CN106434394A - 出芽短梗霉alb1基因敲除突变株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，是将出芽短梗霉菌株中的alb1基因的全部或部分编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因盒。所述潮霉素B抗性基因盒包含：出芽短梗霉转录延长因子启动子PTEF和潮霉素B抗性基因HygR；所述出芽短梗霉转录延长因子启动子PTEF的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；所述潮霉素B抗性基因序列hyg^R序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。将本发明所述突变株用于微生物多糖发酵生产，该突变株不产生黑色素，可显著提高纯化过程中多糖收率和多糖品质。

Description

出芽短梗霉alb1基因敲除突变株及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及出芽短梗霉alb1基因敲除突变株及其应用。

背景技术

出芽短梗霉(Aureobacidium pullulans)是一类类酵母真菌，具有酵母状和真菌菌丝体两种形态，因其产生大量黑色素，又被称为黑酵母。出芽短梗霉发酵能产生胞外多糖、酶、抗菌素、单细胞蛋白等多种产物，尤其是所产生的普鲁兰多糖具有极佳的成膜性、阻氧性、可塑性、稳定性、粘结性和易自然降解等许多独特的理学和生物学特性，无毒无害，对人体无任何副作用，可广泛地应用于医药、食品、化妆品、烟草、采油等众多领域，是一种有极大开发价值和前景的多功能新型生物制品。由于出芽短梗霉发酵过程中合成大量黑色素，一半以上的黑色素会分泌到发酵液中，与胞外多糖紧密结合，给多糖的纯化和精制带来极大困难，不但降低多糖收率，而且严重影响产品品质。因此，获得不产黑色素的出芽短梗霉菌株是普鲁兰多糖工业化生产的必然需求。

构建出芽短梗霉无色素菌株的方法有物理诱变、化学诱变、基因工程构建等。诱变的方法具有简单、快捷、高效的特点，但诱变是一个随机的过程，缺乏方向性，而且诱变菌株传代稳定性差，在发酵过程中极易产生回复突变。基因工程构建菌株具有可操控的方向性，而且基因敲除获得的菌株性状非常稳定，基本不会发生回复突变，在工业微生物改造中得到了大量应用。目前，国内外研究机构普遍采取诱变的方法进行菌株构建，但基因工程构建出芽短梗霉无色素菌株尚未见报道。

出芽短梗霉黑色素属于二羟萘(DHN)黑色素，但出芽短梗霉黑色素体内合成途径及相关基因尚未有报道。因此，如何通过基因工程的方法构建出芽短梗霉无色素菌株是目前的技术难点所在。出芽短梗霉无色素菌株的构建研究对于出芽短梗霉的工业化应用具有重要的意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的一个目的是提供一株出芽短梗霉alb1基因敲除突变株。

本发明提供的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，是将出芽短梗霉菌株中的alb1基因的全部或部分编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因盒。

优选的，是将alb1基因从第1位至1911位之间的编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因盒。

优选的，所述出芽短梗霉菌株为菌株As3.3984，购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为3.3984。

上述As3.3984菌株中的alb1基因的全部编码基因序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

所述潮霉素B抗性基因盒包含：出芽短梗霉转录延长因子启动子P_TEF和潮霉素B抗性基因HygR。

所述出芽短梗霉转录延长因子启动子PTEF的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

所述潮霉素B抗性基因序列hyg^R序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

所述潮霉素B抗性基因HygR来源于大肠杆菌，将启动子替换为出芽短梗酶来源的高效启动子P_TEF，目的是使该基因能在出芽短梗酶中正常表达。

本发明的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，命名为出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans)Mut，已于2016年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCC NO.12509。

为方便说明，在本发明的后续表述中将“出芽短梗霉(Aureobacidium pullulans)Mut”记为“As3.3984Δalb1”。

本发明的另一目的是提供一种构建上述出芽短梗霉alb1基因敲除突变株的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

(1)合成含alb1左同源臂-潮霉素B抗性基因盒-alb1右同源臂的重组片段，重组片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)将步骤(1)的重组片段连接到pUC18质粒上的EcoRI位点，得到alb1基因敲除质粒；

