CN109136109B - 一种出芽短梗霉菌株及其应用 - Google Patents

一种出芽短梗霉菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种出芽短梗霉菌株及其应用，属于发酵工程与生物技术领域。该出芽短梗霉菌株的保藏名称为：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ZK‑502，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年08月20日，保藏编号：CGMCC No.16326。本发明提供的芽短梗霉菌株能高效地发酵产生liamocin，并且该出芽短梗霉菌株不产黑色素，发酵液为浅粉色至淡黄色，有利于简化后期处理工艺。本发明提供的方法简单易行，所用的原料成分简单，liamocin的产量可以达到8～10g/L，有望实现liamocin的商业化、大规模生产；所得的liamocin产品，溶于水，在医药、化妆品、食品中具有广泛应用前景。

Description

一种出芽短梗霉菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种出芽短梗霉菌株及其应用，属于发酵工程与生物技术领域。
背景技术
liamocin是出芽短梗霉的新型活性产物之一，由于其密度比水重，静止时会沉淀在底部，故又称为重油(heavy oil)。liamocin目前泛指出芽短梗霉产生的一类比水重的多元醇酯类的化合物，该多元醇酯头部基团多为甘露醇或阿拉伯醇，尾部为3,5-二羟基癸酸的三联体或四联体。
liamocin具有椰子香气，密度比水大，油的颜色由淡黄色到孔雀石色颜色不等，且大部分的油具有荧光性，微溶于水，易溶于有机溶剂。现已证明该多元醇酯具有抑制哺乳动物癌细胞增增殖、抑菌、表面活性剂等多种生物活性，具有广泛的应用前景。
尽管早在20世纪90年代就有学者发现了liamocin。但liamocin的生物合成途径十分复杂，liamocin的生物合成机理尚未研究清楚。以Kurosawa T及Price NPJ为代表的学者对liamocin结构，性能和应用做了较深入的研究，但liamocin的发酵方面的研究较少，目前现有技术中liamocin的产量普遍不高。
本申请的发明人从浙江省杭州市小和山地区植物花蕊表面筛选获得一株高产liamocin的出芽短梗霉菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一株高产liamocin的出芽短梗霉菌株。
本发明的另一个目的在于提供该出芽短梗霉菌株在发酵生产liamocin中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
一种出芽短梗霉菌株，所述出芽短梗霉菌株的保藏名称为：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ZK-502，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年08月20日，保藏编号：CGMCC No.16326。
本发明出芽短梗霉菌株的菌落形态特征：在PDA培养基培养，菌落最初乳白色，后变为淡粉色，菌落质地粘稠湿润，菌落边缘呈菌丝状。主要为酵母样形态，细胞椭圆形，大小均匀，可产生芽生孢子、厚壁孢子、肿胀孢子和菌丝。
所述出芽短梗霉菌株在发酵生产liamocin中的应用，具体步骤如下：
S1、菌种活化：将斜面菌种转接至PDA斜面培养基中，于25～28℃恒温培养箱培养2～3d；
S2、种子培养：选取步骤S1中培养良好的斜面菌种，挑取2～3环接种于种子培养基中，于摇床25～28℃，150～200r/min培养2～3d；
S3、发酵培养：分为两个阶段
(1)将步骤S2中培养好的种子液以6～10％的比例接种至发酵培养基(一)中，于摇床25～28℃，150～200r/min培养2～3d；
(2)将步骤(1)中培养结束的培养液在无菌条件下7000～8000r/min离心5～10min，收取细胞转移至发酵培养基(二)中，于摇床25～28℃，150～200r/min继续培养5～7d；
S4、liamocin的提取：在经步骤S3中步骤(2)发酵后的发酵液中加入适量有机溶剂，对发酵产生的liamocin进行萃取，然后旋转蒸发有机溶剂、干燥除去水分，获得liamocin。
作为优选，所述步骤S2中种子培养基的组成为：5％葡萄糖、0.2％酵母提取物、0.5％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O和0.1％NaCl。
