CN115322924B - 一种双菌混合培养合成聚羟基脂肪酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种双菌混合培养合成聚羟基脂肪酸酯的方法，属于微生物合成技术领域。本发明筛选出两株菌，分别为缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)R79和巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)R90。本发明以湿重比1:(0.5～2)将上述两株菌混合培养，在发酵过程中以乙酸钠为唯一碳源合成PHA，缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90之间协同增效，共同促进PHA产量的提高，与现有技术相比，提高了PHA的产量，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种双菌混合培养合成聚羟基脂肪酸酯的方法，属于微生物合成技术领域。
背景技术
聚羟基烷酸酯(PHA)，即聚羟基脂肪酸酯是一类在营养条件受限的条件下，许多微生物积累的为自身提供碳源和能源的细胞内生聚合物。PHA还是一种环境友好型高分子生物塑料，具有可再生、生物可降解、生物相容性好等优良特性，是石油基塑料的有效替代品，可由可再生原料生产。
PHA可以通过生物工艺在受控条件下生产，通过改变生产菌株、底物或共底物合成出单体组成不同的聚酯，通过这种方法，可以生产出具有特定物理特性的PHA。PHA具有优异的化学和物理性能，已在能源、医药、农业和包装等多个领域得到开发利用。但目前PHA的生产主要采用传统的单一菌种发酵生产，但是单菌发酵产量低，成本高，极大的限制了PHA的广泛应用。而混合培养过程中，两种或多种微生物之间可以达成一定的共生或促生，能够通过对中间产物的利用而克服纯种发酵过程中产生的底物抑制现象。并且不同的菌株组合后，会对菌株的转录调控产生影响，从而影响他们的相互作用关系。因此，筛选出合适的互作菌株去提高PHA的产量具有很好的理论意义和现实意义。
中国专利文献CN 110331175 A(申请号201910597566.X)公开了一种混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法，具体步骤如下：一、取总底物体积1/20～1/10量的活性污泥置于SBR反应器中，加入奇数碳脂肪酸浓度为SCOD100～500mg/L的底物进行PHA菌群驯化；二、丰盛期长度以SCOD下降达到拐点计，丰盛-饥饿比为1:3～1:5，下一周期接种比例以OD600计，使初始OD600为0.3～0.4；三、稳定后将底物奇数碳脂肪酸浓度依次增加为SCOD 1000、1500～3000、3500～5000mg/L，每个梯度以最大PHA合成率和PHA浓度为指标，连续两周期标准差小于5％判断为稳定；四、在最高浓度稳定后，丰盛期末收集70～80％菌体用于回收PHA产品，另20～30％菌体在饥饿期后接种于下一周期。本发明合成的PHA含较高比例的3HV和3H2MV单体，加工性良好。
中国专利文献CN 104561144 A(申请号201510012076.0)公开了一种利用剩余活性污泥生产中长链聚羟基烷酸酯的方法，以月桂酸钠为唯一底物碳源，对原始污泥进行驯化，利用驯化稳定的活性污泥合成聚-3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx)。当以1.5g/L月桂酸钠为唯一碳源，均分三次投加，在连续曝气条件和缺氮缺磷下，污泥可累积PHBHHx的最高浓度为505.5mg/L。首次利用活性污泥混合微生物合成PHBHHx，经红外吸收光谱和热重分析，证实得到PHBHHx样品与纯菌合成的PHBHHx标准品有接近的化学结构和物理性质。
上述现有技术中，虽均采用了多种微生物混合培养合成PHA，但所采用的活性污泥中微生物复杂多样且微生物种类不明确，不利于PHA合成工艺的精确控制。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种双菌混合培养合成聚羟基脂肪酸酯的方法，主要是采用缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)R79和巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)R90共培养，提高PHA的产量。
本发明的技术方案如下：
缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)R79，于2022年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M2022946。
巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)R90，于2022年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2022947。
上述缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90中的一种或其组合在合成聚羟基脂肪酸酯中的应用。
根据本发明优选的，所述应用是取缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90中的一种或两种以乙酸钠为底物发酵生产聚羟基脂肪酸酯。
上述缺陷短波单胞菌R79合成聚羟基脂肪酸酯的方法，步骤如下：
(1)菌种活化：取缺陷短波单胞菌R79，在LB固体培养基中划线，28～30℃培养，得到活化菌种；
(2)种子液培养：将步骤(1)活化的缺陷短波单胞菌R79，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，28～30℃、180～200rpm培养至对数生长后期，得种子液；
