CN102234660A - 构建含有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV)的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，提供了克隆含有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV)的方法。本方法根据VHb能够与氧结合形成氧合态，介入细胞与氧有关的代谢途径，改变氧限条件下细胞的原有生物代谢方式，在贫氧条件下促进细胞生长和蛋白质合成，直接或间接影响需氧生物初级代谢和次级代谢的作用原理，首先构建了大肠杆菌表达质粒pQEV，表达了具有生物活性的血红蛋白。在此基础上构建了糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV)。为解决在氧限条件下实现细胞高密度培养和代谢产物高产率发酵，提供一个vgb基因元件和与糖多孢红霉菌染色体基因组发生同源重组的重要途径。
Description
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及构建含有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV)的方法。
背景技术：
该项发明来源于辽宁省教育厅青年人才基金项目“改造糖多孢红霉菌提高红霉素产量降低成本的研究No.05L433”。糖多孢红霉菌是产生大环内酯类抗生素一红霉素的工程菌株，红霉素在临床上应用广泛，每年需求量不断增加。而红霉素发酵生产需要充足的氧气供应，由于氧在水中的溶解度较低，距离糖多孢红霉菌正常生长的需氧量相距甚远，而供氧不足会导致菌体生长不良和红霉素产率下降。因此，溶氧问题成为抗生素发酵生产的“瓶颈”问题。目前，工业生产采用提高搅拌速度和增加通气量等方法来解决氧气不足的问题，但这往往对设备的要求较高，需要消耗大量的能量，增加生产成本。
透明颤菌血红蛋白(VHb)是一种原核生物血红蛋白，它与真核生物的血红蛋白具有较高的同源性。能够与氧结合形成氧合态，介入细胞与氧有关的代谢途径，改变氧限条件下细胞的原有生物代谢方式，在贫氧条件下促进细胞生长和蛋白质的合成，并且它的表达随溶氧水平的下降而增加。此特点正适合于传统发酵菌株的基因改造。利用透明颤菌血红蛋白基因的分子克隆，能够在细胞内从分子水平上增强重组菌株对氧的摄取和利用能力，从而在氧限条件下实现细胞高密度培养和代谢产物高产率发酵，解决传统发酵过程中由于氧需不足而导致的产率低下和成本高的问题，而且VHb的应用还不需要附加的设备投资，这更进一步地降低了发酵成本。正是为了解决生物反应器中的氧供矛盾，促使我们利用基因重组技术将透明颤菌血红蛋白基因整合于糖多孢红霉菌表达载体中，利用这一有效途径构建高产基因工程菌株恰恰是工业生产中利用新技术所要达到的目标，本发明对细胞高密度培养和工业微生物发酵生产具有重大的科学意义。
发明内容：
本发明的目的是提供一种分子生物学领域的操作技术，克隆一个含有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的糖多孢红霉菌重组表达质粒(pBlueV)。
本发明是通过如下技术方案实现的：
编码透明颤菌血红蛋白的基因序列(vgb)与编码变铅链霉菌启动子基因序列(PmerR)和糖多孢红霉菌中的两段红霉素合成非必需片段，分别以各自原始菌株为模板，通过PCR扩增获得。报告基因(葡糖苷酸酶GUS)从质粒pBIl01中酶切获得。然后将vgb基因、PmerR启动子、非必需片段1和片段2以及GUS基因共5个DNA片段在体外连接构成新的大片段，再将其插入分子量为3.0Kb的糖多孢红霉菌表达载体pBluescript SK中，经蓝白斑筛选获得阳性克隆pBlueV。为研究外源基因(vgb)与糖多孢红霉菌染色体基因组整合提供了一个获得外源基因的途径。携带vgb基因的整合型载体将随糖多孢红霉菌染色体DNA一起复制，表达的血红蛋白可以在分子水平提高细胞摄氧能力。
本发明的技术解决方案包括以下步骤：
1.vgb在大肠杆菌中的克隆与鉴定
1.1PCR扩增vgb：PCR引物设计：根据Khosla(1988)测定的vgb核酸序列(GenBank Accession No.M30794，142bp-582bp)合成引物，以透明颤菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增，获得分子量约0.5kb vgb片段(附图1)。
