CN114634896B - 一株缺陷短波单胞菌及降解四溴双酚a的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株缺陷短波单胞菌及降解四溴双酚A的应用。本发明中的缺陷短波单胞菌分离于四溴双酚A废水生物处理反应器中，得到一株对四溴双酚A具有优势降解能力的缺陷短波单胞菌，将其命名为TB‑1菌，已于2022年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2022366。该菌株具有较强的四溴双酚A降解能力；能够以四溴双酚A为唯一营养来源进行代谢；同时该菌株活力高，培养方法简单，可直接应用于对四溴双酚A污染物的生物修复；具有良好前景。

Description

一株缺陷短波单胞菌及降解四溴双酚A的应用
技术领域
本发明涉及的是环境微生物学研究领域，具体涉及的是一株缺陷短波单胞菌及降解四溴双酚A的应用。
背景技术
四溴双酚A分子结构中的羟基和溴基团易与高分子材料反应，常作为反应型阻燃剂，广泛应用于印刷线路板、电子元器件中，且可作为添加型阻燃剂应用于纺织、塑料、造纸、电子设备等领域。四溴双酚A的大量生产与使用使其部分释放到环境中，对水、空气、土壤都造成了严重的污染。且因具有生物富集性，常通过呼吸作用、暴露途径、食物链等在人类和动物体内积累。
处理四溴双酚A污染的方法主要有物理、化学和生物法。物理法仅对污染物进行转移而不能彻底去除，且易对环境产生二次污染；化学法处理成本昂贵且处理过程中伴随有毒副产物的产生；生物法降解四溴双酚A成本低、高效、不产生二次污染，具有良好的降解四溴双酚A的应用前景。
降解四溴双酚A的微生物主要有细菌、真菌和原生生物。其中参与降解的真菌主要有白腐真菌，细菌主要有假单胞菌属、苍白杆菌属，参与降解的原生生物有甲基杆菌。目前可用于降解四溴双酚A的假单胞菌属处理四溴双酚A时存在两种问题：处理时间长及可降解四溴双酚A的浓度较低。如：当苍白杆菌降解2mg/L的四溴双酚A时，84h后的降解率为96.2％，可降解的四溴双酚A浓度低且降解时间长。因此，筛选具有高效降解四溴双酚A能力的微生物至关重要。
发明内容
本发明目的在于提供一株缺陷短波单胞菌及降解四溴双酚A的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一株缺陷短波单胞菌，该缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)的保藏编号为CCTCC M 2022366；已于2022年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编：430072；电话：(027)-6875 2319。
一种培养缺陷短波单胞菌的方法，所述的缺陷短波单胞菌为权利要求1所述的缺陷短波单胞菌；挑取缺陷短波单胞菌单菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于31℃及150±10r/min下恒温震荡培养，待其生长至OD600nm为1.6～1.8；牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法：NaCl 5g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L。煮沸溶解至溶液澄清，冷却后用6M NaOH调溶液pH为7.8。
本发明所述的缺陷短波单胞菌用于降解四溴双酚A的应用。
可选的，缺陷短波单胞菌降解水中四溴双酚A包括：接种生长至对数期的缺陷短波单胞菌种子液于水中，降解温度25～33℃，降解转速150～210r/min。
优选的，所述的降解温度为31℃，降解转速150r/min。
进一步的，生长至对数期的缺陷短波单胞菌种子液的培养方法包括：挑取缺陷短波单胞菌单菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于31℃及150±10r/min下恒温震荡培养，待其生长至OD600nm为1.6～1.8；
牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法：NaCl 5g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L。煮沸溶解至溶液澄清，冷却后用6M NaOH调溶液pH为7.8。
本发明所述的缺陷短波单胞菌用于制备生物降解剂的应用，所述的生物降解剂用于降解四溴双酚A。
可选的，生物降解剂降解水中四溴双酚A包括：接种生长至对数期的缺陷短波单胞菌种子液于水中，降解温度25～33℃，降解转速150～210r/min。
进一步的，所述的降解温度为31℃；
生长至对数期的缺陷短波单胞菌种子液的培养方法包括：挑取缺陷短波单胞菌单菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于31℃及150±10r/min下恒温震荡培养，待其生长至OD600nm为1.6～1.8；牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法：NaCl 5g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L。煮沸溶解至溶液澄清，冷却后用6M NaOH调溶液pH为7.8。
