CN102443561B - 一种高效转化棘白菌素b的基因工程菌及其制备方法 - Google Patents
一种高效转化棘白菌素b的基因工程菌及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102443561B CN102443561B CN201010505210.8A CN201010505210A CN102443561B CN 102443561 B CN102443561 B CN 102443561B CN 201010505210 A CN201010505210 A CN 201010505210A CN 102443561 B CN102443561 B CN 102443561B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ecb
- acylase
- engineering bacterium
- goes
- conversion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 0 CC(C)CC(NC(C(C)O)C(NCC(*)*O)=O)=O Chemical compound CC(C)CC(NC(C(C)O)C(NCC(*)*O)=O)=O 0.000 description 3
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌及其制备方法。该基因工程菌是在变铅青链霉菌Streptomyces lividans野生菌株的基因组中整合有棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒的工程菌。通过棘白菌素B转化验证,该基因工程菌的转化效率较犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis野生菌株提高1.5倍。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域,特别涉及一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌及其制备方法。
背景技术
在过去的二十多年里,严重危害人类生命健康的真菌感染,无论是其发生频率还是感染种类都在不断地增加,特别是在免疫抑制患者中。在20世纪80年代中期前的近30年里,两性霉素一直是控制临床真菌感染的主要药物,尽管其神经毒性比较大,但临床别无选择。直到20世纪80年代末和90年代咪唑类及三唑类抗真菌药物的研发成功,临床方能有效而安全地控制真菌感染。但是,随着这些抗真菌药物的使用,耐药菌不断出现,因此,寻找一种新的安全有效的抗真菌药物就显得尤为重要。
棘白菌素类药物是20世纪70年代发现的一组天然产物,是真菌的次级代谢产物,包含一个带有一条脂类侧链的环状六肽核,该脂类侧链通过非竞争性作用机制抑制β-(1,3)-D-葡聚糖的合成,从而导致细胞壁葡聚糖的排空、渗透不稳定以及真菌细胞的溶解而发挥其抗真菌作用。棘白菌素作为一种可杀死真菌的药物表现出抗菌谱广、活性强的特点,是治疗免疫抑制患者和免疫正常患者真菌感染的重要选择药物。但是天然的棘白菌素类化合物由于酰基侧链的存在,使其具有一定的溶血毒性。将棘白菌素B切除侧链之后,经过一系列的化学修饰可以得到一系列具有临床应用前景的衍生物。其中最主要的是如西洛芬净(Cilofungin)、卡帕芬净(Caspofungin,MK991)、米卡芬净(Micafungin,FK463)、阿尼芬净(Anidulafungin,LY303366)。西洛芬净由于其毒性和剂型(不溶于水)问题以及对卡氏肺囊虫肺炎(PCP)的活性较低,目前已经终止了研究开发,但后三者已先后在01年、02年、06年上市。
其中阿尼芬净是由礼来公司和Vicuron Pharmaceuticals公司联合研制开发,给药途径为静脉滴注。动物实验研究表明,同卡泊芬净和米卡芬净相比,阿尼芬净对烟曲霉菌活性更强,对白色念珠菌活性相对较弱。在一项对食管念珠菌感染患者进行的双盲对照试验中,静脉滴注阿尼芬净的有效率为97.2%,氟康唑的有效率为98.8%,阿尼芬净的不良反应发生率为10%,对照组为13%。阿尼芬净的制备过程经过两步:(1)通过微生物转化-游动放线菌发酵产生的去酰化酶对棘白菌素B进行催化,使侧链断裂,生成母核和不饱和脂肪酸侧链。(2)在母核的基础上加入新的侧链——戊氧-三苯羧基。但是游动放线菌生长周期长,发酵条件较为苛刻,并且游动放线菌野生菌株去酰化酶产量不高,因此目前通过游动放线菌转化棘白菌素B的效率低,生产成本较高。
棘白菌素B(ECB)去酰化反应过程
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题是针对现有的棘白菌素B去酰化酶产生菌如游动放线菌生长周期长以及转化棘白菌素B效率低的不足,提供一种生长周期更短、转化棘白菌素B的效率更高的基因工程菌及其制备方法。