作为优选，所述步骤S3中发酵培养基(一)的组成为：5～7％碳源、0.1～0.2％有机氮源、0.5％K2HPO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O、0.1％NaCl和0.1～0.2％吐温80。
作为优选，所述步骤S3中发酵培养基(二)的组成为：5～7％碳源、0.1～0.2无机氮源、0.5％K2HPO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O、0.1％NaCl和0.1～0.2％吐温80。
作为优选，所述碳源为葡萄糖、木糖、蔗糖或麦芽糖。
作为优选，所述有机氮源为酵母提取物或蛋白胨等。
作为优选，所述无机氮源为NH4NO3或NH4(SO4)2等。
作为优选，所述步骤S5中有机溶剂为：乙酸乙酯或甲基乙基酮。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明的出芽短梗霉菌株(编号为CGMCC No.16132)，能高效地发酵产生liamocin。
(2)本发明的出芽短梗霉菌株不产黑色素，发酵液为浅粉色至淡黄色，有利于简化后期处理工艺。
(3)本发明提供的方法简单易行，所用的原料成分简单，liamocin的产量可以达到8～10g/L，有望实现liamocin的商业化、大规模生产。
(4)本发明所得的liamocin产品，提取方法简单，产品溶于水，在医药、化妆品、食品中具有广泛应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
1、菌株的分离筛选
步骤1：选取植物的花蕊将其用剪刀剪碎，取适量放入装有5ml富集培养基的小试管中，于摇床28℃、180r/min培养2～4d。
所述富集培养基的组成为：10％甘露醇、0.1％NaNO3、0.05％KH2PO4、0.02％MgSO4·7H2O、0.2％柠檬酸和0.02％司班80。
步骤2：取富集培养中培养液变浑浊的样品100μL均匀涂布于PDA平板培养基表面，于恒温培养箱中28℃培养3～4d，筛选出与出芽短梗霉菌落相似的单菌落，然后将该菌落用平板划线法进行分离，直至获得菌落形态一致的单菌落。提取单菌落接种于PDA斜面培养基上进行保存。
所述PDA平板/斜面培养基的组成：20％马铃薯(去皮)，2％葡萄糖和1.5～2％琼脂。
步骤3：选取上述新鲜斜面菌株接种到发酵培养基中进行发酵培养，筛选出liamocin的高产菌株。
所述发酵培养基的组成：5％葡萄糖、0.06％蛋白胨、0.04％酵母提取物、0.5％K2HPO4、0.04％MgSO4·7H2O和0.1％NaCl。
经上述分离路线从植物花蕊中得到一株编号为ZK-502菌株，证明该菌株具有发酵高产liamocin的性能。通过将本发明菌株的ITS序列和其他真菌的对比，结果证实本发明的菌株为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ZK-502。
2、菌株的鉴定
菌落形态特征为：PDA培养基培养，菌落最初乳白色，后变为淡粉色。菌落质地粘稠湿润，菌落边缘呈菌丝状。菌体主要为酵母样形态，细胞椭圆形，大小均匀，可产生芽生孢子、厚壁孢子、肿胀孢子和菌丝。
3、本发明的出芽短梗霉菌株用于发酵产liamocin的方法
以下实施例中的种子培养基为：装液量为250mL或300mL三角瓶中50mL种子培养基。
发酵培养基为：装液量为250mL或300mL三角瓶中50mL发酵培养基。
实施例1
本发明的出芽短梗霉菌株用于发酵产生liamocin的方法如下：
S1、菌种活化：将斜面菌转接于PDA斜面培养基中，于26℃恒温培养箱培养2d；
S2、种子培养：选取培养良好的斜面菌种挑取3环接种于50mL的种子培养基中，于摇床26℃，160r/min培养2d；
其中，种子培养基的组成为：5％葡萄糖、0.2％酵母提取物、0.5％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O和0.1％NaCl。
S3、发酵培养：分为两个阶段
(1)将步骤S2中培养好的种子液以6％的比例接种至发酵培养基(一)中，于摇床26℃，160r/min培养3d；
其中，发酵培养基(一)的组成为：5％葡萄糖、0.2％酵母提取物、0.5％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O、0.1％NaCl和0.1％吐温80。