一种生物降解剂，所述的生物降解剂中含有本发明所述的缺陷短波单胞菌和/或其次生代谢产物；所述的生物降解剂用于降解四溴双酚A。
本发明具有以下有益效果：
a.本发明首次从处理四溴双酚A的生物反应器中分离筛选出具有高效降解四溴双酚A能力的缺陷短波单胞菌。
b.本发明的缺陷短波单胞菌降解四溴双酚A的能力强且降解时间短，在四溴双酚A浓度为50mg/L时，降解96h后的降解率可达56.095％。
c.本发明的缺陷短波单胞菌对四溴双酚A的耐受能力强，可耐受四溴双酚A的最大浓度为1000mg/L。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是本发明的缺陷短波单胞菌TB-1的菌落形态；
图2是本发明的缺陷短波单胞菌TB-1菌体形态电镜图；
图3是本发明与有效种之间构建的系统发育树；
图4是本发明随时间对50mg/L四溴双酚A的降解率；
图5是本发明对不同浓度四溴双酚A耐受度的研究。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方案做进一步说明，但本发明的实施方案不仅限于此：
本发明的缺陷短波单胞菌Brevundimonas diminuta TB-1分离于处理四溴双酚A的生物反应器中，具有高效降解四溴双酚A的能力，其优势在于可耐受高浓度的四溴双酚A环境且生物降解时间短。目前为止，还未见筛选出具有高效降解四溴双酚A能力的缺陷短波单胞菌。该缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)的保藏编号为CCTCC M 2022366；已于2022年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编：430072；电话：(027)-6875 2319。
本发明的缺陷短波单胞菌Brevundimonas diminuta TB-1能够降解环境中的四溴双酚A，不限于土壤、水体等环境中的四溴双酚A。
缺陷短波单胞菌Brevundimonas diminuta TB-1菌种收集：于处理四溴双酚A的生物反应器中，收集该系统中的固定化生物膜，并经超声震荡将生物膜上的微生物收集于无菌水中，得菌悬液。
处理四溴双酚A的生物反应器为铜绿假单胞菌NY3降解四溴双酚A模拟废水的序批式好氧生物反应器(陕西西安，西安建筑科技大学实验室)，具体为：在序批式好氧生物反应器中，加入适量的溴双酚A模拟废水，以葡萄糖为共代谢碳源，将铜绿假单胞菌NY3固定化生物膜置于反应器中，进行四溴双酚A的降解。其中，四溴双酚A的浓度为50mg/L，铜绿假单胞菌NY3固定化生物膜的接种量为1.44g固定化载体/100mL溴双酚A模拟废水。待反应器运行结束后，取出生物膜，经超声震荡将生物膜上的微生物收集于无菌水中，得菌悬液。然后将菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基，分离纯化后获得TB-1菌。
缺陷短波单胞菌Brevundimonas diminuta TB-1菌种分离：取上述菌悬液，经梯度稀释后涂布于牛肉膏固体培养基上，稀释浓度梯度为10-1，10-2，10-3.....，10-7，每个浓度梯度涂布三个平行样品，于37℃恒温箱中倒置培养，待平板长出菌落后(一般10-5或10-6稀释浓度的平板单菌落分布较好)，根据菌落的形态、大小和颜色挑取不同的单菌落。
其中，牛肉膏培养基的配置为：5g/L Nacl、10g/L酵母浸粉、3g/L牛肉膏，加热溶解培养基之后待其冷却，用6mol/L NaOH调其pH为7.8后，加琼脂15g/L，于高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min备用。
缺陷短波单胞菌Brevundimonas diminuta TB-1菌种纯化：挑取分离的不同类型单菌落，在牛肉膏固体培养基平板上采用平板划线法划线培养，于37℃恒温箱中倒置培养24h，如此反复转接，直至获得纯化的单菌落。
缺陷短波单胞菌Brevundimonas diminuta TB-1菌落形态观察：将纯化的TB-1单菌落转接于牛肉膏液体培养基中，置于31℃、150r/min的恒温水浴摇床过夜生长，待其OD600nm值为1.6～1.8，采用稀释涂布法，吸取TB-1菌的不同浓度梯度的悬浊液100μL到牛肉膏固体培养基上，经均匀涂布至培养基完全吸收后，倒置放于37℃恒温培养箱，于24h后观察平板上菌落生长情况发现：TB-1菌的菌落呈现圆形、透亮、白绿色、生长密集、边缘整齐、表面湿润、点状大小，直径约0.5mm。其中，牛肉膏液体培养基配置方法同上述固体培养基，不加琼脂即可。具体菌落形态见图1。
缺陷短波单胞菌Brevundimonas diminuta TB-1菌体形态观察：取TB-1菌种子液50mL，进行固定及梯度脱水预处理后，使用扫描式电子显微镜(SEM)观察菌体形态特征发现，具体见图2：TB-1菌的菌体呈现为细杆状，大小约2～2.5×0.2～0.4μm。