变铅青链霉菌Streptomyces lividans是一种生长周期短,生长条件比较简单,比较为人们所熟练掌握的真菌,但是不具有转化棘白菌素B的功能。因此,本发明人将棘白菌素B去酰化酶基因,作为外源基因插入变铅青链霉菌Streptomyces lividans的基因组中,并使它高效表达,发现得到的变铅青链霉菌突变株具有较高的棘白菌素B转化效率,从而完成了本发明。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是:一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌,其是在变铅青链霉菌Streptomyces lividans野生菌株的基因组中整合有棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒的工程菌。
在基因组中整合入外源基因的表达盒,从而使插入的外源基因表达是现有技术,一般是让该外源基因用启动子转录,终止子终止转录即可。本发明中所述的棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒较佳的依次包括启动子、棘白菌素B去酰化酶基因编码区和终止子。启动子可以启动基因的转录,从而使基因表达。强启动子的启动效率更高。因此,本发明中所述的启动子可以采用现有技术中任何可以在变铅青链霉菌中启动转录的启动子,优选红霉素抗性基因启动子,其核苷酸序列优选序列表中SEQ ID NO.1所示的序列,也可以是犹他游动放线菌中棘白菌素B去酰化酶基因的自身启动子。所述的棘白菌素B去酰化酶基因较佳的来源于犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis,其核苷酸序列优选序列表中SEQ ID NO.2所示的序列。所述的终止子为本领域常规的终止子。
本发明中,所述的基因表达盒在变铅青链霉菌Streptomyces lividans野生菌株的基因组中的整合位点可以是基因组中的任何位点,较佳的是整合位点是attB位点。
本发明中,所述的变铅青链霉菌Streptomyces lividans野生菌株可以是任何Streptomyces lividans属的野生菌株,都可以达到本发明的效果,优选变铅青链霉菌Streptomyces lividans TK24。
本发明还提供一种重组载体,其在多克隆位点插入有棘白菌素B去酰化酶基因的的表达盒。其中,所述的启动子可以采用现有技术中任何可以在变铅青链霉菌中启动转录的启动子,优选红霉素抗性基因启动子,其核苷酸序列优选序列表中SEQ ID NO.1所示的序列,也可以是犹他游动放线菌的自身启动子。本发明中,所述的棘白菌素B去酰化酶基因较佳的来源于犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis,其核苷酸序列优选序列表中SEQ ID NO.2所示的序列。所述的终止子为本领域常规。
本发明所述的重组载体的骨架可以是本领域常规的穿梭载体,优选质粒pSET152。质粒pSET152是整合型穿梭质粒,可以在大肠杆菌中复制,也可以穿梭于变铅青链霉菌Streptomyces lividans中,其中含有attP位点,可以使该载体整合于宿主细胞基因组中的attB位点。所述的棘白菌素B去酰化酶基因的的表达盒较佳的插入在质粒pSET152多克隆位点的XbaI酶切位点。
本发明的重组载体的制备方法可以采用本领域的常规的方法,将启动子和棘白菌素B去酰化酶基因编码序列构建到表达盒中,插入到载体的多克隆位点即可。
本发明还提供一种转化子,其含有本发明所述的重组载体。该转化子的宿主细胞可以是本领域的常规宿主,优选大肠杆菌ET12567(pUZ8002)(即ATCC BAA-525)、S17-1(即ATCC 47055)或者DH5α(即ATCC 53868)。
本发明还提供一种制备所述的高效转化棘白菌素B的基因工程菌的方法,包括将所述的转化子与变铅青链霉菌Streptomyces lividans接合,挑选接合子即得。所述的转化子优选宿主为大肠杆菌ET12567(pUZ8002)。转化子中含有的重组载体的骨架优选质粒pSET152。所述的变铅青链霉菌优选变铅青链霉菌Streptomyces lividans TK24。转化子中含有的重组质粒具有attP位点,可以和变铅青链霉菌基因组上的attB位点特异性整合,该特异性整合可以将整个质粒插入基因组中,从而使质粒中带有的棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒也插入到基因组中并高效表达,从而使变铅青链霉菌具有转化棘白菌素B的功能。
本发明还提供一种制备棘白菌素B母核的方法,包括采用如上所述的基因工程菌,以静息细胞转化法转化棘白菌素B为棘白菌素B母核。其中静息细胞转化法是本领域的常规方法,一般包括:将如上所述的基因工程菌置于缓冲溶液中,以棘白菌素B为前体物质进行转化反应,较佳的在30℃,250rpm转化反应5小时,从所得转化反应液中即可分离获得ECB母核。所述的缓冲溶液是本领域常用的细胞缓冲溶液,如磷酸缓冲溶液等。
本发明中,上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外,均市售可得。
