓冲液中的活性高，并且在4℃短时间放置，活性略有升高，4℃放置13天后活性为原来的1.3倍(图2中A)。该酶4℃下非常稳定，在不额外添加任何保护剂的情况下，4℃储存357天，蛋白无降解(图2中B)，活性仍为初始值的69％(图2中C)。
3、磷酸三酯酶8047PTE-GD3最适温度及温度稳定性测定
深海来源的重组表达的磷酸三酯酶8047PTE-GD3在HEPES缓冲液中的最适温度为45℃(图3中A)，在磷酸钾缓冲液中50℃加热30分钟，活性降为原来的54.5％(图3中B)。通过圆二色谱测定，LB培养基中不额外加金属离子培养pET-8047PTE-GD3[BL21(λDE3)]菌株，纯化所得的8047PTE-GD3-apo蛋白其二级结构解链温度为Tm＝55.9±0.1℃(图4中A)；LB培养基中添加0.2mM ZnCl2培养pET-8047PTE-GD3[BL21(λDE3)]菌株，纯化所得的8047PTE-GD3蛋白其二级结构解链温度为Tm＝58.1±0.1℃(图4中B)。两种蛋白的二级结构均以α螺旋为主，两者二级结构类似。
4、磷酸三酯酶8047PTE-GD3的pH稳定性
深海细菌来源的重组表达的磷酸三酯酶8047PTE-GD3在pH2.4-pH10.0的缓冲液中处理2小时，之后在pH7.0的磷酸盐缓冲液中测定其活性。分析表明，该酶在pH8.0处理条件下，酶活性最高，在pH10.0的缓冲液中处理2小时，仍然保留24％的活性(图5)。
5、磷酸三酯酶8047PTE-GD3重组表达菌株pET-8047PTE-GD3[BL21(λDE3)]在不同金属离子培养条件下的活性比较
该深海细菌来源的磷酸三酯酶为金属酶，在菌株培养的过程中添加Zn2+、Co2+或Mn2 +将显著提高所获得的重组蛋白的活性。由于ZnCl2在酸性pH下可溶，因此在LB培养基中直接添加1mM ZnCl2会导致培养基pH的降低从而影响菌体的生长，在LB培养基中直接添加1mMCoCl2也会导致培养基pH的降低。因此选用磷酸盐培养基(成分如方法6中所示)选用12g/LBactrotryptone，24g/L Bactoyeas，80mM K2HPO4，20mM KH2PO4，4g/L glycerol培养基添加0.1mM金属离子，16℃，0.5mM IPTG诱导表达20h，将磷酸盐培养基培养条件下重组表达的磷酸三酯酶纯化后测定其比活。Zn2+、Co2+或Mn2+及不加金属离子培养条件下纯化得到的蛋白的比活如图6中A所示。添加Co2+时，活性最高。比活分别为8047PTE-GD3(CK)6391.5±966.2U/mg、8047PTE-GD3(Zn2+)6970.4±1371.4 U/mg、8047PTE-GD3(Co2+)10916.8±310.1 U/mg、8047PTE-GD3(Mn2+)7330.8±1030.4 U/mg。
然而，在上述磷酸盐培养基培养条件下，磷酸三酯酶的表达量相较于LB培养基培养下，重组菌株的目的蛋白表达量显著降低。LB培养基中补加0.2mM Zn2+、Co2+或Mn2+不影响其生长。Zn2+、Co2+或Mn2+及不加金属离子培养条件下纯化得到的蛋白的比活如图6中B所示。添加Co2+时，活性最高。比活分别为8047PTE-GD3(CK)6391.5±966.2 U/mg、8047PTE-GD3(Zn2 +)13314.5±1270.3 U/mg、8047PTE-GD3 14455.6±1195.6(Co2+)U/mg、8047PTE-GD3(Mn2+)9518.3±1112.9 U/mg。在两种培养基中添加钴离子，所获得的重组蛋白比活最高，是不加离子培养条件下所获得蛋白比活的1.7倍(图6)。在LB培养基培养条件下所获得的重组蛋白，相较于磷酸盐培养基培养条件下获得的重组蛋白，其比活更高。
6、磷酸三酯酶的底物特异性测定
深海细菌来源的重组表达的磷酸三酯酶8047PTE-GD3对乙酸4-硝基苯酯、丁酸4-硝基苯酯、己酸4-硝基苯酯、α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯均有活性，最适底物为丁酸4-硝基苯酯(图7中A和B)。加相同的金属离子，在磷酸盐培养基和LB培养基条件下，获得的相同浓度的蛋白，LB培养条件下获得的磷酸三酯酶蛋白的活力更高。
7、磷酸三酯酶8047PTE-GD3的动力学参数测定
以乙酸4-硝基苯酯为底物测定该酶的最大反应速度为Vmax＝2.42ⅹ10-5 M·min-1，米氏常数Km＝2.45ⅹ10-5 M，转换数kcat＝486±15.7min-1；以丁酸4-硝基苯酯为底物，该酶的最大反应速度为Vmax＝2.48ⅹ10-5 M·min-1，米氏常数Km＝1.89ⅹ10-5 M，转换数kcat＝407.5±11.9min-1；以己酸4-硝基苯酯为底物，该酶的最大反应速度为Vmax＝1.34ⅹ10-5M·min-1，米氏常数Km＝1.87ⅹ10-5 M，转换数kcat＝181.9±1.92min-1(表1)。
表1不同金属离子培养条件下所获得的8047PTE-GD3蛋白对不同底物的酶促反应动力学参数米氏常数Km、最大反应速度Vmax、转换数kcat