其中，种子液脱水程序如下：10000r/min，4℃冷冻离心后去其上清收集菌体后，将收集菌体置于4％戊二醛溶液中制成菌悬液，4℃冰箱浸泡过夜以进行固定；将上述菌体收集并均匀分散于0.2M的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，于恒温振荡器150r/min震荡15min，以相同方法漂洗样品3次；使用不同浓度的乙醇(50％、70％、80％、90％和95％)对样品梯度脱水，每次均匀分散以后静置15min，最后用100％浓度的乙醇处理两次，每次20min；将脱水后的菌体浸泡于醋酸异戊酯中，置于4℃冰箱保存过夜后置于临界点干燥仪(K850)中干燥，备用。将该制备样品于电流20mA的溅射仪上喷金60s，即可用扫描式电子显微镜观察微生物的菌体结构。
缺陷短波单胞菌Brevundimonas diminuta TB-1菌的分子生物学鉴定：经细菌基因组提取DNA试剂盒提取TB-1菌的基因组DNA，送至上海生工生物工程有限公司测序后获得其16S rDNA序列，将该基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行比对分析发现：TB-1菌与Brevundimonas diminuta JCM 2788相似性最高，为100％。由此可得知TB-1菌为缺陷短波单胞菌属。
缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)TB-1的16S rDNA序列如下所示：
Figure GDA0003651424000000051
Figure GDA0003651424000000061
上海生工生物工程有限公司，PatentIn version 3.5；缺陷短波单胞菌(Brevundimonas sp.)。
图3中发育树的做法包括：将TB-1菌的16Sr DNA序列输入NCBI GenBank中，经BLAST比对，确定其在属水平的分类；然后从bacterio网站(http://www.bacterio.cict.fr/)查找其属水平的所有“种”的模式菌株，根据菌株号或网站已提供的该种的登录号，下载所有模式菌株的16Sr RNA序列，并下载临近属的一个模式菌株的16SrRNA序列作为外源序列。导入所有序列后，以clustalX 1.83进行序列对比，然后采用mega 4.0NJ法构建进化树，确定TB-1菌的分类地位。
结论：由图3的发育树可知，TB-1菌为缺陷短波单胞菌Brevundimonas diminuta。
测定缺陷短波单胞菌Brevundimonas diminuta TB-1菌主要的生理生化特征发现其：革兰氏阴性菌，不水解明胶，不含有脲酶、酯酶及淀粉水解酶，含氧化酶、接触酶，产吲哚，在半固体牛肉膏培养基上穿刺接种运动阴性。将上述各项理化性质与常见细菌系统鉴定手册中的缺陷短波单胞菌进行比较，结合分子生物学鉴定结果，可确定所分离的TB-1菌为Brevundimonas diminuta种，命名为Brevundimonas diminuta TB-1。
缺陷短波单胞菌Brevundimonas diminuta TB-1降解四溴双酚A的能力探究：无菌条件下以10％接种量转接生长至对数期的TB-1菌种子液于无机盐培养基中，添加四溴双酚A使其体系浓度为50mg/L，置于31℃、150r/min的恒温水浴摇床，分别测定降解体系相应时间点的降解率；
用接种环从牛肉膏蛋白胨的固体平板培养基上挑取TB-1单菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，将其置于31℃，150±10r/min的恒温水浴摇床中震荡，待其生长至OD600nm为1.6-1.8，即得黏质沙雷氏菌种子液。
牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法：NaCl 5g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L。煮沸溶解至溶液澄清，冷却后用6M NaOH调溶液pH为7.8。
牛肉膏蛋白胨固体平板培养基的制备方法：NaCl 5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，将其溶于适量蒸馏水中，煮沸溶解至溶液澄清，冷却后用6M NaOH溶液调节pH为7.8后，加入琼脂15g/L，于121℃，高温高压灭菌15min后，制备牛肉膏蛋白胨固体平板。
其中，无机盐培养基的配备：NH4NO3 1g/L，磷酸盐缓冲液25mL/L，MgSO4·7H2O(1M，246.47g/L)0.5mL，CaCl2·2H2O(1M，147.01g/L)0.1mL，微量元素1mL，蒸馏水定容至1L。磷酸盐缓冲液：NaH2PO4·2H2O：42.9g/L；K2HPO4·3H2O：42.9g/L，蒸馏水定容至1L，用NaOH颗粒调pH至8.0。微量元素：ZnSO4·7H2O 0.148g；MnSO4·H2O 0.258g；NiSO4·6H2O 0.022g；CoCl2·6H2O 0.024g；CuCl2·2H2O 0.013g；H3BO3 0.062g；Na2MoO4·2H2O 0.10g；FeSO4·7H2O 4.5g，蒸馏水定容至1L。