(3)将alb1基因敲除质粒转化到出芽短梗霉感受态细胞中，通过潮霉素B抗性筛选得到抗性菌株；对抗性菌株进行鉴定，筛选得到敲除alb1基因的突变株。

步骤(1)中，所述重组片段采用全基因合成的方法进行合成。

步骤(3)中，利用电转化的方法将alb1基因敲除质粒转化到出芽短梗霉感受态细胞中。

步骤(3)中，敲除alb1基因的突变株的筛选方法为：根据SEQ ID NO.4序列合成可以扩增潮霉素B抗性基因的引物hyg-1和hyg-2，如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；根据出芽短梗霉As3.3984基因组中alb1左同源臂左侧序列设计引物out-1，如SEQ ID NO.7所示，根据alb1右同源臂右侧序列的反向互补序列设计引物out-2，如SEQ ID NO.8所示。用hyg-1/hyg-2和out1-1/out-2两对引物通过PCR的方法对抗性菌株进行鉴定。

上述出芽短梗霉alb1基因敲除突变株在制备微生物多糖中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第三个目的是提供一种制备微生物多糖的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：在多糖发酵培养基中发酵培养上述的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，发酵液离心，收集上清液，向上清液中加入工业乙醇沉淀多糖，离心，收集沉淀，干燥，纯化，即得微生物多糖。

所述多糖发酵培养基的组成为：蔗糖100.0g/L，酵母膏2.0g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO₄.7H₂O 0.2g/L，K₂HPO₄ 5.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.6g/L，pH6.5，115℃灭菌30分钟。

发酵培养的条件为：28℃震荡培养72小时。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次利用基因敲除技术对出芽短梗霉的alb1基因编码区进行了部分敲除，经基因敲除后，细胞不能合成黑色素。传统的出芽短梗霉发酵过程中黑色素会分泌到发酵液中并与胞外多糖紧密结合，给多糖的纯化和精制带来困难，采用本发明的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株进行多糖的生产，发酵过程中无黑色素的产生，能明显提高多糖的纯化收率和产品品质。

经试验证明，采用本发明的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株进行多糖的生产，与原始菌相比，多糖的纯化收率和纯化后多糖产量能分别提高18.0％和21.4％以上。

(2)本发明构建的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，为出芽短梗霉的工业化应用打下了良好的基础。

附图说明

图1：本发明所述出芽短梗霉alb1基因敲除突变株PCR鉴定电泳图；

其中，M.DNA ladder；1.以As3.3984基因组为模板，以hyg-1/hyg-2为引物对的PCR产物；2.以As3.3984Δalb1基因组为模板，以hyg-1/hyg-2为引物对的PCR产物；3.以As3.3984基因组为模板，以out-1/out-2为引物对的PCR产物；4.以As3.3984Δalb1基因组为模板，以out-1/out-2为引物对的PCR产物；

图2：本发明所述出芽短梗霉原始菌As3.3984和突变株As3.3984Δalb1发酵液及发酵生产的微生物多糖。图中：A.As3.3984发酵液；B.As3.3984Δalb1发酵液；C.As3.3984发酵生产的多糖；D.As3.3984Δalb1发酵生产的多糖。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法。

实施例1：出芽短梗霉alb1基因敲除突变株的构建

(1)基因敲除片段合成

采用全基因合成方法合成含alb1左同源臂-潮霉素B抗性基因盒-alb1右同源臂的重组片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该重组片段连接到pUC18质粒上的EcoRI位点，构建得到alb1基因敲除质粒。

上述重组片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(2)出芽短梗霉As3.3984电转化感受态制备

挑取As3.3984(购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为3.3984)单菌落接种至3mL YPD液体培养基，28℃震荡培养48小时；转接100μL培养物至50mL YPD液体培养基，28℃培养至OD₆₀₀为1.0～1.2左右；4℃离心收集菌体，用1mol/L山梨醇溶液细菌2次，最后用3mL 1mol/L山梨醇重悬菌体，分装100μL/管，保存于-80℃备用。

上述YPD培养液成分：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，自然pH，115℃灭菌30分钟。其中葡萄糖单独配制灭菌，115℃灭菌30分钟，取出后与其他成分混合。