(2)将步骤(1)中培养结束的培养液在无菌条件下8000r/min离心10min，收取细胞转移至发酵培养基(二)中，于摇床26℃，180r/min继续培养7d；
其中，发酵培养基(二)的组成为：5％葡萄糖、0.2％NH4NO3、0.5％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O、0.1％NaCl和0.1％吐温80。
S4、liamocin的提取：取等体积的甲基乙基酮加入到将上述步骤S3发酵后的发酵液中，使发酵液中所产的liamocin油滴充分溶于有机溶剂中，倒入分液漏斗中分离，然后用旋转蒸发器蒸发掉有机溶剂，气流干燥除去水分，得到liamocin。经测定，liamocin产量达到9.06g/L。
实施例2
本发明的出芽短梗霉菌株用于发酵产生liamocin的方法如下：
S1、菌种活化：将斜面菌转接于PDA斜面培养基中，于28℃恒温培养箱培养2.5d；
S2、种子培养：选取步骤S1中培养良好的斜面菌种，挑取2环接种于50mL种子培养基中，于摇床26℃，160r/min培养2d；
其中，种子培养基的组成为：5％葡萄糖、0.2％酵母提取物、0.5％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O和0.1％NaCl。
S3、发酵培养：分为两个阶段：
(1)将步骤S2中培养好的种子液以10％的比例接种至发酵培养基(一)中，于摇床28℃，200r/min培养3d；
其中，发酵培养基(一)的组成为：5％木糖、0.2％酵母提取物、0.5％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O、0.1％NaCl和0.1％吐温80。
(2)将步骤(1)中培养结束的培养液在无菌条件下7000r/min离心10min，收取细胞转移至发酵培养基(二)中，于摇床28℃，200r/min继续培养7d；
其中，发酵培养基(二)的组成为：5％木糖、0.2％NH4NO3、0.5％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O、0.1％NaCl和0.1％吐温80。
S4、liamocin的提取：取等体积的乙酸乙酯加入到将上述步骤S3发酵后的发酵液中，使发酵液中所产的liamocin油滴充分溶于有机溶剂中，倒入分液漏斗分离，然后用旋转蒸发器蒸发掉有机溶剂，气流干燥除去水分，得到liamocin。经测定，liamocin产量达到8.54g/L。
实施例3
本发明的出芽短梗霉菌株用于发酵产生liamocin的方法如下：
S1、菌种活化：将斜面菌转接于PDA斜面培养基中，于26℃恒温培养箱培养2d；
S2、种子培养：选取步骤S1中培养良好的斜面菌种，挑取3环接种于种子培养基中，于摇床28℃，200r/min培养2d；
其中，种子培养基的组成为：5％葡萄糖、0.2％酵母提取物、0.5％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O和0.1％NaCl。
S3、发酵培养：分为两个阶段
(1)将步骤S2中培养好的种子液以8％的比例接种至发酵培养基(一)中，于摇床28℃，180r/min培养3d；
其中，发酵培养基(一)的组成为：7％麦芽糖、0.2％蛋白胨、0.5％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O、0.1％NaCl和0.1％吐温80。
(2)将步骤(1)中培养结束的培养液在无菌条件下8000r/min离心10min，收取细胞转移至发酵培养基(二)中，于摇床28℃，150r/min继续培养7d；
其中，发酵培养基(二)的组成为：7％麦芽糖、0.2％NH4(SO4)2、0.5％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O、0.1％NaCl和0.1％吐温80。
S4、liamocin的提取：取等体积的甲基乙基酮加入到将上述步骤S3发酵后的发酵液中，使发酵液中所产的liamocin油滴充分溶于有机溶剂中，倒入分液漏斗分离，然后用旋转蒸发器蒸发掉有机溶剂，气流干燥除去水分，得到liamocin。经测定，Liamocin产量达到8.38g/L。
实施例4
本发明的出芽短梗霉菌株用于发酵产生liamocin的方法如下：
S1、菌种活化：将斜面菌种转接至PDA斜面培养基中，于26℃恒温培养箱培养2d；
S2、种子培养：选取步骤S1中培养良好的斜面菌种，挑取3环接种于种子培养基中，于摇床28℃，200r/min培养2d；