相比于现有技术,本发明的有益效果如下:本发明通过位点特异性重组在变铅青链霉菌基因组中插入棘白菌素B去酰化酶基因表达盒,使变铅青链霉菌具有转化棘白菌素B的功能。本发明首先避免了现有技术中多数通过同源性重组发生单交换,大片段外源基因转入可能导致获得的基因工程菌遗传稳定性差,易发生回复突变的缺点。本发明得到的基因工程菌的生长周期较犹他游动放线菌缩短至2天,而且经过棘白菌素B转化验证,对棘白菌素B转化效率是53.3%,是犹他游动放线菌野生菌株的1.54倍,并且经过多次传代,转化效率稳定。
附图说明
以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。
图1是突变株重组质粒构建过程。
图2是位点特异性整合方式。
图3是棘白菌素B去酰化酶野生菌株及其变铅青链霉菌基因工程菌转化棘白菌素B的HPLC结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究和反复的试验,发现将棘白菌素B去酰化酶基因表达盒导入变铅青链霉菌Streptomyces lividans中,可以使变铅青链霉菌具有转化棘白菌素B的功能。因此,本发明通过基因工程构建一株生长周期更短和棘白菌素B去酰化酶产量更高的变铅青链霉菌基因工程菌,缩短现有的棘白菌素B去酰化酶产生菌菌丝体的培养周期并提高棘白菌素B的转化效率。
首先克隆红霉素抗性基因启动子和棘白菌素B去酰化酶基因。红霉素抗性基因启动子和棘白菌素B去酰化酶基因是已知基因,可用常规的方法克隆得到。
接着构建用于位点特异性整合的重组质粒,采用穿梭质粒,如带有attp位点的质粒pSET152连接红霉素抗性基因启动子和棘白菌素B去酰化酶基因编码序列,构建成表达盒。
然后用该重组质粒转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002),获得转化子。该转化子菌株和变铅青链霉菌Streptomyces lividans野生菌株共培养,发生接合,该重组质粒和变铅链霉菌的基因组发生attB位点特异性重组,筛选阳性的接合子,即得到基因组中含有棘白菌素B去酰化酶基因的突变株,可以高产棘白菌素B去酰化酶,从而使变铅青链霉菌具有转化棘白菌素B的功能。
下面用实施例来进一步说明本发明,但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
所使用的工具酶和DNA分子量Marker均购自Takara公司,具体的反应条件和使用的方法均参考商品说明书。所使用的胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司,使用方法参考商品说明书。
实施例1红霉素抗性基因启动子及棘白菌素B去酰化酶基因编码序列的克隆
首先以红霉素产生菌株S.erythraea HL 3168E3(即S.erythraea ATCC11635)的总基因组为模板克隆红霉素抗性基因启动子,上游引物:5’-AAAAGATCTTCTAGAAGCCCGACCCGAGCA-3’;下游引物:5’-AAAGAATTCTCCGGAGGTCGCACC-3’,进行PCR,所得PCR产物纯化后连接在质粒pSP72(购自Takara公司)上,得到质粒pYG-LAJ-3,并测序,序列与网上序列(Gene ID:4940594)比对同源性为100%。直接酶切质粒pYG-LAJ-3得到红霉素抗性基因启动子(EcoR I/Bgl II)。
根据GenBank中游动放线菌棘白菌素B去酰化酶基因及其前后序列(Gene ID:33036681)设计引物,上游:5’-AAAAGATCTTCTAGAAGCCCGACCCGAGCA-3’;下游:5’-AAAGAATTCTCCGGAGGTCGCACC-3’。以犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis NRRL 12052[来源于美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)]的总基因组为模板,使用宝生物公司的primer star高保真聚合酶来进行片段的克隆。PCR条件为:98℃,10s、68℃,15s、72℃,3min。PCR产物电泳后,回收目的条带。PCR产物全长为2800bp。回收的片段与质粒进行连接,棘白菌素B去酰化酶基因通过PCR产物(EcoRI/XbaI)连接入购自Takara公司的质粒pSP72(EcoRI/XbaI),得到质粒pYG-LAJ-4并测序,序列与网上序列(Gene ID:33036681)比对同源性为100%。
将红霉素抗性基因启动子(EcoR I/Bgl II)连接入pYG-LAJ-4(EcoR I/BglII),得到质粒pYG-LAJ-5。直接酶切质粒pYG-LAJ-5得到含有红霉素抗性基因启动子及棘白菌素B去酰化酶基因编码序列的片段(XbaI/XbaI)。
实施例2特异性位点整合质粒的构建、接合转移
将实施例1所得红霉素抗性基因启动子及棘白菌素B去酰化酶基因编码序列的片段(XbaI/XbaI)连接入购自Takara公司的质粒pSET152(XbaI/XbaI,脱磷处理),得到质粒pYG-LAJ-6。此重组质粒即为含有红霉素抗性基因启动子及棘白菌素B去酰化酶基因编码序列的整合质粒,用此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,挑取转化子在LB中培养,提取质粒进行酶切和PCR验证,最终构建成位点特异性整合质粒pYG-LAJ-6。上述质粒构建过程示意图见图1。