Figure BDA0002024304120000171
8、磷酸三酯酶8047PTE-GD3聚合形式及金属离子含量测定：
深海细菌来源的重组表达的磷酸三酯酶重组菌株pET-8047PTE-GD3[BL21(λDE3)]在LB培养基添加不同金属离子(0.2mM ZnCl2、CoCl2和MnCl2)培养条件下，纯化得到的8047PTE-GD3-Zn2+、8047PTE-GD3-Co2+、8047PTE-GD3-Mn2+蛋白，在位点排阻层析实验中，出峰位置基本一致，比BSA二聚体(理论分子量大小132.86kDa)出峰位置要靠前，根据其单体分子量大小42kDa推断，该蛋白主要以四聚体形式存在，不同金属离子培养条件，不影响该蛋白的聚合体形式(图8)。ICP-MS等离子质谱测定结果表明，重组菌株pET-8047PTE-GD3[BL21(DE3)]在LB中添加0.2mM ZnCl2培养条件下，纯化得到的8047PTE-GD3-Zn2+蛋白每分子聚合体含有约4个Zn2+和1个Mn2+。
<110> 中国科学院微生物研究所；中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）
<120> 一种磷酸三酯酶8047-PTE的编码基因及其应用
<130> GNCLN190268
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1158
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
atgacctctc acgacacttc gagcgagcga tccgaggccc atacgggctc gggccaggtg 60
atgacggtga acggcccgat cccggtcgcg gcgttgggcg tcaccttgat gcacgagcat 120
attctcaacg actgctcctg ttggtggaac aagccggaag agcccgagcg gctgcatctc 180
gccacggagc cggtccatat cggcattctc ggtgaactgc ggatggatcc cttcgtcaat 240
ctccacaatt gcgcgctgga cgacgagctg ctggcgatcg cggagctttc ccggttcgcc 300
gggcttggcg gacgcacggt cgtcgatccc acctgccggg gcatcgggcg caatccgaaa 360
gccctgcggc gcatcgccaa ggcgaccggc ctcaacatcg tgatgggcgc aggatattat 420
ctccagtctt cgcatcctga agagttggcc aggctttcga tcgacggggt cgccgaccag 480
atcgtcacag aggccaagac cggcgtcgac gggacggatg ccaagatcgg cttgatcggg 540
gagatcggcg tctctgccga ttttacacca gacgaggaga agagcctgcg cggtgcggtc 600
cgtgcccagg ctcggacagg gcttcctctg atggtgcatc tgcccggctg gttccggctc 660
gccgacaaga tcctcgacat cgtcgaggag gaaggcggcg atgtggccca gaccgttctg 720
tgccacatga acccttccca tggcgatttc gcctatcagg atgccctcgc caagcgcggc 780
gccttcctgg aatacgacat gatcggcatg gatttctggt atgacgatca gaaggtccaa 840
tgcccctccg acgacgacaa cgcggccgcc atcatgcggc tgatcgaggc cggccatctc 900
ggccgacttc ttctgtcgca ggacgtcttt ctgaagatga tgctcacccg ctatggcggt 960
ctcggctatg accacgtcct gcgcaatttc gtaccgcggc tgaagcgctt cggcgccgat 1020
gacgcgatga tcgaggcgct gatggtcgcc aatccgcgat cggtttttca cgcagccgcc 1080
ggcgatgatg atggcgatga cgacggcgac gatgataagc ttgcggccgc actcgagcac 1140
caccaccacc accactga 1158
<210> 2
<211> 1083
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
