CN102443560A - 一种高效转化棘白菌素b的基因工程菌及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌及其制备方法。该基因工程菌是在犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis野生菌株的基因组中整合有棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒的工程菌。通过棘白菌素B转化验证,该基因工程菌的转化效率较野生菌株提高1.8倍。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域,特别涉及一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌及其制备方法。
背景技术
在过去的二十多年时间里严重危害人类生命健康的真菌感染,无论是在死亡率以及感染的种类方面都在不断的增加,特别是在免疫抑制病人中。目前用于治疗临床深部真菌感染的主要药物是唑类抗真菌药物和两性霉素B,虽然这两类药物对控制临床深部真菌感染起到了重要的作用,但由于这些药物由于选择性差、耐药真菌的出现、对诸如曲霉和白念珠菌等真菌的敏感性不强等不足,使深部真菌感染疾病的死亡率居高不下。
棘白菌素(Echinocandin)类抗真菌抗生素是20世纪70年代发现的一组天然产物,由相似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链组成,是临床治疗系统性真菌感染的重要药物。这类抗生素能够非竞争性地抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性。其作用机制独特,毒副作用低,且对一些唑类和两性霉素B耐药的真菌具有很强的抗菌活性,尤其是对诸如曲霉和白念珠菌等呈现上升趋势的真菌具有独特的疗效,是目前临床治疗深部真菌感染的“王牌抗生素”。棘白菌素类抗生素主要有三种类型:B,C和D,其中棘白菌素B(Echinocandin B,ECB)是最主要的类型。ECB,是于1974年NyfelerR.等人发现由曲霉菌属Aspergilus nidulans和Aspergilu rugulosus发酵产生的,但由于酰基侧链的存在,使其具有一定的溶血毒性。以ECB为先导化合物进行结构改造,可以得到一些具有临床应用前景的化合物,如西洛芬净(Cilofungin)、卡帕芬净(Caspofungin,MK991)、米卡芬净(Micafungin,FK463)、阿尼芬净(Anidulafungin,LY303366)。西洛芬净由于毒性和剂型问题终止了研究开发,但后三者已分别先后在美国(2001年)、日本(2002年)、美国(2006年)首次上市。
对ECB进行结构改造,用戊氧-三苯羧基取代亚油酰基侧链即可得到阿尼芬净,而其中ECB的去酰化即其母核的制备是关键步骤。目前对于ECB母核的制备方法中,因化学制备成本较高,因此主要是通过微生物转化——犹他游动放线菌NRRL12052发酵产生的去酰化酶对ECB进行催化的方式得到。微生物转化具有以下优点:反应条件温和、产物单一、高度的化学选择性、区域选择性和对映体选择性、易于纯化、不污染环境且能完成一些化学合成难以进行的反应。但是犹他游动放线菌野生菌株的ECB去酰化酶的产量很低,对ECB的生物转化效率不高。
棘白菌素B(ECB)去酰化反应过程
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题是针对现有的犹他游动放线菌野生菌株ECB去酰化酶产量低,对ECB的生物转化效率不高的不足,提供一种ECB去酰化酶产量较高,转化ECB效率更高的犹他游动放线菌基因工程菌及其制备方法。
阿尼芬净制备的工艺路线中,ECB去酰化即其母核的制备是关键步骤。因此,本发明人将该去酰化酶基因,作为外源基因插入ECB去酰化酶产生菌犹他游动放线菌的基因组中,并使它高效表达,发现得到的犹他游动放线菌突变株的ECB转化效率大大提高,可见ECB去酰化酶基因的插入,增加了ECB去酰化酶基因的拷贝数并上调了该酶的表达量,从而提高了转化ECB的效率,从而完成了本发明。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是:一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌,其是在犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis野生菌株的基因组中整合有棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒的工程菌。
在基因组中整合入外源基因的表达盒,从而使插入的外源基因表达是现有技术,一般是让该外源基因用启动子转录,终止子终止转录即可。本发明中所述的棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒较佳的依次包括启动子、棘白菌素B去酰化酶基因编码区和终止子。启动子可以启动基因的转录,从而使基因表达。强启动子的启动效率更高。因此,本发明中,所述的启动子可以采用现有技术中任何可以在犹他游动放线菌中启动转录的启动子,优选犹他游动放线菌的自身启动子,较佳的如序列表中SEQ ID NO.1的第1~430位所示的序列。也可以为红霉素抗性基因启动子。本发明中所述的棘白菌素B去酰化酶基因较佳的来源于犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis,其编码序列优选序列表中SEQ ID NO.1第431~2794位所示的序列。所述的终止子为本领域常规的终止子,较佳的如序列表中SEQ ID NO.1的第2795~3998位所示的序列。