(3)alb1基因敲除质粒电转化

取上述步骤(1)中的alb1基因敲除质粒0.1～1μg与上述步骤(2)中制备的As3.3984感受态细胞100μL混合，加入电转杯后冰浴10分钟，在1.0～2.5kV电压、3～5ms脉冲时间条件下电击1～10次。加入1mL含1mol/L山梨醇的YPD液体培养基，28℃，100rpm震荡培养3～4小时后涂布于含有400μg/mL潮霉素B的YPD平板上。28℃培养72小时，挑取单菌落进行鉴定。

(4)突变株筛选和验证

根据SEQ ID NO.4序列设计可以扩增潮霉素B抗性基因的引物hyg-1和hyg-2。引物序列如下：

hyg-1:5’-ATGAAAAAGCCTGAACTCAC-3’(SEQ ID NO.5)；

hyg-2:5’-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3’(SEQ ID NO.6)；

根据出芽短梗霉As3.3984基因组中alb1左同源臂左侧序列设计引物out-1，根据alb1右同源臂右侧序列的反向互补序列设计引物out-2，引物序列如下：

out-1:5’-AAGGTGGTCATCGTAGCCTC-3’(SEQ ID NO.7)；

out-2:5’-TGGCAGAGATGACACCAGCA-3’(SEQ ID NO.8)；

用真菌基因组提取试剂盒提取原始菌As3.3984和步骤(3)中得到的潮霉素B抗性菌落的基因组，提取步骤参照OMEGA公司的真菌基因组提取试剂盒说明书。

以上述基因组为模板，分别用hyg-1/hyg-2和out-1/out-2两对引物进行PCR扩增。若突变株发生同源重组双交换，潮霉素B抗性基因盒Hyg^R将替换基因组中alb1基因第1位到第1911位的编码序列。相应的，用hyg-1/hyg-2引物将能够扩增到1026bp的片段，而原始菌结果为阴性。用out-1/out-2引物将能够扩增到2450bp的片段，而原始菌得到的片段为2784bp。筛选PCR产物大小与理论值相符的突变株，经DNA测序验证后，将该菌株命名为As3.3984Δalb1，DNA电泳结果如图1所示。

该菌株命名为As3.3984Δalb1，于2016年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCC NO.12509。

实施例2：微生物多糖发酵和纯化实验

1.微生物多糖的发酵和纯化：

(1)菌株发酵：分别将出芽短梗霉原始菌As3.3984和实施例1中获得的出芽短梗霉突变株As3.3984Δalb1接种于多糖发酵培养基中，28℃震荡培养72小时。

上述多糖发酵培养基成分：蔗糖100.0g/L，酵母膏2.0g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO₄.7H₂O0.2g/L，K₂HPO₄ 5.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.6g/L，pH6.5，115℃灭菌30分钟。

(2)沉淀粗多糖：

发酵液8000rpm离心10分钟收集上清液；上清液中加入3倍体积工业乙醇沉淀多糖，3000rpm离心5分钟收集沉淀，50℃烘干获得粗多糖。

(3)多糖纯化：

将粗多糖溶于水，使浓度为5％～10％，粗多糖溶液中加入0.5％～2％活性炭粉末，混匀，50℃保温0.5小时；抽滤除掉活性炭颗粒，收集滤液；滤液中加入3倍体积工业乙醇沉淀多糖，3000rpm离心5分钟收集沉淀，50℃烘干获得多糖。

2.结果分析：

如图2所示，出芽短梗霉原始菌As3.3984在发酵过程中产生大量黑色素，发酵液呈黑色；而突变株As3.3984Δalb1由于敲除了黑色素合成中的关键酶基因alb1，在发酵过程中不产生黑色素，发酵液呈黄色。

对出芽短梗霉原始菌As3.3984和突变株As3.3984Δalb1进行发酵液颜色、多糖颜色、粗多糖产量、多糖产量、多糖收率等比较，结果见表1。

由表1可以看出，突变株和原始菌发酵液多糖含量相近，但突变株多糖在纯化过程中的收率和纯化后多糖产量明显高于原始菌，多糖的收率和产量分别提高了18.0％和21.4％。

表1出芽短梗霉原始菌和突变株在多糖生产中的比较

菌株	原始菌As3.3984	突变株As3.3984Δalb1
			发酵液颜色	黑色	黄色
多糖颜色	棕黑色	白色
			发酵液多糖含量(g/L)	32.04	31.56
多糖产量(g/L)	24.80	30.11
			收率(％)	77.4	95.4