(3)接种培养：将步骤(2)所得缺陷短波单胞菌R79的种子液离心去上清，收集菌体，将缺陷短波单胞菌R79接种至驯化培养液中，接种后驯化培养液中菌体的初始湿重为15～25g/L，28～30℃、180～200rpm培养5～10d。
根据本发明优选的，所述驯化培养液的组分为：CH3COONa 5g/L，(NH4)2SO40.16g/L，K2HPO4·3H2O 0.121g/L，KH2PO40.045g/L，NaCl16g/L，微量元素1mL/L，pH 7.0；
其中，所述微量元素的组成为：MnSO4·H2O 1.5g/L，H3BO3 1.0g/L，EDTA-2Na1.0g/L，CuSO4·5H2O 0.2g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，Na2SiO3·9H2O0.2g/L，NaMoO4·2H2O 0.05g/L，NiSO4·6H2O0.05 g/L。
根据本发明优选的，所述离心为5000rpm离心5～20min。
根据本发明优选的，在接种培养的过程中，每隔24h进行换液，将培养液离心，弃去一半体积上清，补加相同体积新鲜的驯化培养液，继续28～30℃、180～200rpm振荡培养。
上述巴利阿里假单胞菌R90合成聚羟基脂肪酸酯的方法，步骤如下：
(1)菌种活化：取巴利阿里假单胞菌R90，在LB固体培养基中划线，28～30℃培养，得到活化菌种；
(2)种子液培养：将步骤(1)活化的巴利阿里假单胞菌R90，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，28～30℃、180～200rpm培养至对数生长后期，得种子液；
(3)接种培养：将步骤(2)所得巴利阿里假单胞菌R90的种子液离心去上清，收集菌体，将巴利阿里假单胞菌R90接种至驯化培养液中，接种后驯化培养液中菌体的初始湿重为15～25g/L，28～30℃、180～200rpm培养5～10d。
根据本发明优选的，所述驯化培养液的组分为：CH3COONa 5g/L，(NH4)2SO40.16g/L，K2HPO4·3H2O 0.121g/L，KH2PO40.045g/L，NaCl16g/L，微量元素1mL/L，pH 7.0；
其中，所述微量元素的组成为：MnSO4·H2O 1.5g/L，H3BO3 1.0g/L，EDTA-2Na1.0g/L，CuSO4·5H2O 0.2g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，Na2SiO3·9H2O0.2g/L，NaMoO4·2H2O 0.05g/L，NiSO4·6H2O0.05 g/L。
根据本发明优选的，所述离心为5000rpm离心5～10min。
根据本发明优选的，在接种培养的过程中，每隔24h进行换液，将培养液离心，弃去一半体积上清，补加相同体积新鲜的驯化培养液，继续28～30℃、180～200rpm振荡培养。
上述缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90双菌混合培养合成聚羟基脂肪酸酯的方法，步骤如下：
(1)菌种活化：取缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90，在LB固体培养基中划线，28～30℃培养，得到活化菌种；
(2)种子液培养：将步骤(1)活化的缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，28～30℃、180～200rpm培养至对数生长后期，得种子液；
(3)接种培养：将步骤(2)所得缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90的种子液离心去上清，收集菌体，将缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90以湿重比1:(0.5～2)共同接种至驯化培养液中，接种后驯化培养液中菌体的初始湿重为15～25g/L，28～30℃、180～200rpm培养5～10d。
根据本发明优选的，所述驯化培养液的组分为：CH3COONa 5g/L，(NH4)2SO40.16g/L，K2HPO4·3H2O 0.121g/L，KH2PO40.045g/L，NaCl16g/L，微量元素1mL/L，pH 7.0；
其中，所述微量元素的组成为：MnSO4·H2O 1.5g/L，H3BO3 1.0g/L，EDTA-2Na1.0g/L，CuSO4·5H2O 0.2g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，Na2SiO3·9H2O0.2g/L，NaMoO4·2H2O 0.05g/L，NiSO4·6H2O0.05 g/L。
根据本发明优选的，所述离心为5000rpm离心5～10min。
根据本发明优选的，在接种培养的过程中，每隔24h进行换液，将培养液离心，弃去一半体积上清，补加相同体积新鲜的驯化培养液，继续28～30℃、180～200rpm振荡培养。
上述方法中，未详细说明的实验步骤均按照本领域常规操作进行。
有益效果：
本发明筛选出两株菌，分别为缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)R79和巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)R90。本发明以湿重比1:(0.5～2)将上述两株菌混合培养，在发酵过程中以乙酸钠为唯一碳源合成PHA，缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90之间协同增效，共同促进PHA产量的提高，与现有技术相比，提高了PHA的产量，降低了生产成本。