引物：5’......CGCGGATCCATGTTAGACCAGCAAACC......3’
Bam HI
5’......CCCAAGCTTCTATTATTCAACCGCTTG......3’
Hind III
1.2大肠杆菌表达载体pQE V构建：将vgb基因片段和质粒pQE-30分别经BamHI和Hind III双酶切消化后，通过T4DNA连接酶，得到重组质粒pQE V，CaCl2转化法将含有vgb基因的载体质粒pQE V转入E.coli M15感受态细胞，在含有50μg/ml Amp的LB平板培养基上37℃培养12-18h，挑取抗性单菌落，分别以质粒小量提取、质粒大量提取方法制备含有目的基因的载体和表达载体，以5V/cm的电压在琼脂糖凝胶上电泳以及用限制性内切酶的酶切反应鉴定目的基因和载体，并进行BamHI和Hind III双酶切，对pQE V进行电泳鉴定，用适量T4DNA连接酶(0.5Weiss单位)置16℃水浴过夜或25℃lh进行连接反应。重组子的筛选和鉴定采用酶切法。结果获得分子量约3.9kb阳性克隆(附图2)。2.vgb在E.coli M15中的表达与鉴定pQE V转入大肠杆菌后在含氨苄青霉素LB培养基中振荡培养过夜，离心后的菌体呈红色，而不含vgb的大肠杆菌菌体为白色，这表明vgb已经在大肠杆菌中得到了高效表达。用SDS-PAGE电泳检测vgb表达的血红蛋白，分子量约为16kDa(附图3)。
对转化后的大肠杆菌进行蛋白印迹和C0示差光谱分析，结果分子量为16kDa(附图4)。在0D420nm出现典型的吸收峰值，表明vgb在转化后的大肠杆菌中表达了有活性的血红蛋白。
3.构建含有vgb基因的糖多孢红霉菌载体及鉴定
3.1PmerR启动子的PCR扩增：根据文献(Brunker et al，1998)中启动子PmerR的序列(GenBank Accession No.X65467)2538bp-2723bp设计引物，以Streptomyces lividans基因组DNA为模板，PCR扩增PmerR启动子，启动子PmerR的序列如下：
2521gggatttcat gggcagggcc tttccaccag cagctattcg tctgcccgca tagtaaggtg
2581gcggtctgca atacggcaag ccgcatagga atgggtccgg cgtccggcgc tggaccccac
2641tgagggaggt agtgctgtgc tccaggcaca caccggttac gacctggcga tcatcggctc
2701gggcgccggc gcattcgccg cgg
引物：5’......TGCACTGCAGGCCTTTCCACCAGCAGCT......3’
Pst I
5’......CGCGGATCCCCGCGGCGAATGCGCCGG......3’
BamHI
3.2糖多孢红霉菌非必需区片段1和片段2的PCR扩增：根据文献(Brown，DPet al，1994)中糖多孢红霉菌染色体中的序列(GenBank Accession No.L11597)设计两对引物，以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板，进行PCR反应，扩增出21-321bp和441-698bp两段DNA片段，分别称为片段1和片段2。包含片段1和片段2的碱基序列如下：
21 cctccgccac tccctcggct cgacctgcgc aaaccccaca acagggaacg agggaacgcc
81 ccgcgcacac cgcccgacac ccccggaatc cggggttgtc gacaccggcc cccgcttccc
141tcccccggcc ccgggagtcc ggggacgcaa cgcggctgct gctgaccgtc gagcaggccg
201cccgccggtt gtcggtcggc cgcaccacga tgttcaagct catcaagtcc ggcgacgtcg
261actcggtacg catcggccac gcccgccgcg tccccgtcga agcgctcacc gcctacatcg
321accgcctggc ccggggcgcg gcatgaccac cgccgtcacg tcgcccagtc ggcccaatat