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明批露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省药学科学院;山东福瑞达医药集团公司

<120> 出芽短梗霉alb1基因敲除突变株及其应用

<130> 2016

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6489

<212> DNA

<213> Aureobasidium pullulans As3.3984

<400> 1

atgtctaacg ttcttctttt cggcgaccag accgccgagc agtaccctct gctccgcaag 60

gtggtcctga gaactaagaa tgctctcgtt ctcaacttcc tggagcgcac cgtcgtcgct 120

ctgcgaggag aaattgccca actctctcgc cctcagcgcg atgccattcc ggatttcatg 180

accctcaaca acttggtcga tctctactac gagaagggat tgaagcttcc tcaccttgag 240

agtgccctgg tcactatcgc ccagcttggc cactacatcg gatacttctc cgagaagact 300

aacgagcttc ctcctgctgc caacactcgc attcttgctc tctgcactgg atcactcgcc 360

gctgccgctg tcgcttccgc cagaactctt gatgagctcg tcactcttgg tgtcgagacc 420

gtccgcatcg ccttccgcac tggtgtccgc gtcaatgaag ccagaactgc tttgggccag 480

gacctcatgt ccagggagag ctggtctact attgtcactg gcattaacga gcagtccgcc 540

aaggaggctc tcaacgcttt ccacgagtct gctggcattc ccactaccag ccacgcttac 600

atcagcgctg ttagcaccat ggccatcact atcagtggtc ctcccaccat cactaagcgc 660

ttcttcgagg agtctgaggc tgttcgcaag aacaaccgtg ttaagatccc cgtttacgct 720

ccttaccacg ccgagcacct ctacagcagt gccgatatcg agaccgtcat tggcgaggag 780

tctgctaagc tcctccaggc ttaccagcct cgttcgttgg tccactccgg ctcatctggc 840

atgtgccaca ttgccgagaa caccttcgag ctgttcaagt tgtccctgaa cgacatgctc 900

agatcccctg ttggctggaa caacctcctc gaggagagtg tttcgcagat caccgccaac 960

accaacgctc ctgctaaggt cttctgcatt ggtgtcagca acgtatccaa cagcctcgtc 1020

tcggccatca aagctggtgg ccaggcctcg gtctccctcg ttgaccactc tgcctgggag 1080

tctgccgtca ctgatgccag ccacggtcgc acccagaacg acaagattgc catcgttggt 1140

atgtctggtc gtttccccag cgctgccagc accgaggctc tttgggaact tctcgagaag 1200

ggtctcgatg tccaccgcaa gattccctct gaccgtttcg atgccgacgc tcactgcgac 1260

ccctctggca agggcaagaa caagtcgcac actccttacg gttgctttat cgacgagcct 1320

ggtcttttcg accctcgctt cttcaacatg tctcctcgtg aggctgcaca gactgatcct 1380

atgggtcgtc tggctctcgt caccgcttac gaggctcttg agcaatctgg ttacgtcccc 1440

aaccgtactc cctccaccaa gcttcaccgc atcggtacct tctacggtca gacctctgac 1500

gattggcgtg agatcaacgc ttccgagaat gttgacacct acttcatcac tggtggtgtg 1560

cgtgctttcg cacctggtcg catcaactac tacttcaagt tcagtggtcc ttcgttctcg 1620

atcgatactg cttgttcgtc atctttggct gctattcagc ttgcctgcac ttcgctgtgg 1680

gccggtgact gcgacactgc ctgtgctggt ggtctgaacg tccttaccaa ccctgacatt 1740

ttctctggtc tttccaaggg tcaattcttg tccaagacag gttcttgcaa gacttacgac 1800

aacgctgccg atggttactg ccgtggtgat ggttgtggta ccgttgtcct caagagatac 1860

gaggatgcgc ttgccgacaa ggacaacatc ctcggatgca ttcttggcgc tgctaccaac 1920

cactctgctg aggctgtttc tattactcac cctcacgctg gcgctcagga gttcctttac 1980

aagaaggtcc tcgccaacgc tggtgtcgat gcccatgaga ttagctacgt cgagatgcac 2040

ggtactggta cccaggctgg tgatggtatt gagatgacct cagtcaccaa cgtcttcgct 2100

ccccgtcacc gccagcgcaa gcctgaggag aagctccacc ttggtgccat caaggccaac 2160

atcggccacg gtgaagccgc ttctggtatc aactccctct gcaaggtctt gatgatgatg 2220

aagaagaacg ccattcctgc caacgttggt atcaagggcg agatcaacaa gactttcccc 2280

aaggacttga aggaccgcaa tgtccacatt cctcagcagc agatcgactt cccccgcaac 2340

ggtgctgaga agcgcaagat cttcctcaac aacttctccg ctgctggtgg taacaccgcc 2400

atcctcctcg aggatggtcc tcttcgtgag gctcctaagg ctgttgaccc tagaggcact 2460

cttcccgtca ctgtaactgc ccgttcgatc gctgccttga agaacaacat tcagcgtctg 2520

cagggatacc tccgcgagaa ccccgagacc actcttccca gcttgtccta cacttcgact 2580