本发明中,所述的基因表达盒在犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis野生菌株的基因组中的整合位点可以是基因组中的任何位点,较佳的整合位点是attB位点。
本发明中,所述的犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis野生菌株可以是任何Actinoplanes utahensis属的野生菌株,都可以达到本发明的效果,优选犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis NRRL 12052。
本发明还提供一种重组载体,其在多克隆位点插入有棘白菌素B去酰化酶基因的的表达盒。其中,所述的棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒较佳的依次包括启动子、棘白菌素B去酰化酶基因编码区和终止子。所述的启动子可以采用现有技术中任何可以在犹他游动放线菌中启动转录的启动子,优选犹他游动放线菌的自身启动子,较佳的如序列表中SEQ ID NO.1的第1~430位所示的序列。本发明中,所述的棘白菌素B去酰化酶基因是较佳的来源于犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis,其编码序列优选序列表中SEQ IDNO.1第431~2794位所示的序列。所述的终止子为本领域常规,较佳的如序列表中SEQ ID NO.1的第2795~3998位所示的序列。
本发明所述的重组载体的骨架可以是本领域常规的穿梭载体,优选质粒pSET152。质粒pSET152是整合型穿梭质粒,可以在大肠杆菌中复制,也可以穿梭于放线菌犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis中,其中含有attP位点,可以使该载体整合于宿主细胞基因组上的attB位点。所述的棘白菌素B去酰化酶基因的的表达盒较佳的插入在质粒pSET152多克隆位点的EcoRI和XbaI的双酶切位点。
本发明的重组载体的制备方法可以采用本领域常规的方法,将棘白菌素B去酰化酶基因构建到表达盒中,插入到载体的多克隆位点即可。
本发明还提供一种转化子,其含有本发明所述的重组载体。该转化子的宿主细胞可以是本领域的常规宿主,优选大肠杆菌ET12567(pUZ8002)(即ATCC BAA-525)或者DH5α(即ATCC 53868)。
本发明还提供一种制备所述的高效转化棘白菌素B的基因工程菌的方法,包括将所述的转化子与犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis接合,挑选接合子。所述的转化子优选宿主为大肠杆菌ET12567(pUZ8002)。转化子中含有的重组载体的骨架优选质粒pSET152。所述的犹他游动放线菌优选犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis NRRL 12052。转化子中含有的重组质粒具有attP位点,可以和放线菌基因组上的attB位点特异性整合,该特异性整合可以将整个质粒插入基因组中,从而使质粒中带有的棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒也插入到基因组中,使棘白菌素B去酰化酶基因拷贝数增加,从而高效表达棘白菌素B去酰化酶,提高对棘白菌素B的转化效率。
本发明还提供一种制备棘白菌素B母核的方法,包括采用如上所述的基因工程菌,以静息细胞转化法转化棘白菌素B为棘白菌素B母核。其中静息细胞转化法是本领域的常规方法,一般包括:将如上所述的基因工程菌置于缓冲溶液中,以棘白菌素B为前体物质进行转化反应,较佳的在30℃,250rpm转化反应5小时,从所得转化反应液中即可分离获得ECB母核。所述的缓冲溶液是本领域常用的细胞缓冲溶液,如磷酸缓冲溶液等。
本发明中,上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外,均市售可得。
相比于现有技术,本发明的有益效果如下:本发明通过位点特异性重组在基因组中倍增棘白菌素B去酰化酶基因的拷贝数策略达到提高棘白菌素B去酰化酶产量的效果,从而提高棘白菌素B转化效率。避免现有同源重组单交换技术中大片段外源基因转入可能导致获得的基因工程菌遗传稳定性差,易发生回复突变的缺点。本发明得到的基因工程菌经过棘白菌素B转化验证,对棘白菌素B转化效率较野生菌株提高1.8倍以上,并且经过多次传代,转化效率稳定。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。
图1是突变株重组质粒构建过程。
图2是棘白菌素B去酰化酶产生菌株位点特异性整合方式。
图3是棘白菌素B去酰化酶野生菌株及其基因工程菌转化棘白菌素B的HPLC结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究和反复的试验,发现将棘白菌素B去酰化酶基因表达盒导入犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis中,可以大大提高转化棘白菌素B的效率。因此,本发明在已有棘白菌素B去酰化酶产生菌野生菌的基础上通过基因改造构建一株基因组中倍增了棘白菌素B去酰化酶基因拷贝数的基因工程菌,提高棘白菌素B的转化效率。
首先克隆棘白菌素B去酰化酶基因的自身启动子序列和编码序列。棘白菌素B去酰化酶基因是已知基因,可用常规的方法克隆得到。
