CN101818165A - 利用vgb基因构建抗贫氧的高密度发酵L-Phe工程质粒的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用vgb基因构建抗贫氧的高密度发酵L-Phe工程质粒的方法，其采用透明颤菌血红蛋白基因及其本身的启动子元件，融合T7强终止子序列，设计合适的酶切插入位点将其插入L-苯丙氨酸工程质粒中，与功能基因一起进行串联表达，构建携带完整vgb基因表达元件的工程质粒；所述vgb基因表达元件具有附图1所示的核苷酸序列；或者具有与附图1所示序列90％以上同源性，且编码同一功能蛋白的核苷酸序列；还或者在严密实验条件下，能与附图1所示核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列，杂交程度在90％以上。本发明保证宿主菌在高密度发酵贫氧的环境中提高细胞的摄氧能力，较好的保证外源基因的表达，从而改善了重组宿主菌高密度发酵产L-Phe过程中的氧气供求，提高了工程宿主菌的发酵水平。

Description

利用vgb基因构建抗贫氧的高密度发酵L-Phe工程质粒的方法

【技术领域】

本发明涉及生物工程领域，具体涉及利用透明颤菌血红蛋白基因及其低氧启动子的基因工程质粒在L-苯丙氨酸工程宿主菌的高密度发酵过程中改善细胞利用氧能力的一种方法。

【背景技术】

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)简称L-Phe，为白色结晶粉末，是人体和动物不能在体内自行合成的必须的氨基酸之一，广泛应用于食品、饲料、医药和化妆品等领域，尤其是低热量、高甜度的二肽甜味剂阿斯巴甜(Aspartame)应用日益广泛，作为合成阿斯巴甜两种原料之一的L-苯丙氨酸的市场需求量迅速增加。另外L-苯丙氨酸也是抗肿瘤药物和氨基酸输液制剂的必需原料，随着其在医药领域的不断开发，需求量也不断增加。因此，对L-苯丙氨酸生物合成途径的研究、L-苯丙氨酸产生菌的改良和对其工业化生产的研究越来越受到人们的重视。

国内外L-Phe的生产方法主要有水解抽提法、化学合成法、酶法和发酵法等。由于天然蛋白中L-苯丙氨酸含量较低，水解抽提法很少使用；化学合成法的工艺复杂，成本较高，在国外基本上被酶法和发酵法取代。但由于底物和酶的价格较高且来源有限，酶法应用也受到限制；由于微生物直接发酵法可利用廉价易得的原料，又可在常温常压下进行，是目前国内外生产L-Phe的主流方法，具有较大的竞争优势。其中大肠杆菌以其繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传背景清楚等特点被广泛改造为适应于外源基因表达的安全的基因工程受体生物。利用对大肠杆菌基因工程宿主菌的高密度发酵来实现工业中的大规模的L-Phe的生产。基因工程宿主菌的高密度发酵技术作为获取大量基因工程重组目的产物的基础，是基因工程技术从实验室通向市场的桥梁。

对于重组大肠杆菌的发酵L-Phe来讲，实现高密度发酵，可相应地缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用，从而降低生产成本，达到提高生产效率的目的，极大地提高了L-Phe在市场上的竞争力。但细胞高密度发酵对发酵设备有较高的要求，而且对发酵条件也有非常高的要求，因此影响高密度发酵的因素也很多，比如细菌生长营养物质、发酵过程中代谢的积累、发酵条件(温度、pH、溶氧等)、补料方式及发酵液流变学特性等等。迄今报道的高密度发酵系统，随着菌体培养密度的不断提高，发酵罐中出现溶氧(DO)不足、刺激醋酸盐的形成等导致工程宿主菌生长速率降低，对工程宿主菌发酵影响很大。

DO是L-Phe高密度发酵生产中影响工程宿主菌生长的重要因素之一。大肠杆菌工程宿主菌的生长代谢过程需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大，于是发酵过程中DO的控制也显得尤为关键，DO浓度过高或过低都会影响细菌的代谢，使后期的生长变得极为缓慢。菌体在大量扩增过程中，耗氧进行氧化分解代谢，饱和氧的及时供给非常重要。随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增加，溶氧浓度随之下降，细胞生长减慢。在高密度发酵的后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参数均不能满足对氧的供给，结果外源蛋白表达量很低，直接导致L-Phe产量的降低。微生物细胞在低溶氧条件下的生理活性通常与通气或无氧条件下的细胞不同。许多事实表明，低溶氧水平将改变细胞生理学。同时，生物反应器的空间多相性有可能导致极低的溶氧水平，在大规模细胞培养或高密度发酵如补料分批培养和固定化细胞系统中，供氧的问题一直尤为突出。如何在发酵过程中提高工程宿主菌在高密度条件下对氧的利用，对于提高基因工程宿主菌的培养密度及产物收率具有重要意义。