gcccgccgca tccagcacaa ctaccgcatc gccttcccca ttgctgatat tgccaaggtc 2640

agcgatgctc tgcaggccca aactaaggac acctacagcc cagtccccat ggtttctacc 2700

aagaccgcct tctgcttcac cggacagggc tcacagtaca ctgctcttgg tcagaagctc 2760

taccaagacc tcaagtcttt ccgtgacgac atcaaccagc tcgacaacat ggccaccatt 2820

cagggccttc cttcgttcat tgagctgctt gacggcactg atgtcgctac tctttcccct 2880

gtcaaggttc agctgggtat ggcttgtatt caggttgctc tcgctcgcat gtgggcttca 2940

tggggtatca ctcctaccgc tgtcattggc cacaacttgg gcgagtacgc tgctctccac 3000

gttgctggtg tcatctctgc cagcgacatg atcaccctcg ttggtcgtcg tgctgagctc 3060

cttgtcaagg actgcactcc tcacacccac ggtatgctcg ctgtcaaggg tggcgctgaa 3120

gccatccgtg acgtcctcgg ctccaagatg accgagattg cctgcatcaa cggtcctgag 3180

gagactgtac tttgcggtag tggcgaggtt gttagtgctg ccaacgagac tctttccgct 3240

cgcggcttca aggccaccaa gctcaatgtt cccttcgcct tccactcggc ccaggtcgac 3300

cctatcctcg agtccttcaa gaaggttgct tcctgcgtca ccttcaacaa gcccgctgtc 3360

cctgtcctct ctcccctttc cggagatgtc attcgcgagg ctggtgttat tggcccagac 3420

tacctcgcta gacacgccag agagactgtc aacttctgga ccgctctgac cactggtcag 3480

aaggagaaga tcttcgatga gaagactgct tggctcgagg ttggcgctca ccccgtctgc 3540

tctggcatgg tcaaggcttc tgtcggtgcc accgtcaccg ctccttcgct ccgtcgcaac 3600

gaggacccct ggaagactat cgccaccagt gtttgcgccc tcttcaacgc tggtgtccag 3660

atcaacttcg atgagtacca ccgtgaattc aatgctgctc aggaacttct tcctctgccc 3720

acctactctt tcgacaacaa gaagtactgg ctcgactacc agaacaactg gactcttacc 3780

aaaggtgagg cccgcgaggt ccagaagact attgaggccg cccctcaagc tgcccctgtc 3840

gtcgagaagc ccgctaagcg cctctccact tcctgtcaga aggttatcca cgaggagttc 3900

gaggccaact ctggtaccgt tgtcattcag tccaacgttg ccgagcccaa gctcttccag 3960

gctgtcattg gtcaccaagt caacgacact gccctctgcc cctcgtccct gtacgctgac 4020

atggcattga ctgtctgcga ctacctttac aagcagctca gaccctctgc ccccaagatt 4080

ggcatgaacg tctgcgagat ggaggtccct aagcccttca tcgccaagat ggagcagccc 4140

gctgaaggtc agcacatcca actcgaggcc aaggctgacc tcgacgaggg tgtcgctcat 4200

ttgaagttca gaagtgtcac tcccgatggc aagctcatcc aagaccatgc tcactgcctc 4260

gtcaagttcg aggacatcaa ctcctggaac gaggactggg agcgtatcaa cttcatggtc 4320

aagtctcaag tcgatgttct caaggctaag actaagactc aggaggctca tgtcatgcag 4380

cgcggtatgg cttacaagct cttcaagtgc ttcgtcaact acaacgagaa gtaccgtggt 4440

atggaggagg tcattgtcaa cagccagacc actgaggcta ctgcctccat caagttccag 4500

aacggcccca acgacggtga ctggtaccaa gccccttacc agattgacag catgtgccac 4560

atctcgggtt tcattgtcaa cgctactgac ctgattgact ctgacaacaa cgtctgcatc 4620

tcgcacggct ggggttcgat gagaattgcc aagcagatga ctcctgaggg caactatcgc 4680

tcctgcgttc gcatgcttcc caagcctggt aacatttacc aaggtgatgt ttacatcatg 4740

gagggagatg agatcgttgc cgtctgcggt ggtcttaagt tccagcagat ctttcgccgt 4800

gtcctgaacg tcttcctgcc tcctcagaag gctggagcac ctgccaaggc tgctgcccct 4860

gctgcccccg ctgctgcacc caaggcagtc gctgccccca aggctgccgc tcctaaggcc 4920

caggccccta agcctgttgt caaggctgct aaggctccca agaaggtcgc tgccaagaag 4980

cctcaaggcg ctaccatcac ttctcgtgtt atgcaaatca ttgctaccga gaccgatgtt 5040

gagcagtctg agcttgttga tgaggctgca ttcgagaatc ttggtgtcga ctccctcatg 5100

tccctgaccg tctctgcgaa gttcagagag gatcttgaca tggagatcag ctctactctt 5160

ttcactgact accctaccgt tggtgagatg aagaagtact tctctcagtt cgatggaaac 5220

gtcggcccag ttgaggatga ctctgaggac gagtctgagc cttcggacat cgccactcct 5280

tacgaggacg acctcagcac tcccgccagc tctgctccta gcactgctcc cagtgatgca 5340