接着构建用于位点特异性整合的重组质粒,采用穿梭质粒,如带有attp位点的质粒pSET152连接的棘白菌素B去酰化酶基因,构建成表达盒。
然后用该重组质粒转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002),获得转化子。该转化子菌株和棘白菌素B去酰化酶产生菌犹他游动放线菌野生菌株共培养,发生接合,该重组质粒和棘白菌素B去酰化酶产生菌犹他游动放线菌野生菌株的基因组发生attB位点特异性重组,筛选阳性的接合子,即得到基因组中倍增了棘白菌素B去酰化酶基因的突变株,可以高产棘白菌素B去酰化酶,提高棘白菌素B的转化效率。
下面用实施例来进一步说明本发明,但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
所使用的工具酶和DNA分子量Marker均购自Takara公司,具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。
所使用的胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司,使用方法参考商品说明书。
实施例1棘白菌素B去酰化酶基因的克隆
首先根据GenBank中游动放线菌棘白菌素B去酰化酶基因及其前后序列(Gene ID:33036681)设计引物,扩增包括启动子、编码序列及终止子的片段。上游引物:5’-ATAGAATTCCGTGCCCAGCTGTTC-3’;下游引物:5’-AAAAAGCTTGACTGCGTGAGTTCTGC-3’。以犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis NRRL 12052[来源于美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)]的总基因组为模板,使用宝生物公司的primer star高保真聚合酶来进行片段的扩增。PCR条件为:98℃,10s、68℃,15s、72℃,4min。PCR产物电泳后,回收目的条带。PCR产物全长为4007bp。回收PCR片段。
回收的PCR片段与质粒进行连接。棘白菌素B去酰化酶基因通过PCR产物(EcoRI/XbaI)连接入购自Takara公司的质粒pSP72(EcoRI/XbaI),得到重组质粒pYG-LAJ-1并测序。该序列与网上序列(Gene ID:33036681)比对同源性为100%。直接酶切质粒pYG-LAJ-1得到棘白菌素B去酰化酶基因(EcoRI/XbaI)。
实施例2特异性位点整合质粒的构建、接合转移
将棘白菌素B去酰化酶基因(EcoRI/XbaI)连接入购自Takara公司的质粒pSET152(EcoRI/XbaI),得到重组质粒pYG-LAJ-2。此重组质粒即为倍增了棘白菌素B去酰化酶基因的整合质粒,用此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,挑取转化子在LB中培养,提取质粒进行酶切和PCR验证,最终构建成位点特异性整合质粒pYG-LAJ-2。上述质粒构建过程示意图见图1。
斜面培养棘白菌素B去酰化酶产生菌——犹他游动放线菌Actinoplanesutahensis NRRL 12052。从斜面挑取适量菌体于50ml TSB中培养72小时左右达到对数生长期,1%接种量转接于50ml TSB培养60小时左右使菌液达到对数生长后期,离心倒去上清得到菌丝体。菌丝体用20ml的LB液体洗涤2次(4000rpm,10min,4℃),最后重悬于20ml LB,待用。用位点特异性整合质粒pYG-LAJ-2转化感受态大肠杆菌ET 12567(pUZ8002)(购自Takara公司),挑转化子至4ml LB(含Am 100μg/ml)的小试管中37℃振荡培养12小时,ET12567(pUZ8002)菌株2%接种于50ml LB的250ml三角瓶,37℃振荡培养5小时左右,使菌液OD值在0.4~0.6之间,将菌液移入50ml的无菌塑料离心管,离心(4000rpm,10min,4℃),倒去上清,菌体用20ml LB洗涤2次(4000rpm,10min,4℃),最后重悬于3~4ml LB中,将大肠杆菌菌液与之前的菌丝体菌液按体积比(10∶1、1∶1、1∶10)于EP管中混匀。将混合菌液涂MS平板,用涂棒充分混匀菌液,30℃恒温箱培养。MS平板培养基成分(g/l):甘露醇20.0,热榨黄豆粉20.0,琼脂(sigma agar)20.0。培养20小时后,取出平板,涂抗生素(阿伯拉霉素Am 50μg/ml和萘啶酮酸50μg/ml),再于30℃恒温箱培养。培养一周后出现接合子。
实施例3位点特异性重组工程菌的筛选
挑取接合子于含有阿伯拉霉素(50μg/ml)的TSB中培养,然后菌液涂于含有阿伯拉霉素(50μg/ml)的斜面培养基(酵母提取物0.3%,麦芽浸出物0.3%,蛋白胨0.5%,葡萄糖1.0%,琼脂2.7,pH7.2),在30℃培养。因为pSET152上含有噬菌体C31整合位点(attP),可以与放线菌基因组中的attB位点特异性同源整合,将质粒pYG-LAJ-2携带的Am抗性基因以及棘白菌素B去酰化酶基因插入到犹他游动放线菌染色体中的attB位点,并随染色体复制而同步扩增,接合子可稳定表达Am抗性基因以及棘白菌素B去酰化酶基因基因。该位点特异性整合方式,示意图见图2。挑取该接合子于4mlTSB的小试管中(含阿伯拉霉素50μg/ml、试管中加入2~3粒玻璃珠),30℃振荡培养,抽提其总DNA。选用pSET152质粒通用引物M13-47(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和RV-M(5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’),该引物从野生菌株——犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis NRRL 12052的基因组扩增不出条带,而从接合子基因组可扩增出4000bp的片段,从而验证得到的扩增出4000bp片段的接合子是发生了位点特异性整合的基因工程菌株。