传统的高密度发酵L-Phe改善溶氧的方法与一般发酵过程中提高溶氧的方法相似，都集中在通过改善设备的供氧能力以及控制各种环境参数来提高氧的输送率，例如优化通风或搅拌装置以增大通气量，从而增加空气在培养液中的截留率，增加气液相接触的比表面积，或者在培养液中加入某些助溶剂如正十二烷、全氟碳(ForaneF66)等或加入氧载体的方式来增加液相中氧气的浓度和溶解度。所有这些方法均受到设备和能耗的限制。然而，随着分子生物学技术的快速发展，人们更多的寻求从根本上解决氧需求问题的途径，其中的一种重要手段就是利用基因工程技术来提高细胞自身摄取和利用氧的性能。比如表达外源透明颤菌血红蛋白基因增强细胞对氧的摄取能力，从而提高细胞对氧的宽容度，保证细胞在贫氧条件下的正常生长。Khosla和Bailey已经分离出了透明颤菌血红蛋白基因并使其在大肠杆菌中得到了表达。与不含有表达血红蛋白质粒的细胞相比，重组细胞生长得更快，同时细胞密度也大得多。重组细胞中不仅活性血红蛋白增加了，而且血红素也增加了，该血红蛋白增加了氧的利用率，尤其是在溶氧低于大气饱和度5％的时候。

透明颤菌(Vitreoscilla)是一种革兰氏阴性丝状专性好氧菌，属Beggiatoe族，习惯生长于泥塘腐叶等贫氧环境中，是一种专性好氧菌。20世纪70年代，美国科学家Tyree等在透明颤菌的中发现了血红蛋白。透明颤菌为了解决自身生长的需氧问题，它能够诱导合成一种可溶性的血红素蛋白，作用机制可能是在低氧条件下VHb可以结合环境之中的氧气，起到富积氧气以供宿主细胞利用的作用。透明颤菌血红蛋白(VHb)的存在使得透明颤菌能在贫氧环境中生存。该蛋白为同型二聚休，含有146个氨基酸残基，亚基分子量为15.7KD，各含有一分子的b型血红素。它无论在光谱学性质、结构及氧合动力学性质与真核生物血红蛋白极为相似，因此正式命名为Vitreoscilla hemoglobin(透明颤菌血红蛋白)，简称VHb，而编码蛋白的基因序列也称为透明颤菌血红蛋白基因，简称vgb。

透明颤菌血红蛋白基因的天然启动子是个受氧浓度调控的高效启动子，在贫氧条件下能有效地启动vgb基因的表达，vgb基因表达主要围绕着它对氧限状态的应答反应。研究表明利用其本身的启动子在大肠杆菌宿主中同样可以实现透明颤菌血红蛋白基因在氧限中的诱导表达，结果显示在重组大肠杆菌中表达的VHb的存在状态与透明颤菌中VHb的状态相一致，在大肠杆菌中的表达也促进了细胞在微氧状态的生长和蛋白质的合成。在实验室条件下，当氧浓度下降到某一临界值或该菌处于缺氧条件时，透明颤菌的细胞血红素浓度增加20-40倍。

利用vgb基因其天然启动子受氧浓度调控的特性，克隆vgb基因及其天然启动子并插入基因工程宿主菌，使得基因工程宿主菌在贫氧条件下能有效地启动vgb基因的表达，从而改善发酵液中细胞对氧利用效率，在限氧条件下促进细胞生长和产物合成，从而提高发酵过程中目的产物的产量和收率，同时不需要附加的设备投资。因此，利用vgb基因在其他宿主菌当中实现外源表达这一基因策略为解决好氧发酵过程中的供氧问题，且可降低发酵成本。本发明正是通过克隆、表达外源的透明颤菌血红蛋白基因，构建工程质粒并转化工程化宿主细胞，构建适用于贫氧发酵的工程宿主菌，从而改善细胞贫氧的生长能力，提高细胞的氧耐受力。