斜面培养变铅青链霉菌Streptomyces lividans TK24(即CPCC 260835,来源于中国微生物菌种保藏委员会药用微生物菌种保藏中心)。从斜面挑取适量菌体于50ml TSB中培养24小时左右达到对数生长期,1%接种量转接于50ml TSB培养30小时左右使菌液达到对数生长后期,离心倒去上清得到菌丝体。菌丝体用20ml的LB液体洗涤2次(4000rpm,10min,4℃),最后重悬于20ml LB,待用。用重组质粒pYG-LAJ-6转化感受态大肠杆菌ET12567(pUZ8002)(购自Takara公司),挑转化子至4ml LB(Am 100μg/ml)的小试管中37℃振荡培养12小时,然后以2%接种于50ml LB的250ml三角瓶,37℃振荡培养5小时左右,使菌液OD值在0.4~0.6之间,将菌液移入50ml的无菌塑料离心管,离心(4000rpm,10min,4℃),倒去上清,菌体用20ml LB洗涤2次(4000rpm,10min,4℃),最后重悬于3~4ml LB中,将大肠杆菌菌液与之前的菌丝体菌液按体积比(10∶1、1∶1、1∶10)于EP管中混匀。将混合菌液涂MS平板,用涂棒充分混匀菌液,30℃恒温箱培养。MS平板培养基成分(g/l):甘露醇20.0,热榨黄豆粉20.0,琼脂(sigma agar)20.0。培养20小时后,取出平板,涂抗生素(阿伯拉霉素50μg/ml、和萘啶酮酸50μg/ml),再于30℃恒温箱培养。培养一周后出现接合子。
实施例3特异性位点同源重组工程菌的筛选
挑取接合子于含有阿伯拉霉素(50μg/ml)的TSB中培养,然后菌液涂于含有阿伯拉霉素(50μg/ml)的斜面培养基(可溶性淀粉2.0%,NaCl 0.05%,K2HPO4·3H2O 0.05%,KNO30.1%,MgSO4·7H2O 0.05%,FeSO4·7H2O 0.001%,纯化琼脂粉2.0%,pH 7.4),在30℃培养。因为pSET152上含有噬菌体整合位点(attP),可以与变铅青链霉菌基因组中的attB位点特异性同源整合,将质粒pYG-LAJ-6携带的阿伯拉霉素抗性基因以及红霉素抗性基因启动子和棘白菌素B去酰化酶基因插入到变铅青链霉菌染色体中的attB位点,并随染色体复制而同步扩增,接合子可稳定表达阿伯拉霉素抗性基因以及棘白菌素B去酰化酶基因。该接合子位点特异性整合方式,示意图见图2。挑取该接合子于4ml TSB的小试管中(含阿伯拉霉素50μg/ml、试管中加入2~3粒玻璃珠),30℃振荡培养,抽提其总DNA。选用pSET152质粒通用引物M13-47(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和RV-M(5’-GAGCGGATA ACAATTTCACACAGG-3’),该引物从野生菌株——变铅青链霉菌Streptomyces lividans TK24的基因组扩增不出条带,而从接合子基因组可扩增出3300bp的片段,从而验证得到的扩增出3300bp片段的接合子是的发生了位点特异性整合的基因工程菌株。
实施例4产棘白菌素B去酰化酶的工程菌的转化棘白菌素B验证
挑取实施例3中能扩增出3300bp片断的突变株于斜面培养基(可溶性淀粉2.0%,,NaCl 0.05%,K2HPO4·3H2O 0.05%,KNO30.1%,MgSO4·7H2O0.05%,FeSO4·7H2O 0.001%,纯化琼脂粉2.0%,pH 7.4)30℃培养,培养一周后,接种于种子培养液(酵母粉0.5%,蛋白胨1.0%,葡萄糖1.0%,pH自然),30℃培养24h后1%转接于种子培养液(酵母粉0.5%,蛋白胨1.0%,葡萄糖1.0%,pH自然)。30℃,250r/m培养30h后放瓶。取培养液用去离子水洗涤数次,离心沉淀后(4000rpm,20min),用与收集到的菌丝体等体积新鲜的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)悬浮,再加入溶解有棘白菌素B的DMSO水溶液,使棘白菌素最终浓度为2mg/ml,DMSO浓度为整个反应体系的2%,混匀,进行转化反应(30℃,250rpm)5h。取转化反应液600ul,加等体积的甲醇,混匀后离心(12000rpm,5min),取上清进行HPLC分析。HPLC色谱条件:色谱柱为Agilent C18(5μm,250×4.6mm);流动相A为2g/L乙酸铵溶液;流动相B为水-乙腈(40∶60,含2g/L乙酸铵)。检测条件为:B%=8~98,15min;98~8,10min;8,6min;流速为0.8ml/min;检测波长为222nm;柱温35℃。另外,转化反应液中主要含有棘白菌素B母核和残留的棘白菌素B,出峰时间分别为6.747min,22.797min。HPLC分析结果见图3。可见,通过位点特异性整合的工程菌转化反应液发酵产物中棘白菌素B母核的产量较游动放线菌Actinoplanes utahensis NRRL 12052野生菌株提高1.5倍以上,转化效率达到53.3%,并且均未出现突变株不转化棘白菌素B的情况。
实施例5产棘白菌素B去酰化酶的工程菌的传代稳定性