附图说明
图1为R79与R90混合培养(湿重比1:1)和单独培养的PHA产量图；
图2为R79与R90混合培养(湿重比2:1)和单独培养的PHA产量图；
图3为R79与R90混合培养(湿重比1:2)和单独培养的PHA产量图；
图4为Y6与L17混合培养(湿重比1:1)和单独培养的PHA产量图。
具体实施方式
以下为结合实施例对本发明进行进一步的说明。实施例中涉及的试剂与药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中的实验操作，若无特殊说明，均为本领域的常规操作。
实施例中所涉及的缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)R79、巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)R90、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)L17及滨州副球菌(Paracoccusbinzhouense)Y6均为本实验室筛选得到，其中缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)R79、巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)R90已保藏于中国典型培养物保藏中心。
缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)R79，于2022年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2022946。
巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)R90，于2022年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2022947。
实施例1
本发明所涉及菌株均由本实验室自山东省滨州市某环氧丙烷(PO)皂化废水处理厂的活性污泥中筛到，具体步骤如下：
(1)环氧丙烷(PO)皂化废水活性污泥的富集培养
取活性污泥10mL于500mL蓝盖试剂瓶中，加入250mL富集培养基，于37℃培养箱中静置培养，每天早晚各翻转一次，富集周期为7d；
(2)菌株的分离与筛选
取富集培养后的活性污泥样品0.1mL，加入0.9mL无菌水充分混合，制得10-1的污泥稀释液；依次用无菌水梯度稀释，得到10-5、10-6两个梯度的污泥稀释液，在LB固体平板进行涂布；挑取单菌落，连续三次传代培养获得纯培养物；
(3)菌株的鉴定
挑取单菌落，以“三区划线法”接种至LB固体平板，静置4～6天，观察记录单菌落的形态特征；挑取单菌落进行液体培养，取1mL菌液提取菌株基因组，以基因组为模板，对16SrRNA进行PCR扩增，并送至生物公司进行测序。通过测序所得结果运用EzBioCloud数据库进行Blast比对，并构建系统发育树，对其所属的属种进行定位。
上述所涉及的富集培养基的组分如下：
NH4Cl 1g/L，CH3COONa 2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，酵母粉0.2g/L，蛋白胨0.2g/L，EDTA-2Na 1g/L，丙酮酸钠1.1g/L，NaHCO3 10％(w/v)，KH2PO4 2％(w/v)。
经鉴定后，筛选到的菌株包括缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)R79、巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)R90、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)L17及滨州副球菌(Paracoccusbinzhouense)Y6。其中，缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)R79和巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)R90进行了专利菌种保藏。
实施例2
聚羟基脂肪酸酯(PHA)的合成方法，具体步骤如下：
(1)菌种活化
取缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90，在LB固体培养基中划线，在恒温培养箱中30℃恒温培养，活化菌种。
(2)制备实验所需双菌的种子液
挑取步骤(1)缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90平板上的单菌落，分别接入LB液体培养基中，放置于30℃培养箱中，180rpm振荡培养至对数生长期后期，得缺陷短波单胞菌R79种子液和巴利阿里假单胞菌R90种子液。
(3)接种培养
①缺陷短波单胞菌R79单独培养组：将缺陷短波单胞菌R79种子液置于无菌离心管中，5000rpm离心去上清，重复加入缺陷短波单胞菌R79种子液离心去上清；用5mL驯化培养液吹悬，接种至含有250mL驯化培养液的500mL锥形瓶中，使初始菌体湿重保持在25g/L左右，每组设置三个平行，放置于30℃培养箱中，180rpm振荡培养，总的培养时间为7d。
②巴利阿里假单胞菌R90单独培养组：将巴利阿里假单胞菌R90种子液置于无菌离心管中，5000rpm离心去上清，重复加入巴利阿里假单胞菌R90种子液离心去上清；用5mL驯化培养液吹悬，接种至含有250mL驯化培养液的500mL锥形瓶中，使初始菌体湿重保持在25g/L左右，每组设置三个平行，放置于30℃培养箱中，180rpm振荡培养，总的培养时间为7d。
③缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90混合培养组：将缺陷短波单胞菌R79种子液和巴利阿里假单胞菌R90种子液分别置于无菌离心管中，5000rpm离心去上清，分别重复加入相应的种子液离心去上清；分别用5mL驯化培养液吹悬，共同接种至含有250mL驯化培养液的500mL锥形瓶中，使两株菌的初始菌体湿重分别保持在12.5g/L左右，每组设置三个平行，放置于30℃培养箱中，180rpm振荡培养，总的培养时间为7d。
(4)换液
每隔24h进行换液，将培养液5000rpm离心5min，弃去一半体积上清，补加相同体积新鲜的驯化培养液，继续30℃、180rpm振荡培养。
上述所涉及的驯化培养液的组分如下：
CH3COONa 5g/L，(NH4)2SO40.16g/L，K2HPO4·3H2O 0.121g/L，KH2PO40.045g/L，NaCl16g/L，微量元素1mL/L，pH 7.0；
其中，微量元素的组成为：MnSO4·H2O 1.5g/L，H3BO3 1.0g/L，EDTA-2Na 1.0g/L，CuSO4·5H2O 0.2g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，Na2SiO3·9H2O 0.2g/L，NaMoO4·2H2O 0.05g/L，NiSO4·6H2O0.05 g/L。
取样检测PHA产量：
发酵结束后，取45mL菌液，收集菌体，用于检测PHA产量，检测方法如下：
1)将菌液5000rpm离心去上清，于-80℃冻存过夜后用真空冷冻干燥仪进行冷冻干燥。称重得到细胞干重(DCW)；
2)称取50mg冷冻干燥后的样品于酯化管中，加入2mL三氯甲烷、850μL甲醇和150μL浓硫酸，100℃油浴1h，冷却至室温，加1mL蒸馏水，混匀后静置分层，吸取下层氯仿层，经0.22μm有机系滤膜过滤，进行GC检测。
PHA产量的检测结果如图1所示，缺陷短波单胞菌R79单独培养组的PHA产量为56.84mg/L，巴利阿里假单胞菌R90单独培养组的PHA产量为11.03mg/L，缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90混合培养组的PHA产量为164.89mg/L，三个处理组在初始菌体湿重大致相同的条件下，混合培养组的PHA产量远高于单独培养组，说明缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90之间协同增效，促进PHA产量的提高。
实施例3
按照实施例2进行聚羟基脂肪酸酯(PHA)的合成，不同之处在于，缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90混合培养组中缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90以菌体湿重比2：1进行混合培养。
按照实施例2的方法检测PHA产量，PHA产量的检测结果如图2所示，缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90混合培养组的PHA产量为161.09mg/L，三个处理组在初始菌体湿重相同的条件下，混合培养组的PHA产量高于单独培养组，说明缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90以2：1的湿重比例混合同样可以起到协同增效的作用，促进PHA产量的提高。
实施例4
按照实施例2进行聚羟基脂肪酸酯(PHA)的合成，不同之处在于，缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90混合培养组中缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90以菌体湿重比1：2进行混合培养。
按照实施例2的方法检测PHA产量，PHA产量的检测结果如图3所示，缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90混合培养组的PHA产量为186.90mg/L，三个处理组在初始菌体湿重相同的条件下，混合培养组的PHA产量高于单独培养组，说明缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90以1：2的湿重比例混合同样可以起到协同增效的作用，促进PHA产量的提高。
对比例1
将滨州副球菌Y6和蜡样芽孢杆菌L17按照实施例2的方法进行菌种活化及种子液的培养，然后进行接种培养，设置以下三个培养组：
①滨州副球菌Y6单独培养组：将滨州副球菌Y6种子液置于无菌离心管中，5000rpm离心去上清，重复加入滨州副球菌Y6种子液离心去上清；用5mL驯化培养液吹悬，接种至含有150mL驯化培养液的500mL锥形瓶中，使初始菌体湿重保持在25g/L左右，每组设置三个平行，放置于30℃培养箱中，180rpm振荡培养，总的培养时间为7d。
②蜡样芽孢杆菌L17单独培养组：将蜡样芽孢杆菌L17种子液置于无菌离心管中，5000rpm离心去上清，重复加入蜡样芽孢杆菌L17种子液离心去上清；用5mL驯化培养液吹悬，接种至含有150mL驯化培养液的500mL锥形瓶中，使初始菌体湿重保持在25g/L左右，每组设置三个平行，放置于30℃培养箱中，180rpm振荡培养，总的培养时间为7d。
③滨州副球菌Y6和蜡样芽孢杆菌L17混合培养组：将滨州副球菌Y6种子液和蜡样芽孢杆菌L17种子液分别置于无菌离心管中，5000rpm离心去上清，分别重复加入相应的种子液离心去上清；分别用5mL驯化培养液吹悬，共同接种至含有150mL驯化培养液的500mL锥形瓶中，使两株菌的初始菌体湿重分别保持在12.5g/L左右，每组设置三个平行，放置于30℃培养箱中，180rpm振荡培养，总的培养时间为7d。