通过图4中的测试结果，发现24及96h的降解率分别为：34.728％、47.661％。
目前已发现的降解四溴双酚A的菌株如下：
厌氧条件下：1.链球菌属在1d内对四溴双酚A(0.5mg/L)的降解率为71.6％，其降解率较好但污染物四溴双酚A的浓度过低；2.丛毛单胞菌属在10d后对四溴双酚A(0.5mg/L)的降解率为的降解率为86.0％，其存在的问题是，可降解浓度较低，且所需的降解时间过长。
好氧条件下：1.苍白杆菌T(Ochrobactrum sp.T)，该菌株在35℃、pH为7下，3d后对3mg/L的四溴双酚A达86.7％的降解率，存在的问题是可降解浓度较小；2.假单胞菌属W1-2，属于好氧性降解菌株，在10mg/L的四溴双酚A浓度下，其5d的降解率达91.4％，其降解率虽好，但系统的耐受浓度较低且所需的降解时间较长；3.假单胞菌fz(Pseudomonas sp.f z)，该菌株在外加碳氮源-牛肉膏和蛋白胨的辅助下，对10mg/L四溴双酚A有80％的降解率，其存在的问题是需添加共代谢碳源作为微生物的共培养物质，且可耐受的四溴双酚A浓度较小；4.假单胞菌属(Pseudomonas sp.)在添加8g/L的葡萄糖为共代谢碳源条件下，对于四溴双酚A的浓度为10mg/L的降解体系，降解6d的降解率为55.2％，其存在的问题是，降解时间长，且菌株在无外加碳源的条件下不能直接以四溴双酚A为唯一碳源进行微生物的代谢及利用。
目前对于降解四溴双酚A的菌株及条件而言，好氧菌比厌氧菌降解四溴双酚A更具优势，且目前已发现关于降解四溴双酚A的相关好氧菌属存在的明显问题是其降解四溴双酚A的浓度较低，且所需的降解时间较长，一般需要添加共代谢碳源如葡萄糖等到降解体系。经试验，在未优化条件下，当体系四溴双酚A浓度为50mg/L时，缺陷短波单胞菌TB-1在以四溴双酚A为唯一碳源条件下，24h的降解率可达34.728％，96h的降解率可达47.661％。
缺陷短波单胞菌TB-1降解四溴双酚A的耐受度探究：以相同方法配置无机盐体系，分别设置TB-1菌降解四溴双酚A体系的终浓度为50、100、1000、1500mg/L，置于31℃、150r/min的恒温水浴摇床，且于相应时间点测定各降解体系的生长及降解率情况。以OD600nm表示的生长及降解率结果如表1和图5所示。
表1不同初始浓度的四溴双酚A体系的生长及降解率
四溴双酚A浓度 OD600nm 降解率
50mg/L 0.828 64.479％
100mg/L 0.733 48.248％
1000mg/L 0.582 39.264％
1500mg/L 0.549 3.898％
从表1可看出，缺陷短波单胞菌TB-1可耐受的最大四溴双酚A浓度为：1000mg/L。
上述为本发明的最佳实施方案，但本发明的具体实施方案不局限于此，其他任何未背离本发明的实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化等，均应为等效的置换方式，均包含在本发明的保护范围之内。
核苷酸序列表电子文件
<110>西安建筑科技大学
<120>一株缺陷短波单胞菌及降解四溴双酚A的应用
<160>1
<210> 1
<211>1285
<212> DNA
<213>缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）TB-1的16S rDNA序列
<400> 1
gtggcggacg ggtgtaagta acacgtggga gcgtgcctct taggttcgga gtagctccct 60
ggaaacgggt ggtaatgccg aatgtgccct tcgggggaaa gagttatcgc ctttagagcg 120
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ggtctgagag gatgaccagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 240
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ggctcaaccc tggaactgcc tttgatactg gcgatcttga gtatgagaga ggtatgtgga 540
actccgagtg tagaggtgaa attcgtagat attcggaaga acaccagtgg cgaaggcgac 600
atactggctc attactgacg ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 660
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgattg ctagttgtcg ggctgcatgc agttcggtga 720
cgcagctaac gcattaagca atccgcctgg ggagtacggt cgcaagatta aaactcaaag 780