挑取实施例3中能扩增出3300bp片断的突变株,经过三次传代,在与实施例4相同的斜面培养基中培养,经过与实施例4相同的培养方法及棘白菌素B转化验证,转化效率稳定在50%以上。说明本发明中构建的产棘白菌素B去酰化酶基因工程菌具有传代稳定性。
Claims (4)
1.一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌,其特征在于,其是在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24的基因组中的attB位点整合有棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒的工程菌,所述的棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒依次含有启动子、棘白菌素B去酰化酶编码区和终止子,所述启动子序列如SEQ ID NO.1所示,所述的棘白菌素B去酰化酶编码区的序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种制备如权利要求1所述的高效转化棘白菌素B的基因工程菌的方法,其特征在于,包括在骨架载体pSET152的多克隆位点插入棘白菌素B去酰化酶基因的的表达盒得到重组载体,然后将该重组载体转化大肠杆菌宿主菌ET12567制备转化子,将所述的转化子与变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24接合,挑选接合子即得,其中,所述的棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒依次含有启动子、棘白菌素B去酰化酶编码区和终止子,所述启动子序列如SEQ ID NO.1所示,所述的棘白菌素B去酰化酶编码区的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种制备棘白菌素B母核的方法,其特征在于,包括采用如权利要求1所述的基因工程菌,以静息细胞转化法转化棘白菌素B为棘白菌素B母核。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的静息细胞转化法包括:将如权利要求1所述的基因工程菌置于缓冲溶液中,以棘白菌素B为前体物质进行转化反应,从所得转化反应液中即可分离获得ECB母核。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201010505210.8A CN102443561B (zh) | 2010-10-13 | 2010-10-13 | 一种高效转化棘白菌素b的基因工程菌及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201010505210.8A CN102443561B (zh) | 2010-10-13 | 2010-10-13 | 一种高效转化棘白菌素b的基因工程菌及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102443561A CN102443561A (zh) | 2012-05-09 |
CN102443561B true CN102443561B (zh) | 2014-08-27 |
Family
ID=46006499
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201010505210.8A Expired - Fee Related CN102443561B (zh) | 2010-10-13 | 2010-10-13 | 一种高效转化棘白菌素b的基因工程菌及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102443561B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107779487A (zh) * | 2016-08-27 | 2018-03-09 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种利用犹他游动放线菌转化棘白菌素b的方法 |
CN109593661B (zh) * | 2017-09-30 | 2022-10-04 | 上海医药工业研究院 | 一种产棘白菌素b的基因工程菌及其构建方法和应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1230990A (zh) * | 1997-03-25 | 1999-10-06 | 加利福尼亚技术学院 | 用随机或确定的引物来重组多核苷酸序列 |
CN101649325A (zh) * | 2009-07-03 | 2010-02-17 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 一种提高基因工程异戊酰螺旋霉素主组分含量的基因串连技术 |