VHb在大肠杆菌中表达所显示的功能，促进了该血红蛋白越来越多地应用在微生物工业的许多领域，在短短二十年中取得了明显的效果。透明颤菌血红蛋白在大肠杆菌中应用最早，也最成熟。自从VHb在大肠杆菌中成功地进行表达以来，VHb已在假单胞杆菌、链霉菌、霉菌和酵母等多种生物体内实现克隆，它已越来越多地应用到微生物发酵工业的许多领域，并取得了显著成果。如抗生素、β-羟基丁酸酯等的生产，VHb的引入可以提高氧的利用效率，保证低溶氧环境下具有较高的产量。文献报道在兼性厌氧的肠杆菌中引入VHb可以提高2，3-丁二醇的产量。Enayati等将vgb基因克隆到含芽孢杆菌α-淀粉酶基因的pMK59质粒中，得到重组质粒pMK79，将pMK59和pMK79转化进大肠杆菌菌株JM103中，获得两个菌株MK59和K79，从细菌的生长和α-淀粉酶的表达，可以看到MK79比MK59具有明显的生长优势。结果证实，vgb基因在大肠杆菌中表达明显地提高总蛋白质的产量，在大肠肝菌中使用氧依赖的启动子(Oxygen dependent promoter)可以显著增加vgb基因的表达，总蛋白表达水平比对照提高10％以上。Peter等证实vgb基因的应用使得利用链霉菌生产红霉素的产量提高了60％以上；文莹等将vgb基因转入阿维链霉菌和肉桂地链霉菌中，提高了抗生素的产量。Kallio等发现，透明颤菌血红蛋白在枯草芽孢杆菌中同样能提高总蛋白的产量。但迄今为止，还未发现vgb基因在工业化大规模发酵L-Phe工业中的应用。

综上所述，VHb能够从分子水平上提高携带vgb基因的工程宿主菌对氧气的利用能力，因此能在贫氧条件下促进细胞生长和产物合成，从而大幅度提高发酵过程中目的产物的产量和收率。由于VHb的应用不仅可以降低氧气及能量的消耗，还不需要附加的设备投资，因此可大大降低发酵成本。利用VHb及其本身自带低氧启动子在大肠杆菌中实现外源表达这一基因策略来解决L-Phe工程宿主菌高密度发酵过程中的氧供求矛盾，为解决工业化生产L-Phe发酵溶氧不足提供了一条新的思路，并可能带来巨大的经济效益。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题，在于提供一种利用透明颤菌血红蛋白基因构建抗贫氧的高密度发酵L-Phe工程质粒的方法，在高效表达产L-Phe关键蛋白的工程质粒的基础上引入vgb基因表达元件，构建了一种能够在低氧环境中诱导表达VHb，保证宿主菌在高密度发酵贫氧的环境中提高细胞的摄氧能力，维持细胞在低氧情况下的代谢，保证外源基因的表达较好，从而改善了含重组工程质粒的宿主菌高密度发酵产L-Phe过程中的氧气供求问题，进一步提高了工程宿主菌的发酵水平。

本发明是这样实现的：一种利用vgb基因构建抗贫氧的高密度发酵L-Phe工程质粒的方法，其采用透明颤菌血红蛋白基因及其本身的启动子元件，融合T7强终止子序列，设计合适的酶切插入位点将其插入L-苯丙氨酸工程质粒中，与功能基因一起进行串联表达，构建携带完整vgb基因表达元件的工程质粒；其中，所述vgb表达元件具有附图1所示的核苷酸序列；或者具有与附图1所示序列90％以上同源性，且编码同一功能蛋白的核苷酸序列；还或者在严密实验条件下，能与附图1所示核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列，杂交程度在90％以上。

所述工程质粒为MDphevgb-2。

其中，质粒还包括构建工程质粒MDphevgb-2过称中的其他克隆载体以及表达载体。所述克隆载体为pUCvgb和pMDvgb载体；其中pUCvgb载体是含有附图1序列中的vgb基因及其启动子合成的为附图1中划线部分的核苷酸序列；pMDvgb载体是包含有附图1所示序列的完整部分，该pMDvgb载体是将附图1所示序列与pMD18T载体进行连接而成；所述表达载体包括pETvgb和MDphevgb-2载体，其中pETvgb载体是将vgb基因及其启动子进行酶切插入pET28a的T7终止子之前，方便进行融合T7终止子构建完整vgb表达元件；MDphevgb-2载体是在构建的工程质粒MDphe-2的基础上通过单酶切插入完整vgb基因表达元件连接而成。