ggaaagcctg acattgactc tcccactcgt gagatccctg actccgaggt tggtgaagtc 5400

agcctggctc gccacatcat cgttcaggag atgggaattg acagctccga acttactgac 5460

gaggctgacc tttctgagct cggtatggac tctttgatga gcttgaccat ccttagtgag 5520

cttcgcgaga agacgggtat cgatcttccc tcgaccttcc tctccaccaa ctctaccatc 5580

ttggacattg agaatgctct cggtatgcgc ccaaagccca aggccaaggc tgctgctgcc 5640

cccaaggccg caaagcagac ttcgcctcaa cttgacaaag tcaacgccaa gcttaccgat 5700

gtctccaagt tccccgccgc aacctcagtt cttctccagg gcaatgctaa gattgctacc 5760

aagaagatct tcttcctgcc cgacggttct ggctctgcta catcctatgt cagcattcct 5820

aacattggtc ctgatgttgc tgcctttgga ctcaactgcc ctttcatgaa gagccccact 5880

gactggactt gtggtatcga gactgtctct ctcctctacc ttgctgagat caagagacgc 5940

cagcctcaag gcccctacat catcggtggt tggtctgctg gtggtgtcat tgcctacgcc 6000

gttgctcagg ctctgcttgc caacggtgaa gaagtcgagc gcctgcttct tcttgactct 6060

ccttgccctg tcaaccttgc acctcttcct caacgtctcc acgtcttctt caacgagatt 6120

ggtctccttg gtactggtga cccgtccaag actcccaagt ggttgcttcc ccacttcagc 6180

gccgccattc gttcgctctc tgattacgag cctcaacctt cgttgaagcc tatcaagacc 6240

tacgctatct ggtgccgtga tggtgtcgct ggtaaccccg gtgaccctcg ccctccacca 6300

gctgaggagg aggaccctgc acccatgaag tggctgttga accaccgcac tgacttcact 6360

gacaacggtt gggctcagct ctgcggcaat gagatgaagt tcggtgttat gggcggcaac 6420

cacttcacca tgatgaagga gcctcatgca caagaactcg gcaagctcat ccaagaaggt 6480

cttcagatct aa 6489

<210> 2

<211> 551

<212> DNA

<213> Aureobasidium pullulans

<400> 2

atatcggcac gactagattc actagaaagc atcaagagca gttcattgag catattatca 60

cgtgtaagcc gatagctgtg gccaggttga gacaccgcaa gtgaaagata cacacataga 120

ttctcgattc aagcagtttg cctccgccac cgcagtgcat agcaagcaaa aaaaaaacga 180

cagttggctc atcatccgtt acatcatttt ttctactggc tccgctcggt gggctcccaa 240

cgaagcagca aaaaagtgag agaaaaaaac tagcttggcg gggcaacaga agctagaccc 300

tttggctcgc ttagtcagtg cgcccgctca cacacactca aaaaggccac ccctcccgca 360

ccctcttctc atcaccgtct tcataccacg gttcgtcaag caatcgtatc tggtaagctt 420

tgacctcctc gagcaggctc cactttgcta tttcttggat ctgctctttc ttttctctct 480

tcctcttttt ctaacctctc ttcagaaagt tcaaccgtac ttcactcaat cttccataca 540

caaccgtcaa c 551

<210> 3

<211> 1026

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 3

atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60

agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120

gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180

cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240

ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300

caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360

gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420

atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480

cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540

ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600

tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660

atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720

tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780

cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840

ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900

gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960

tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020

gaatag 1026

<210> 4

<211> 2450

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gcagtatcag tgcttcgcga agatccgctg ccggtactag tggtctccat acacaatcgc 60