US7785826B2 (en) * | 2004-12-15 | 2010-08-31 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method for the deacylation of lipopeptides |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20010032861A (ko) * | 1997-12-08 | 2001-04-25 | 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 | 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 형성하는 방법 |
-
2010
- 2010-10-13 CN CN201010505210.8A patent/CN102443561B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1230990A (zh) * | 1997-03-25 | 1999-10-06 | 加利福尼亚技术学院 | 用随机或确定的引物来重组多核苷酸序列 |
US7785826B2 (en) * | 2004-12-15 | 2010-08-31 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method for the deacylation of lipopeptides |
CN101649325A (zh) * | 2009-07-03 | 2010-02-17 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 一种提高基因工程异戊酰螺旋霉素主组分含量的基因串连技术 |
Non-Patent Citations (17)
Title |
---|
Actinoplanes utahensis aculeacin A acylase gene, complete cds;Inokoshi,J. et al.;《GenBank: D10610.1》;20080216;1-3 * |
AJ Kreuzman et al..Membrane-associated echinocandin B deacylase of Actinoplanes utahensis: purification, characterization, heterologous cloning and enzymatic deacylation reaction.《Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology》.2000,第24卷(第3期),173-180. |
AJ Kreuzman et al..Membrane-associated echinocandin B deacylase of Actinoplanes utahensis: purification, characterization, heterologous cloning and enzymatic deacylation reaction.《Journal of Industrial Microbiology & * |
Biotechnology》.2000,第24卷(第3期),173-180. * |
Efficient Bioconversion of Echinocandin B to its Nucleus by Over-expression of Deacylase Gene in Different Host Strains;Lei Shao et al.;《Applied and Environmental Microbiology》;20121207;1 * |
Giovanna Pirri et al..Lipopeptides as anti-infectives: a practical perspective.《Central European Journal of Biology》.2009,第4卷(第3期),258-273. |
Inokoshi,J. et al..Actinoplanes utahensis aculeacin A acylase gene, complete cds.《GenBank: D10610.1》.2008,1-3. |
Lei Shao et al..Efficient Bioconversion of Echinocandin B to its Nucleus by Over-expression of Deacylase Gene in Different Host Strains.《Applied and Environmental Microbiology》.2012,1. |
Lipopeptides as anti-infectives: a practical perspective;Giovanna Pirri et al.;《Central European Journal of Biology》;20090930;第4卷(第3期);258-273 * |