按照实施例2的方法检测PHA产量，PHA产量的检测结果如图4所示，蜡样芽孢杆菌L17单独培养组的PHA产量为0.62mg/L，滨州副球菌Y6单独培养组的PHA产量为9.72mg/L，滨州副球菌Y6和蜡样芽孢杆菌L17混合培养组的PHA产量为4.65mg/L，三个处理组在初始菌体湿重相同的条件下，混合培养组的PHA产量低于滨州副球菌Y6单独培养组，说明滨州副球菌Y6和蜡样芽孢杆菌L17的混合培养不利于PHA的合成。
经检测得知，当缺陷短波单胞菌R79与巴利阿里假单胞菌R90以1:(0.5～2)湿重比混合后，PHA的产量都比单独培养时的产量有明显上升，说明双菌混合培养可以提高PHA的产量；当滨州副球菌Y6与蜡样芽孢杆菌L17以1：1湿重比混合后，PHA的产量不仅没有上升反而有所降低，说明PHA的双菌合成具有菌株特异性，即缺陷短波单胞菌R79可以通过与巴利阿里假单胞菌R90的混合培养使得低产或不产PHA的菌株PHA产量提升，当混合培养菌株换成别的任意两株菌则不会出现PHA产量提升的现象。
Claims (9)
1.巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas balearica)R90，于2022年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2022947。
2.权利要求1所述的巴利阿里假单胞菌R90在合成聚羟基脂肪酸酯中的应用。
3.缺陷短波单胞菌R79和权利要求1所述的巴利阿里假单胞菌R90在合成聚羟基脂肪酸酯中的应用；
所述缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)R79，于2022年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2022946。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述应用是以乙酸钠为底物发酵生产聚羟基脂肪酸酯。
5.权利要求1所述的巴利阿里假单胞菌R90合成聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)菌种活化：取巴利阿里假单胞菌R90，在LB固体培养基中划线，28～30℃培养，得到活化菌种；
(2)种子液培养：将步骤(1)活化的巴利阿里假单胞菌R90，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，28～30℃、180～200rpm培养至对数生长后期，得种子液；
(3)接种培养：将步骤(2)所得巴利阿里假单胞菌R90的种子液离心去上清，收集菌体，将巴利阿里假单胞菌R90接种至驯化培养液中，接种后驯化培养液中菌体的初始湿重为15～25g/L，28～30℃、180～200rpm培养5～10d。
6.缺陷短波单胞菌R79和权利要求1所述的巴利阿里假单胞菌R90合成聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)菌种活化：取缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90，分别在LB固体培养基中划线，28～30℃培养，得到活化菌种；
所述缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta)R79，于2022年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2022946；
(2)种子液培养：将步骤(1)活化的缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90，挑取单菌落分别接种到LB液体培养基中，28～30℃、180～200rpm培养至对数生长后期，得缺陷短波单胞菌R79种子液和巴利阿里假单胞菌R90种子液；
(3)接种培养：将步骤(2)所得缺陷短波单胞菌R79种子液和巴利阿里假单胞菌R90种子液分别离心去上清，收集菌体，将缺陷短波单胞菌R79和巴利阿里假单胞菌R90以湿重比1:(0.5～2)共同接种至驯化培养液中，接种后驯化培养液中菌体的初始湿重为15～25g/L，28～30℃、180～200rpm培养5～10d。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述驯化培养液的组分为：CH3COONa 5g/L，(NH4)2SO4 0.16g/L，K2HPO4·3H2O 0.121g/L，KH2PO4 0.045g/L，NaCl 16g/L，微量元素1mL/L，pH 7.0；
其中，所述微量元素的组成为：MnSO4·H2O 1.5g/L，H3BO3 1.0g/L，EDTA-2Na 1.0g/L，CuSO4·5H2O 0.2g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，Na2SiO3·9H2O 0.2g/L，NaMoO4·2H2O 0.05g/L，NiSO4·6H2O 0.05g/L。
8.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述离心为5000rpm离心5～10min。
9.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，在接种培养的过程中，每隔24h进行换液，将培养液离心，弃去一半体积上清，补加相同体积新鲜的驯化培养液，继续28～30℃、180～200rpm振荡培养。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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