381cggggtggga gggggtgccg tcccagccgt cccagccgtc ccaccgcagg tcagcgcggg
441acggcaacac gccctgggac ggcacgagcc gtcccaccga ccccagcggc gcgcactgct
501gggacggcac gagccgtccc acgcctgcaa gccgtcccag cctgaccagc actgggacgc
561ttgggacggc tgggacggct accccctcac cccgtaccgc cgggccgcgc gaggccagtg
621aacgggccag tgagcccggc aggggccagt ggatatccac tggccatcca ctggcccggc
681ccactgggca cggcctgcga
片段1引物：5’......CCCATCGATCCTCCGCCACTCCCTCGG......3’
ClaI
5’......GGCGAGCTCTCGATGTAGGCGGTGAGC......3’
Sac I
片段2引物：5’......TGCACTGCAGACGGCAACACGCCCTGGG......3’
Pst I
5’......TCCCCCGGGGCAGGCCGTGCCCAGTGG......3’
Sma I
3.3报告基因GUS的获得：由于GUS(葡糖苷酸酶)在底物X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸)的存在下能够使菌落呈现蓝色。便于从pBlue V转化菌株中筛选出含有vgb的重组菌株。用Hind III和Sac I双酶切质粒pBI101，电泳后回收2.0kb大小的片段，即获得GUS基因的片段。
3.4糖多孢红霉菌表达载体pBlueV的构建和鉴定：将PCR扩增的vgb基因、PmerR启动子、非必需区片段1和2及GUS基因分别用各自对应的限制内切酶消化，用适量T4DNA连接酶(0.5Weiss单位)置16℃水浴过夜或25℃1h。进行连接反应后。反复转化大肠杆菌，经阳性克隆筛选，分别以质粒小量提取、质粒大量提取方法制备含有目的基因的载体和表达载体，以5V/cm的电压在琼脂糖凝胶上电泳、PCR实验以及用限制性内切酶的酶切反应反复鉴定目的基因和载体，直至鉴定vgb基因、PmerR启动子、非必需区片段1和2及GUS基因在体外已经连接到一起，然后再插入质粒pBluescript SK多克隆位点(附图5)。本发明的实用意义：红霉素是从糖多孢红霉菌培养液中分离出来的一种抗生素，对耐药菌具有很好的抗菌作用，临床需求量很大。然而糖多孢红霉菌进行规模化生产发酵培养时，只有在生物反应器中提高氧气的利用率，才能有效地提高红霉素的产量降低生产成本，因此，寻求能够提高细胞利用氧气能力的途径是提高红霉素产量的关键。
依据VHb能够与氧结合形成氧合态，并且介入细胞与氧有关的代谢途径，从而改变氧限条件下细胞的原有生物代谢方式，在贫氧条件下促进细胞生长和蛋白质合成，并且它的表达随溶氧水平的下降而增加，直接或间接影响需氧生物的初级代谢和次级代谢的原理，我们利用透明颤菌血红蛋白基因的分子克隆，拟对糖多孢红霉菌株进行基因改造。因此，构建了含有vgb基因的糖多孢红霉菌的表达载体pBlueV。为在细胞内从分子水平上增强重组菌株对氧的摄取和利用能力、在氧限条件下促进细胞生长，从而实现细胞高密度培养和产品高产率发酵。为解决传统发酵过程中由于氧供不足而导致产率低下和成本过高的问题. 提供一个将vgb基因与糖多孢红霉菌染色体基因组发生同源重组的途径和基因元件基础。
附图说明：
图1PCR扩增的vgb琼脂糖凝胶电泳
Fig.1Electrophoresis of amplified vgb
1.DNA marker；2.amplified vgb gene
(The vgb gene was amplified by PCR using genomic DNA of Vitreoscilla as the template with theprimers 5’-CGCGGATCCATGTTAGACCAGCAAACC-3’and5’-CCCAAGCTTCTATTATTCAACCGCTTG-3’，during which Bam HI and Hind III restrictionsites were introduced to the end of the fragments.)