其中，种子培养基的组成为：5％葡萄糖、0.2％酵母提取物、0.5％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O和0.1％NaCl。
S3、发酵培养：分为两个阶段
(1)将步骤S2中培养好的种子液以9％的比例接种至发酵培养基(一)中，于摇床26℃，160r/min培养3d；
其中，发酵培养基(一)的组成为：6％蔗糖、0.2％酵母提取物、0.5％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O、0.1％NaCl和0.2％吐温80。
(2)将步骤(1)中培养结束的培养液在无菌条件下7000r/min离心10min，收取细胞体转移至发酵培养基(二)中，于摇床26℃，200r/min继续培养7d；
其中，发酵培养基(二)的组成为：6％蔗糖、0.2％NH4NO3、0.5％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O、0.1％NaCl和0.2％吐温80。
S5、liamocin的提取：取等体积的乙酸乙酯加入到将上述步骤S3发酵后的发酵液中，使发酵液中所产的liamocin油滴充分溶于有机溶剂中，倒入分液漏斗分离，然后用旋转蒸发器蒸发掉有机溶剂，气流干燥除去水分，得到liamocin。经测定，liamocin产量达到8.47g/L。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (7)

1.一种出芽短梗霉菌株，其特征在于，所述出芽短梗霉菌株的保藏名称为：出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ZK-502，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2018年08月20日，保藏编号：CGMCC No.16326。
2.一种权利要求1所述出芽短梗霉菌株的应用，其特征在于，所述出芽短梗霉菌株在发酵生产liamocin中的应用。
3.根据权利要求2所述出芽短梗霉菌株的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、菌种活化：将斜面菌种转接至PDA斜面培养基中，于25～28℃恒温培养箱培养2～3d；
S2、种子培养：选取步骤S1中培养良好的斜面菌种，挑取2～3环接种于种子培养基中，于摇床25～28℃，150～200r/min培养2～3d；
S3、发酵培养：分为两个阶段：
(1)将步骤S2中培养好的种子液以6～10％的比例接种至发酵培养基(一)中，于摇床25～28℃，150～200r/min培养2～3d；
(2)将步骤(1)中培养结束后的培养液在无菌条件下7000～8000r/min离心5～10min，收取细胞转移至发酵培养基(二)中，于摇床25～28℃，150～200r/min继续培养5～7d；
S4、liamocin的提取：在经步骤S3中步骤(2)发酵后的发酵液中加入适量有机溶剂，对发酵产生的liamocin进行萃取，然后旋转蒸发有机溶剂、干燥除去水分，获得liamocin；
其中，所述步骤S2中种子培养基的组成为：5％葡萄糖、0.2％酵母提取物、0.5％KH2PO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O和0.1％NaCl；
所述步骤S3中发酵培养基(一)的组成为：5～7％碳源、0.1～0.2％有机氮源、0.5％K2HPO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O、0.1％NaCl和0.1～0.2％吐温80；
所述步骤S3中发酵培养基(二)的组成为：5～7％碳源、0.1～0.2％无机氮源、0.5％K2HPO4、0.04％MgSO4·7H2O、0.04％MnSO4·H2O、0.1％NaCl和0.1～0.2％吐温80。
4.根据权利要求3所述出芽短梗霉菌株的应用，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、木糖、蔗糖或麦芽糖。
5.根据权利要求3所述出芽短梗霉菌株的应用，其特征在于，所述有机氮源为酵母提取物或蛋白胨。
6.根据权利要求3所述出芽短梗霉菌株的应用，其特征在于，所述无机氮源为NH4NO3或NH4(SO4)2。
7.根据权利要求3所述出芽短梗霉菌株的应用，其特征在于，所述步骤S4中有机溶剂为：乙酸乙酯或甲基乙基酮。
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