tcgatctcat gcgagtggtt ttgccttcgg acattatttg agctcccaac tccacttgac 120

aatatatacc ctcctcgttc ccaagctctg tgtctccttt cttcatccaa gccatcctct 180

cttgttactt cgagacgtcc agcccacatc tcgagtaatc tacatttcgt ttcattgcat 240

agtatcgctc acagccagag tatactatca ccttaatcca tccctcattc tccgccacat 300

catattctat tgaccctagc caagtcattc gaatatcgac tactttcagt actatcgttc 360

ttcaaccagt tcaccaacga atcagcctaa tttcatcaac tatactgcaa gtcagcttca 420

actcatcaca atatcggcac gactagattc actagaaagc atcaagagca gttcattgag 480

catattatca cgtgtaagcc gatagctgtg gccaggttga gacaccgcaa gtgaaagata 540

cacacataga ttctcgattc aagcagtttg cctccgccac cgcagtgcat agcaagcaaa 600

aaaaaaacga cagttggctc atcatccgtt acatcatttt ttctactggc tccgctcggt 660

gggctcccaa cgaagcagca aaaaagtgag agaaaaaaac tagcttggcg gggcaacaga 720

agctagaccc tttggctcgc ttagtcagtg cgcccgctca cacacactca aaaaggccac 780

ccctcccgca ccctcttctc atcaccgtct tcataccacg gttcgtcaag caatcgtatc 840

tggtaagctt tgacctcctc gagcaggctc cactttgcta tttcttggat ctgctctttc 900

ttttctctct tcctcttttt ctaacctctc ttcagaaagt tcaaccgtac ttcactcaat 960

cttccataca caaccgtcaa catgaaaaag cctgaactca ccgcgacgtc tgtcgagaag 1020

tttctgatcg aaaagttcga cagcgtctcc gacctgatgc agctctcgga gggcgaagaa 1080

tctcgtgctt tcagcttcga tgtaggaggg cgtggatatg tcctgcgggt aaatagctgc 1140

gccgatggtt tctacaaaga tcgttatgtt tatcggcact ttgcatcggc cgcgctcccg 1200

attccggaag tgcttgacat tggggaattc agcgagagcc tgacctattg catctcccgc 1260

cgtgcacagg gtgtcacgtt gcaagacctg cctgaaaccg aactgcccgc tgttctgcag 1320

ccggtcgcgg aggccatgga tgcgatcgct gcggccgatc ttagccagac gagcgggttc 1380

ggcccattcg gaccgcaagg aatcggtcaa tacactacat ggcgtgattt catatgcgcg 1440

attgctgatc cccatgtgta tcactggcaa actgtgatgg acgacaccgt cagtgcgtcc 1500

gtcgcgcagg ctctcgatga gctgatgctt tgggccgagg actgccccga agtccggcac 1560

ctcgtgcacg cggatttcgg ctccaacaat gtcctgacgg acaatggccg cataacagcg 1620

gtcattgact ggagcgaggc gatgttcggg gattcccaat acgaggtcgc caacatcttc 1680

ttctggaggc cgtggttggc ttgtatggag cagcagacgc gctacttcga gcggaggcat 1740

ccggagcttg caggatcgcc gcggctccgg gcgtatatgc tccgcattgg tcttgaccaa 1800

ctctatcaga gcttggttga cggcaatttc gatgatgcag cttgggcgca gggtcgatgc 1860

gacgcaatcg tccgatccgg agccgggact gtcgggcgta cacaaatcgc ccgcagaagc 1920

gcggccgtct ggaccgatgg ctgtgtagaa gtactcgccg atagtggaaa ccgacgcccc 1980

agcactcgtc cgagggcaaa ggaataggct accaaccact ctgctgaggc tgtttctatt 2040

actcaccctc acgctggcgc tcaggagttc ctttacaaga aggtcctcgc caacgctggt 2100

gtcgatgccc atgagattag ctacgtcgag atgcacggta ctggtaccca ggctggtgat 2160