atgacctctc acgacacttc gagcgagcga tccgaggccc atacgggctc gggccaggtg 60
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tga 1083
<210> 3
<211> 385
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 3
Met Thr Ser His Asp Thr Ser Ser Glu Arg Ser Glu Ala His Thr Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gln Val Met Thr Val Asn Gly Pro Ile Pro Val Ala Ala Leu
20 25 30
Gly Val Thr Leu Met His Glu His Ile Leu Asn Asp Cys Ser Cys Trp
35 40 45
Trp Asn Lys Pro Glu Glu Pro Glu Arg Leu His Leu Ala Thr Glu Pro
50 55 60
Val His Ile Gly Ile Leu Gly Glu Leu Arg Met Asp Pro Phe Val Asn
65 70 75 80
Leu His Asn Cys Ala Leu Asp Asp Glu Leu Leu Ala Ile Ala Glu Leu
85 90 95
Ser Arg Phe Ala Gly Leu Gly Gly Arg Thr Val Val Asp Pro Thr Cys
100 105 110
Arg Gly Ile Gly Arg Asn Pro Lys Ala Leu Arg Arg Ile Ala Lys Ala
115 120 125
Thr Gly Leu Asn Ile Val Met Gly Ala Gly Tyr Tyr Leu Gln Ser Ser
130 135 140
His Pro Glu Glu Leu Ala Arg Leu Ser Ile Asp Gly Val Ala Asp Gln
145 150 155 160
Ile Val Thr Glu Ala Lys Thr Gly Val Asp Gly Thr Asp Ala Lys Ile
165 170 175
Gly Leu Ile Gly Glu Ile Gly Val Ser Ala Asp Phe Thr Pro Asp Glu
180 185 190
Glu Lys Ser Leu Arg Gly Ala Val Arg Ala Gln Ala Arg Thr Gly Leu
195 200 205
Pro Leu Met Val His Leu Pro Gly Trp Phe Arg Leu Ala Asp Lys Ile
210 215 220
Leu Asp Ile Val Glu Glu Glu Gly Gly Asp Val Ala Gln Thr Val Leu
225 230 235 240
Cys His Met Asn Pro Ser His Gly Asp Phe Ala Tyr Gln Asp Ala Leu
245 250 255
Ala Lys Arg Gly Ala Phe Leu Glu Tyr Asp Met Ile Gly Met Asp Phe
260 265 270
Trp Tyr Asp Asp Gln Lys Val Gln Cys Pro Ser Asp Asp Asp Asn Ala
275 280 285
Ala Ala Ile Met Arg Leu Ile Glu Ala Gly His Leu Gly Arg Leu Leu
290 295 300
Leu Ser Gln Asp Val Phe Leu Lys Met Met Leu Thr Arg Tyr Gly Gly
305 310 315 320
Leu Gly Tyr Asp His Val Leu Arg Asn Phe Val Pro Arg Leu Lys Arg
325 330 335
Phe Gly Ala Asp Asp Ala Met Ile Glu Ala Leu Met Val Ala Asn Pro
340 345 350
Arg Ser Val Phe His Ala Ala Ala Gly Asp Asp Asp Gly Asp Asp Asp
355 360 365
Gly Asp Asp Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His
370 375 380
His
385
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 4
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20 25 30