图2为大肠杆菌重组表达质粒pQE V的酶切鉴定
图3转化pQE V的大肠杆菌SDS-PAGE
Fig.3SDS-PAGE analysis of E.coli /pQEVand E.coli
1.protein marker 2.E.coli M15(no plasmid)3.E.coli M15(pQE V)
图4转化pQE V的大肠杆菌细胞粗提物的Western blotting分析
Fig.4Western blotting analysis of cleared cell extracts from E.coli(pQE V)
1.protein marker 2.E.coli M15(pQE V)
图5为糖多孢红霉菌重组表达质粒pBlueV的酶切鉴定
具体实施方式：
实施例1：大肠杆菌重组表达质粒pQE V酶切鉴定图(见附图2)
实施例2：糖多孢红霉菌重组表达质粒pBlueV酶切鉴定图(见附图5)
Claims (6)
1.构建含有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV)的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1).vgb在大肠杆菌中的克隆与鉴定
①PCR扩增vgb：PCR引物设计：根据Khosla(1988)测定的vgb核酸序列(GenBank Accession No.M30794，142bp-582bp)合成引物，以透明颤菌基因组DNA为模板，通过PCR扩增，获得分子量约0.5kb vgb片段。
引物：5’......CGCGGATCCATGTTAGACCAGCAAACC......3’
Bam HI
5’......CCCAAGCTTCTATTATTCAACCGCTTG......3’
Hind III
②大肠杆菌表达载体pQE V构建：将vgb基因片段和质粒pQE-30分别经BamHI和Hind III双酶切消化后，通过T4DNA连接酶，得到重组质粒pQE V，CaCl2转化法将含有vgb基因的载体质粒pQE V转入E.coli M15感受态细胞，在含有50μg/ml Amp的LB平板培养基上37℃培养12-18h，挑取抗性单菌落，分别以质粒小量提取、质粒大量提取方法制备含有目的基因的载体和表达载体，以5V/cm的电压在琼脂糖凝胶上电泳以及用限制性内切酶的酶切反应鉴定目的基因和载体，并进行Bam HI和Hind III双酶切，对pQE V进行电泳鉴定，用适量T4DNA连接酶(0.5weiss单位)置16℃水浴过夜或25℃1h进行连接反应。重组子的筛选和鉴定采用酶切法。结果获得分子量约3.9kb阳性克隆。
(2).vgb在E.coli M15中的表达与鉴定pQE V转入大肠杆菌后在含氨苄青霉素LB培养基中振荡培养过夜，离心后的菌体呈红色，而不含vgb的大肠杆菌菌体为白色，这表明vgb已经在大肠杆菌中得到了高效表达。用SDS-PAGE电泳检测vgb表达的血红蛋白，分子量约为16kDa。对转化后的大肠杆菌进行蛋白印迹和CO示差光谱分析，结果分子量为16kDa。在OD420nm出现典型的吸收峰值，表明vgb在转化后的大肠杆菌中表达了有活性的血红蛋白。
(3).构建含有vgb基因的糖多孢红霉菌载体及鉴定
①PmerR启动子的PCR扩增：根据文献(Brunker et al，1998)中启动子PmerR的序列(GenBank Accession No.X65467)2538bp-2723bp设计引物，以Streptomyces lividans基因组DNA为模板，PCR扩增PmerR启动子，启动子PmerR的序列如下：
2521 gggatttcat gggcagggcc tttccaccag cagctattcg tctgcccgca tagtaaggtg
2581 gcggtctgca atacggcaag ccgcatagga atgggtccgg cgtccggcgc tggaccccac
2641 tgagggaggt agtgctgtgc tccaggcaca caccggttac gacctggcga tcatcggctc
2701 gggcgccggc gcattcgccg cgg
引物：5’......TGCACTGCAGGCCTTTCCACCAGCAGCT......3’
Pst I
5’......CGCGGATCCCCGCGGCGAATGCGCCGG......3’
Bam HI
②糖多孢红霉菌非必需区片段1和片段2的PCR扩增：根据文献(Brown，DP etal，1994)中糖多孢红霉菌染色体中的序列(GenBank Accession No.L11597)设计两对引物，以糖多孢红霉菌基因组DNA为模板，进行PCR反应，扩增出21-321bp和441-698bp两段DNA片段，分别称为片段1和片段2。包含片段1和片段2的碱基序列如下：
21 cctccgccac tccctcggct cgacctgcgc aaaccccaca acagggaacg agggaacgcc
81 ccgcgcacac cgcccgacac ccccggaatc cggggttgtc gacaccggcc cccgcttccc
141 tcccccggcc ccgggagtcc ggggacgcaa cgcggctgct gctgaccgtc gagcaggccg