ggtattgaga tgacctcagt caccaacgtc ttcgctcccc gtcaccgcca gcgcaagcct 2220

gaggagaagc tccaccttgg tgccatcaag gccaacatcg gccacggtga agccgcttct 2280

ggtatcaact ccctctgcaa ggtcttgatg atgatgaaga agaacgccat tcctgccaac 2340

gttggtatca agggcgagat caacaagact ttccccaagg acttgaagga ccgcaatgtc 2400

cacattcctc agcagcagat cgacttcccc cgcaacggtg ctgagaagcg 2450

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

atgaaaaagc ctgaactcac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ctattccttt gccctcggac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

aaggtggtca tcgtagcctc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

agttgttgag gaagatcttg 20

Claims (10)

1.一株出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，其特征在于，是将出芽短梗霉菌株中的alb1基因的全部或部分编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因盒；

优选的，是将alb1基因从第1位至1911位之间的编码基因敲除，替换为潮霉素B抗性基因盒。

2.如权利要求1所述的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，其特征在于，所述潮霉素B抗性基因盒包含：出芽短梗霉转录延长因子启动子P_TEF和潮霉素B抗性基因HygR；

所述出芽短梗霉转录延长因子启动子P_TEF的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

所述潮霉素B抗性基因序列hyg^R序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

3.如权利要求1或2所述的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，其特征在于，所述出芽短梗霉菌株为菌株As3.3984。

4.如权利要求3所述的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，已于2016年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.12509。

5.权利要求1-4任一项所述的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)合成含alb1左同源臂-潮霉素B抗性基因盒-alb1右同源臂的重组片段，重组片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(2)将步骤(1)的重组片段连接到pUC18质粒上的EcoRI位点，得到alb1基因敲除质粒；

(3)将alb1基因敲除质粒转化到出芽短梗霉感受态细胞中，通过潮霉素B抗性筛选得到抗性菌株；对抗性菌株进行鉴定，筛选得到敲除alb1基因的突变株。

6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，敲除alb1基因的突变株的筛选方法为：根据SEQ ID NO.4序列合成可以扩增潮霉素B抗性基因的引物hyg-1和hyg-2，如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；根据出芽短梗霉As3.3984基因组中alb1左同源臂左侧序列设计引物out-1，如SEQ ID NO.7所示，根据alb1右同源臂右侧序列的反向互补序列设计引物out-2，如SEQ ID NO.8所示。用hyg-1/hyg-2和out1-1/out-2两对引物通过PCR的方法对抗性菌株进行鉴定。

7.权利要求1-4任一项所述的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株在制备微生物多糖中的应用。

8.一种制备微生物多糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：在多糖发酵培养基中发酵培养上述的出芽短梗霉alb1基因敲除突变株，发酵液离心，收集上清液，向上清液中加入工业乙醇沉淀多糖，离心，收集沉淀，干燥，纯化，即得微生物多糖。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多糖发酵培养基的组成为：蔗糖100.0g/L，酵母膏2.0g/L，NaCl 1.0g/L，MgSO₄.7H₂O 0.2g/L，K₂HPO₄ 5.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.6g/L，pH6.5。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，发酵培养的条件为：28℃震荡培养72小时。