实施例4产棘白菌素B去酰化酶的工程菌的转化棘白菌素B验证
挑取实施例3中能扩增出4000bp片断的突变株于斜面培养基(酵母提取物0.3%,麦芽浸出物0.3%,蛋白胨0.5%,葡萄糖1.0%,琼脂2.7,pH7.2)30℃培养,培养一周后,接种于种子培养液(蔗糖2.0%,燕麦片2.0%,麦芽浸出物0.5%,酵母0.25%,K2HPO4 0.1%,KCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.05%,FeSO4·7H2O 0.0002%,pH自然),30℃培养4天后转接于发酵培养基(蔗糖2.0%,花生粉1.0%,K2HPO4 0.12%,KH2PO4 0.05%,MgSO4·7H2O 0.025%,pH自然)(10%的接种量)。30℃,250r/m培养3天后放瓶。取发酵液用去离子水洗涤数次,离心沉淀后(4000rpm,20min),用与收集到的菌丝体等体积的新鲜0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)悬浮,再加入溶解有棘白菌素B的DMSO水溶液,使棘白菌素最终浓度为2mg/ml,DMSO浓度为整个反应体系的2%,混匀,进行转化反应(30℃,250rpm)5h。取转化反应液600μl,加等体积的甲醇,混匀后离心(12000rpm,5min),取上清进行HPLC分析。HPLC色谱条件:色谱柱为Agilent C18(5μm,250×4.6mm);流动相A为2g/L乙酸铵溶液;流动相B为水-乙腈(40∶60,含2g/L乙酸铵)。检测条件为:B%=8~98,15min;98~8,10min;8,6min;流速为0.8ml/min;检测波长为222nm;柱温35℃。另外,转化反应液中主要含有棘白菌素B母核和残留的棘白菌素B,出峰时间分别为6.747min,22.797min。HPLC分析结果见图3。可见,通过位点特异性整合的工程菌转化反应液中发酵产物中棘白菌素B母核的产量较野生菌株提高1.8倍以上,转化效率达到61.7%,并且均未出现突变株不转化棘白菌素B的情况。
实施例5产棘白菌素B去酰化酶的工程菌的传代稳定性
挑取实施例3中能扩增出4000bp片断的突变株,经过三次传代,在与实施例4相同的斜面培养基中培养,经过与实施例4相同的种子培养基、发酵培养基及棘白菌素B转化验证,转化效率稳定在60%以上。说明本发明中构建的产棘白菌素B去酰化酶工程菌具有传代稳定性。
Claims (10)
1.一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌,其特征在于,其是在犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis野生菌株的基因组中整合有棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒的工程菌。
2.如权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述的棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒依次含有启动子、棘白菌素B去酰化酶基因编码区和终止子。
3.如权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述的表达盒在犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis野生菌株的基因组中的整合位点是attB位点。
4.如权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述的犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis野生菌株是犹他游动放线菌Actinoplanesutahensis NRRL 12052。
5.一种重组载体,其特征在于,其在多克隆位点插入有棘白菌素B去酰化酶基因的的表达盒。
6.如权利要求6所述的重组载体,其特征在于,所述的重组载体的骨架是pSET152。
7.一种转化子,其特征在于,其含有权利要求5或6所述的重组载体。
8.一种制备如权利要求1~4任一项所述的高效转化棘白菌素B的基因工程菌的方法,其特征在于,包括将权利要求7所述的转化子与犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis接合,挑选接合子即得。
9.一种制备棘白菌素B母核的方法,其特征在于,包括采用如权利要求1~4任一项所述的基因工程菌,以静息细胞转化法转化棘白菌素B为棘白菌素B母核。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述的静息细胞转化法包括:将如权利要求1~4任一项所述的基因工程菌置于缓冲溶液中,以棘白菌素B为前体物质进行转化反应,从所得转化反应液中即可分离获得ECB母核。
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