201 cccgccggtt gtcggtcggc cgcaccacga tgttcaagct catcaagtcc ggcgacgtcg
261 actcggtacg catcggccac gcccgccgcg tccccgtcga agcgctcacc gcctacatcg
321 accgcctggc ccggggcgcg gcatgaccac cgccgtcacg tcgcccagtc ggcccaatat
381 cggggtggga gggggtgccg tcccagccgt cccagccgtc ccaccgcagg tcagcgcggg
441 acggcaacac gccctgggac ggcacgagcc gtcccaccga ccccagcggc gcgcactgct
501 gggacggcac gagccgtccc acgcctgcaa gccgtcccag cctgaccagc actgggacgc
561 ttgggacggc tgggacggct accccctcac cccgtaccgc cgggccgcgc gaggccagtg
621 aacgggccag tgagcccggc aggggccagt ggatatccac tggccatcca ctggcccggc
681 ccactgggca cggcctgcga
片段1引物：5’......CCCATCGATCCTCCGCCACTCCCTCGG......3’
Cla I
5’......GGCGAGCTCTCGATGTAGGCGGTGAGC......3’
Sac I
片段2引物：5’......TGCACTGCAGACGGCAACACGCCCTGGG......3’
Pst I
5’......TCCCCCGGGGCAGGCCGTGCCCAGTGG......3’
Sma I
③报告基因GUS的获得：由于GUS(葡糖苷酸酶)在底物X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸)的存在下能够使菌落呈现蓝色。便于从pBlue V转化菌株中筛选出含有vgb的重组菌株。用Hind III和Sac I双酶切质粒pBI101，电泳后回收2.0kb大小的片段，即获得GUS基因的片段。
④糖多孢红霉菌表达载体pBlueV的构建：将PCR扩增的vgb基因、PmerR启动子、非必需区片段1和2及GUS基因分别用各自对应的限制内切酶消化，用适量T4DNA连接酶(0.5weiss单位)置16℃水浴过夜或25℃1h。进行连接反应后，反复转化大肠杆菌，经阳性克隆筛选，分别以质粒小量提取、质粒大量提取方法制备含有目的基因的载体和表达载体。以5V/cm的电压在琼脂糖凝胶上电泳、PCR实验以及用限制性内切酶的酶切反应反复鉴定目的基因和载体，直至鉴定vgb基因、PmerR启动子、非必需区片段1和2及GUS基因在体外已经连接到一起，然后再插入质粒pBluescript SK多克隆位点。
2.根据权利要求1所述的构建含有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV)的方法，其特征在于：以自行分离的透明颤菌基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得分子量约0.5kb vgb片段。
3.根据权利要求1所述的构建含有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV)的方法，其特征在于：所述的vgb目的基因片段和质粒pQE-30分别经Bam HI和Hind III双酶切消化后，通过T4DNA连接酶，得到重组质粒pQE V，获得分子量约3.9kb的阳性克隆。
4.根据权利要求1所述的构建含有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV)的方法，其特征在于：所述的重组质粒pQE V转入大肠杆菌后，vgb在转化的大肠杆菌中表达了有活性的血红蛋白，分子量约为16kDa。CO示差光谱分析，在OD420nm出现典型的吸收峰值。
5.根据权利要求1所述的构建含有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV)的方法，其特征在于：将PCR扩增的vgb基因、PmerR启动子、非必需区片段1和2及GUS基因分别用各自对应的限制内切酶消化，用适量T4DNA连接酶(0.5weiss单位)置16℃水浴过夜或25℃1h。进行连接反应后，反复转化大肠杆菌，经阳性克隆筛选，PCR实验以及用限制性内切酶的酶切反应反复鉴定目的基因和载体，直至将vgb基因、PmerR启动子、非必需区片段1和2及GUS基因在体外连接成分子量约为3.1kb的基因片段。
6.根据权利要求1所述的构建含有透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的糖多孢红霉菌表达质粒(pBlueV)的方法，其特征在于：将vgb基因、PmerR启动子、非必需区片段1和2及GUS基因在体外连接成分子量约为3.1kb的基因片段，同时用ClaI和SmaI双酶消化，然后定向克隆于糖多孢红霉菌表达质粒pBluescript SK多克隆位点，经阳性克隆筛选，获得了分子量约为6.0kb的重组糖多孢红霉菌表达质粒pBlueV。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20111109 |