所述宿主菌为包含克隆载体或表达载体的宿主菌，所述宿主菌为大肠杆菌。

本发明具有如下优点：在高效表达产L-Phe关键蛋白的工程质粒的基础上引入vgb基因表达元件，构建了一种能够在低氧环境中诱导表达VHb，保证工程宿主菌在高密度发酵贫氧的环境中提高细胞的摄氧能力，维持细胞在低氧情况下的代谢，保证外源基因的表达较好，从而改善了含重组工程质粒的工程宿主菌菌高密度发酵产L-Phe过程中的氧气供求问题，进一步提高了工程宿主菌的发酵水平。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1为工程质粒MDphevgb-2的构建流程图。

图2为本发明的完整vgb表达元件的序列图。

【具体实施方式】

步骤一、透明颤菌血红蛋白基因及其低氧诱导启动子的获得。

(1)根据NCBI公布的完整vgb基因序列(GenBank NO.L77863)，同时结合大肠杆菌密码子的偏爱性，利用生物信息学的在线分析(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)和设计，结合基因转录和密码子优化的原则，选择最优的优化方式确定vgb基因及其启动子序列，进行基因合成。

(2)化学合成的vgb基因及其启动子序列全长541bp，其中从5′端开始第1到100个bp为启动子序列，第101bp开始至541bp为完整441bp的vgb基因的开放阅读框序列，包含启动子ATG，以及终止子TAA序列。基因合成后采用BamH I/Apa I双酶切插入克隆质粒pUC57中，构建pUCvgb质粒载体，并转化感受态细胞E.coli JM109，进行质粒和甘油菌的序列信息保存。

步骤二、vgb基因融合T7终止子序列，构建完整的vgb表达元件。

(1)融合PCR引物设计

以vgb基因、启动子以及待融合的T7终止子的全序列为模板，利用生物学软件Primer Premier 5.0进行PCR引物设计，同是为方便后续操作，在融合引物的两端加上Bstp I的酶切位点，融合片段全长760bp，软件分析，最佳退火温度58.5℃，引物序列如下(框中序列为加入的Bstp I酶切识别序列)：

pETvgb-f：5′-TGG GTC GCG GAT CCT GTG G-3′

pETvgb-r：5′-

CCG GAT ATA GTT CCT CCT TTC-3′

(2)pUCvgb质粒以及pET28a质粒的双酶切及pETvgb大肠杆菌表达质粒载体的构建

将表达质粒pET28a和pUCvgb分别进行HindIII/BamH I的双酶切并进行电泳割胶回收，酶切体系如下(50μl酶切体系)：

dd H₂O          20μl

10×K buffer    5μl

HindIII         1μl

BamH I          1μl

质粒            23μl(约含质粒1.2μg)

30℃水浴酶切反应5h后，用柱式DNA凝胶回收试剂盒分别进行电泳割胶回收所需的DNA片段：vgb基因和pET28a的线性片段。然后将目的片段用T₄DNA连接酶进行体外连接，构建表达质粒pETvgb。

(3)质粒pETvgb转化感受态细胞E.coli JM109

分别取新鲜制备的100μl感受态细胞E.coli JM109和10μl连接产物(质粒pETvgb)于1.5mlEP管中，混匀，冰浴30min，42℃热激45s，再冰浴2-5min。加入890μl 37℃预热的SOC培养基，37℃120rpm振荡1h，将转化菌涂布于含LB/Kan⁺平板上，于37℃培养14h，经抗性筛选，分别挑取数个单菌落于4ml含50μg/ml Kan的LB液体培养基中，于37℃，250rpm震荡培养过夜。

(4)阳性克隆子的质粒提取及鉴定

用碱裂解法提取保存于E.coli JM109细胞中的含vgb基因的pETvgb质粒，将提取出来的重组质粒pETvgb同样进行HindIII/BamH I的双酶切验证(10μl体系)，酶切3h后取全量酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；同时以单克隆为模板，融合引物(pETvgb-f/r)为PCR引物，进行菌落PCR的验证。出现目的基因条带即可判定所挑的菌落为阳性克隆子。保存阳性克隆子质粒，此即为重组的pETvgb质粒。