刘爱娟等.犹他游动放线菌中酰胺水解酶基因拷贝数增加对转化棘白菌素B效率的影响.《Chinese Journal of New Drugs》.2012,第21卷(第1期),17-20. |
常青.植物内生真菌来源抗菌物质的筛选及产ECB侧链酰胺水解酶基因工程菌的构建.《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》.2011,(第3期),E057-24. |
常青等.酰胺水解酶基因工程菌的构建及其对棘白菌素B的转化.《工业微生物》.2011,第41卷(第2期),11-15. |
朱宏莉等.静息细胞法转化天麻素的研究.《西北大学学报(自然科学版)》.2007,第37卷(第1期),73. |
植物内生真菌来源抗菌物质的筛选及产ECB侧链酰胺水解酶基因工程菌的构建;常青;《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20110315(第3期);E057-24 * |
犹他游动放线菌中酰胺水解酶基因拷贝数增加对转化棘白菌素B效率的影响;刘爱娟等;《Chinese Journal of New Drugs》;20120115;第21卷(第1期);17-20 * |
酰胺水解酶基因工程菌的构建及其对棘白菌素B的转化;常青等;《工业微生物》;20110430;第41卷(第2期);11-15 * |
静息细胞法转化天麻素的研究;朱宏莉等;《西北大学学报(自然科学版)》;20070225;第37卷(第1期);73 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102443561A (zh) | 2012-05-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103060248B (zh) | 一种构建基因工程fk506高产菌株的方法和筑波链霉菌高产菌株 | |
CN102191208A (zh) | 高产多杀菌素的基因工程菌及其制备方法 | |
CN102443560A (zh) | 一种高效转化棘白菌素b的基因工程菌及其制备方法 | |
CN111575310B (zh) | 表达小窝蛋白的重组酿酒酵母及其应用 | |
CN106497827A (zh) | 一种定向生产抗结核活性和抗肿瘤活性化合物的基因工程菌株及其应用 | |
CN101649325B (zh) | 一种提高基因工程异戊酰螺旋霉素主组分含量的基因串连技术 | |
CN110317803A (zh) | 麦角硫因的纳米生物学制备方法 | |
CN101565710B (zh) | 3-甾酮-△1-脱氢酶基因、相关载体和工程菌及应用 | |
CN101613712A (zh) | 提高阿维菌素和/或伊维菌素产量的方法及生产菌株 | |
CN112501194A (zh) | 生产羟基红景天苷的重组质粒和基因工程菌及其运用 | |
CN116987603A (zh) | 一种高产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用 | |
CN102443561B (zh) | 一种高效转化棘白菌素b的基因工程菌及其制备方法 | |
CN104263744B (zh) | 一种人工改造的葡萄糖氧化酶基因及其表达应用 | |
CN108929884A (zh) | 通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法 | |
CN103834605A (zh) | 一种阿维菌素产生菌及其制备方法和应用 | |
CN109097342A (zh) | 蓝色犁头霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用 | |
CN110106191A (zh) | 人工合成的透明颤菌血红蛋白基因及相应工程菌株和应用 | |
CN101892185B (zh) | 产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌基因工程菌及其制备方法 | |
CN101818165A (zh) | 利用vgb基因构建抗贫氧的高密度发酵L-Phe工程质粒的方法 | |
CN104928313B (zh) | 阿维链霉菌rex基因在提高阿维菌素产量中的应用 | |
CN106566796A (zh) | 阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系 | |
CN101892186A (zh) | 产表柔红霉素的天蓝淡红链霉菌的基因工程菌及其制备方法 | |
CN104830851A (zh) | 一种甲酸脱氢酶的重组菌及其应用 | |
CN103849591B (zh) | 一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用 | |
CN107541481A (zh) | 一种产表阿霉素的基因工程菌及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140827 Termination date: 20191013 |