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35 40 45
Trp Asn Lys Pro Glu Glu Pro Glu Arg Leu His Leu Ala Thr Glu Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Leu His Asn Cys Ala Leu Asp Asp Glu Leu Leu Ala Ile Ala Glu Leu
85 90 95
Ser Arg Phe Ala Gly Leu Gly Gly Arg Thr Val Val Asp Pro Thr Cys
100 105 110
Arg Gly Ile Gly Arg Asn Pro Lys Ala Leu Arg Arg Ile Ala Lys Ala
115 120 125
Thr Gly Leu Asn Ile Val Met Gly Ala Gly Tyr Tyr Leu Gln Ser Ser
130 135 140
His Pro Glu Glu Leu Ala Arg Leu Ser Ile Asp Gly Val Ala Asp Gln
145 150 155 160
Ile Val Thr Glu Ala Lys Thr Gly Val Asp Gly Thr Asp Ala Lys Ile
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Gly Leu Ile Gly Glu Ile Gly Val Ser Ala Asp Phe Thr Pro Asp Glu
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Glu Lys Ser Leu Arg Gly Ala Val Arg Ala Gln Ala Arg Thr Gly Leu
195 200 205
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275 280 285
Ala Ala Ile Met Arg Leu Ile Glu Ala Gly His Leu Gly Arg Leu Leu
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Leu Ser Gln Asp Val Phe Leu Lys Met Met Leu Thr Arg Tyr Gly Gly
305 310 315 320
Leu Gly Tyr Asp His Val Leu Arg Asn Phe Val Pro Arg Leu Lys Arg
325 330 335
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340 345 350
Arg Ser Val Phe His Ala Ala Ala
355 360

Claims (10)

1.DNA分子，其核苷酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.1的第1-1116位。
2.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒。
3.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒自上游到下游由T7启动子、所述DNA分子和T7终止子组成。
4.含有权利要求1所述DNA分子或权利要求2或3所述表达盒的重组载体。
5.含有权利要求1所述DNA分子或权利要求2或3所述表达盒或权利要求4所述重组载体的重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将权利要求1所述DNA分子或权利要求2或3所述表达盒或权利要求4所述重组载体导入大肠杆菌后得到的重组菌。
7.含有权利要求1所述DNA分子或权利要求2或3所述表达盒或权利要求4所述重组载体的转基因细胞系。
8.权利要求1所述的DNA分子或权利要求2或3所述的表达盒或权利要求4所述的重组载体或权利要求5或6所述的重组菌或权利要求7所述的转基因细胞系在表达SEQ ID No.3或SEQ ID No.3的第1-372位所示蛋白质中的应用。
9.权利要求1所述的DNA分子或权利要求2或3所述的表达盒或权利要求4所述的重组载体或权利要求5或6所述的重组菌或权利要求7所述的转基因细胞系在制备磷酸三酯酶中的应用。
10.一种制备磷酸三酯酶的方法，包括如下步骤：
(a1)对权利要求6所述的重组菌进行诱导培养，收集菌体；
所述诱导培养为：加入IPTG至终浓度0.5mM，16℃条件下培养16-20小时；
(a2)超声破碎步骤(a1)所得菌体并离心，从离心所得上清液中获得磷酸三酯酶。
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