(5)完整的vgb基因表达元件的PCR扩增及测序验证

以构建的pETvgb质粒为模板，pETvgb-f及pETvgb-r为上下游引物进行vgb基因、启动子以及T7终止子的PCR扩增。

PCR体系与条件如下：

PCR产物经电泳检测，PCR产物回收试剂盒进行目的片段的回收，电泳检测，其大小与预测的理论大小基本相符，约为760bp。

将回收后的vgb基因表达元件片段进行与pMD18T载体进行T-A克隆构建pMDvgb质粒，转化感受态E.coli JM109细胞，筛选阳性克隆子并送交含有vgb基因表达元件的阳性克隆子测序，验证vgb基因表达元件是否在PCR扩增以及酶切操作过程中存在突变或缺失，同时确证是否融合完整的vgb基因表达元件。测序完成的序列如图1所示，序列经生物学软件分析，其中除包含有设计的限制性内切酶Bstp I识别序列外，还包括序列的vgb基因及其启动子序列(图1序列中划线部分)以及融合的终止子序列(图1划线序列之后的序列)。由此可确认，成功获得了与预测序列相符的完整的Vgb基因表达元件。。

步骤三、完整的vgb基因表达元件在MDphe-2工程质粒中的插入，构建新工程质粒MDphevgb-2。

质粒MDphevgb-2完整的构建过程示意图如图2所示，其中涉及的具体方法和技术如下：

(1)工程质粒MDphe-2的序列分析

在进行vgb基因表达元件的插入之前，对于先前构建的工程质粒MDphe-2的序列进行了完整的序列分析。利用生物信息学手段，借助生物学软件Primer Premier 5.0、Clustal X 1.83以及在线分析的方法(NCBI)，确认在工程质粒MDphe-2的某两个功能基因之间串联插入vgb基因表达元件，插入位点为Bstp I切点，位置为MDphe-2的2984bp处。

(2)vgb基因表达元件及MDphe-2工程质粒的预处理

首先，对质粒pMDvgb质粒进行Bstp I的单酶切消化，Bstp I单酶切体系如下(50μl)：

dd H₂O         19μl

10×H buffer   5μl

Bstp I         2μl

质粒           24μl(约含质粒1.2μg)

60℃水浴反应5h，反应结束后加入10×Loading Buffer终止反应并进行电泳割胶回收。通过0.7％低熔点的琼脂糖电泳回收酶切目的片段：vgb基因表达元件。

其次，同样对工程质粒MDphe-2进行相同的单酶切(Bstp I单酶切)，酶切体系和条件如上，同样回收单切后的线性的MDphe-2片段。

(3)MDphevgb-2质粒载体的构建

为减少后续的筛选鉴定工作，避免假阳性的出现，我们将回收后的线性化MDphe-2片段进行了去磷酸化的处理，具体方法如下：在微量离心管中按下列顺序配制下列反应液，全量定容至50μl。

dd H₂O                             13μl

DNA片段                            30μl(约1μg)

10×Alkaline Phosphatase Buffer    5μl

CIAP(30U/μl)                      2μl

37℃反应3h，进行回收。首先苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)对反应液抽提2次，取上清继续氯仿/异戊醇(24∶1)抽提1次，取上清添加5μl的3M的NaOAc(醋酸钠)以及125μl的(2.5倍量)预冷的无水乙醇，在-20℃下沉淀2h。离心分离回收沉淀，用200μl的70％冷乙醇洗净后，真空干燥。用15μl的dd H₂O溶解沉淀。此即为去磷酸化后的MDphe-2片段。-20℃保存备用。

将经同样Bstp I单酶切的vgb基因表达元件片段以及MDphe-2片段利用T4-DNA连接酶进行连接，构建MDphevgb-2质粒。参照TAKARA说明书操作。