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aaccttacca ccttttgaca tgcctggacc gccacggaga cgtggctttc ccttcgggga 900
ctaggacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 960
ccgcaacgag cgcaaccctc gccattagtt gccatcattt agttgggaac tctaatggga 1020
ctgccggtgc taagccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcctcatgg cccttacagg 1080
gtgggctaca cacgtgctac aatggcaact acagagggtt aatccttaaa agttgtctca 1140
gttcggattg tcctctgcaa ctcgagggca tgaagttgga atcgctagta atcgcggatc 1200
agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggaa 1260
gttggttcta cccgaaggcg gtgcg 1285

Claims (10)

1.一株缺陷短波单胞菌，其特征在于，该缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）的保藏编号为CCTCC M 2022366。
2.一种培养缺陷短波单胞菌的方法，其特征在于，所述的缺陷短波单胞菌为权利要求1所述的缺陷短波单胞菌；
挑取缺陷短波单胞菌单菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于31℃及150±10r/min下恒温震荡培养，待其生长至OD600nm为1.6～1.8；
牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法：NaCl 5 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L。煮沸溶解至溶液澄清，冷却后用6 M NaOH调溶液pH为7.8。
3.权利要求1所述的缺陷短波单胞菌用于降解四溴双酚A的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，缺陷短波单胞菌降解水中四溴双酚A包括：
接种生长至对数期的缺陷短波单胞菌种子液于水中，降解温度25～33℃，降解转速150～210 r/min。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的降解温度为31℃，降解转速150r/min。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，生长至对数期的缺陷短波单胞菌种子液的培养方法包括：挑取缺陷短波单胞菌单菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于31℃及150±10r/min下恒温震荡培养，待其生长至OD600nm为1.6～1.8；
牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法：NaCl 5 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L。煮沸溶解至溶液澄清，冷却后用6 M NaOH调溶液pH为7.8。
7.权利要求1所述的缺陷短波单胞菌用于制备生物降解剂的应用，所述的生物降解剂用于降解四溴双酚A。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，生物降解剂降解水中四溴双酚A包括：
接种生长至对数期的缺陷短波单胞菌种子液于水中，降解温度25～33℃，降解转速150～210 r/min。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的降解温度为31℃；
生长至对数期的缺陷短波单胞菌种子液的培养方法包括：挑取缺陷短波单胞菌单菌落于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于31℃及150±10r/min下恒温震荡培养，待其生长至OD600nm为1.6～1.8；
牛肉膏蛋白胨液体培养基的制备方法：NaCl 5 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L。煮沸溶解至溶液澄清，冷却后用6 M NaOH调溶液pH为7.8。
10.一种生物降解剂，其特征在于，所述的生物降解剂中含有权利要求1所述的缺陷短波单胞菌；所述的生物降解剂用于降解四溴双酚A。
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