步骤四、工程质粒MDphevgb-2转化大肠杆菌工程宿主菌构建抗贫氧的高密度发酵L-苯丙氨酸工程宿主菌。

(1)工程质粒MDphevgb-2转化感受态E.coli JM109细胞

为保证工程质粒在工程宿主菌中的转化率，采取先将连接好的MDphevgb-2质粒，全量(10μl)加入电转感受态E.coli JM109细胞，将质粒进行电穿孔导入细胞中：电穿孔电压2500V，脉冲时间6ms。点击结束后，马上加入37℃预热的电击复苏培养基SOB中，进行37℃，150rpm，震荡复苏1h，涂布含有抗性选择的LB培养基平板中(Kan⁺)，37℃，倒置培养14h。

(2)重组菌阳性克隆子的快速筛选及酶切验证

随机挑取平板上10个阳性克隆子，37℃摇床培养过夜后，利用质粒快速抽提法提取质粒DNA，电泳检测后，出现目的条带即可初步判定所挑的菌落为阳性克隆子，再提取阳性重组菌的质粒进行Bstp I酶切验证。电泳结果显示：出现两条线性的DNA片段，其中一条为约760bp的Vgb基因表达元件的条带，另一条为载体的线性条带，大小相符。由此即可确认vgb基因表达元件成功插入MDphe-2载体中。

(3)重组质粒MDphevgb-2转化工程化宿主

其中工程宿主菌为经过改造的营养缺陷型工程化宿主菌。将转化E.coliJM109细胞获得的阳性克隆菌株进行质粒抽提(质粒提取试剂盒，上海生工)，取10μl的MDphevgb-2质粒进行电转工程化宿主菌，电转条件如上述。

(4)重组质粒MDphevgb-2在工程化宿主菌中的质粒稳定性验证

原始质粒MDphe-2在工程宿主菌中的质粒稳定性已经经过验证，具有相当高的质粒稳定性(97％)，而且在高密度发酵过程(小试、中式和大式)中同样保持着高稳定性，为确保重组质粒同样具有质粒的稳定性，进行了重组质粒MDphevgb-2工程化宿主菌中的质粒稳定性实验。

从平板中挑取含质粒MDphevgb-2的单菌落，接入2mL含Kan⁺的LB培养基中，30℃培养过夜，取20μl接入不含Kan⁺的LB培养基中，35℃培养，使菌株在热诱导前在无Kan的培养基中连续生长48h，繁殖50代以上，最后一次，细菌在生长到OD₆₀₀＝0.3时，转入37℃诱导，取样涂于不含Kan的LB平板上，次日，随机挑取菌落100个点含Amp⁺的平板上，在含Kan⁺平板上生长菌落的百分数为约97％，证明重组质粒MDphevgb-2在工程化宿主当中同样具有较高的质粒遗传稳定性。

(5)含透明颤菌血红蛋白基因的重组质粒MDphevgb-2的工程宿主菌抗贫氧高密度发酵L-苯丙氨酸的潜力

验证工程宿主菌的抗贫氧发酵能力主要是利用全自动的小型发酵罐(30L)，通过控制溶氧和搅拌来控制，而且通过氨、糖来控制细胞的生长速度，在细胞发酵进入对数生长期的时候控制溶氧在较低水平，溶氧范围为1％-15％(正常L-苯丙氨酸的高密度发酵溶氧水平控制在30％-40％)，这样的溶氧水平也是诱导vgb基因启动子启动VHb表达的低溶氧范围。发酵过程中设立阴性对照，即以原始工程宿主菌(含MDphe-2工程质粒)为对照菌种，发酵实验同样工艺条件重复三次，结果显示：

1)MDphevgb-2质粒工程宿主菌在贫氧条件下细胞达到稳定期的时间比原始菌缩短4h，稳定期总时长延长约4h；

2)发酵的最高菌浓(OD610)两者差不多，但MDphevgb-2质粒工程宿主菌在生长过程中出现“二次”增长的现象，出现两个生长的峰值，而原始菌未有此类现象；

3)在发酵40h结束，两者的最终酸值虽都比以往正常溶氧发酵(DO＝30％-40％)的酸值要略低，但二者之间的酸值具有明显的差别，MDphevgb-2质粒工程宿主菌的酸值比原始菌提高了14％；

4)为验证重组工程质粒MDphevgb-2中vgb基因表达元件在发酵过程中是否进行表达，我们对发酵罐进行取样，收集发酵菌体进行SDS-PAGE，进行透明颤菌血红蛋白的检测，SDS-PAGE包含5％的浓缩胶和18％的分离胶(具体配方参见TAKARA说明书方法)：对发酵在16h以及30h分别进行取样收集此时菌体。电泳结束后，凝胶经进行固定液固定，染色液染色以及脱色最后进行凝胶成像系统分析，结果显示在重组工程质粒MDphevgb-2的工程宿主菌中明显比原始菌多出一条大小约为15kD大小的蛋白片段，而此与VHb大小(15.7kD)相符，基本证明VHb在溶氧控制为5％-10％的情况下获得了表达。

上述结果说明利用低氧诱导的vgb基因启动子控制表达VHb提高宿主对氧气的利用率，从而提高了细胞在贫氧条件下的生存能力，低氧条件下携带vgb表达元件的工程宿主菌表达的VHb可能参与微氧条件卜细菌呼吸链的某些步骤，使细胞处于生物氧化效率较高的状态，从而显示了生长优势。也正因为细胞的生长优势以及摄取氧的能力增强，使细胞得以维持正常生理代谢，故而在同样的低氧水平下携带MDphevgb-2质粒的工程宿主菌比原始菌的产酸水平高。

虽然相比低氧发酵条件下的酸值比正常溶氧水平的低，这也属于正常发酵现象，因为为避免对宿主产生生理代谢负担，vgb基因在正常氧气浓度条件下不表达VHb，而在全程低氧条件下进行细胞高密度发酵，虽然贫氧条件维持了工程细胞的生长和发酵水平，但在人为设计中细胞受氧浓度限制发酵的情况接近极限，这在一定情况下影响了整体产酸，故而最终酸偏低也在情理之中了。

综上所述，本发明首次将受氧浓度诱导vgb基因表达元件插入质粒中进行L-苯丙氨酸抗贫氧高密度发酵，并显著提高了工程宿主菌株对氧的宽容度，改善高密度发酵过程中氧不足的情况。

Claims (7)

1.一种利用vgb基因构建抗贫氧的高密度发酵L-Phe工程质粒的方法，其特征在于：

其采用透明颤菌血红蛋白基因及其本身的启动子元件，融合T7强终止子序列，设计合适的酶切插入位点将其插入L-苯丙氨酸工程质粒中，与功能基因一起进行串联表达，构建携带完整vgb基因表达元件的工程质粒；

其中，所述vgb基因表达元件具有附图1所示的核苷酸序列；

或者具有与附图1所示序列90％以上同源性，且编码同一功能蛋白的核苷酸序列；

还或者在严密实验条件下，能与附图1所示核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列，杂交程度在90％以上。

2.根据权利要求1所述的利用vgb基因构建抗贫氧的高密度发酵L-Phe工程质粒的方法，其特征在于：所述工程质粒为MDphevgb-2。

3.根据权利要求1所述的利用vgb基因构建抗贫氧的高密度发酵L-Phe工程质粒的方法，其特征在于：所述工程质粒的构建中包含有附图1所示的核苷酸序列的质粒载体，该质粒载体还包括克隆载体以及表达载体。

4.根据权利要求3所述的利用vgb基因构建抗贫氧的高密度发酵L-Phe工程质粒的方法，其特征在于：

所述克隆载体为pUCvgb和pMDvgb载体；其中pUCvgb载体是含有附图1序列中的vgb基因及其启动子合成的为附图1中划线部分的核苷酸序列；pMDvgb载体是包含有附图1所示序列的完整部分，该pMDvgb载体是将附图1所示序列与pMD18T载体进行连接而成。

5.根据权利要求3所述的利用vgb基因构建抗贫氧的高密度发酵L-Phe工程质粒的方法，其特征在于：

所述表达载体包括pETvgb和MDphevgb-2载体，其中pETvgb载体是将vgb基因及其启动子进行酶切插入pET28a的T7终止子之前，方便进行融合T7终止子构建完整vgb基因表达元件；MDphevgb-2载体是在构建的工程质粒MDphe-2的基础上通过单酶切插入完整vgb基因表达元件连接而成。

6.根据权利要求1所述的利用vgb基因构建抗贫氧的高密度发酵L-Phe工程质粒的方法，其特征在于：所述工程质粒包含于宿主菌当中，该宿主菌为包含克隆载体或表达载体的宿主菌。

7.根据权利要求6所述的利用vgb基因构建抗贫氧的高密度发酵L-Phe工程质粒的方法，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌。

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